CN1130563C - 免疫组织化学染色用组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

免疫组织化学染色用组合物，其特征在于它包括含有荧光性官能团结合抗体的诊断用标记物，和选自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物的表面活性剂的物质。该组合物具有良好的荧光强度，而且经紫外线激发不会引起活体组织或DNA的损伤，所以可用于活体免疫组织化学染色。比如可以使用红外线内窥镜等进行的食道癌、胃癌、或结肠癌等上皮组织恶性肿瘤准体内早期诊断、及外科手术时的病灶定位诊断成为有效而且安全的进行。

Description

免疫组织化学染色用组合物及其用途
免疫组织化学染色用组合物
本发明涉及免疫组织化学染色用组合物。详细来讲，本发明涉及包含对组织损害性小的、经近红外线或远红外线照射后能发出荧光的标记用化合物，能与特异的识别癌细胞等的抗体等结合的诊断用标记，并且荧光强度优良的免疫组织化学染色用组合物。
近年来，随着电子内窥镜的普及内窥镜诊断变得越来越容易，胃癌及结肠癌等癌症在早期阶段即可被发现。不过，在微小癌症的诊断方面，采用电子内窥镜与使用一般的内窥镜其诊断能力几乎相同。这与新的诊断方法还没有确立，尚无法充分发挥和利用电子内窥镜的机能有关。如果能发现一种能标记微小病变的标记抗体，使在一般内窥镜下无法辨别的微小病变，在电子内窥镜下能够检测出来，再经电子计算机的处理使之图象化，就可以使检测变得简易可行，但这种方法迄今还未实用化。
为了使上述使用电子内窥镜进行诊断的方法得以实现，有采用根据免疫组织化学染色法对活体组织进行直接染色。固定后标本的染色法已有非常成熟的技术。但是，未经固定的标本的染色法却没有现成的、可供同行利用的技术。例如，尽管目前已有有关未经固定标本的免疫染色法报道(四国医学杂志，29，180，1987)，但尚未见有关采用近红外线对新鲜切除标本或活体组织本身进行免疫染色的报道。
另一方面，对于上面描述的诊断方法，必须有在电子内窥镜下能够检测出来的诊断用标记物(标记化的抗体等)才行。我们知道目前已有这么一种诊断用标记物：它把具有经紫外线激发后、可发出紫外或可见荧光的标记用化合物结合到抗体上，这种诊断用标记物已被广泛地用于诊断从活体摘除的组织是否存在癌组织或癌细胞。但是采用这种由紫外线激发、具有荧光特性的诊断用标记物的方法，由于紫外线会导致活体组织和DNA的损伤，不适宜在活体使用。迄今还没有能够直接用于活体的诊断用标记物。
我们知道吲哚花青绿(ICG)在红外线内窥镜下，具有特异性吸收从而发出荧光。尽管已有在使用红外线内窥镜时，使用吲哚花青绿的报道(Gastroenterological Endoscopy，34，pp.2287-2296，1992；Gastrointestinal Endoscopy，40，pp.621-2；628，1994)，但有关这方面的工作均为血管内给ICG。而且，一般说来，象吲哚花青绿这类荧光性物质疏水溶性强，其单体在肠道内很快被吸收，我们尝试着在其母核或侧链部位导入一个亲水溶性的磺基以提高它的水溶性，从而使测定效率提高，并可避免吸收后的毒性问题(有关以上背景技术材料的综述，可以参考喜纳兼勇著“2.临床检查用(诊断用)色素”项pp.223-230、入江正浩主编“技能性色素的最新应用技术”、株式会社CMC发行、1996年)。
本发明者们，经过不断合成各种各样的吲哚花青绿衍生物，终于成功地生产出在近红外线乃至远红外线激发下即可产生荧光的吲哚花青绿衍生物，同时发现将上述吲哚花青绿衍生物用作标记用化合物，使之与抗癌抗原抗体发生反应，能制造出可直接在活体上使用的诊断用标记物，而且发现这种诊断用标记物对于采用免疫组织化学染色法直接用于活体的组织染色是很有用的。有关此项发明已做了专利申请(特愿平7-12283号)。
另外，本发明人，本着要提供具有良好水溶性的诊断用标记物为宗旨，进行了锐意研究，结果发现对于上述吲哚花青绿衍生物中能形成分子内偶离子(两性离子)的化合物，偶离子的形成，可使分子的离子性下降，进而使水溶性会受到损害对此让碘化钠等作用于该衍生物，使其分子内部无法形成偶离子，继续保持分子整体的离子特性，水溶性可显著增加。有关这方面的发明也做了专利申请(特愿平7-223613号)。
但是，对于使吲哚花青绿衍生物等具有荧光特性的标记用化合物和抗体结合得到的本诊断用标记物。做进一步的研究发现：这种诊断用标记物的荧光强度，与结合前吲哚花青绿衍生物(标记用化合物)自身的荧光强度相比较，大约衰减了十分之一。在应用上述诊断用标记物进行在体免疫组织化学染色、进行癌组织等微小组织检测时，如果采用与一般的荧光检测装置相比敏感度很高的装置来进行，则有可能避免这样的问题，但是高性能装置的开发和使用必须投入巨大的劳力和资金。另一方面，如果能提供一种特异地作用于将荧光性标识用化合物结合在抗体上得到的诊断用标记物，并使它的荧光强度增强的荧光强度增强剂，就有可能利用原本就有的检测装置对染色组织进行简便而准确的检测。
本发明的目的，是提供一种能作用于使吲哚花青绿衍生物等具有荧光特性的标记化合物和抗体结合。得到的诊断用标记物、并使其荧光强度增强的物质，另外提供一种，当在使用上述诊断用标记物进行活体内免疫组织化学染色时，能使其荧光强度显著增强的免疫组织化学染色用组合物。
本研究的发明者们，为了解决上述课题，进行了锲而不舍的努力，结果发现选自：二肉豆蔻酰基磷脂酸及二硬脂酰基磷脂酸等酰基甘油磷酸、二硬脂酰基磷脂酰胆碱等酰基甘油磷酸胆碱等甘油磷脂；硬脂酸等脂肪酸；及辛基糖苷等糖衍生物表面活性剂的物质，这些物质能使这种一让吲哚花青绿衍生物等具有荧光特性的标记用化合物和抗体结合得到的诊断用标记物荧光强度显著增强。另外，发现包含这些物质和诊断用标记物的组合物，作为能够直接用于活体免疫组织化学染色用的组合物是非常有实际价值的。而且发现在上述组合物中辛基糖苷等糖衍生物表面活性剂如果作为必须成分来使用的话，能够提供溶解性优良的稳定的组合物。本发明就是在这些见解的基础上完成的。
也就是说，本发明是提供一种免疫组织化学染色用的组合物，其特征在于包括含有结合了与荧光性官能团的抗体的诊断用标记物，及选自甘油磷脂、脂肪酸、糖衍生物等表面活性剂中选取出来的物质。根据本发明的最佳实施方式，可以提供甘油磷脂是酰基甘油磷酸的组合物；酰基甘油磷酸是包含2个C10-20脂肪酸残基的1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸的组合物；1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸是二肉豆蔻酰基磷脂酸或二硬脂酰基磷脂酸的组合物；甘油磷脂是酰基甘油磷酸胆碱的组合物；酰基甘油磷酸胆碱是包含2个C10-20脂肪酸残基的1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸胆碱的组合物；1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸胆碱是二硬脂酰基磷脂酰胆碱的组合物；以及该表面活性剂是辛基糖苷的组合物。
而且，按照本发明可以提供包含选自甘油磷脂及脂肪酸的物质和上述表面活性物质的上述组合物；该荧光性官能团是来源于吲哚花青绿衍生物的官能团的上述组合物；荧光性官能团是由吲哚花青绿-N-羟基硫代琥珀酰亚胺基酯衍变而来官能团的上述组合物；及抗体是抗癌抗原抗体的上述组合物。
进一步根据本发明的其它形式，可以提供包括结合了荧光性官能团的抗体的免疫组织化学染色用的诊断用标记物荧光强度增强剂，该荧光强度增强剂包括选自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性剂的物质；提供运用以包括含有结合了荧光性官能团的抗体的诊断用标记物和选自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性剂的物质在内的荧光强度增强剂为特点的组合物进行活体组织免疫组织化学染色的方法；以及，提供运用以包括含有荧光性官能团结合抗体在内的诊断用标记物和选自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性剂的物质在内的荧光强度增强剂为特点的组合物，从免疫组织化学角度进行癌症诊断的方法。
附图简述
图1是在普通光及红外线光的照射下，滴加了本发明组合物的木棉纱布类纤维组织通过显微镜拍摄下来的照片。图中、(a)表示用普通光进行拍照的结果、(b)表示用红外线进行拍照的结果。
图2表示对于结合ICG-sulfo-OSu的小鼠抗粘蛋白抗体、添加荧光强度增强剂肉豆蔻酰基磷脂酸及辛基糖苷前后的吸收光谱和荧光光谱的变化。图中、(c)为添加荧光强度增强剂前的吸收光谱；(c’)为添加荧光强度增强剂后，本发明的组合物的吸收光谱；(d)为添加荧光强度增强剂前的荧光光谱；及(d’)为添加荧光强度增强剂后，本发明的组合物的荧光光谱。
实施发明的最好方式
本发明的组合物是免疫组织化学染色用的组合物，其特征在于它包含含有荧光性官能团结合抗体的诊断用标记物和选自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性剂的物质。而且，作为本发明最佳实施方式的组合物，其特征在于它包含含有荧光性官能团结合抗体的诊断用标记物、选自甘油磷脂及脂肪酸的物质、及糖衍生物表面活性剂。
在本说明书，“甘油磷脂(glycerophospholipid)”是指以甘油为基本骨架的磷脂、具体点说就是以甘油磷酸(glycerol phosphate)为基本骨架磷脂。例如，1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸胆碱(磷脂酰胆碱)等的酰基甘油磷酸胆碱类；1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸乙醇胺(磷脂酰乙醇胺)等酰基甘油磷酸乙醇胺类；1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸-L-丝氨酸(磷脂酰丝氨酸)等的酰基甘油磷酸丝氨酸类；磷脂酰肌醇类；1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸(脂酸)等的酰基甘油磷酸类；及二磷脂酰甘油等都是甘油磷脂的代表化合物。
作为构成上述甘油磷脂的甘油磷酸，甘油1-磷酸、甘油2-磷酸和甘油3-磷酸的任何一种异构体均可，没有一定的立体构型的限制，但由天然型的sn-甘油3-磷酸(L-α-甘油磷酸)形成的甘油磷脂最适合使用(甘油3-磷酸用HOCH2-CH(OH)-CH2O-PO3H2表示)。在上述的甘油磷脂中，最适用于本发明组合物的是酰基甘油磷酸或酰基甘油磷酸胆碱。
在本说明书中“酰基甘油磷酸”是指，甘油磷酸的单脂肪酸酯或双脂肪酸酯，即用式：A1OCH2-CH(OA2)-CH2O-PO3H2(式中A1及A2各自独立地表示氢原子或脂肪酸残基的酰基，A1及A2并不同时表示氢原子)表示的化合物。在上式中，作为形成单价脂肪酸酯或双价脂肪酸酯的脂肪酸残基(从用A1OH和/或A2OH表示的脂肪酸中分别除去-OH表示的羟基以后剩下的基团)，可以使用碳原子数在8～22(C8-22)范围优选碳原子数在10～22(C10-20)范围的脂肪酸残基，例如：从碳原子数10、碳原子数12、碳原子数14、碳原子数16及碳原子数18的脂肪酸中产生的残基是最合适的。
象这种脂肪酸残基直链或支链均可、饱和或不饱和也均可。另外构成双脂肪酸酯的脂肪酸，相同及不同也均可。作为酰基甘油磷酸，最好能够使用sn-甘油3-磷酸的二硬脂酸酯(二硬脂酰基磷酯酸)或二肉豆蔻酰基酯(二肉豆蔻酸基磷脂酸)等。作为酰基甘油磷酸使用碱加成盐也可以。作为这种碱加成盐，可举出钠盐、钾盐等例子。其中，优选二硬脂酰磷脂酸或二肉豆蔻酰基磷脂酸的钠盐。
本说明书中“酰基甘油磷酸胆碱”，是指甘油磷酸胆碱的单脂肪酸酯或双脂肪酸酯，即可用下式表示的化合物：A3OCH2-CH(OA4)-CH2O-PO(OH-)OCH2CH2N4(CH3)3(式中A3及A4各自独立地表示氢原子或脂肪酸残基的酰基，A3及A4并不都同时表示氢原子)。在上面这个式子中，作为形成单脂肪酸酯或双脂肪酸酯的脂肪酸残基(从用A3OH和/或A4OH表示的脂肪酸中分别除去以-OH表示的羟基以后剩下的基团)，可以使用碳原子数在8～22(C8-22)范围优选碳原子数在10～22(C10-20)范围的脂肪酸残基，例如：从碳原子数10、碳原子数12、碳原子数14、碳原子数16及碳原子数18的脂肪酸中产生的残基是最合适的。象这种脂肪酸残基直链或支链均可、饱和或不饱和也均可。另外构成双价脂肪酸酯的脂肪酸，相同及不同均可。作为酰基甘油磷酸，最好能够使用sn-甘油3-磷酸胆碱的二硬脂酸酯(二硬脂酰基磷脂酰胆碱酸)等。
作为脂肪酸，可以使用碳原子数在8～22(C8-22)范围的脂肪酸，优选使用碳原子数在10～22(C10-20)范围的脂肪酸，例如：从碳原子数10、碳原子数12、碳原子数14、碳原子数16及碳原子数18的脂肪酸中产生的残基是最合适的。脂肪酸直链或支链均可、饱和或不饱和也均可。例如最好能够使用硬脂酸。作为糖衍生物表面活性剂，只要是既不让蛋白质发生实质性变性的物质，还对皮肤和粘膜等活体组织刺激性低的物质即可，并无特别的限定，比如可以使用辛基糖苷、庚基糖苷、辛基硫代糖苷、或庚基硫代糖苷等。
本发明的组合物，还可包括选自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性剂的一种或两种以上的物质的荧光增强剂。前面所述的糖衍生物尽管它本身就有荧光增强作用，但在选自甘油磷脂及脂肪酸的物质难溶于水的场合，此时最好是把它和选自甘油磷脂及脂肪酸的物质混合起来使用。因为通过前面所述的糖衍生物表面活性作用可使原本不溶于水的酰基甘油磷酸等物质变得可溶于水，使组合物的配制变得容易起来，而且制剂的稳定性也有显著改善。此外，通过把糖衍生物表面活性剂和选自甘油磷脂及脂肪酸的物质混合起来使用，还有望得到荧光强度协同增强的效果。例如包含辛基糖苷和二硬脂酰基磷脂酸的组合物、包含辛基糖苷和二蜂蜡基磷酸肌酸的组合物是本发明中最好的方式。
前面所述的荧光增强剂的含量不必特别限制，可以选择所使用的诊断用标记物的种类及激发光的种类等适当选择。此外，在把上述糖衍生物和选自甘油磷脂及脂肪酸的物质混合起来使用时，所选糖衍生物的适宜量，是以能使选自甘油磷脂及脂肪酸的物质溶化为标准。比如，最好是采用使糖衍生物成为临界胶束浓度附近(辛基糖苷约为25mM左右)的浓度。
作为包含在本发明组合物的诊断用标记物，是荧光性官能团结合抗体的诊断用标记物，只要是能够在免疫组织化学染色中使用的物质即可，并没有特别限定。例如，最好能够使用这种诊断用标记物，通过用600-800nm波长的激发光进行照射，能激发780nm以上、最好是780-840nm以上波长的荧光。其中，通过用近红外线乃至远红外线照射，就能够激发出波长在810nm以上、优选在820nm以上的荧光，象这种诊断用标记物，由于在进行诊断时不会引起活体组织和DNA的损伤，所以特别用于本发明的组合物。此外，最好能使用水溶性好的诊断用标记物。本发明的组合物可以包含一种或一种以上的诊断用标记物。
本说明书中“荧光性官能团”，是来源于荧光性标记用化合物的、具有荧光特性的部分构造，是指通过标记用化合物和抗体发生反应后结合在抗体上的那部分化学构造。作为为了使荧光性官能团结合到抗体上而使用的标记用化合物，能够使用如吲哚花青绿衍生物之类。作为优选的标记用化合物，可以使用如在Bioorganic & Medicinal ChemistryLetters，5(22)，pp.2689-2694，1995中记载的吲哚花青绿-N-羟基琥珀酰亚胺基酯(ICG-OSu)和吲哚花青绿-N-羟基硫代琥珀酰亚胺基酯(ICG-su1fo-OSu)等。如果使用这些标记用化合物，能够容易地使作为荧光性官能团的吲哚花青绿衍生物的整个母核构造导入到抗体上。
荧光性官能团既可以直接和抗体结合，荧光性官能团和抗体之间也可通过接头(リンカ-)或白蛋白等蛋白质结合。在白蛋白等蛋白质上，能导入一个或两个以上前面所述的荧光性官能团，好的时候能导入十个以上，而且抗体的导入也变得非常容易，因此使用了这种蛋白的诊断用标记物是优选的。
本发明组合物包含的诊断用标记物中，作为优选的诊断用标记物，能够例举出：
①含有(a)抗体和、(b)与该抗体结合的如式(I)所示的：
Figure C9719980800091
(分子式中，R1及R2各自独立地表示氢原子、烷基、芳基、烷氧基、或磺酸基；R3表示烷基、磺酸烷基或氨基取代的烷基；X表示需要时存在的阴离子材料；Y为碳原子数1乃至10的亚烷基、或含有氧原子、氮原子、及硫原子的一个以上原子的碳原子数在1至10之间的亚烷基)荧光性官能团的诊断用标记物；及
②含有(a)抗体和、(b)与该抗体结合的分子式如(II)所示的：
(分子式中，R4及R5各自独立地表示氢原子、烷基、烷氧基、或磺酸盐基；R6表示亚烷基；M+表示碱金属离子；Q-表示卤素离子、高氯酸离子、或硫氰酸离子；Y为碳原子数1到10的亚烷基、或含有从氧原子、氮原子、及硫原子中选取出来的一个以上原子的碳原子数在1至10之间的亚烷基)荧光性官能团的诊断用标记物。
用上述分子式(I)及(II)表示的荧光性官能团，是通过结合在母核上的-Y-CO-基的羰基与抗体结合的。上述分子式(I)中，R1及R2各自独立地表示氢原子、烷基、烷氧基、或磺酸基(-SO3H)。R1及R2，分别能够在到苯基上的任意位置取代。作为烷基，可以使用碳原子数在1至6范围的直链或支链低级烷基，最好是使用碳原子数在1至4范围的直链或低级支链烷基。例如：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等最为合适。
作为用R1及R2表示的芳基，可以使用取代或未取代的苯基、萘基、吡啶基等。作为烷氧基，可以使用碳原子数在1至6范围优选碳原子数在1至4范围的直链或支链低级烷氧基，具体说来，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基是最适合使用的。作为磺酸基，可以使用游离形态的-SO3H基、磺酸基的碱加成盐(磺酸盐基)，比如：钠盐、钾盐等。其中，R1及R2最好是分别表示氢原子、烷基、烷氧基、或磺酸盐基。
R3表示烷基、磺酸烷基或氨基取代的烷基。在这些基团当中，作为烷基，可以使用前面叙述的物质。磺酸烷基的磺酸基或氨基取代烷基的氨基，可以分别取代烷基上的任何部位，比如可以使用烷基末端取代的物质。
磺酸基及氨基，可以分别形成碱加成盐及酸加成盐。比如：磺酸可形成钠盐和钾盐、氨基可以形成卤化铵等盐，优选氨基形成季铵盐等。另外，作为氨基可以使用取代或未取代的氨基。作为磺酸烷基或氨基取代烷基的例子，可以例举磺酸甲基(-CH2SO3H)、磺酸乙基、氨甲基、氨乙基、甲氨乙基、及它们的盐。
在用式(I)表示的荧光性官能团中，X表示需要时存在的阴离子材料，例如卤素离子、醋酸根离子、高氯酸根离子、碳酸根离子等。用X表示的这些阴离子材料，可以抵消Y-CO-基取代的母核内氮原子所带的正电荷，以维持用式(I)表示的荧光性官能团整体为中性。因此，例如：当用式(I)表示的荧光性官能团中的R1、R2及R3三个基团中的某个基团为阴离子性基团时，这个基团的负电荷会抵消母核内季铵所携带的正电荷，由此形成分子内两性离子，此时就不需要X-了。另一方面，例如：R1或R2是磺酸基，R3是氨基取代烷基时，为了使这些基团之间电荷均衡，此时X又变得很有必要了。
在上述分子式(II)所表示的荧光性官能团中，R4和R5分别各自代表氢原子、烷基、烷氧基、或磺酸盐(スルホネ一ト)基。R4和R5能够分别取代苯基上的任意位置。作为烷基及烷氧基能够使用上述物质，作为磺酸盐基(-SO3 -M+：M+表示碱金属离子，和Q-的偶离子M+既可相同也可以不一样)，可以使用诸如磺酸钠基或磺酸钾基等。
R6表示直链或者支链的亚烷基，例如，碳原子数在1-6之间，优选碳原子数在2-5之间的直链或支链的低级亚烷基，优选使用三甲撑基、四甲撑基、或五甲撑基。取代R6的-SO3 -基，能够取代该亚烷基的任意位置，例如优选使用置换了亚烷基末端的物质。更加具体地说，作为R6-SO3，例如用-(CH2)k-SO3(k表示2-4的整数)表示的基团等是最合适的。
M+表示碱金属离子。作为碱性金属离子，优选使用钠离子或钾离子。Q表示卤素离子、高氯酸根离子、或硫氰酸根离子，优选使用氯离子、溴离子、或碘离子等。这当中，碘离子是最好的。不必拘泥于任何特定的理论，上述的荧光性官能团尽管有Y-CO-取代的氮原子所携带的正电荷(上式中用N+表示)和来自于R3-SO3的负电荷，若与用M+Q表示的碱金属盐共存的话，氮原子所携带的正电荷(上式中用N+表示)和Q之间、及R3-SO3和M+之间，分别形成离子键。其结果，阻止了分子内的偶离子形成，维持分子整体的离子特性，水溶性显著增大。
在上述分子式(I)和(II)中，Y为碳原子数1到10的直链或支链的烷基，优选碳原子数3-5的直链或支链的亚烷基，更优选三甲撑基、四甲撑基、或五甲撑基。另外，Y表示含有选自氧原子、氮原子、及硫原子的一个以上原子的碳原子数1-10的直链或支链烷基。作为用-Y-CO-表示的基团，例如：可以利用-CH2-CO-；-(CH2)2-CO-；-(CH2)3-CO-；-(CH2)4-CO-；-(CH2)5-CO-；-CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-；-(CH2)2-CO-NH-(CH2)5-CO-；-(CH2)3-CO-NH-(CH2)5-CO-；-(CH2)4-CO-NH-(CH2)5-CO-；-CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-NH-(CH2)2-CO-；-(CH2)4-CO-(N，N’-piperadinyl)-(CH2)2-CO(N，N’-piperadinyl，表示哌嗪的1-位被-(CH2)4-CO-基团取代，4-位被-(CH2)2-Z基团取代。以下与此相同。)；或-CH2-CO-NH-(CH2)5-CO-(N，N’-piperadinyl)-(CH2)2-CO-等。
另外，-Y-CO-基团的羰基，也可进一步通过碳原子数1-10的直链或支链的亚烷基；含有选自氧原子、氮原子、及硫原子的一个以上原子的碳原子数1-10的直链或支链亚烷基；或-NH-NH-基等与抗体结合。而且，上面所叙述的优选的诊断用标记物，在特愿平7-12283号说明书及特愿平7-223613号说明书中已做了详细的说明、其制造方法在说明书上也做了详细的记载，从事本行业的人如果遵照这些公开的说明，就可容易地制造出上面所叙述的优选的诊断用标记物。此外，促使用上述分子式(I)和(II)表示的荧光性官能团和抗体相结合的标记用化合物也同样在上述说明书中做了公开说明。而且，在用分子式(I)和(II)表示的荧光性官能团中，为了方便起见，把氮原子所携带的正电荷(上式中用N+表示)固定的写在母核内的一个氮原子上，其实通过共轭双键，正电荷有可能移动到另一个氮原子上去，这一点对从事本行业的人来说是很容易理解的。
作为构成诊断用标记物的抗体，能够利用识别各种抗原的、对癌特异性高的抗体。例如：能够应用与癌细胞和癌组织、最好是与早期癌细胞和早期癌组织特异性结合的抗癌抗原抗体，具体点说，可以使用与CEA、AFP、CA19-9、NSE、DU-PAN-2、CA50、Span-1、CA72-4、CA125、HCG、p53、STN(シフリルTn抗原)、c-erbB-2蛋白发生特异性反应、与胃有关的抗肿瘤抗体、抗粘蛋白抗体、抗糖链抗体等，及其它如与食道癌、大肠癌、直肠癌、皮肤癌、子宫癌等肿瘤抗原发生特异性反应的抗肿瘤抗体。而且，也可以使用在抗病原体蛋白抗体、抗癌抗原抗体上结合了抗生物素蛋白或生物素等增强反应体系的抗体等。不过，上面说明的抗体只是示范性的，诊断用标记物能够使用的抗体并不限于上面所例举到的，只要是与作为检查诊断目的的靶细胞和靶组织发生实质性特异性结合的抗体，均可应用。
构成诊断用标记物的抗体、因为可与癌抗原等发生特异性地结合，所以癌细胞和癌组织等病灶均可采用诊断用标记物进行免疫染色。然后，用红外线激光等进行近红外线甚至远红外线照射，根据发出的荧光可以确认病灶。因为本发明的组合物包含的荧光增强剂，它可使诊断用标记物的荧光强度增加数倍--数十倍，这样应用荧光测定装置，便能够轻易地把病灶确定下来。
本发明的组合物，一般提供水溶性组合物、或微粒子状粉末及冻结干燥粉等固体组合物。作为荧光增强剂最好使用包含糖衍生物和酰基甘油磷酸的水溶性组合物，例如：把辛基糖苷等表面活性剂根据需要溶解于生理盐水或磷酸缓冲生理盐水等水溶性介质后，加入二硬脂酰基磷脂酸的钠盐，在室温--约60℃范围，优选约50℃，更优选约40℃溶解，然后，加入溶解了诊断用标记物的生理盐水或磷酸缓冲生理盐水等水溶性介质，混合，配制而成。不过，本发明组合物的配制方法并不限于上面所例举到的，从事本工作的人毫无疑问可选择其它适宜的方法。把上面叙述到的水溶性组合物冻结干燥，使其成为冻结干燥粉末状的组合物，也可得到本发明的组合物。
另外，本发明的组合物可以把包括荧光增强剂的水溶液(例如：酰基甘油磷酸及需要时含有的表面活性剂的水溶液)及包含诊断用标记物的水溶液分别准备好，在诊断使用前将两液体混合调配好。而且，也可以采用下面的方法进行诊断：在给予包含诊断用标记物的水溶液后，再把包含荧光强度增强剂的水溶液通过别的途径再给予。
为了配制本发明的组合物，从药理学、制剂学角度考虑允许使用的添加物如下：赋形剂、崩解剂及其辅助剂、结合剂、润滑剂、包衣剂、色素、稀释剂、基质、溶解剂及其辅助剂、等渗剂、pH调节剂、稳定剂、抛射剂、及粘合剂等。比如：可以添加葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、淀粉、或结晶纤维素等赋形剂；羧甲基纤维素、淀粉、或羧甲基纤维素钙等崩解剂及其辅助剂；凡士林、液体石蜡、聚乙二醇、明胶、高岭土、甘油、纯水、或硬脂等基质；葡萄糖、氯化钠、D-甘露糖醇、甘油等渗剂；无机酸、有机酸、无机碱或有机碱等pH调节剂；维生素A、维生素E、辅酶Q等有助于稳定的药物制剂用添加物。
把本发明的免疫组织化学染色用组合物当作诊断药物使用的例子，拟结合使用红外线内窥镜进行检查的方法加以说明，对怀疑病灶存在的组织喷射或涂抹专供内窥镜使用的上述诊断药物(浓度范围为0.1-1000mg/ml)，使病变部位染色，适当清洗把多余的诊断药从组织中除去，用近红外线乃至远红外线，具体点说，用波长600-800nm范围、最好用波长768nm的光线，或用激光激发光等进行照射，就能把发出荧光的病灶部位给检出来。本发明的组合物可直接应用于活体，而且，具有荧光强度良好的特性，但本发明的组合物的使用范围并不限定于活体，对石蜡包埋的标本同样适合使用。
为了检出荧光，可以使用如红外线内窥镜或红外线显微镜等手段，可以使用具有透过特性的滤光器，具体点说，可把具有可以挡住激发光特性的滤光器和荧光检出用滤光器一或两片以上组合起来使用。用本发明的组合物进行活体内窥镜检查时，可使用放大率在10-1000范围的内窥镜，最好使用具有显微镜水平放大率的红外线内窥镜等。另外，内窥镜方面，还可设计喷射或涂抹本发明组合物的手段、及洗净手段。
需要使用本发明组合物对取出的活体组织及标本进行处理时，可以使用检出荧光的红外线显微镜。而且，在普通光下观察标本、确定染色部位后，在暗室内红外线光源下，或用红外线胶片进行摄影，也可以先将其记录在录象带等记录媒体上，然后用电子计算机进行图象分析。
实施例：
下面通过实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的范围并不限于以下的实施例。
实施例1
吲哚花青绿衍生物而使用ICG-sulfo-OSu(Biooraganic &Medicinal Chemistry Letters，5(22)，pp.2689-2694，1995)，参照该刊物记载的方法，配制了每分子小鼠抗CEA抗体可与16分子的ICG-sulfo-OSu结合的诊断用标记物。这种诊断用标记物冻干保存直到使用前。把这种诊断用标记物溶解在含37.5mM辛基糖苷的PBS-液中，测定吸收光谱和荧光光谱。结果，最大吸收波长为：802.8nm，摩尔吸光系数：3.90×105M-1.cm-1(狭缝宽度：0.2nm，对照：含37.5mM辛基糖苷的PBS-液，常温测定)；激发波长为：768nm，荧光波长为820nm(激发光侧狭缝宽度：5nm；荧光侧狭缝宽度：5nm)。
另一方面，往磷酸缓冲生理盐水(10ml，pH7.4)中静静地加入辛基糖苷(株式会社同仁化学研究所制，880mg)，在40℃水浴环境中边搅拌使其溶解。接着，往溶液中加入二硬脂酰基磷脂酸钠(148.8mg)，在60℃水浴环境中边搅拌使其溶解，加入磷酸缓冲生理盐水使其最终液量为20ml，降至室温后，分装成1ml的包装，冰冻保存，直到临用时。这种溶液的二硬脂酰基磷脂酸钠和辛基糖苷的终浓度分别为10mM和150mM。
在冻结干燥状态的上述诊断用标记物(54μg)中加入10％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)-磷酸缓冲生理盐水(20μl，pH7.4)溶解，这种溶液每5μl中加入上述加温的二硬脂酰基磷脂酸钠及辛基糖苷溶液5μl，用微吸量管缓慢地反复吹打，使之混匀，即可获得水状的本发明组合物。另外，使用吲哚花青绿(ICG)溶液、ICG-sulfo-OSu溶液、及水(对照)代替诊断用标记物溶液，通过同样的操作制得水溶性组合物。观察上述各种样品溶液(添加组)和未加含有二硬脂酰基磷脂酸钠及辛基糖苷的溶液的样品溶液(未添加组)，波长在800nm以上的荧光发光，以评价添加二硬脂酰基磷脂酸钠所引起的荧光强度的增加。发现在添加了二硬脂精磷酸肌酸钠溶液的诊断用标记物组，荧光强度显著增强。
而且，使用奥林帕司光学社制的BHSM-IR，这是一种从可见光到近红外线范围均可观察的红外线显微镜，在样品的下方配置激发光透过滤光器(朝日分光社制)，它能透过波长在710-790nm范围的光，在样品的上方配置激发光透过滤过器(朝日分光社制)，它能透过波长在810-920nm范围的光。CCD使用日立电子社制造的KP-MI，把经过CCD的荧光摄入列图象摄取装置(奥林帕司光学社制，EVIP-230)，经过增幅系统(奥林帕司光学社制)记录到图象记录装置(奥林帕司光学社制，S321S)内。
把上述样品各5μl滴到放在载玻片上的木棉纱布线(1cm)上，采用上述光学系统摄取普通光及红外线光照射下的图象。荧光强度按照下面的划分进行评价：图象上完全观察不到荧光者规定为(-)，可见到部分荧光者规定为(+)，荧光清晰可见者规定为(++++)，介于它们之间的再划分为(++)和(+++)两个级别。又通过前述机器，对记录下来的图象，进行包括原图像的累计处理、背景图像的累计处理、减算图像的制作、过滤图象的制作、及增强反差等系列图象处理，转换成最终图象。结果如下面的表1所示。添加了二硬脂酰基磷脂酸钠的诊断用标记物，荧光强度明显增强。表中浓度均表示ICG换算浓度。又，图1是采用上述光学系统，对滴加了本发明组合物的木棉纱布线进行普通光或红外线光照射而拍摄到的照片。图中(a)表示在普通光照射下的拍摄结果，(b)表示在红外线光照射下的拍摄结果。
                         表1
  被检材料         ICG换算浓度     非添加组  添加组
  ICG              1mg/ml          ++        ++100μg/ml10μg/ml1μg/mlICG-sulfo Osu    100μg/ml       ±                 ++10μg/ml        +         +1μg/ml                   -0.1μg/ml                 -ICG sulfo-Osu    120μg/ml       +         +++标记抗体         10μg/ml                  ++1μg/ml                   +0.1μg/ml       -         ±水                                -         -
+++：非常清晰可见
++：清晰可见
+：可见
±：隐约可见
实施例2
和实施例1一样，采用小鼠抗粘蛋白抗体(抗MUC-1：Yamamoto，M.，et al.，Japanese Journal of Cancer Research，87(5)，pp.488-496，1996)，配制了每分子抗体与16分子的ICG-sulfo-OSu结合的诊断用标记物。这种诊断用标记物一直冰冻干燥保存，直到临使用前。采用和实施例1同样的方法测定吸收光谱和荧光光谱，最大吸收波长为：802.8nm，摩尔吸光系数：3.90×105M-1.cm1(狭缝宽度：0.2nm，对照：含37.5mM辛基糖苷的PBS-液，常温测定)；激发波长为：768nm，荧光波长为820nm(激发光侧狭缝宽度：5nm；荧光侧狭缝宽度：5nm)。
又，采用小鼠抗硫代粘蛋白抗体(91.9H：Irimura，T.，etal.，Cancer Res.，51，pp.5728-5735，1991)，配制了每分子抗体与16分子的ICG-sulfo-OSu结合的诊断用标记物。这种诊断用标记物一直冰冻干燥保存，直到临使用前。采用和实施例1同样的方法测定吸收光谱和荧光光谱，最大吸收波长为：802.8nm，摩尔吸光系数：3.90×105M-1.cm1(狭缝宽度：0.2nm，对照：含37.5mM辛基糖苷的PBS液，常温测定)；激发波长为：768nm，荧光波长为820nm(激发光侧狭缝宽度：5nm；荧光侧狭缝宽度：5nm)。进而采用人抗CEA抗体、人抗粘蛋白抗体及人抗硫粘蛋白抗体，均配制成了每分子抗体与16分子的ICG-sulfo-OSu结合的诊断用标记物。给予这些诊断用标记物的分光学光谱数据，与各自对应的、由小鼠抗体配制成的诊断用标记物相同。
在从小鼠抗粘蛋白抗体得到的上述诊断用标记物的冻结干燥品100μg中加入4.0ml的磷酸缓冲生理盐水溶解，取这种液体1.5m1再加本发明的荧光增强剂溶液1.5ml，在50℃的水浴环境中加热，配制成最终的样品。作为对照配制了加1.5ml磷酸缓冲生理盐水的溶液。最终诊断用标记物的抗体浓度为83.3nM、ICG-sulfo-OSu的浓度为1.33μM。
使用日立分光光度计650-40测定各种样品的荧光光谱。激发光和荧光的缝隙均为5nm。将测定1ppm硫酸奎宁得到的荧光强度作为标准值，测定前68.0(λex＝255nm，λcm＝451nm)，测定后69.5(λex＝255nm，λcm＝451nm)。结果如表2所示。
                             表2
    组合物   荧光强度增强剂  激发波长(nm)  荧光波长(nm)  荧光强度(nm)
    1a      DSPA+OG         768           825(807)b    0.95(0.19)c2        DSPA+OG         768           825(807)      1.01(0.23)3a      OG              768           820(807)      0.92(0.20)4        OG              768           825(807)      0.96(0.25)5        DSPC+OG         768           825(807)      1.10(0.26)6        DMPA+OG         768           825(807)      1.20(0.29)7        SIAD+OG         768           825(807)      1.17(0.28)8(对照)  PBS             768           807(807)      0.25(0.24)
 OG：辛基糖苷(37.5mM)
 DSPA：二硬脂酰基磷脂酸(2.5mM)
 DSPC：二硬脂酰基磷脂酰胆碱(2.5mM)
 DMPA：二棕榈酰基磷脂酸(2.5mM)
 STAD：硬脂酸(2.5mM)
 PBS：磷酸缓冲生理盐水(对照)
 a：常温测定，其它组合物在50℃加热后马上测定
 b：括号内为荧光强度增强剂添加前的值
 c：括号内为荧光强度增强剂添加前的值
 另外，关于表中组合物6，添加荧光强度增强剂二肉豆蔻酰基磷脂酸和辛基糖苷前后的吸收光谱及荧光光谱的变化如图2所示。图中，(c)为荧光强度增强剂添加前、(c’)为荧光强度增强剂添加后的吸收光谱；(d)为荧光强度增强剂添加前、(d’)为荧光强度增强剂添加后的荧光光谱。包含荧光强度增强剂的本发明组合物，使吸收光谱和荧光光谱的强度显著增大，在荧光的发射光谱方面，最大荧光波长向长波长侧移位约18nm。
实施例3
为了探讨辛基糖苷的荧光强度增强作用和浓度之间的关系，将实施例2所制得的ICG-sulfo-OSu标记抗粘蛋白抗体的冻结干燥品400μg，加入到16ml的磷酸缓冲生理盐水中溶解，取这种溶液1.5ml再加各种浓度的辛基糖苷溶液1.5ml，在50℃衡温。最终的诊断用标记物中抗体浓度为83.3nM、ICG-sulfo-OSu的浓度为1.33μM。和实施例2一样测定样品的荧光光谱。激发光和荧光的狭缝均为2nm。将测定1ppm硫酸奎宁得到的荧光强度作为标准值，测定前100.0(λex＝251nm，λcm＝450nm)，测定后96.0(λex＝251nm，λcm＝450nm)。结果如表3所示。在辛基糖苷临界胶束浓度(25mM)附近，荧光强度急剧增加，在这以上的浓度可见到荧光强度平稳增加。随着荧光波长向长波长侧移位，在临界胶束浓度附近，可见到移位急剧增大。
                            表3
    OG浓度(mM)     荧光强度   激发波长(nm)    荧光波长(nm)
    0.0            0.153      768             8041.0            0.150      768             8065.0            0.150      768             80410.0           0.189      768             80920.0           0.436      768             81737.5           0.520      768             81750.0           0.515      768             82075.0           0.525      768             816100.0          0.600      768             816150            0.588      768             821
OG：辛基糖苷
产业上的应用
本发明的组合物对活体组织免疫染色有用，例如：对应用红外线内窥镜等进行准体内食道癌、胃癌、或大肠癌等上皮组织恶性新生物的早期诊断，和外科手术时的病灶定位、诊断有用。由于本发明的组合物具有荧光强度良好的特征，经紫外线激发不会对活体组织和DNA造成损伤，可应用普通的荧光检出装置直接对活体进行检查或诊断。特别是使用本发明的荧光强度增强剂后，荧光的峰波长向长波长侧移位，而且，由于在峰波长位置的吸收光强度显著增大，不受激发光的干涉使荧光观测变得更加容易，使包括荧光滤过器等在内的测定系统整体设计的容许度得到大幅度地改善，此为本发明的特征。

Claims (13)

1.免疫组织化学染色用组合物，其特征在于其含有包括源自吲哚花青绿衍生物的官能团结合抗体在内的诊断用标记物和选自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性剂的物质。
2.权利要求1的组合物，其中甘油磷脂是酰基甘油磷酸。
3.权利要求2的组合物，其中酰基甘油磷酸是包含2个C10-20脂肪酸残基的1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸。
4.权利要求3的组合物，其中1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸是二肉豆蔻酰基磷脂酸或二硬脂酰基磷脂酸。
5.权利要求1的组合物，其中甘油磷脂是酰基甘油磷酸胆碱。
6.权利要求5的组合物，其中酰基甘油磷酸胆碱是包含2个C10-20脂肪酸残基的1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸胆碱。
7.权利要求6的组合物，其中1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸胆碱是二硬脂酰基磷酸酯酰胆碱。
8.权利要求1的组合物，其中该表面活性剂是辛基糖苷。
9.权利要求1的组合物，其中荧光性官能团是源自吲哚花青绿-N-羟基硫代琥珀酰亚胺基酯的官能团。
10.权利要求1-9任一项的组合物，其中抗体是抗癌抗原抗体。
11.荧光强度增强剂，用于增强含有荧光性官能团结合抗体的免疫组织化学染色用的诊断用标记物的荧光强度增强，含有选自甘油磷脂、脂肪酸、及糖衍生物表面活性剂的物质。
12.权利要求1的组合物用于对癌细胞进行免疫组织化学染色的用途。
13.权利要求1的组合物用于对癌进行免疫组织化学诊断的用途。
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