DE69731654T2

DE69731654T2 - Zusammensetzung zur immunohistochemischen anfärbung

Info

Publication number: DE69731654T2
Application number: DE69731654T
Authority: DE
Inventors: Seiichi Chuo-ku SHIBAMURA; Susumu Tokushima-shi ITO; Kazuhiro Takesako; Tatsuro Setagaya-ku IRIMURA
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 1996-09-19
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2017-09-19
Also published as: AU719676B2; AU4318897A; CN1130563C; NO991317D0; ATE282827T1; EA002222B1; EP0935139A1; CA2266405A1; EP0935139B1; WO1998012560A1; NO991317L; CN1238042A; EA199900302A1; DE69731654D1; EP0935139A4; KR20000036240A

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Zusammensetzung zum immunhistochemischen Anfärben. Im speziellen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Zusammensetzung zum immunhistochemischen Anfärben, die eine ausgezeichnete Intensität der Fluoreszenzstrahlung aufweist, welche ein diagnostisches Markierungsmittel enthält, umfassend eine Markierungsverbindung, die durch Bestrahlung mit Strahlen aus dem nahen Infrarotbereich oder Strahlen aus dem fernen Infrarotbereich angeregt wird, welche selten Gewebeschaden verursacht und Fluoreszenzstrahlung emittiert und welche an einen Antikörper oder anderes, der spezifisch Tumorzellen und dergleichen erkennt, gebunden ist.
Stand der Technik
In den letzten Jahren ist die endoskopische Diagnose mit der Ausbreitung von elektronischen Endoskopen mühelos durchgeführt worden. Es wird möglich, zuverlässig Magenkrebs oder Dickdarmkrebs im Anfangsstadium zu entdecken. Jedoch, soweit die Diagnose von einem Mikrokarzinom betroffen ist, werden beinahe die gleichen diagnostischen Leistungsniveaus durch ein elektronisches Endoskop und ein normales Endoskop erreicht. Die Tatsache bedeutet, daß neue diagnostische Verfahren, bei denen elektronische Endoskope effizient funktionieren, bis jetzt noch nicht eingeführt worden sind. Falls Mikroläsione, wie zum Beispiel diejenigen, die durch ein normales Endoskop nicht erkennbar sind, mit einem Markierungsantikörper markiert werden können, der mit elektronischer Endoskopie nachweisbar ist, kann es möglich sein, Mikroläsione durch das Sichtbarmachen mittels eines Verfahrens, bei dem ein Rechner benutzt wird, leicht festzustellen. Jedoch ist solch ein Verfahren bis jetzt in der Praxis noch nicht entwickelt worden.
Um ein Verfahren einzuführen, das ein wie oben beschriebenes elektronisches Endoskop verwendet, ist es notwendig, das direkte Anfärben eines lebenden Gewebes durch ein immunhistochemisches Anfärbeverfahren durchzuführen. Verfahren zum Anfärben von fixierten Proben sind schon bestehende Arbeitsverfahren. Ein Verfahren zum Anfärben von nicht-fixierten Proben ist jedoch bis jetzt dem Fachmann nicht zur Verfügung gestanden. Zum Beispiel wurde von einem immunanfärbenden Verfahren für nicht-fixierte Proben berichtet [Shikoku Igaku Zasshi (Shikoku Medical Journal), 29, 180, 1987]; jedoch ist von keinem immunanfärbendem Verfahren berichtet worden, das Strahlung aus dem nahen Infrarotbereich verwendet, welche an einer herausgeschnittenen frischen Probe oder einem lebenden Gewebe, per se, angewendet wird.
Für das vorher erwähnte diagnostische Verfahren ist außerdem ein diagnostisches Markierungsmittel, das mit elektronischer Endoskopie nachweisbar ist, z. B. ein markierter Antikörper, ebenfalls erforderlich. Es sind diagnostische Markierungsmittel bekannt, bei denen ein Antikörper an eine Markierungsverbindung gebunden ist, die Fluoreszenzstrahlung als ultraviolettes und sichtbares Licht emittiert, sobald sie mit ultravioletten Strahlen angeregt wird. Die Markierungsmittel sind gewöhnlich für den Nachweis von Krebzellen oder Krebsgeweben, die in Geweben bestehen, die von lebenden Körpern isoliert wurden, verwendet worden. Jedoch können Verfahren, die fluoreszierende diagnostische Markierungsmittel verwenden, die Anregung mit ultravioletten Strahlen benötigen, nicht an lebenden Körpern angewendet werden, da ultraviolette Strahlen Schäden an lebenden Geweben und DNAs verursachen können. Bis jetzt ist kein diagnostisches Markierungsmittel bekannt gewesen, das direkt an einem lebenden Körper angewendet werden kann.
Es ist bekannt, daß Indocyaningrün (ICG) einzigartige Absorptionseigenschaften aufweist und Fluoreszenzstrahlung bei der Infrarotstrahlen-Endoskopie emittiert. Es wurde von klinischen Fällen berichtet, bei denen bei Verwendung eines Infrarotstrahlen-Endoskops Indocyaningrün eingesetzt wurde (Gastroenterological Endoscopy, 34, S. 2287–2296, 1992; und Gastrointestinal Endoscopy, 40, S. 621-2; 628, 1994). Jedoch wurde in diesen Fällen ICG intravasculär verabreicht. Weiterhin sind fluoreszierende Farbstoffe, die als ein typisches Beispiel Indocyaningrün einschließen, im allgemeinen stark hydrophob und werden schnell absorbiert, sobald sie, per se, in den Darmtrakt verabreicht werden. Aus diesem Grunde sind Versuche unternommen worden, ihre Wasserlöslichkeit durch das Einführen von hydrophilen Gruppen, z. B. einer Sulfonylgruppe, in Ringstrukturen oder Seitenkettenresten zu erhöhen, und dadurch die Messeffizienz zu verbessern und das Problem der Toxizität nach der Absorption zu eliminieren (als einen Übersichtsartikel für den oben beschriebenen Stand der Technik siehe zum Beispiel Kina K., Section 2: Dyes for Clinical Examination (Diagnosis), in „The Latest Applied Technology of Functional Dyes", herausgegeben von M. Irie, CMC Co. Ltd., 1996, und dergleichen).
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung waren durch die Synthese von verschiedenen Indocyaningrün-Derivaten erfolgreich beim Herstellen von Indocyaningrün-Derivaten, die Fluoreszenzstrahlung bei Anregung mit Strahlen aus dem nahen Infrarotbereich und Strahlen aus dem fernen Infrarotbereich emittieren. Sie stellten ebenfalls fest, daß ein diagnostisches Markierungsmittel, das direkt an lebenden Körpern anwendbar ist, durch das Umsetzen des vorher erwähnten Indocyaningrün-Derivats, als eine Markierungsverbindung, mit einem Anti-Krebs-Antigen-Antikörper und dergleichen, hergestellt werden kann, und daß das oben erwähnte diagnostische Markierungsmittel für ein direktes Anfärben eines lebenden Gewebes durch ein immunhistochemisches Anfärbeverfahren nützlich ist. Die Erfinder reichten eine Patentanmeldung ein, die auf diese Erfindungen gerichtet ist (Japanische Patentanmeldung No. Hei 7-12283/1995).
Außerdem führten die Erfinder ernsthaft Untersuchungen durch, um diagnostische Markierungsmittel, die eine ausgezeichnete Wasserlöslichkeit aufweisen, zur Verfügung zu stellen. Als Folge hiervon stellten sie fest, daß unter den vorher erwähnten Indocyaningrün-Derivaten, Verbindungen, die ein intramolekulares Ionenpaar (ein Zwitterion) bilden können, auf Grund der Abnahme der molekularen ionischen Eigenschaft nach der Bildung des intramolekularen Ionenpaares eine verminderte Wasserlöslichkeit aufweisen können, wohingegen diese Derivate kein intramolekulares Ionenpaar bilden, sobald sie mit Natriumiodid oder anderem behandelt werden, und die gesamten molekularen ionischen Eigenschaften erhalten bleiben und dadurch die Wasserlöslichkeiten bemerkenswert erhöht werden. Die Erfinder reichten ebenfalls eine Patentanmeldung, die auf diese Erfindungen gerichtet ist, ein (Japanische Patentanmeldung Nr. Hei 7-223613/1995).
Jedoch zeigten weitere Untersuchungen an diagnostischen Markierungsmitteln, die eine fluoreszierende Markierungsverbindung, wie zum Beispiel Indocyaningrün-Derivate, die an einen Antikörper gebunden sind, enthalten, daß die Intensität der Fluoreszenzstrahlung der diagnostischen Markierungsmittel auf etwa ein Zehntel von derjenigen der Indocyaningrün-Derivate (Verbindungen zum Markieren), per se, vor der Bindung verringert ist. Sobald immunhistochemisches Anfärben in vivo durch das Verwenden der vorher erwähnten diagnostischen Markierungsmittel durchgeführt wird, um Mikrogewebe, wie zum Beispiel Krebsgewebe, zu entdecken, kann das obige Problem wahrscheinlich durch das Verwenden eines Apparates für den Nachweis von Fluoreszenzstrahlung, der eine deutlich höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu derjenigen von normalen Apparaten aufweist, überwunden werden. Jedoch können die Entwicklung und der Betrieb von Apparaten, die eine hohe Leistung aufweisen, enorme Anstrengungen und wirtschaftliche Investitionen erfordern. Falls auf der anderen Seite ein Mittel für das Erhöhen der Intensität der Fluoreszenzstrahlung zur Verfügung gestellt wird, das spezifisch auf ein diagnostisches Markierungsmittel, umfassend eine fluoreszierende Markierungsverbindung, die an einen Antikörper gebunden ist, einwirkt, und die Intensität seiner Fluoreszenzstrahlung erhöht, können möglicherweise angefärbte Gewebe sicher und bequem durch das Verwenden eines momentan erhältlichen Apparates nachgewiesen werden.
Beschreibung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Substanz zur Verfügung zu stellen, die auf ein diagnostisches Markierungsmittel, umfassend eine fluoreszierende Markierungsverbindung, wie zum Beispiel Indocyaningrün-Derivate, die an einen Antikörper gebunden sind, einwirkt, und die Intensität seiner Fluoreszenzstrahlung erhöht.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung zum immunhistochemischen Anfärben zur Verfügung zu stellen, die eine bemerkenswert erhöhte Intensität der Fluoreszenzstrahlung aufweist, um das vorher erwähnte diagnostische Markierungsmittel zum immunhistochemischen Anfärben in lebenden Körpern, wie durch die beigefügten Ansprüche definiert, zu verwenden.
Um die obigen Aufgaben zu bewerkstelligen, unternahmen die Erfinder der vorliegenden Erfindung verschiedene Anstrengungen, und als Folge hiervon stellten sie fest, daß eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycerophospholipiden, zum Beispiel Acylglycerinphosphate, wie zum Beispiel Dimyristoylphosphatidsäure und Distearoylphosphatidsäure, Acylglycerinphosphocholin, wie zum Beispiel Distearoylphosphatidylcholin und dergleichen; Fettsäuren, wie zum Beispiel Stearinsäure; und oberflächenaktive Substanzen bestehend aus Saccharid-Derivaten, wie zum Beispiel Octylglucosid, die Intensität der Fluoreszenzstrahlung von diagnostischen Markierungsmitteln, die eine fluoreszierende Markierungsverbindung, wie zum Beispiel Indocyaningrün-Derivate, die an einen Antikörper gebunden sind, enthalten, bemerkenswert erhöhen können. Sie stellten ebenfalls fest, daß eine Zusammensetzung, die solch eine Substanz und das diagnostische Markierungsmittel enthält, außerordentlich nützlich als eine Zusammensetzung für das an lebenden Körpern anwendbare immunhistochemische Anfärben ist, und eine stabile Zusammensetzung, die eine außergewöhnliche Löslichkeit aufweist, kann durch das Verwenden einer oberflächenaktiven Substanz bestehend aus einem Saccharid-Derivat, wie zum Beispiel Octylglucosid, als eine wesentliche Komponente in der vorher erwähnten Zusammensetzung, zur Verfügung gestellt werden. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Feststellungen fertiggestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt so eine Zusammensetzung zum immunhistochemischen Anfärben zur Verfügung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die besagte Zusammensetzung ein diagnostisches Markierungsmittel, das einen Antikörper umfasst, der an eine fluoreszierende funktionelle Gruppe gebunden ist, die von einem Indocyaningrün-Derivat abgeleitet ist, zusammen mit einer oberflächenaktiven Substanz bestehend aus einem Saccharid-Derivat, das aus Octylglucosid, Heptylglucosid, Octylthioglucosid oder Heptylthioglucosid ausgewählt ist, enthält. Entsprechend den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthält die Zusammensetzung zusätzlich ein Glycerophospholipid oder eine Fettsäure, wobei das Glycerophospholipid ein Acylglycerinphosphat ist; die obige Zusammensetzung, wobei das Acylglycerinphosphat ein 1,2-Diacyl-sn-glycerin-3-phosphat, das zwei C_10-20 Fettsäurereste enthält, ist; die obige Zusammensetzung, wobei das 1,2-Diacyl-sn-glycerin-3-phosphat Dimyristoylphosphatidsäure oder Distearoylphosphatidsäure ist; die obige Zusammensetzung, wobei das Glycerophospholipid ein Acylglycerinphosphocholin ist; die obige Zusammensetzung, wobei das Acylglycerinphosphocholin ein 1,2-Diacyl-sn-glycerin-3-phosphocholin ist, das zwei C_10-20 Fettsäurereste enthält; die obige Zusammensetzung, wobei das 1,2-Diacyl-sn-glycerin-3-phosphocholin ein Distearoylphosphatidylcholin ist; und die obige Zusammensetzung, wobei die oberflächenaktive Substanz Octylglucosid ist.
Es wird entsprechend der vorliegenden Erfindung weiterhin die obige Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, wobei die fluoreszierende funktionelle Gruppe eine funktionelle Gruppe, die von dem Indocyaningrün-N-hydroxysulfosuccinimidester abgeleitet ist, darstellt; und die obige Zusammensetzung, wobei der Antikörper einen Anti-Krebs-Antigen-Antikörper darstellt.
Es wird weiterhin entsprechend einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für das immunhistochemische Anfärben eines lebenden Gewebes durch das Verwenden einer Zusammensetzung entsprechend den Ansprüchen 1–11, und ein Verfahren für das immunhistochemische Diagnostizieren eines Tumors durch das Verwenden einer Zusammensetzung entsprechend den Ansprüchen 1–11, zur Verfügung gestellt.
Kurze Erklärung der Zeichnungen
1 zeigt Photographien von Fasergeweben einer Baumwollgazefaser, betröpfelt mit einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, aufgenommen unter einem Mikroskop mit normalem Licht und Infrarot-Bestrahlung. In der Figur zeigt (a) das Ergebnis, das unter normalem Licht erhalten wurde, und (b) zeigt das Ergebnis, das unter Infrarot-Bestrahlung erhalten wurde.
2 zeigt Änderungen der Absorptions- und Fluoreszenzspektren bevor und nachdem Dimyristoylphosphatidsäure und Octylglucosid als das Mittel für das Erhöhen der Intensität der Fluoreszenzstrahlung zu dem Anti-Mucin-Antikörper der Maus, der an ICG-sulfo-OSu gebunden ist, dazugegeben wurde. In der Figur zeigt (c) das Absorptionsspektrum vor der Zugabe des Mittels für das Erhöhen der Intensität der Fluoreszenzstrahlung; (c') zeigt das Absorptionsspektrum der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung nach der Zugabe des Mittels für das Erhöhen der Intensität der Fluoreszenzstrahlung; (d) zeigt das Fluoreszenzspektrum vor der Zugabe des Mittels für das Erhöhen der Intensität der Fluoreszenzstrahlung; und (d') zeigt das Fluoreszenzspektrum der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung nach der Zugabe des Mittels für das Erhöhen der Intensität der Fluoreszenzstrahlung.
Beste Durchführungsweise der Erfindung
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird zum immunhistochemischen Anfärben verwendet, und ist dadurch gekennzeichnet, daß sie ein diagnostisches Markierungsmittel, umfassend einen Antikörper, der mit einer von einem Derivat des Indocyaningrüns abgeleiteten fluoreszierenden funktionellen Gruppe verbunden ist, zusammen mit einer oberflächenaktiven Substanz bestehend aus einem Saccharid-Derivat ausgewählt aus Octylglucosid, Heptylglucosid, Octylthioglucosid oder Heptylthioglucosid, enthält. Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycerophospholipiden und Fettsäuren enthält.
Wie hierin benutzt, bedeutet der Ausdruck „Glycerophospholipid" ein Phospholipid, das Glycerin als eine Grundstruktur enthält, und im speziellen bedeutet es ein Phospholipid, das Glycerinphosphat (ebenfalls bezeichnet als Glycerophosphat) enthält. Typische Beispiele der Glycerophospholipide schließen zum Beispiel Acylglycerinphosphocholine, wie zum Beispiel 1,2-Diacyl-sn-glycerin-3-phosphocholin (phosphatidylcholin); Acylglycerinphosphoethanolamine, wie zum Beispiel 1,2-Diacyl-sn-glycerin-3-phosphoethanolamin (phosphatidylethanolamin); Acylglycerinphosphoserine, wie zum Beispiel 1,2-Diacyl-sn-glycerin-3-phospho-L-serin (phosphatidylserin); Phosphatidylinisotole; Acylglycerinphosphate, wie zum Beispiel 1,2-Diacyl-sn-glycerin-3-phosphat (phosphatidsäure); Diphospatidylglycerin und dergleichen ein.
Die Glycerinphosphate, die das oben erwähnte Glycerophospholipid bilden, können irgendeines der Isomere davon sein, z. B. Glycerin-1-phosphat, Glycerin-2-phosphat und Glycerin-3-phosphat. Obwohl ihre Stereochemie nicht besonders eingeschränkt ist, können vorzugsweise Glycerophospholipide, die natürlich vorkommende sn-Glycerin-3-phosphate (L-α-Glycerinphosphat) umfassen, verwendet werden (Glycerin-3-phosphat wird durch die Formel HOCH₂-CH(OH)-CH₂O-PO₃H₂ dargestellt). Unter den oben erwähnten Glycerophospholipiden sind Acylglycerinphosphate und Acylglycerinphosphocholine diejenigen, die vorzugsweise in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Wie hierin benutzt, bezeichnet der Ausdruck „Acylglycerinphosphat" einen Monofettsäureester oder einen Difettsäureester von Glycerinphosphat, z. B. eine Verbindung, dargestellt durch die folgende Formel: A¹OCH₂-CH(OA²)-CH₂O-PO₃H₂, wobei A¹ und A² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe als einen Fettsäurerest darstellen, vorausgesetzt daß A¹ und A² nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen. In der obigen Formel kann der Fettsäurerest, z. B. eine Gruppe, gebildet durch das Entfernen einer Hydroxygruppe, dargestellt als -OH, von Fettsäuren, dargestellt als A¹OH und/oder A²OH, der die obigen Monofettsäureester oder Difettsäureester bildet, ein Fettsäurerest sein, der etwa 8–22 Kohlenstoffatome (C_8-22), vorzugsweise etwa 10–20 Kohlenstoffatome (C_10-20) aufweist. Zum Beispiel werden Reste, die von einer Fettsäure mit 10, 12, 14, 16 oder 18 Kohlenstoffatomen abgeleitet sind, vorzugsweise verwendet.
Diese Fettsäurereste können unverzweigt oder verzweigt sein, und sie können gesättigt oder ungesättigt sein. Die Fettsäurereste, die die Difettsäureester bilden, können die gleichen Reste oder verschiedene Reste sein. Als das Acylglycerinphosphat können geeigneterweise Distearoylester von sn-Glycerin-3-phosphat (Distearoylphosphatidsäure), Dimyristoylester von sn-Glycerin-3-phosphat (Dimyristoylphosphatidsäure) und dergleichen verwendet werden. Das Acylglycerinphosphat kann als ein Alkalisalz verwendet werden. Beispiele für solch ein Alkalisalz schließen zum Beispiel Natriumsalze und Kaliumsalze ein. Unter ihnen werden Natriumsalze der Distearoylphosphatidsäure und der Dimyristoylphosphatidsäure bevorzugt.
Wie hierin benutzt, bezeichnet der Ausdruck „Acylglycerinphosphocholin" einen Monofettsäureester oder einen Difettsäureester von Glycerinphosphocholin, z. B. eine Verbindung, dargestellt durch die folgende Formel: A³OCH₂-CH(OA⁴)-CH₂O-PO(OH^–)OCH₂CH₂N⁺(CH₃)₃, wobei A³ und A⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe als einen Fettsäurerest darstellen, vorausgesetzt, daß A³ und A⁴ nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen. In der obigen Formel kann der Fettsäurerest, z. B. eine Gruppe, gebildet durch das Entfernen einer Hydroxygruppe, dargestellt als -OH, von Fettsäuren, dargestellt als A³OH und/oder A⁴OH, der den obigen Monofettsäureester oder Difettsäureester bildet, ein Fettsäurerest sein, der etwa 8–22 Kohlenstoffatome (C_8-22), vorzugsweise etwa 10–20 Kohlenstoffatome (C_10-20) aufweist. Zum Beispiel werden Reste, die von einer Fettsäure mit 10, 12, 14, 16 oder 18 Kohlenstoffatomen abgeleitet sind, vorzugsweise verwendet. Diese Fettsäurereste können unverzweigt oder verzweigt sein, und sie können gesättigt oder ungesättigt sein. Die Fettsäurereste, die die Difettsäureester bilden, können die gleichen Reste oder verschiedene Reste sein. Als das Acylglycerinphosphat können geeigneterweise Distearoylester von sn-Glycerin-3-phosphocholin (Distearoylphosphatidylcholsäure) und dergleichen verwendet werden.
Als die Fettsäure können zum Beispiel Fettsäuren mit etwa 8–22 Kohlenstoffatomen (C_8-22), vorzugsweise mit etwa 10–20 Kohlenstoffatomen (C_10-20), verwendet werden. Zum Beispiel werden Fettsäuren mit 10, 12, 14, 16 oder 18 Kohlenstoffatomen bevorzugt. Diese Fettsäuren können unverzweigt oder verzweigt sein, und sie können gesättigt oder ungesättigt sein. Zum Beispiel kann geeigneterweise Stearinsäure und dergleichen verwendet werden. Die oberflächenaktive Substanz, die ein Saccharid-Derivat darstellt, ist nicht besonders eingeschränkt, solange sie zu keiner wesentlichen Denaturierung von Proteinen führt, und eine geringe Stimulation gegen lebende Gewebe, wie zum Beispiel Häuten und Schleimhäuten, aufweist. Zum Beispiel können Octylglucosid, Heptylglucosid, Octylthioglucosid, Heptylthioglucosid verwendet werden.
Die oben erwähnten Saccharid-Derivate weisen, per se, eine die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhende Wirkung auf; jedoch können die Saccharid-Derivate bevorzugt in Kombination mit einer Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycerophospholipiden und Fettsäuren verwendet werden, wenn die aus der Gruppe bestehend aus Glycerophospholipiden und Fettsäuren ausgewählte Substanz in Wasser schwach löslich ist. Eine wasserunlösliche Substanz, wie zum Beispiel Acylglycerinphosphat, kann durch die Hilfe der oberflächenaktivierenden Eigenschaft des Saccharid-Derivates in Wasser löslich gemacht werden, was manchmal die Herstellung der Zusammensetzung erleichtert und die Stabilität des Produktes bemerkenswert verbessert. Ein synergistischer, die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhender Effekt kann ebenfalls bei Verwendung eines Saccharid-Derivates und einer Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycerophospholipiden und Fettsäuren erwartet werden. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind zum Beispiel eine Zusammensetzung, die Octylglucosid und Distearoylphosphatidsäure enthält, und eine Zusammensetzung, die Octylglucosid und Dimyristoylphosphatidsäure enthält.
Die Menge des Gehalts des vorher erwähnten, die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhenden Mittels ist nicht besonders eingeschränkt, und die Menge kann in Abhängigkeit des Typs des benutzten diagnostischen Markierungsmittels, des Typs des Anregungslichtes und anderem passend gewählt werden. Sobald das vorher erwähnte Saccharid-Derivat und eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycerophospholipiden und Fettsäuren in Kombination verwendet werden, kann das Saccharid-Derivat in einer Menge, die für das Auflösen der Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycerophospholipiden und Fettsäuren geeignet ist, verwendet werden. Manchmal kann zum Beispiel die Verwendung des Saccharid-Derivates bei einer Konzentration nahe der kritischen Micellenkonzentration (etwa 25 mM für Octylglucosid) bevorzugt werden.
Das in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthaltene diagnostische Markierungsmittel ist nicht besonders eingeschränkt, insofern, daß das Markierungsmittel einen Antikörper, der mit einer fluoreszierenden funktionellen Gruppe verbunden ist, umfasst und für das immunhistochemische Anfärben verwendet werden kann. Zum Beispiel können vorzugsweise diagnostische Markierungsmittel verwendet werden, die Fluoreszenzstrahlung mit einer Wellenlänge von 780 nm oder mehr, vorzugsweise 780–840 nm oder mehr, emittieren, sobald sie mit einem Anregungslicht mit einer Wellenlänge von 600–800 nm bestrahlt werden. Unter diesen werden jene Markierungsmittel für die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt verwendet, die durch Strahlen aus dem nahen Infrarotbereich und Strahlen aus dem fernen Infrarotbereich angeregt werden können, und Fluoreszenzstrahlung von 810 nm oder mehr, vorzugsweise 820 nm oder mehr, emittieren, da solche Markierungsmittel während der Diagnose keine lebenden Gewebe und DNAs schädigen werden. Vorzugsweise werden ebenfalls hoch wasserlösliche Diagnose-Markierungsmittel verwendet. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann ein Diagnose-Markierungsmittel oder mehrere Diagnose-Markierungsmittel enthalten.
Wie hierin benutzt, bezeichnet der Ausdruck „fluoreszierende funktionelle Gruppe" eine chemische Struktur, die eine fluoreszierende Teilstruktur, abgeleitet von einer fluoreszierenden Markierungsverbindung, darstellt und durch eine Reaktion zwischen einem Antikörper und der Markierungsverbindung an den Antikörper bindet. Als die Markierungsverbindung, die für das Binden einer fluoreszierenden funktionellen Gruppe an einen Antikörper benutzt wird, können zum Beispiel Indocyaningrün-Derivate verwendet werden. Als bevorzugte Markierungsverbindungen können zum Beispiel Indocyaningrün-N-hydroxysuccinimidester (ICG-OSu), Indocyaningrün-N-hydroxysulfosuccinimidester (ICG-sulfo-OSu), die in Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 5(22), S. 2689–2694, 1995 beschrieben sind, und andere verwendet werden. Durch das Verwenden dieser Markierungsverbindungen kann als eine fluoreszierende funktionelle Gruppe die gesamte Ringstruktur der Indocyaningrün-Derivate leicht mit einem Antikörper verbunden werden.
Die fluoreszierende funktionelle Gruppe und der Antikörper können direkt aneinander gebunden sein, oder können alternativ mittels eines Linkers oder eines Proteins, wie zum Beispiel Albumin, verbunden sein. Eine fluoreszierende funktionelle Gruppe oder mehrere fluoreszierende funktionelle Gruppen, vorzugsweise etwa 10 oder mehr der vorher erwähnten fluoreszierenden funktionellen Gruppen, können an ein Protein, wie zum Beispiel Albumin, gebunden sein. Weiterhin kann auch ein Antikörper leicht eingeführt werden. Diagnostische Markierungsmittel, die solch ein Protein benutzen, sind bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Unter den diagnostischen Markierungsmitteln, die in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten sein können, umfassen bevorzugte diagnostische Markierungsmittel:

(1) Diagnostische Markierungsmittel, die (a) einen Antikörper und (b) eine fluoreszierende funktionelle Gruppe, die an den Antikörper gebunden ist, umfassen und durch die folgende Formel (I) dargestellt werden:
wobei R¹ und R² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, eine Arylgruppe, eine Alkoxygruppe oder eine Sulfonsäuregruppe darstellen; R³ eine Alkylgruppe, eine Sulfonsäure-Alkylgruppe oder eine aminosubstituierte Alkylgruppe darstellt; X^–, falls erforderlich, eine Anion-Spezies darstellt; Y eine C₁-C₁₀ Alkengruppe oder eine C₁-C₁₀ Alkengruppe, die ein Atom oder mehrere Atome ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoffatom, Stickstoffatom und Schwefelatom enthält, darstellt; und
(2) diagnostische Markierungsmittel, die (a) einen Antikörper und (b) eine fluoreszierende funktionelle Gruppe, die an den Antikörper gebunden ist, umfassen und durch die folgende Formel (II) dargestellt werden:
wobei R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe oder eine Sulfonatgruppe darstellen; R⁶ eine Alkengruppe darstellt; M⁺ ein Alkali-Metallion darstellt; Q^– ein Halogen-Ion, ein Perchlorat-Ion oder ein Thiocyanat-Ion darstellt; Y eine C₁-C₁₀ Alkengruppe oder eine C₁-C₁₀ Alkengruppe, die ein Atom oder mehrere Atome ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoffatom, Stickstoffatom und Schwefelatom enthält, darstellt.

Die fluoreszierende funktionelle Gruppe, dargestellt durch die obigen Formeln (I) oder (II), bindet mittels der Carbonylgruppe der -Y-CO-Gruppe, die mit der Ringstruktur verbunden ist, an einen Antikörper. In der obigen Formel (I) stellen R¹ und R² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe oder eine Sulfonsäuregruppe (-SO₃H) dar. Jedes R¹ und R² kann an jeder Position der Phenylgruppe Substituent sein. Als die Alkylgruppe kann eine unverzweigte oder verzweigte niedere Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ein unverzweigtes oder verzweigtes niederes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, verwendet werden. Zum Beispiel werden eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine Propylgruppe, eine Isopropylgruppe, eine n-Butylgruppe, eine sec.-Butylgruppe, eine tert.-Butylgruppe und dergleichen bevorzugt.
Als die Arylgruppe, dargestellt durch R¹ und R², können eine Phenylgruppe, eine Napthylgruppe, eine Pyridylgruppe und dergleichen, die substituiert oder nicht-substituiert sind, verwendet werden. Als die Alkoxygruppe können eine unverzweigte oder verzweigte niedere Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise solche mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, verwendet werden. Im speziellen werden vorzugsweise eine Methoxygruppe, eine Ethoxygruppe, eine Propoxygruppe, eine Isopropoxygruppe, eine n-Butoxygruppe, eine sec.-Butoxygruppe, eine tert.-Butoxygruppe und dergleichen verwendet. Als die Sulfonsäuregruppen können eine -SO₃H Gruppe als die freie Form oder Sulfonsäuregruppen in der Form von basischen Salzen (Sulfonatgruppen), wie zum Beispiel Natriumsalz und Kaliumsalz, verwendet werden. Unter diesen werden solche, bei denen R¹ und R² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe oder eine Sulfonatgruppe darstellen, bevorzugt.
R³ stellt eine Alkylgruppe, eine Sulfonsäure-Alkylgruppe oder eine aminosubstituierte Alkylgruppe dar. Als die Alkylgruppe in diesen Gruppen können zum Beispiel jene, die oben erwähnt sind, verwendet werden. Eine Sulfonsäuregruppe der Sulfonsäure-Alkylgruppe oder eine Aminogruppe der aminosubstituierten Alkylgruppe können an jeder Position einer Alkylgruppe Substituent sein. Zum Beispiel können vorzugsweise jene, bei denen eine Alkylgruppe endständig substituiert ist, verwendet werden.
Die Sulfonsäuregruppe und die Aminogruppe können unabhängig voneinander oder miteinander Salze bilden. Zum Beispiel werden solche, bei denen die Sulfonsäuregruppen Natriumsalze oder Kaliumsalze bilden, solche, bei denen die Aminogruppen Salze, wie zum Beispiel Ammoniumhalogenide bilden, oder solche, bei denen die Aminogruppen quaternäre Amine bilden, bevorzugt. Außerdem können substituierte oder nicht-substituierte Aminogruppen als die Aminogruppe verwendet werden. Beispiele für die Sulfonsäure-Alkylgruppe und die aminosubstituierte Alkylgruppe schließen eine Sulfonsäure-Methylgruppe (-CH₂SO₃H), eine Sulfonsäure-Ethylgruppe, eine Aminomethylgruppe, eine Aminoethylgruppe, eine Methylaminoethylgruppe und Salze davon ein.
In der fluoreszierenden funktionellen Gruppe, dargestellt durch die Formel (I), stellt, falls erforderlich, X^– eine Anion-Spezies, wie zum Beispiel ein Halogen-Ion, ein Acetat-Ion, ein Perchlorat-Ion und ein Carbonat-Ion, dar. Die Anion-Spezies, dargestellt durch X^–, bewirkt, daß die positive Ladung auf dem Ring-Stickstoffatom, das mit einer Y-CO-Gruppe substituiert ist, ausgeglichen wird, so daß die fluoreszierende funktionelle Gruppe, dargestellt durch die Formel (I), als ganzes neutral erhalten bleibt. Deshalb ist, wenn eine der Gruppen R¹, R² und R³ in der fluoreszierenden funktionellen Gruppe, dargestellt durch die Formel (I), beispielsweise eine anionische Gruppe ist, X^– manchmal nicht erforderlich, da die negative Ladung der Gruppe die positive Ladung auf dem quaternären Stickstoffatom der Ringstruktur ausgleicht, um so ein intramolekulares Zwitterion zu bilden. Wenn auf der anderen Seite irgendein R¹ und R² eine Sulfonsäuregruppe ist, und R³ eine aminosubstituierte Alkylgruppe ist, können Ladungen zwischen diesen Gruppen ausgeglichen werden, und folglich kann X-manchmal nicht erforderlich sein.
In der fluoreszierenden funktionellen Gruppe, dargestellt durch die obige Formel (II), stellen R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe oder eine Sulfonatgruppe dar. Jedes R⁴ und R⁵ kann an jeder Position der Phenylgruppe Substituent sein. Als die Alkylgruppe und die Alkoxygruppe können solche, die oben erwähnt wurden, verwendet werden. Die Sulfonatgruppe (-SO₃ ^–M⁺, wobei M⁺ ein Alkalimetall-Ion darstellt, das das gleiche M⁺ oder ein anderes als das M⁺ des Gegenions für Q^– sein kann) kann zum Beispiel eine Natriumsulfonatgruppe oder eine Kaliumsulfonatgruppe sein.
R⁶ stellt eine unverzweigte oder verzweigte Alkengruppe dar. Zum Beispiel kann eine unverzweigte oder verzweigte niedere Alkengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise eine solche mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, und insbesondere bevorzugt eine Trimethylengruppe, eine Tetramethylengruppe oder eine Pentamethylengruppe verwendet werden. Die -SO₃ ^– Gruppe, die ein Substituent von R⁶ ist, kann an jeder Position der Alkengruppe an diese binden. Zum Beispiel können vorzugsweise solche, bei denen eine Alkengruppe endständig substituiert ist, verwendet werden. Im speziellen wird eine Gruppe, dargestellt durch -(CH₂)_k-SO₃ ^–, wobei k eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist, und dergleichen als R⁶-SO₃ ^– bevorzugt.
M⁺ stellt ein Alkalimetall-Ion dar. Als das Alkalimetall-Ion kann vorzugsweise ein Natrium-Ion oder ein Kalium-Ion verwendet werden. Q^– stellt ein Halogen-Ion, ein Perchlorat-Ion oder ein Thiocyanat-Ion dar. Vorzugsweise können ein Chlor-Ion, ein Brom-Ion, ein Iod-Ion oder dergleichen benutzt werden. Unter diesen wird besonders das Iod-Ion bevorzugt. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, weist die zuvor erwähnte fluoreszierende funktionelle Gruppe eine positive Ladung auf dem Stickstoffatom auf, das mit einer -Y-CO-Gruppe substituiert ist (dargestellt als N⁺ in der obigen Formel), und eine negative Ladung, die von R³-SO₃ ^– herstammt. Wo ein Alkalimetall-Salz, dargestellt durch M⁺Q^–, co-existiert, werden ionische Bindungen sowohl zwischen der positiven Ladung auf dem Stickstoffatom (dargestellt durch N⁺ in der obigen Formel) und Q^– beziehungsweise als auch zwischen R³-SO₃ ^– und M⁺ gebildet. Als Folge hiervon wird die Bildung eines intramolekularen Ionenpaars verhindert, und die ionische Eigenschaft des gesamten Moleküls bleibt erhalten, und die Wasserlöslichkeit wird bemerkenswert erhöht.
In den obigen Formeln (I) und (II) stellt Y eine unverzweigte oder verzweigte Alkengruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen dar, vorzugsweise eine unverzweigte oder verzweigte Alkengruppe mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen, und insbesondere bevorzugt eine Trimethylengruppe, eine Tetramethylengruppe oder eine Pentamethylengruppe. Alternativ stellt Y eine unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen dar, welche ein Atom oder mehrere Atome ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoffatom, Stickstoffatom und Schwefelatom enthält. Als die Gruppe, dargestellt durch -Y-CO-, können zum Beispiel -CH₂-CO-, -(CH₂)₂-CO-, -(CH₂)₃-CO-, -(CH₂)₄-CO-, -(CH₂)₅-CO-, -CH₂-CO-NH-(CH₂)₅-CO-, -(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₅-CO-, -(CH₂)₃-CO-NH-(CH₂)₅-CO-, -(CH₂)₄-CO-NH-(CH₂)₅-CO-, -CH₂-CO-NH-(CH₂)₅-CO-NH-(CH₂)₂-CO-, -(CH₂)₄-CO-(N,N'-Piperadinyl)-(CH₂)₂-CO- („N,N'-Piperadinyl" bedeutet, daß ein Piperazin mit -(CH₂)₄-CO- an der 1-Position und mit einer -(CH₂)₂-Z-Gruppe an der 4-Position substituiert ist, und gleichermaßen im folgenden in der Beschreibung verwendet wird), -CH₂-CO-NH-(CH₂)₅-CO-(N,N'-Piperadinyl)(CH₂)₂-CO- und dergleichen verwendet werden.
Die Carbonylgruppe der -Y-CO-Gruppe kann an einen Antikörper mittels einer zusätzlichen Gruppe, wie zum Beispiel einer unverzweigten oder verzweigten Alkengruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, einer unverzweigten oder verzweigten Alkengruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, welche ein Atom oder mehrere Atome ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoffatom, Stickstoffatom und Schwefelatom enthält, oder einer -NH-NH-Gruppe gebunden sein. Die vorher erwähnten bevorzugten diagnostischen Markierungsmittel werden insbesondere in den Beschreibungen der japanischen Patentanmeldungen mit den Nummern (Hei) 7-12283/1995 und (Hei) 7-223613/1995 offenbart, und eine genauere Erklärung von deren Herstellungsverfahren sind ebenfalls in den Beschreibungen gegeben. In Anbetracht der Offenbarungen wird ein Fachmann die vorher erwähnten bevorzugten diagnostischen Markierungsmittel ohne weiteres herstellen. Außerdem werden in den vorher erwähnten Beschreibungen die Markierungsverbindungen, die für das Binden der fluoreszierenden funktionellen Gruppen, dargestellt durch die vorher erwähnten Formeln (I) und (II), an die Antikörper verwendet werden, ebenfalls offenbart. In den fluoreszierenden funktionellen Gruppen, dargestellt durch die vorher erwähnten Formeln (I) und (II), wird der Einfachheit halber die positive Ladung auf den Stickstoffatomen (dargestellt durch N⁺ in den obigen Formeln) als Ladung, die auf einem Stickstoffatom der Ringstruktur fixiert ist, angezeigt. Jedoch kann von einem Fachmann leicht verstanden werden, daß sich durch konjugierte Doppelbindungen die positive Ladung auf ein anderes Stickstoffatom bewegen kann.
Als der Antikörper, der an die vorher erwähnte fluoreszierende funktionelle Gruppe bindet, können Antikörper, die verschiedene Antigene erkennen, wie zum Beispiel Antikörper, die hoch spezifisch für Krebse sind, verwendet werden. Als die Antikörper können zum Beispiel Anti-Krebs-Antigen-Antikörper verwendet werden, die spezifisch an Krebszellen oder Krebsgewebe binden, vorzugsweise an Krebszellen im Anfangsstadium oder an Krebsgeweben im Anfangsstadium. Im speziellen können Anti-Tumor-Antikörper, Anti-Mucin-Antikörper und Anti-Zuckerkette-Antikörper, die sich auf den Magen beziehen, die spezifisch mit CEA, AFP, CA19-9, NSE, DU-PAN-2, CA50, SPan-1, CA72-4, CA125, HCG, p53, STN (Sialyl-Tn-Antigen), c-erbB-2-Proteine und andere, und Anti-Tumor-Antikörper, die spezifisch mit Tumor-Antigenen des Speiseröhrenkrebses, des Dickdarmkrebses, des Mastdarmkrebses, des Hautkrebses, des Gebärmutterkrebses und anderem reagieren, verwendet werden. Anti-pathogene Protein-Antikörper, Anti-Tumor-Antigen-Antikörper und dergleichen, die mit einem Amplifikationssystem, wie zum Beispiel Avidin und Biotin, verbunden sind, können ebenfalls verwendet werden. Jedoch sind die oben erklärten Antikörper nur als Beispiele angegeben, und Antikörper, die für die Diagnose-Markierungsmittel verwendet werden können, sind nicht auf solche, die oben erwähnt wurden, eingeschränkt. Alle Antikörper können verwendet werden, solange sie die wesentliche Eigenschaft aufweisen, spezifisch an Zielzellen oder Zielgeweben, die Gegenstände der Untersuchung und Diagnose sind, zu binden.
Der Antikörper, der in dem diagnostischen Markierungsmittel enthalten ist, bindet spezifisch an krebsartige Antigene oder anderes, und als Folge hiervon, werden Läsione, wie zum Beispiel Krebszellen oder Krebsgewebe, immunologisch mit dem diagnostischen Markierungsmittel angefärbt. Folglich können die Läsione, die Fluoreszenzstrahlung emittieren, bei Bestrahlung mit Strahlen aus dem nahen Infrarotbereich oder Strahlen aus dem fernen Infrarotbereich unter Verwendung eines Infrarot-Lasers oder anderem erkannt werden. Das die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhende Mittel, das in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten ist, erhöht die Intensität der Fluoreszenzstrahlung des diagnostischen Mittels um mehrere Male bis zu mehreren Zehnmalen, und entsprechend wird es möglich, die Läsione durch Fluoreszenzstrahlungsdetektoren leicht zu beobachten.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird allgemein in der Form von wässrigen Zusammensetzungen oder als Zusammensetzungen, die in einem festen Zustand vorliegen, wie zum Beispiel zermahlte Pulver und lyophilisierte Pulver, zur Verfügung gestellt. Bevorzugte wässrige Zusammensetzungen, die ein Saccharid-Derivat und Acylglycerinphosphat als das die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhende Mittel enthalten, können zum Beispiel durch das Lösen der oberflächenaktiven Substanz, wie zum Beispiel Octylglucosid, in einem wässrigen Medium, wie zum Beispiel, wie erforderlich, einer physiologischen Salzlösung und einer phosphatgepufferten Salzlösung, und dann durch die Zugabe von zum Beispiel einem Natriumsalz der Distearoylphosphatidsäure zu dem Medium und durch das Lösen bei Raumtemperatur bis etwa 60°C, vorzugsweise etwa 50°C, insbesondere bevorzugt etwa 40°C, gefolgt von der Zugabe einer Lösung, die durch das Lösen eines diagnostischen Markierungsmittels in einem wässrigen Medium, wie zum Beispiel einer physiologischen Salzlösung und einer phosphatgepufferten Salzlösung, erhalten wird, zu der obigen Lösung und durch das Vermischen der Mischung hergestellt werden. Jedoch ist das Herstellungsverfahren der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung nicht auf das oben erwähnte Verfahren beschränkt, und es sollte verstanden werden, daß geeignete Verfahren von dem Fachmann gewählt werden können. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls als eine Zusammensetzung in der Form eines lyophilisierten Pulvers durch das Lyophilisieren der vorher erwähnten wässrigen Zusammensetzung hergestellt werden.
Alternativ kann eine wässrige Lösung, die das die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhende Mittel enthält, wie zum Beispiel eine wässrige Lösung, die, wie erforderlich, ein Acylglycerinphosphat und eine oberflächenaktive Substanz enthält, getrennt von einer wässrigen Lösung, die ein diagnostisches Markierungsmittel enthält, hergestellt werden, und nachfolgend das Mischen der beiden Lösungen vor dem Gebrauch, z. B. gerade vor der Diagnose, um die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung herzustellen. Es ist weiterhin möglich, die Diagnose durch das Verabreichen einer wässrigen Lösung, die das diagnostische Markierungsmittel enthält, durchzuführen, und dann getrennt davon eine wässrige Lösung, die das die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhende Mittel enthält, zu verabreichen.
Als pharmakologisch und pharmazeutisch annehmbare Additive für die Herstellung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel Arzneistoffträger, Disintegratoren oder Hilfsmittel für die Disintegration, Bindemittel, Schmiermittel, Beschichtungsmittel, färbende Materialien, Verdünnungsmittel, Grundmaterialien, Lösungsvermittler oder auflösende Hilfsmittel, Isotonien, pH-Modifizierer, Stabilisierungsmittel, Treibmittel, Verdickungsmittel und dergleichen eingesetzt werden. Zum Beispiel können Arzneistoffträger, wie zum Beispiel Glucose, Lactose, D-Manitol, Stärke oder kristalline Cellulose; Disintegratoren oder Hilfsmittel für die Disintegration, wie zum Beispiel Carboxymethylcellulose, Stärke oder Calcium-Carboxymethylcellulose; Grundmaterialien, wie zum Beispiel Vaseline, flüssiges Paraffin, Polyethylenglykol, Gelatine, Kaolin, Glycerin, gereinigtes Wasser oder hartes Fett; Isotonien, wie zum Beispiel Glucose, Natriumchlorid, D-Manitol oder Glycerin; pH-Modifizierer, wie zum Beispiel anorganische Säuren, organische Säuren, anorganische Basen oder organische Basen; Substanzen, die die Stabilität erhöhen, wie zum Beispiel Vitamin A, Vitamin E oder Coenzym Q, dazugegeben werden.
Als ein Beispiel für ein Verfahren für das Verwenden der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zum immunhistochemischen Anfärben als ein diagnostisches Mittel wird ein Untersuchungsverfahren, das ein Infrarotstrahlen-Endoskop verwendet, erklärt werden. Ein fokaler Bereich, der Fluoreszenzstrahlung emittiert, kann durch das Anfärben eines läsionalen Bereiches eines Gewebes, das verdächtigt wird, fokale Bereiche zu umfassen, durch das endoskopische Spreizen oder durch das Aufbringen des vorher erwähnten diagnostischen Mittels (bei einer Konzentration von etwa 0.1 bis 1,000 mg/ml), durch die Durchführung geeigneter Waschvorgänge, um überflüssiges diagnostisches Mittel von dem Gewebe zu entfernen, und dann durch das Bestrahlen des Gewebes mit Strahlen aus dem nahen Infrarotbereich oder mit Strahlen aus dem fernen Infrarotbereich, im speziellen mit einem Licht mit einer Wellenlänge von zum Beispiel 600 – 800 nm, vorzugsweise etwa 768 nm, insbesondere bevorzugt ein Laseranregungslicht, detektiert werden. Obwohl die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet ist, daß sie direkt an lebenden Körpern angewendet werden kann und eine ausgezeichnete Intensität der Fluoreszenzstrahlung zeigt, sollte es verstanden werden, daß die Verfahren der Verwendung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung nicht auf solche beschränkt sind, die an lebenden Körpern angewendet werden, und daß die Zusammensetzung ebenfalls für fixierte Proben, wie zum Beispiel in Paraffin eingelagerte Präparate, anwendbar ist.
Die Detektion der Fluoreszenzstrahlung kann zum Beispiel mittels eines Infrarotstrahlen-Endoskops, eines Infrarotstrahlen-Mikroskops und anderem durchgeführt werden. Zum Beispiel können ein Filter, der gegebene Transmissionseigenschaften aufweist, im speziellen ein oder zwei oder mehr Filter in Kombination ausgewählt aus Filtern, die eine Abschirmeigenschaft gegen das Anregungslicht aufweisen und Filtern für das Nachweisen von Fluoreszenzstrahlung, verwendet werden. Wo eine endoskopische Untersuchung durch das Anwenden der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an einem lebenden Körper durchgeführt wird, kann ein Endoskop, das eine Vergrößerung von etwa 10 bis 1,000 aufweist, verwendet werden. Zum Beispiel kann vorzugsweise ein Infrarotstrahlen-Mikroskop, das einen mikroskopartigen Level der Vergrößerung aufweist, verwendet werden. Das Endoskop kann mit einem Mittel für das Sprühen oder für das Anbringen der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung und mit Mitteln für das Waschen ausgestattet werden.
Wo die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an Geweben oder Proben, die von lebenden Körpern isoliert wurden, angewendet wird, kann ein Infrarotstrahlen-Mikroskop für den Nachweis von Fluoreszenzstrahlung verwendet werden. Eine Bildanalyse kann ebenfalls durch das Beobachten der Präparate unter normalem Licht durchgeführt werden, um angefärbte Bereiche zu erkennen, und dann durch das Aufnehmen von Photographien, wobei ein Infrarot-Film in einer Dunkelkammer unter Infrarot-Strahlen benutzt wird, oder alternativ dazu, durch das Aufnehmen auf zum Beispiel Videobändern als das Aufnahmemedium.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend genauer unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erklärt werden. Jedoch ist der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
Durch das Verwenden von ICG-sulfo-OSu (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 5(22), S. 2689–2694, 1995) als ein Indocyaningrün-Derivat wurde entsprechend dem in der Literatur beschriebenen Verfahren ein diagnostisches Markierungsmittel, das einen anti-CEA-Antikörper der Maus umfasst, welches annähernd 16 Moleküle ICG-sulfo-OSu auf ein Molekül des Antikörpers trägt, hergestellt. Das diagnostische Markierungsmittel wurde in gefrorenem Zustand bis kurz vor dem Gebrauch gelagert. Das diagnostische Markierungsmittel wurde in PBS gelöst, das 37.5 mM Octylglucosid enthält, und das Absorptionsspektrum und das Fluoreszenzspektrum wurden gemessen. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß das Markierungsmittel die maximale Absorptionswellenlänge von 802.8 nm, einen molaren Absorptionskoeffizienten von 3.90 × 10⁵ M^–1cm^–1 (Schlitzweite: 0.2 nm; Referenz: PBS, das 37.5 mM Octylglucosid enthält, gemessen bei Umgebungstemperatur), eine Anregungswellenlänge von 768 nm und eine Fluoreszenzstrahlungswellenlänge von 820 nm (Schlitzweite auf der Seite des Anregungslichtes: 5.0 nm, Schlitzweite auf der Seite der Fluoreszenzstrahlung: 5.0 nm).
Octylglucosid (Dojindo Laboratories, 880 mg) wurde vorsichtig zu der phosphatgepufferten Salzlösung (10 ml, pH 7.4) dazugegeben und unter Rühren auf einem Wasserbad bei 40°C gelöst. Natrium-Distearylphosphatidat (148.8 mg) wurde zu der sich ergebenden Lösung dazugegeben und unter Rühren über einem Wasserbad bei 60°C gelöst, und dann wurde zu dieser Lösung bis zu einem Endvolumen von 20 ml phosphatgepufferte Salzlösung dazugegeben. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur gebracht und vor dem Gebrauch als gefrorene Aliquots mit 1 ml Volumen gelagert. Die Endkonzentration des Natrium-Distearoylphosphatidats und Octylglucosids in der Lösung waren 10 mM, beziehungsweise 150 mM.
Das obige Diagnose-Markierungsmittel (54 μg) in dem lyophilisiertem Zustand wurde zu einer 10% (V/V) Dimethylsulfoxid (DMSO)/phosphatgepufferte Salzlösung (20 μl, pH 7.4) gegeben und gelöst. Die obige Lösung aus Natrium-Distearoylphosphatidat und Octylglucosid (5 μl) wurde zu 5 μl der sich ergebenden Lösung, die vorher erwärmt wurde, gegeben, und sie wurde, indem eine Mikropipette benutzt wurde, durch das Wiederholen von vorsichtigem Ansaugen und Ausdrücken, gemischt, um eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in der Form einer wässrigen Lösung zu erhalten. Durch das Verwenden einer Indocyaningrün (ICG)-Lösung, einer ICG-sulfo-OSu-Lösung und Wasser (Kontrolle) anstelle der Lösung des Diagnose-Markierungsmittels wurden wässrige Zusammensetzungen auf die gleiche, wie oben beschriebene Art und Weise hergestellt. Die Emission der Fluoreszenzstrahlung der obigen Probelösungen (Zusatzgruppen) und der Proben, zu denen keine Lösung, die Natrium-Distearoylphosphatidat und Octylglucosid (keine Zusatzgruppen) enthält, gegeben wurde, wurde bei 800 nm oder mehr beobachtet, und die Zunahme der Intensität der Fluoreszenzstrahlung auf Grund der Zugabe von Natrium-Distearoylphosphatidat wurde ausgewertet. Bei den Gruppen, bei denen die Lösung des Natrium-Distearoylphosphatidats zu dem diagnostischen Markierungsmittel gegeben wurde, wurde eine Zunahme der Fluoreszenzstrahlung deutlich erkannt.
BHSM-IR (Olympus Optical) wurde als ein Infrarotstrahlen-Mikroskop, das die Beobachtung bei sichtbarem Licht bis in den Bereich des nahen Infrarot-Lichtes erlaubt, benutzt. Das Mikroskop wurde unter der Probe mit einem das Anregungslicht durchlassenden Filter, der Licht von 710–790 nm (Asahi Bunko) durchlässt, und über der Probe mit einem das Anregungslicht ausschneidenden Filter, der Licht von 810–920 nm (Asahi Bunko) durchlässt, ausgestattet. KP-MI von Hitachi Electronic Engineering wurde als ein CCD benutzt, und die Fluoreszenzstrahlung, die durch das CCD eingefangen wurde, wurde in einem bildersammelnden Apparat (EVIP-230, Olympus Optical) gegeben und über ein Amplifikationssystem (Olympus Optical) in einem Bilder aufzeichnenden Apparat (S321S, Olympus Optical) aufgenommen.
5 μl jeder Probe wurde auf eine Baumwollgazefaser (1 cm), die auf einem Objektivglas platziert wurde, getröpfelt, und Bilder wurden unter Bestrahlung mit normalen Licht und Infrarot-Licht beobachtet, wobei das obige optische System benutzt wurde. Die Intensität der Fluoreszenzstrahlung wurde ausgewertet, wobei die folgenden Kriterien benutzt wurden: (–), wo keine Fluoreszenzstrahlung in dem Bild beobachtet wurde; (+), wo eine schwache Fluoreszenzstrahlung beobachtet wurde; und (++++), wo ein Bild klar beobachtet wurde, und intermediäre Levels wurden bewertet, wobei zwei Kriterien (++) und (+++) benutzt wurden. Die aufgenommenen Bilder wurden in Endbilder durch eine Bildbearbeitung, die die Schritte der Integration eines Originalbildes, der Integration eines Hintergrundbildes, der Bildung eines Subtraktionsbildes, der Bildung eines gefilterten Bildes und der Kontrastvergrößerung umfasst, wobei der oben erwähnte Apparat verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in der unten dargelegten Tabelle 1 gezeigt. Bei der Gruppe, bei der die Lösung aus Natrium- Distearoylphosphatidat zu dem diagnostischen Markierungsmittel gegeben wurde, wurde eine Zunahme der Fluoreszenzstrahlung klar erkannt. In der Tabelle zeigen alle Konzentrationen solche an, die auf der Basis der ICG-Konzentration berechnet wurden. 1 zeigt Photgraphien der Baumwollgazefasern, die mit der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung betröpfelt wurden, aufgenommen unter Bestrahlung mit normalem Licht und Infrarot-Strahlen. In der Figur stellt (a) das Ergebnis, das unter Bestrahlung mit normalem Licht erhalten wurde, dar, und (b) stellt das Ergebnis, das bei Bestrahlung mit Infrarot-Strahlen erhalten wurde, dar. Tabelle 1

+++: Deutlich hell.
++: Hell.
+: Beobachtbar.
±: Schwach beobachtbar.

Beispiel 2
Auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 wurde ein diagnostisches Markierungsmittel, das einen Anti-Mucin-Antikörper der Maus (anti-MUC-1: Yamamoto, M. et al., Japanese Journal of Cancer Research, 87(5), S. 488–496, 1996) umfasst, welches annähernd 16 Moleküle ICG-sulfo-OSu auf ein Molekül des Antikörpers umfasst, hergestellt. Das diagnostische Markierungsmittel wurde in gefrorenem Zustand bis kurz vor dem Gebrauch gelagert. Das Absorptionsspektrum und das Fluoreszenzspektrum wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen, und es wurde festgestellt, daß das Markierungsmittel die maximale Wellenlänge von 802.8 nm, den molaren Absorptionskoeffizienten von 3.90 × 10⁵ M^–1cm^–1 (Schlitzweite: 0.2 nm, Referenz: PBS, das 37.5 mM Octylglucosid enthält, gemessen bei Umgebungstemperatur); die Anregungswellenlänge von 768 nm und die Fluoreszenzstrahlungswellenlänge von 820 nm (Schlitzweite auf der Seite des Anregungslichtes: 5.0 nm, Schlitzweite auf der Seite der Fluoreszenzstrahlung: 5.0 nm) aufweist.
Ein diagnostisches Markierungsmittel, das einen Anti-Sulfomucin-Antikörper der Maus (91.9H: Irimura, T. et al., Cancer Res., 51, S. 5728 – 5735, 1991) umfasst, welches annähernd 16 Moleküle ICG-sulfo-OSu auf ein Molekül des Antikörpers trägt, wurde ebenfalls hergestellt. Das diagnostische Markierungsmittel wurde in gefrorenem Zustand bis kurz vor dem Gebrauch gelagert. Das Absorptionsspektrum und das Fluoreszenzspektrum wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen, und es wurde festgestellt, daß das Markierungsmittel die maximale Wellenlänge von 802.8 nm, den molaren Absorptionskoeffizienten von 3.89 × 10⁵ M^–1cm^–1 (Schlitzweite: 0.2 nm, Referenz: PBS, das 37.5 mM Octylglucosid enthält, gemessen bei Umgebungstemperatur); die Anregungswellenlänge von 768 nm und die Fluoreszenzstrahlungswellenlänge von 820 nm (Schlitzweite auf der Seite des Anregungslichtes: 5.0 nm, Schlitzweite auf der Seite der Fluoreszenzstrahlung: 5.0 nm) aufweist. Weiterhin wurden, indem ein menschlicher anti-CEA-Antikörper, ein menschlicher anti-Mucin-Antikörper und ein menschlicher anti-Sulfomucin-Antikörper verwendet wurden, diagnostische Markierungsmittel, die alle Antikörper umfassen, welche annähernd 16 Moleküle ICG-sulfo-OSu auf ein Molekül der Antikörper tragen, hergestellt. Diese Diagnose-Markierungsmittel ergaben alle die gleichen spektral photometrischen Spektrumsdaten wie das diagnostische Markierungsmittel, das unter Verwendung eines entsprechenden Maus-Antikörpers hergestellt wurde.
Das obige diagnostische Markierungsmittel in der Form eines lyophilisierten Produktes, das von dem Anti-Mucin-Antikörper der Maus (100 μg) erhalten wurde, wurde zu 4.0 ml der phosphatgepuffferten Salzlösung gegeben und aufgelöst. 1.5 ml der sich ergebenden Lösung wurden zu 1.5 ml einer Lösung des die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhenden Mittels der vorliegenden Erfindung gegeben, und dann wurde die Mischung über einem Wasserbad bei 50°C erwärmt, um eine Endprobe herzustellen. Als eine Kontrolle wurde eine Lösung auf die gleiche Art und Weise hergestellt, wobei 1.5 ml einer phosphatgepuffferten Salzlösung dazugegeben wurde. Die endgültige Antikörper-Konzentration in dem diagnostischen Markierungsmittel betrug 83.3 nM, und die ICG-sulfo-OSu-Konzentration betrug 1.33 μM.
Das Fluoreszenzspektrum von jeder Probe wurde gemessen, indem ein Hitachi-Spektralphotometer 650–40 benutzt wurde. Die Schlitzweite für jedes Anregungslicht und jede Fluoreszenzstrahlung betrug 5 nm. Als ein Standard wurde die Intensität der Fluoreszenzstrahlung von Chininsulfat bei 1 ppm gemessen, die, wie festgestellt wurde, 68.0 (λ_ex = 255 nm, λ_em = 451 nm) vor der Messung des Spektrums und 69.5 (λ_ex = 255 nm, λ_em = 451 nm) nach der Messung des Spektrums beträgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

OG: Octylglucosid (37.5 mM)
DSPA: Distearoylphosphatidsäure (2.5 mM)
DSPC: Distearoylphopshatidylcholin (2.5 mM)
DMPA: Dipalmitoylphosphatidsäure (2.5 mM)
STAD: Stearinsäure (2.5 mM)
PBS: phosphatgepufferte Salzlösung (Kontrolle)
a: Gemessen bei Umgebungstemperatur; wie für die anderen Zusammensetzungen, sofort nach dem Erwärmen bei 50°C gemessen.
b: Die in Klammern gesetzten Werte zeigen Werte vor der Zugabe des die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhenden Mittels an.
c: Die in Klammern gesetzten Werte zeigen Werte vor der Zugabe des die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhenden Mittels an.

2 stellt die Änderungen des Absorptionsspektrums und des Fluoreszenzspektrums der Zusammensetzung 6 in der Tabelle vor und nach der Zugabe von Dimyristoylphosphatidsäure und Octylglucosid als das die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhende Mittel dar. In der Figur stellt (c) das Absorptionsspektrum vor der Zugabe des die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhenden Mittels dar, (c') stellt das Absorptionsspektrum nach der Zugabe des die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhenden Mittels dar, (d) stellt das Fluoreszenzspektrum vor der Zugabe des die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhenden Mittels dar, und (d') stellt das Fluoreszenzspektrum nach der Zugabe des die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhenden Mittels dar.
Bei der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die das die Intensität der Fluoreszenzstrahlung erhöhende Mittel enthält, wurden bemerkenswerte Zunahmen der Intensitäten des Absorptionsspektrums und des Fluoreszenzspektrums beobachtet. Es wurde erkannt, daß die maximale Fluoreszenzstrahlungswellenlänge zu der Seite mit der längeren Wellenlänge um etwa 18 nm in dem Fluoreszenzemissionsspektrum hin verschoben wurde.
Beispiel 3
Um die Beziehung zwischen der Wirkung der Erhöhung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung und der Konzentration von Octylglucosid zu untersuchen, wurde eine Lösung durch das Auflösen von 400 μg des lyophilisierten mit ICG-sulfo-OSu markierten Anti-Mucin-Antikörpers, der in Beispiel 2 hergestellt wurde, in 16.0 ml der phosphatgepufferten Salzlösung, hergestellt, und 1.5 ml Aliquote der sich ergebenden Lösung wurden zu 1.5 ml der Octylglucosidlösungen mit verschiedenen Konzentrationen gegeben, und die Mischungen wurden dann bei 50°C inkubiert. Die endgültige Antikörperkonzentration in den diagnostischen Markierungsmitteln betrug 83.3 nM, und die ICG-sulfo-OSu-Konzentration betrug 1.33 μM. Die Fluoreszenzspektren wurden auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 2 gemessen. Die Schlitzweite betrug für jedes Anregungslicht und für jede Fluoreszenzstrahlung 2 nm. Als ein Standard wurde die Intensität der Fluoreszenzstrahlung von Chininsulfat bei 1 ppm gemessen, die, wie festgestellt wurde, 100.0 (λ_ex = 251 nm, λ_em = 450 nm) vor der Messung des Spektrums und 96.0 (λ_ex = 251 nm, λ_em = 450 nm) nach der Messung des Spektrums beträgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Deutliche Zunahmen der Intensität der Fluoreszenzstrahlung wurden bei Konzentrationen nahe der kritischen Micellenkonzentration von Octylglucosid (25 mM) beobachtet, und graduelle Zunahmen der Intensität der Fluoreszenzstrahlung wurde bei höheren Konzentrationen beobachtet. Wie bei der Verschiebung der Fluoreszenzstrahlung zu einem längeren Wellenlängenbereich hin, wurden deutliche Zunahmen bei Konzentrationen nahe der kritischen Micellenkonzentration beobachtet. Tabelle 3

OG: Octylglucosid

Gewerbliche Anwendbarkeit
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist für das immunhistochemische Anfärben in vivo nützlich. Durch das Verwenden eines Infrarotstrahlen-Endoskops oder anderem ist die Zusammensetzung zum Beispiel nützlich für die quasi-innere frühe Diagnose von bösartigen Geschwulstbildungen in Epithelgeweben, wie zum Beispiel Speiseröhrenkrebs, Magenkrebs und Dickdarmkrebs, und für die Identifizierung und Diagnose von Läsionen während einer chirurgischen Operation. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß sie eine ausgezeichnete Intensität der Fluoreszenzstrahlung aufweist und keine Probleme mit dem Beschädigen von lebenden Geweben und DNAs auf Grund der Bestrahlung durch ultraviolettes Licht verursacht, und folglich ist die Zusammensetzung nützlich, da sie die direkte Untersuchung oder Diagnose ermöglicht, die einen lebenden Zustand widerspiegeln, indem ein normaler Apparat für den Nachweis von Fluoreszenzstrahlung verwendet wird. Insbesondere, da sich die Spitzen wellenlänge der Fluoreszenzstrahlung zu der Seite mit den längeren Wellenlängen hin verschiebt, und die Intensität der Absorption bei der Spitzenwellenlänge deutlich vergrößert wird, indem das Mittel der vorliegenden Erfindung, das die Fluoreszenzstrahlungsintensität erhöht, verwendet wird. Entsprechend erleichtert die Zusammensetzung die Beobachtung der Fluoreszenzstrahlung ohne Interferenz des Anregungslichtes und verbessert bemerkenswert die Möglichkeiten der Gestaltung des gesamten Messungssystems, einschließlich des Fluoreszenzstrahlungsfilters.

Claims

Zusammensetzung zum immunhistochemischen Anfärben, die ein diagnostisches Markierungsmittel enthält, umfassend einen Antikörper, der mit einer von einem Derivat des Indocyaningrüns abgeleiteten, fluoreszierenden funktionellen Gruppe verbunden ist, und eine oberflächenaktive Substanz bestehend aus einem Saccharid-Derivat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Octylglucosid, Heptylglucosid, Octylthioglucosid und Heptylthioglucosid.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung weiterhin eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Glycerophospholipid oder einer Fettsäure umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Glycerophospholipid ein Acylglycerinphosphat ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das Acylglycerinphosphat ein 1,2-Diacyl-sn-glycerin-phosphat ist, das zwei C_10-20 Fettsäurereste enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das 1,2-Diacyl-sn-glycerin-3-phosphat Dimyristoylphosphatidsäure oder Distearoylphosphatidsäure ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Glycerophospholipid ein Acylglycerinphosphocholin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Acylglycerinphosphocholin ein 1,2-Diacyl-sn-glycerin-3-phosphocholin ist, das zwei C_10-20 Fettsäurereste enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das 1,2-Diacyl-sn-glycerin-3-phosphocholin Distearoylphosphatidylcholin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die oberflächenaktive Substanz Octylglucosid ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die fluoreszierende funktionelle Gruppe eine von Indocyaningrün-N-hydroxysulfosuccinimidester abgeleitete funktionelle Gruppe ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Antikörper ein Anti-Krebs-Antigen-Antikörper ist.
Verfahren für das immunhistochemische Anfärben einer Tumorzelle, wobei eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 verwendet wird.
Verfahren für das immunhistochemische Diagnostizieren eines Tumors, wobei eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 verwendet wird.