JPH08508102A - 電気化学発光アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 低温で、塩化アルカリを用い、ｐＨを上げ、および／または初期電圧を下げ、さらにこうした目的に合致した試薬および装置を用いて、電気化学発光現象を測定するための方法。

Description

【発明の詳細な説明】 電気化学発光アッセイ 本発明は、電気化学発光現象を測定するための方法、当該方法を用いて被検体 を検出するための方法、当該方法において使用することができる試薬溶液、およ び当該方法の実施に特に適した装置に関する。 電気化学発光現象を測定するための方法は、近年知られるようになった。こう した方法は、特殊な金属複合体が酸化によって励起状態に達することができるこ とを利用する。ここで金属複合体は励起状態から基底状態に崩壊して電磁波を放 射する。このような方法および好適な金属複合体は、例えばWO 86/02734に記載 されている。 こうした技術は絶えず、さらに高度になっている。WO 90/05296において、酸 化されると強力な還元剤となるアミン、特にトリプロピルアミンが検査組成に添 加される。電気化学反応は電解液の中で生じるが、ここにおいて電気化学発光（ ＥＣＬ）部分、すなわち電磁波を放射することができる金属複合体、およびアミ ンが酸化される。水溶液中の好適な電解質として、ｐＨ６−９、特に７−７．５ のリン酸バッファーに言及している。電磁波を増加させるために、WO 90/05302 は、界面活性剤Triton X-100またはTriton N-401の上記検査組成への添加を提案 している。WO 90/05411は、ＥＣＬを測定するための改良型装置を記述する。 さらに、被検体、被検体類似物、または被検体に特異的な物質に電気化学発光 標識を結合させることにより被検体を検出するた めの技術を利用することが可能になった。電気化学発光を利用して、存在する被 検体の量を定量した。通常利用される標識を電気化学発光標識に置き換えたイム ノアッセイについて特に言及している。 このような技術のさらなる改良および応用が、WO 87/06706，WO 89/04392，WO 89/10552，WO 89/10551，WO 90/05301,およびWO 90/11511に記載されている。 こうした刊行物の開示は、公知であるとみなされる。 したがって、電気化学発光法を組み合わせて、特に被検体検出の感度に関して 上記の公知の方法を改良することが本発明の目的であった。 本発明は、溶液中の、または溶液と接する固相における電気化学発光現象を測 定する方法に関するが、ここで電気化学発光は、一定温度の溶液および／または 固相で測定され、その温度は、溶液の凝固点よりは高いが、２５℃よりは低い。 さらに本発明は、作用電極に電圧をかけることにより電気化学発光を生じさせ 、そのことによって電気化学発光現象を測定するための方法に関する。電気化学 発光を発生させる前に、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して＋４００から−４００ ｍＶの間の電位を作用電極にかける。 また、本発明は、作用電極に電圧をかけることにより電気化学発光を生じさせ 、そのことによって電気化学発光現象を測定するための方法に関する。電気化学 発光システムの酸化還元電位と＋８００ｍＶの間の電圧をかけることによって、 電気化学発光が生じる。 さらに本発明は、溶液中の、または溶液と接する固相における電気化学発光現 象を測定する方法に関するが、ここで溶液は、Thesit，C14-EO9，Genapol，C8-E 09，プランタレン（Plantaren）（商標）およびオクチルグルコシド、またはそ れらの混合物からなる一群から選択される界面活性剤を含む。 さらに本発明は、上記方法、適合する試薬、および最初に述ベた方法を実施す るための装置によって被検体を検出するための方法に関する。 本発明は上記先行技術に基づく教示に関する。電気化学発光法の基本原理は、 このような先行技術の文書に非常に詳細に記載されている。電気化学発光を測定 するための機器は、試薬溶液の容器のついた測定ユニット、測定時に試薬溶液と 接触する少なくとも二つの電極（作用電極および対電極）、および電気化学発光 過程で発生する光を測定するための検出器を含んでなる。通常、最初に溶液に初 期電圧（前分極）をかける。この電圧を、溶液中に含まれる例えばアミンのよう な物質の酸化還元電位を越えて上昇させる。こうして酸化された物質は、例えば 特定のルテニウム複合体のような電気化学発光を生じることができる物質を励起 し、光を放射する。一定時間内に検出器に受容される光の総量が、電気化学発光 物質の総量の存在に関する尺度となる。電気化学発光物質が、例えばイムノアッ セイにおいて、被検体、被検体類似物、または被検体に特異的な物質の標識であ るならば、受容された光は被検体の存在の尺度となる。 現在公知の電気化学発光法は２８℃またはそれ以上の温度で行なわれるが、新 しい知見では、温度を低下させてランプ波電圧を 用いると、一定時間単位ではシグナル強度が減少するが、驚くベきことに感度が 相当に上昇することが明らかになった。この改善は、例えばＥＣＬ複合体と電極 との非特異的結合がかなり減少した結果と考えられる。１０℃では非特異的結合 の量は、試薬溶液に由来するバックグラウンドの総量から区別することはもはや できない。望ましい温度範囲は５から２０℃の間であり、特に望ましい温度は９ から１１℃の間であることが明らかになった。試薬溶液を測定ユニットと接触さ せる前にこの溶液を冷却すること、および／または試薬溶液を測定ユニット内で 全体として冷却することによって、上記のような温度が達成される。 さらに、作用電極にかける最終電圧（Ａｇ／ＡｇＣｌと比較して）の限度を、 酸化され得る物質の酸化還元電位と２．０Ｖとの間の最大値までとすることが有 利であることが判明した。１．２から１．７Ｖの間の電圧が特に望ましい。さら に望ましい電圧は１．６Ｖである。これらの値は白金電極を使用する場合に適用 される。 測定ユニットに矩形波電圧をかけることによって、感度をさらに向上させるこ とができる。これは初期電圧がただちに（最大でも０．４秒以内に）最終電圧値 に上昇することを意味する。励起時間の間、この電圧はほぼ一定に保たれる。励 起時間後、この電圧は系の酸化還元電位以下の値にただちに低下する。さらに、 このような測定法は、測定のダイナミックレンジ、すなわち一定のイムノアッセ イで測定可能な被検体濃度の範囲、も改善する。低温を使用する場合には、矩形 波電圧が、高温については延長される励起時間の間、維持されなければならない （矩形波電圧が、励 起時間の間、維持されなければならない。この励起時間は高温については延長さ れる）。経験により、電圧をかけた後約５秒までに測定される強度がシグナル発 生にかなり寄与することが明らかになった。 電気化学発光測定時の測定ユニットに含有される試薬溶液が、０．１ｍｍｏ／ ｌから０．５ｍｏｌ／ｌまでの濃度の塩化アルカリを含有するならば、上記の方 法を単独で使用する場合も相互に組み合わせて使用する場合にも、感度または被 検体の検出下限を改善することができる。塩化アルカリとしては塩化ナトリウム が望ましい。塩化ナトリウムの特に望ましい濃度は、０．０５ｍｏｌ／ｌから０ ．４５ｍｏｌ／ｌであり、０．３５ｍｏｌ／ｌが特に望ましい。さらに、経験に より、本発明にしたがって塩化ナトリウムを使用すると、測定時間が短縮される こと明らかになった。また、セル内の電流は増加する。 驚くべきことに、電気化学発光を開始する前に、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極に対して ＋４００から−４００ｍＶの間の初期電圧を作用電極にかけることによって、や はりシグナルを増加させることができた。望ましい値の範囲は＋５０ｍＶから− ５０ｍＶの間の範囲であり、０ｍＶが特に望ましい。これらの値は白金電極を使 用するときに適用される。他の材質の電極に関する電位は、容易に算出すること ができる。 さらに、ｐＨを６．８から９．０の間、特に７．０から８．０の間、さらに望 ましくは７．２５から７．５の間の値に調整することによって、やはりシグナル を増加させることができる。これは、常法によりこの範囲に適したｐＨバッファ ーを使用すること によって達成される。 経験により、通常、界面活性剤Tween20と組み合わせて使用され、WO 90/05302 により公知の、一般に使用される界面活性剤、Triton X-100が、最良の結果をも たらさないことが明らかになった。一方では、Tritonn X-100は難分解性であっ て、したがって環境にとって有益でない。他方では、驚くべきことに、Triton X -100以外の特定の界面活性剤がＥＣＬ法を改善することが経験から明らかになっ た。このような特定の界面活性剤は、シグナル発生を増加させ、シグナル／ノイ ズ比を改善し、それによってより高い検出感度を達成し、検出下限を低下させ、 最終的によりよい精度を達成するために使用される。 好適な界面活性剤は、例えばPolidocanol（ドデシルポリ−（エチレングリコ ールエーテル）_n）、C14-E09（ポリ（エチレングリコールエーテル）_n）、Genap ol（イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）_n）、C8-E09（オクチ ルアルコールポリ（エチレングリコールエーテル）_n）、ならびにplantaren（商 標）（アルキルポリグルコシド）およびオクチルグルコシド（オクチル−ベータ −Ｄ−グルコピラノシド）またはそれらの混合物、を包含する脂肪アルコールエ トキシレートからなる一群から選択される。界面活性剤は、０．００１から０． １％までの範囲の濃度で用いられる。最適濃度は、それぞれの界面活性剤につい て容易に決定することができる。最も適した濃度は、０．１から０．５％までの 範囲の濃度である。 ５−１０ｍＭ濃度のアジ化ナトリウムがこの試験組成において防腐剤として通 常使用される。この環境に有害な薬剤を、アジド よりはるかに環境によいbiobanまたはoxabanによって置き換えることができるこ とが経験から明らかになった。驚くべきことに、これらの安定化剤はＥＣＬ法に 関して別の利点、すなわち測定シグナルの増加、を示す。Oxabanおよびbiobanは ０．０１から１％までの濃度で使用され、０．１から０．５％までが望ましい。 前記の測定はそれ自体、公知の方法を有意に改善する。さらに、これらの測定 法を組み合わせることによって、被検体検出アッセイの感度および／またはダイ ナミックレンジをさらに有意に高めることができる。 例えば、減圧下で試薬からガスを抜く（例えば＜５０ｍｂａｒ、２−４時間、 室温）ことによって、酸素を除去することにより、検出限界をさらに減少させる ことができる。 例えばサンドイッチ法または競合法によるイムノアッセイにおける被検体の検 出感度が向上すれば、用いる方法または装置をさらに簡略化することができる。 例えば、検出器としてフォトダイオードを使用すること、検量システムを簡略化 すること、シグナルの増加によって測定時間が減少するので単位時間当り処理さ れる検査数を増加させること、または試料の量を減らすことが可能である。 本発明はさらに、電気化学現象を測定し、特に被検体を検出するための試薬溶 液に関するが、この試薬溶液は電気化学的に酸化されうるアミンを含んでなり、 これは酸化されるときに強力な還元剤である。溶液は塩化アルカリを０．１ｍｍ ｏｌ／ｌから０．５ｍｏｌ／ｌまでの濃度で含有し、または７．０から８．０の 間のｐＨを示す。さらに、この溶液は脂肪アルコールエトキシレー ト、プランタレン、およびオクチルグルコシドまたはそれらの混合物からなる一 群から選択される界面活性剤を含有する。 試薬溶液のための望ましい防腐剤は、biobanまたはoxabanである。 電気化学発光による検出を行なう装置は、例えばWO 90/05302の実施例１に非 常に詳細に記載される。さらに、こうした装置は、測定ユニットおよび／または 液体容器を０から２５℃までの温度に冷却するための手段を含んでなる。測定ユ ニットは、その中で電気化学発光が測定されるセルであると考えられる。液体容 器は保存容器であるが、フィード装置でもある；例えば、試薬溶液のチューブは 測定中は測定ユニットの中にある。 本発明は、また、電気化学発光標識を用いて被検体を検出するための方法に関 するが、ここにおいて、電気化学発光現象を測定するための上記方法のうちの一 つが利用される。 以下の実施例は、本発明をさらに説明することを意図するものである。実施例１ 電気化学発光法を応用したＴＳＨの定量 甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）をサンドイッチイムノアッセイで定量した。使 用した装置は、やはり測定セル内に永久磁石を含有するWO 90/05302の実施例１ に記載されたのと同様の装置とした（IGEN（Rockville，USA）製Origen 1.0また はMagnalyser（商標））。また、同様に、光電子増倍管、ポテンシオスタット、 電気化学フロースルーセル、液体移動剤、および50チューブ試料 ローターを含んでなる機器を用いた。検出反応のために以下の物質を混合した。 インキュベーションバッファー、５０μｌ（６．０６ｇ／ｌ Tris-ＨＣｌ，１ ｇ／ｌクロロアセトアミド，０．１ｇ／ｌ メチルイソチアゾロン、ｐＨ８．０ ，５０ｇ／ｌウシ血清アルブミン、１０ｇ／１Ｒ−ＩｇＧを含有する） ストレプトアビジン−被覆磁粉（Dynal,２．８μｍ）／インキュベーションバッ ファー、６００μｇ／ｍｌ、４０μｌ ＤＳＳ（ジスクシニルスベレート）でビオチン化されたＴＳＨに対する単クロー ン性抗体（ＭＡＢ）／インキュベーションバッファー、３．０μｇ／ｍｌ、４０ μｌ ＴＡＧ：ＴＳＨに対するＭＡＢにＤＳＳとともに結合した（Tris）（2,2'-ジピ リジル）塩化ルテニウム６水和物／インキュベーションバッファー、１．２μｇ ／ｍｌ、４０μｌ 試料液または標準、５０μｌ 再懸濁液（試薬溶液（ＢＭＧ１）の添加）、１００μｌ ストレプトアビジン−被覆磁粉は、Deutsche Dynal GmbHから購入した（Dynab eads M-280 Streptavidin）。 上記混合物を室温（２１℃）で１６分間インキュベートした後、室温においた 測定セルに移した。移動した粒子を試薬溶液ＢＭＧｌで洗浄し、ＢＭＧ１におい て測定した。 ＢＭＧ１は以下の組成を有する： 試薬 ｐＨ７．５ ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄ ^*２Ｈ₂Ｏ ２７．１９ Ｈ₃ＰＯ₄ − Polidocanol １．０ Oxaban A １．０ ＴＰＡ（トリプロピルアミン） １４．３３ ＫＯＨ ３．６ この実施例については、ランプ波電圧を用いた場合のシグナル回収率と標準曲線 に関するセル温度の影響を示すためにＴＳＨイムノアッセイを用いた。 ＬＤＬ（２ｓ）またはＬＤＬ（３ｓ）：標準ａのシグナルの平均に由来する２ま たは３標準偏差によって定義される検出下限 ＳＤ：標準偏差 ＣＶ：変動計数 ｂ／ａ：標準ｂ／ａの測定シグナルの比 ｅ／ａ：標準ｅ／ａの測定シグナルの比（ダイナミックレンジ） ｃ：カウント（測定シグナル） 標準ａ−ｅは下記のＴＳＨ濃度を有する： ａ：０ μU/ml ｂ：0.39μU/ml ｃ：3.54μU/ml ｄ：12.40μU/ml ｅ：44.30μU/ml 標準曲線へのセル温度の影響を第図に示す。検出された化学発光を、μU/mlで 与えられる異なる濃度のＴＳＨを有する５標準ａ−ｅの濃度に対してプロットす る。ランプ波電圧をかけたとき、温度が低いほど光の放射量が増加することは明 白である。実施例２ 実施例１にしたがって、バッファー（ＢＭＧ１）において標準ｅのＴＳＨ濃度 で、ＴＳＨ定量への温度の影響を１０から４２℃までの様々な温度について測定 した。いわゆるランプ波電圧を用いたが、ここにおいて、５６５ｍＶの電位（初 期電圧）を１秒間にわたって３Ｖまで上昇させ、次に同様にして１Ｖにまで低下 させた。結果を第２図にまとめる。明らかに、ランプ波電圧をかけると、シグナ ル強度は４２から２１℃に向かって増加し、１０℃では再び減少する。実施例３ 試験特異的なバックグラウンドシグナル、すなわちビオチン化抗体が存在しな くてもＴＡＧ−被検体複合体だけによって生じるシグナルへの影響を、１０℃お よび２８℃でバッファーＢＭＧ１において測定した。実施例２で述べたランプ波 電圧をかけた。結果を第３図にまとめる。試験特異的な、ＴＡＧ−被検体複合体 の非特異的結合は温度の低下にともなって減少することが明かである。実施例４ 実施例１にしたがって、標準ｅの濃度およびバッファ−ＢＭＧｌでＴＳＨを定 量するために、検出される光の総量の時間間隔を１０℃で５６５ｍｖで始まる矩 形波電圧をかけて測定した。結果を第４図にまとめる。放射強度の大部分は時間 範囲の比較的遅い時点で測定する必要があることが明らかである。０．８秒後に 測定された強度を測定することは不可能であった、または研究者がそのことをし ないでおいたと考えられる。 ランプ波電圧の代わりに矩形波電圧を用いた場合、ＴＳＨの検出限界は0.03mI U/mlから0.006mIU/mlに低下させることができた。ダイナミックレンジは55から1 04まで改善された。この率は、最低濃度（ａ）の標準のシグナル強度に対する最 高濃度（ｅ）の標準のシグナル強度に相当する。実施例５ 一連の実験において、電気化学発光を生じるために加える最終電圧の大きさの シグナル強度への影響を調べた（矩形波電圧）。結果を第５ａ図に示す。１．６ から２．０Ｖの間の電圧でよい結果が得られた。最適な電圧は１．６Ｖであった 。 第５ｂ図は、第５ａ図のシグナル曲線として表示された磁粉（ＨＰ）のシグナ ル振幅を示す。バックグラウンドシグナル（ａｂ）および磁粉のシグナル振幅の バックグラウンドに対する比（ＨＰ／ａｂ）も示す。使用すべき電圧を選択する ために欠かせないファクターは、シグナル／ノイズ比、すなわちＨＰ／ａｂであ る。第５図はその最大値が１．６Ｖで得られることを示す。 測定は、次のようにして電気化学発光標識をつけた磁粉の懸濁液で行なわれた 。 ストレプトアビジン被覆磁粉（Dynal,直径2.8μm）を、ルテニウム−ビス−ピ リジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（IGEN，データは製造業者から 提供された）で標識された、Ｔ４に対するビオチン化ポリクローナル抗体複合体 とともに、バッファー（5OmM HEPES pH7.4；3%サッカロース；2%ウシ血清アルブ ミン；0.01%メチルイソチアゾロン；0.1%Oxypyrion（商標））中で、１時間、２ １℃でローラー撹拌装置内でインキュベートした。その磁粉を標識していないDy nal磁粉で希釈して、ＥＣＬ測定装置（Magnalyser，IGEN）で50,000ユニットを 示す濃度とした。磁粉は使用するまで凍結乾燥の形で保存された。使用前に、磁 粉を4mlバッファー（ＢＭＧ１）に懸濁して、600μg/mlの濃度とした。懸濁液の 50μl分の磁粉を500μlバッファー（ＢＭＧ１）とともにMagnalyser試験管にい れ、測定した。実施例６ 電気化学発光（ＥＣＬ）強度へのハロゲン化アルカリ濃度の影響 一連の実験において、塩化ナトリウム／塩化カリウム濃度のＥＣＬシグナルへ の影響を調べるために、実施例１に従ったＴＳＨ試験を利用した。本実験では、 ＴＳＨ標準ｅを用いた。１．６Ｖの矩形波電圧をかけた。初期電圧は５６５ｍＶ であった。用いたバッファーはＢＭＧ１である。温度は１０℃に調整した。 塩化ナトリウム無しでの試験結果は非常に不十分であったが、０．１ｍｏｌ／ ｌおよび０．２５ｍｏｌ／ｌ濃度での積算は、明 らかに増加している。これほど明白ではないが同様のシグナルの相違が塩化カリ ウムについても得られた。 結果を第６図にまとめる。実施例７ 一連の実験において、ＴＡＧ−標識Dynal磁粉についてＢＭＧｌバッファーを 用いて１０℃で、初期電圧（作用電極の前分極）の影響を調べた。用いたＥＣＬ 電圧は１．６Ｖとした（矩形波）。第７図から、ＥＣＬ強度は、初期電圧がＡｇ ／ＡｇＣｌに対して０ｍＶに近づくとき、最大になる傾向があることが明かであ る。実施例８ 試薬溶液のｐＨの影響を、実施例１の標準ｅでのＴＳＨ試験で調べた。試験に は以下のパラメーターを用いた： 矩形波電圧 １．６Ｖ（最大） 初期電圧 ５６５ｍＶ 温度 １０℃ ｐＨ６．８または先行技術の文書に記載されたバッファーとは対照的に、ｐＨ ７．５では測定時のシグナル強度は有意に増加することが実施例から明らかにな った。 バッファーＢＭＧ２は以下の組成を有する： 試薬 ｐＨ６．８ ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄ ^*２Ｈ₂Ｏ − Ｈ₃ＰＯ₄ １６．４ Polidocanol １．０ Oxaban A １．０ ＴＰＡ（トリプロピルアミン） ２２．９３ ＫＯＨ ５．７ 結果を第８図にまとめる。積算強度は以下の通りである：ｐＨ６．８：１１２ ０００；ｐＨ７．５：３９９０００実施例９ この実施例の実験は、実施例１のＴＳＨ試験に基づいて行なわれた。この実験 から、本発明の測定を組み合わせることによって、比較的初期にＥＣＬシグナル を相当増加させることができることが明らかになった。グラフに示す５本の曲線 は、１０℃で、１．６Ｖの電気化学発光電圧（矩形波電圧）で測定された。 曲線１：ＢＭＧ２，ｐＨ６．８，初期電圧５６５ｍＶ 曲線２：ＢＭＧ１，ｐＨ７．５，初期電圧５６５ｍＶ 曲線３：ＢＭＧ２，ｐＨ７．５，初期電圧５６５ｍＶ 曲線４：ＢＭＧ２，ｐＨ７．５，初期電圧０ｍＶ 曲線５：ＢＭＧ２，ｐＨ７．５，０．２５ＭＮａＣｌ、初期電圧０ｍＶ 実験結果を第９図にまとめる。実施例１０ 第１０図は、実施例１にしたがった１０℃でのＴＳＨ定量に関する標準曲線を 示す。曲線１はランプ波電圧を用いたときの標準曲線を示すが（図２）、曲線２ は最適なｐＨ、イオン強度および 前分極条件を組み合わせて矩形波電圧を用いた場合の標準曲線を示す。このこと は、低温を使用したとき、矩形波電圧を加えることによってシグナル強度を増加 させることができることを示す。 ＴＳＨ検出限界は、測定を組み合わせることによって、約０．００２８μIU/m lにまで低下させることができた。ダイナミックレンジは、約２８０に向上した （標準ｅ／標準ａ）。実施例１１ 次の実験によって、本発明で得られた効果が他の被検体についても適用可能で あることを確認した。第１１図は、先行技術の条件（ランプ波）下、および本発 明の条件（１０℃、矩形波電圧１．６Ｖ）での、エストラジオール（Ｅ２）定量 のための標準曲線である。感度（検出下限）を２０倍高めることができた（約１ ．５ｐｇ／ｍｌに低下）。 Ｅ２検出のために以下の成分を合わせてインキュベートした。 第１段階： ２５μｌバッファーＢＭＧ１ ５０μｌＥ２に対するビオチン化（ＤＳＳ）多クローン性抗体（ＦＡＢ’）溶液 ５０μｌ試料または標準（０．１％、０．３％ウシ血清アルブミン含有） ５０ｍｇ／ｍｌジヒドロキシテストステロン 次に溶液を１５分間インキュベートした。 第２段階： ２５μｌバッファーＢＭＧ１ ５０μｌ実施例１の磁粉溶液 ５０μｌＴＡＧ溶液： ３００ｍｇ／ｍｌ、IGENによるＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺−ＮＨ Ｓエステルで標識されたＦＡＢフラグメント を添加した。 溶液を１５分間インキュベートした。次にこの溶液の１００μｌをＢＭＧ１に 添加して、懸濁液をMagnalyserに移し、固定化された磁粉を１５００μｌＢＭＧ １で洗浄し、以下の標準についてＢＭＧ１中で測定した。 ａ ０ｐｇ／ｍｌ ｂ ７２ｐｇ／ｍｌ ｃ ２２９ｐｇ／ｍｌ ｄ ５２９ｐｇ／ｍｌ ｅ １７０９ｐｇ／ｍｌ ｆ ５０３２ｐｇ／ｍｌ実施例１２ 本発明にしたがって使用される界面活性剤の単独の影響を以下の一連の実験で 判定した。個々の試験パラメーター、すなわち測定すべき被検体、とは独立にシ グナル発生への界面活性剤の影響を判定するために、ビオチン化またはルテニル 化抗体を結合させたストレプトアビジン被覆磁粉を用いた（ＨＳＡＰ：”ホット ストレプトアビジン粒子）。 以下の物質を試薬チューブ内で混合し分析を行なった： ＨＳＡＰ（凍結乾燥ＨＳＡＰをTris/polidocanolバッファー（１００ｍＭ；０． １％）ｐＨ９．０に溶解し、６００μｇ／ｍｌの作用溶液）、５０μｌ ＰＢＳバッファー（５０ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄バッファー；１００ｍＭＮａＣｌ；０． １％ＢＳＡ；ｐＨ７．０）、２００μｌ 試薬溶液（２００ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄バッファー；１００ｍＭＴＰＡ；ｐＨ７．５； 試験する各試薬について） この混合物をピペットで測定チューブに入れた後、測定セルに移した。ＨＳＡ Ｐをバッファー（ＡＢ）で洗浄し、シグナル放射量を上記バッファー中で測定し た。 用いた抗体は、ビオチン−ＤＤＳ（ビオチニル−アミノ−３，６−ジオキサオ クタノイル−アミノカルボニル−ヘプタン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ ステル）によってビオチン化された。（Ｔｒｉｓ）（２，２’−ビピリジル）塩 化ルテニウム６水和物をＤＳＳ（ジスクシニルスベレート）を用いて抗体に結合 した。 Deutsche Dynal GmbH（ドイツ）製のDynabeads M-280 Streptavidinを実験に 用いた。 測定に使用したバッファー（ＡＢ）は以下の組成からなる： ＫＨ₂ＰＯ₄ ^*２Ｈ₂Ｏ ０．２Ｍ ＫＯＨ ０．０７６Ｍ ＮａＣｌ ０．０５ｍＭ ＴＰＡ（トリプロピルアミン） ０．１Ｍ 界面活性剤 濃度は表中に示す Oxaban/bioban ０．１／０．３％ ｐＨ ７．５ 使用する対照は、一般によく知られた界面活性剤Tween2OおよびTriton X-100 、それぞれの濃度は０．０５％とした。比較のために、表２で上記界面活性剤に ついて得られたシグナル放射量を１００％とみなした。もう一つの測定値を得る ために、バッファー（ＡＢ）中の非特異的シグナル放射量を測定して、ＨＳＡＰ ／ＡＢシグナル放射量の比の算出に用いた。ＨＳＡＰ有り、無しでのシグナル放 射量のこのような比は、アッセイの感度のためのすぐれた指標となる。表１に記 載された結果から、明らかに本発明の界面活性剤はもっとも適していると考える ことができる。PolidocanolおよびC8-E09は、ＨＳＡＰ／ＡＢ比に関して最良の 効果を示す。Tween/Triton X-100以外の界面活性剤は、シグナル放射量に悪影響 を及ぼす。 使用した界面活性剤の名称および略号 Ｃ８−Ｅ０９ オクチルアルコールポリ（エチレングリ コールエーテル）ｎ Ｃ１４−Ｅ０９ ポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ Ｃ１６−Ｅ０９ セチルポリ（エチレングリコールエーテ ル）ｎ ドデシルマルトシド ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシル （１→４）α−Ｄ−グルコピラノシド Genapol イソトリデシルポリ（エチレングリコー ルエーテル）ｎ オクチルグルコシド オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド プランタレン アルキルポリグルコシド（Ｃ１４−Ｃ１ ６） Ralufon3-14 ｎ−テトラデシル−ｎ，ｎ−ジメチル− ３−アミノ−１−プロパン硫酸 ＳＤＳ ラウリル硫酸ナトリウム Polidocanol ドデシルポリ（エチレングリコールエー テル）ｎ Triton X-100 オクチルフェノールポリ（エチレングリ コールエーテル）ｎ Tween ポリ（オキシエチレン）ｎ−ソルビタン −モノラウリン酸

【手続補正書】 【提出日】１９９５年１２月８日 【補正内容】 請求の範囲 １．酸化可能なアミンと電気化学発光を生じることができる成分を含有する水溶 液中または該水溶液に接する固相で電気化学発光現象を測定する方法であって、 電圧をかけて電気化学発光を生じさせ、発生した光が電気化学発光を生じること ができる成分の存在の尺度となり、電気化学発光作用が該溶液の凝固点より高い が２５℃よりは低い該溶液および／または該固相の温度で測定されることを特徴 とする方法。 ２．温度範囲が５℃から２０℃の間であることを特徴とする、請求項１記載の方 法。 ３．溶液が脂肪アルコールエトキシレート、アルキルポリグルコシド、オクチル −β−Ｄ−グルコピラノシドまたはこれらの混合物からなる群から選択される界 面活性剤を含有することを特徴とする、請求項１記載の方法。 ４．溶液が１または複数のハロゲン化アルカリまたはアルカリ土類を含有するこ とを特徴とする請求項１記載の方法。 ５．溶液のｐＨが６．８から９．０の範囲であることを特徴とする、請求項１記 載の方法。 ６．電気化学発光が２．０Ｖの最大電圧をかけることによって生じることを特徴 とする、請求項１記載の方法。 ７．測定のために矩形波電圧を用いることを特徴とする、請求項１記載の方法。 ８．電気化学発光を生じることができる成分が被検体、被検体類似物、または被 検体特異的物質の標識であって、受容された光が被検体の存在の指標となること を特徴とする請求項１記載の 方法。 ９．酸化されるときに強力な還元剤となる電気化学的に酸化可能なアミンを含有 し、さらに０．１ｍｍｏｌ／ｌから０．５ｍｏｌ／ｌの濃度の塩化アルカリを含 有することを特徴とする、電気化学発光現象を測定するための試薬溶液。 １０．塩化アルカリが塩化ナトリウムであることを特徴とする、請求項９記載の 試薬溶液。 １１．塩化物が０．０５ｍｏｌ／ｌから０．４５ｍｏｌ／ｌの濃度で存在するこ とを特徴とする、請求項９または１０記載の試薬溶液。 １２．その溶液のｐＨが７．０から８．０の間であることを特徴とする、請求項 ９から１１までの一項に記載の試薬溶液。 １３．溶液が脂肪アルコールエトキシレート、アルキルポリグルコシド、オクチ ル−β−Ｄ−グルコピラノシドまたはこれらの混合物からなる群から選択される 界面活性剤を含有することを特徴とする、請求項９から１２までの一項に記載の 試薬溶液。 １４．作用電極に電圧をかけることによって電気化学発光を生じさせることによ り水溶液中または水溶液に接する固相で電気化学発光現象を測定する方法であっ て、該水溶液が酸化可能なアミンおよび電気化学発光を生じることができる成分 を含有し、該成分が粒子に結合しており、電気化学発光を生じさせる前に、作用 電極にＡｇ／ＡｇＣｌ電極に対して＋４００から−４００ｍＶの間の電位をかけ ることを特徴とする方法。 １５．作用電極に電圧をかけることによって電気化学発光を生じさせることによ り水溶液中または水溶液に接する固相で電気化 学発光現象を測定する方法であって、該水溶液が酸化可能なアミンおよび電気化 学発光を生じることができる成分を含有し、この成分が粒子に結合しており、電 気化学発光系の酸化還元電位と＋８００ｍＶの間で電気化学発光を生じさせるこ とを特徴とする方法。 １６．測定ユニットおよび／または液体容器を０から２５℃までの温度に冷却す るための手段を有することを特徴とする、測定ユニット、および液体容器を含ん でなる、電気化学発光現象を測定するための装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 Ｐ４４０１５７７．１ (32)優先日 1994年１月20日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＮＯ，Ｕ Ｓ (72)発明者 ホイル，ニコラス ドイツ連邦共和国 ディー―82327 チュ ツィンク，ブラウハウスシュトラーセ 25 番地 (72)発明者 クレムト，ヴォルカー ドイツ連邦共和国 ディー―82362 ヴァ イルハイム，アム フィシャンガー ３番 地 (72)発明者 ミュラー，ギュンター ドイツ連邦共和国 ディー―82380 パイ ゼンベルグ，ヴイ．―ボーデンシュヴィン ―ヴェーク ６番地 (72)発明者 ノイマン，ウルリッヒ ドイツ連邦共和国 ディー―82362 ヴァ イルハイム，エスティー．―アンナーヴェ ーク ８番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．電気化学発光が、溶液の凝固点よりは高いが２５℃より低い、溶液および／ または固相の温度で測定されることを特徴とする、溶液または溶液に接する固相 において電気化学発光現象を測定するための方法。 ２．温度範囲が５℃から２０℃の間であることを特徴とする、請求項１記載の方 法。 ３．溶液が脂肪アルコールエトキシレート、プランタレン（Plantaren）および オクチルグルコシドまたはその混合物からなる一群から選択される界面活性剤を 含有することを特徴とする、請求項１記載の方法。 ４．溶液が１または複数のハロゲン化アルカリまたはアルカリ土類を含有するこ とを特徴とする請求項１記載の方法。 ５．溶液のｐＨが６．８から９．０の範囲であることを特徴とする、請求項１記 載の方法。 ６．電気化学発光が２．０Ｖの最大電圧をかけることによって生じることを特徴 とする、請求項１記載の方法。 ７．測定のために矩形波電圧を用いることを特徴とする、請求項１記載の方法。 ８．酸化されるときに強力な還元剤である電気化学的に酸化可能なアミンを含有 し、さらに０．１ｍｍｏｌ／ｌから０．５ｍｏｌ／ｌの濃度の塩化アルカリを含 有することを特徴とする、電気化学発光現象を測定するための試薬溶液。 ９．塩化アルカリが塩化ナトリウムであることを特徴とする、請求項８記載の試 薬。 １０．塩化物が０．０５ｍｏｌ／ｌから０．４５ｍｏｌ／ｌの濃度で存在するこ とを特徴とする、請求項８または９記載の試薬。 １１．電気化学的に酸化可能なアミンを含有し、その溶液のｐＨが７．０から８ ．０の間であることを特徴とする、電気化学現象を測定するための試薬溶液。 １２．溶液が、脂肪アルコールエトキシレート、プランタレンおよびオクチルグ ルコシドまたはその混合物からなる一群から選択される界面活性剤を含有するこ とを特徴とする、請求項８または１１記載の試薬溶液。 １３．電気化学発光を生じる前に、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極に比較して＋４００から −４００ｍＶの間の電位を作用電極にかけることを特徴とする、作用電極に電圧 をかけることによって電気化学発光を生じることにより電気化学発光現象を測定 するための方法。 １４．電気化学発光系の酸化還元電位と＋８００ｍＶの間で電気化学発光を生じ ることを特徴とする、作用電極に電圧をかけることによって電気化学発光を生じ ることにより電気化学発光現象を測定するための方法。 １５．測定ユニットおよび／または液体容器を０から２５℃までの温度に冷却す るための手段を有することを特徴とする、測定ユニット、および液体容器を含ん でなる、電気化学発光現象を測定するための装置。 １６．電気化学発光を測定するために請求項１−７のひとつに従う方法を使用す ることを特徴とする、電気化学発光標識によって被検体を検出するための方法。