EA002222B1 - Композиция для иммуногистохимического окрашивания - Google Patents

Композиция для иммуногистохимического окрашивания Download PDF

Info

Publication number
EA002222B1
EA002222B1 EA199900302A EA199900302A EA002222B1 EA 002222 B1 EA002222 B1 EA 002222B1 EA 199900302 A EA199900302 A EA 199900302A EA 199900302 A EA199900302 A EA 199900302A EA 002222 B1 EA002222 B1 EA 002222B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
group
composition according
composition
antibody
functional group
Prior art date
Application number
EA199900302A
Other languages
English (en)
Other versions
EA199900302A1 (ru
Inventor
Сеиити Сибамура
Сусуму Ито
Казухиро Такесако
Тацуро Иримура
Original Assignee
Дайити Пьюэр Кемикалз Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дайити Пьюэр Кемикалз Ко., Лтд. filed Critical Дайити Пьюэр Кемикалз Ко., Лтд.
Publication of EA199900302A1 publication Critical patent/EA199900302A1/ru
Publication of EA002222B1 publication Critical patent/EA002222B1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Композиция для иммуногистохимического окрашивания, которая содержит диагностический маркер, содержащий антитело, связанное с флюоресцентной функциональной группой, и вещество, выбранное из группы, содержащей глицерофосфолипид, жирную кислоту и поверхностно-активное вещество, состоящее из производного сахарида. Композиция обладает прекрасной интенсивностью флюоресценции и не вызывает проблем, связанных с повреждением живых тканей и ДНК из-за облучения ультрафиолетовым излучением, и, следовательно, композиция применима для иммуногистохимического окрашивания in vivo. Например, она позволяет проводить эффективную и безопасную раннюю псевдовнутреннюю диагностику злокачественных новообразований эпителиальных тканей, таких как рак пищевода, рак желудка и рак толстого кишечника, путем применения инфракрасного эндоскопа или другого или выявления и диагностики патологических изменений в ходе хирургической операции.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к композиции для иммуногистохимического окрашивания. Более конкретно, настоящее изобретение относится к композиции для иммуногистохимического окрашивания, обладающей прекрасной интенсивностью флюоресценции, которая содержит диагностический маркер, содержащий метящее соединение, которое возбуждается при облучении лучами ближней инфракрасной области и лучами дальней инфракрасной области, которые редко вызывают повреждение тканей, и испускает флюоресценцию, связанное с антителами или чем-либо другим, что способно специфично распознавать опухолевые клетки и тому подобное.
Предпосылки изобретения
В последние годы эндоскопическая диагностика легко проводилась в связи с распространением электронных эндоскопов. Она позволяет безошибочно обнаруживать рак желудка или рак толстого кишечника, как, например, первичные раковые опухоли. Однако, что касается диагностики микрокарцином, электронный эндоскоп и обычный эндоскоп позволяют достигать почти одинакового уровня диагностического исполнения. Данный факт означает, что новые диагностические методики, в которых электронные эндоскопы функционировали бы эффективно, еще не устоялись. Если бы микроскопические патологические очаги, такие как не определяемые с помощью обычного эндоскопа, могли быть помечены метящим антителом, определяемым при проведении электронной эндоскопии, можно было бы с легкостью выявлять микроскопические патологические очаги с помощью визуализации посредством обработки с применением компьютера. Однако, такая методика практически еще не была разработана.
В целях установления методики, применяющей электронный эндоскоп, такой как описанная выше, необходимо произвести прямое окрашивание живой ткани в соответствии с методикой иммуногистохимического окрашивания. Окрашивание фиксированных образцов представляет собой уже сложившиеся методики. Однако, окрашивание нефиксированных образцов еще не было доступно специалистам в данной области. Например, сообщалось о методике иммунологического окрашивания нефиксированных образцов [8Ыкоки 1даки Ζηκκίιί (8Ыкоки Ме41са1 1онгна1). 29, 180, 1987]; однако, не сообщалось о методике иммунологического окрашивания, в которой применялось бы излучение ближней инфракрасной области, которая была бы применима к отобранным свежим образцам или живой ткани как таковой.
В дополнение к этому, для указанной выше диагностической методики также требуется диагностический маркер, определяемый при проведении электронной эндоскопии, например, меченое антитело. Известны диагностические маркеры, в которых антитело связано с метящим соединением, которое испускает флюоресценцию, как, например, в ультрафиолетовой и видимой части спектра, будучи возбуждено ультрафиолетовыми лучами. Маркеры традиционно применяли для выявления раковых клеток или раковых тканей, которые присутствуют в тканях, выделенных из живых организмов. Однако, методики, применяющие флюоресцентные диагностические маркеры, которые требуют возбуждения ультрафиолетовыми лучами, не могут быть применены к живым организмам, поскольку ультрафиолетовое излучение может вызвать повреждения живых тканей и ДНК. До сих пор не было известно диагностического маркера, который мог бы быть непосредственно применен в живом организме.
Известно, что индоцианиновый зеленый (ИЦЗ) обладает уникальными характеристиками поглощения и испускает флюоресценцию при проведении эндоскопии с применением инфракрасного излучения. Сообщалось о клинических случаях, когда индоцианиновый зеленый применяли при использовании инфракрасного эндоскопа (Оакйоеп1его1одюа1 Епйоксору, 34, рр. 2287-2296, 1992; и Оакйош1екйпа1 Епйоксору, 40, рр. 621-2; 628, 1994). Однако, в данных случаях ИЦЗ вводили внутрисосудисто. Кроме того, флюоресцентные красители, включая индоцианиновый зеленый в качестве типичного примера, как правило, обладают высоким значением гидрофобности и быстро всасываются, будучи как таковые введены в желудочнокишечный тракт. В силу данной причины предпринимались попытки увеличения их водорастворимости путем внесения гидрофильных групп, например, сульфонильной группы, в циклические структуры и в радикалы боковых цепей, и повышения, таким образом, эффективности измерения и устранения проблемы токсичности, возникающей при всасывании (в качестве обзора предпосылок изобретения, описанных выше, смотри, например, Кша К., 8есйоп 2: Буек Гог С11шса1 Ехаш1пайоп (Б1адпок1к), 1п Тйе Ьа1ек1 Лррйей Тесйно1оду оГ Бипсйопа1 Буек, Ей. Ьу М. 1йе, СМС Со., Ь1й., 1996 и тому подобное).
Синтезировав различные производные индоцианинового зеленого, авторы настоящего изобретения преуспели в получении производных индоцианинового зеленого, которые испускают флюоресценцию при возбуждении лучами ближней инфракрасной области и лучами дальней инфракрасной области. Они также обнаружили, что диагностический маркер, который может быть непосредственно применен в живых организмах, может быть получен путем взаимодействия указанного выше производного индоцианинового зеленого в качестве метящего соединения с антителом против ракового антигена и тому подобным, и что диагностический маркер, такой как указанный выше, применим для прямого окрашивания живой ткани в соответствии с методикой иммуногистохимического окрашивания. Авторы настоящего изобретения подали заявку на патент, направленный на данные изобретения (заявка на патент Японии № Не1 7-12283/1995).
В дополнение к этому, авторы настоящего изобретения убедительно провели исследования для обеспечения диагностических маркеров, обладающих прекрасной водорастворимостью. В качестве результата они обнаружили, что среди указанных выше производных индоцианинового зеленого соединения, которые способны образовывать внутримолекулярную ионную пару (цвиттерион), могут обладать пониженной водорастворимостью благодаря снижению молекулярного ионного свойства после образования внутримолекулярной ионной пары до тех пор, пока данные производные не образуют внутримолекулярную ионную пару при обработке йодидом натрия или чем-либо другим, и молекулярные ионные свойства в целом поддерживаются, и, таким образом, значения водорастворимости значительно повышаются. Авторы настоящего изобретения также подали заявку на патент, направленный на данные изобретения (заявка на патент Японии № Не1 7223613/1995).
Однако, дальнейшие исследования диагностических маркеров, содержащих флюоресцентное метящее соединение, такое как производные индоцианинового зеленого, связанное с антителом, выявили, что интенсивность флюоресценции диагностических маркеров снижена до приблизительно одной десятой таковой производных индоцианинового зеленого (соединений для мечения) как таковых до связывания. При проведении иммуногистохимического окрашивания ίη νίνο с применением указанных выше диагностических маркеров для выявления микроскопических тканей, таких как раковые ткани, указанная выше трудность может быть преодолена путем применения регистрирующего флюоресценцию прибора, обладающего значительно большей чувствительностью по сравнению с традиционными приборами. Однако, разработка и внедрение в практику приборов, обладающих высокой эффективностью, могут потребовать огромных усилий и экономических затрат. С другой стороны, если бы было обеспечено средство для увеличения интенсивности флюоресценции, которое специфично воздействовало бы на диагностический маркер, содержащий флюоресцентное метящее соединение, связанное с антителом, и увеличивало бы интенсивность его флюоресценции, возможно, окрашенные ткани могли бы быть надежно и легко выявлены с помощью прибора, доступного в настоящее время.
Объектом настоящего изобретения является композиция для иммуногистохимического окрашивания, обладающая значительно увели ченной интенсивностью флюоресценции, для применения указанного выше диагностического маркера для иммуногистохимического окрашивания в живых организмах.
Авторы настоящего изобретения предприняли различные попытки достижения указанных выше целей, и в качестве результата они обнаружили, что вещество, выбранное из группы, содержащей глицерофосфолипиды, например, ацилглицеролфосфаты, такие как димиристоилфосфатидная кислота и дистеароилфосфатидная кислота, ацилглицеролфосфохолин, такой как дистеароилфосфатидилхолин и тому подобное; жирные кислоты, такие как стеариновая кислота; и поверхностно-активные вещества, состоящие из производных сахаридов, таких как октилглюкозид, могут значительно увеличить интенсивность флюоресценции диагностического маркера, содержащего флюоресцентное метящее соединение, такое как производные индоцианинового зеленого, связанное с антителом. Они также обнаружили, что композиция, содержащая такое вещество и диагностический маркер, чрезвычайно применима в качестве композиции для иммуногистохимического окрашивания, применимой в живых организмах, и устойчивая композиция, обладающая прекрасной растворимостью, может быть обеспечена путем применения поверхностно-активного вещества, состоящего из производного сахарида, такого как октилглюкозид, в качестве незаменимого компонента указанной выше композиции. Настоящее изобретение было сформировано на основе данных находок.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает композицию для иммуногистохимического окрашивания, характеризующуюся тем, что указанная композиция содержит диагностический маркер, содержащий антитело, связанное с флюоресцентной функциональной группой, совместно с веществом, выбранным из группы, содержащей глицерофосфолипид, жирную кислоту и поверхностно-активное вещество, состоящее из производного сахарида. В соответствии с предпочтительными осуществлениями настоящего изобретения обеспечивается указанная выше композиция, где глицерофосфолипид представляет собой ацилглицеролфосфат; указанная выше композиция, где ацилглицеролфосфат представляет собой 1,2-диацил-кпглицерол-3-фосфат, содержащий два остатка Сю-2о жирных кислот; указанная выше композиция, где 1,2-диацил-8и-глицерол-3-фосфат представляет собой димиристоилфосфатидную кислоту и дистеароилфосфатидную кислоту; указанная выше композиция, где глицерофосфолипид представляет собой ацилглицеролфосфохолин; указанная выше композиция, где ацилглицеролфосфохолин представляет собой 1,2диацил-8и-глицерол-3-фосфохолин, содержащие два остатка С1о-2о жирных кислот; указанная выше композиция, где 1,2-диацил-8и-глицерол
3-фосфохолин представляет собой дистеароилфосфатидилхолин; и указанная выше композиция, где поверхностно-активное вещество представляет собой октилглюкозид.
В соответствии с настоящим изобретением далее обеспечивается указанная выше композиция, которая содержит вещество, выбранное из группы, содержащей глицерофосфолипид и жирную кислоту вместе с указанным выше поверхностно-активным веществом; указанная выше композиция, где флюоресцентная функциональная группа представляет собой функциональную группу, являющуюся производным сложного эфира индоцианинового зеленого и Νгидроксисульфосукцинимида; и указанная выше композиция, где антитело представляет собой антитело против ракового антигена.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 приведены фотографии волокнистых тканей нити хлопковой марли, обработанной композицией по настоящему изобретению, сделанные под микроскопом с применением видимого света и инфракрасного излучения. На фигуре на (а) показан результат, полученный с применением видимого света, а на (б) показан результат, полученный с применением инфракрасного излучения.
На фиг. 2 показаны изменения спектров поглощения и флюоресценции до и после того, как димиристоилфосфатидная кислота и октилглюкозид в качестве средства для увеличения интенсивности флюоресценции добавляли к мышиному антителу против муцина, связанному с ИЦЗ-сульфо-О8и. На фигуре на (в) показан спектр поглощения композиции по настоящему изобретению до добавления средства для увеличения интенсивности флюоресценции; на (в') показан спектр поглощения композиции по настоящему изобретению после добавления средства для увеличения интенсивности флюоресценции; на (г) показан спектр флюоресценции композиции по настоящему изобретению до добавления средства для увеличения интенсивности флюоресценции; на (г') показан спектр флюоресценции композиции по настоящему изобретению после добавления средства для увеличения интенсивности флюоресценции.
Наилучший способ осуществления изобретения
Композиция по настоящему изобретению применяется для иммуногистохимического окрашивания и характеризуется тем, что содержит диагностический маркер, содержащий антитело, связанное с флюоресцентной функциональной группой, вместе с веществом, выбранным из группы, содержащей глицерофосфолипиды, жирные кислоты и поверхностно-активные вещества, состоящие из производного сахарида. Композиция в соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения характеризуется тем, что содержит диагностический маркер, содержащий антитело, связанное с флюоресцентной функциональной группой, вещество, выбранное из группы, содержащей глицерофосфолипиды и жирные кислоты и поверхностно-активное вещество, состоящее из производного сахарида.
Как здесь используется, термин глицерофосфолипид означает фосфолипид, содержащий глицерин в качестве основной структуры, и более конкретно, это означает фосфолипидсодержащий глицеролфосфат (на который также ссылаются как на глицерофосфат). Типичные примеры глицерофосфолипида включают, например, ацилглицеролфосфохолины, такие как 1,2-диацил-8и-глицерол-3-фосфохолин (фосфатидилхолин); ацилглицеролфосфоэтаноламины, такие как 1,2-диацил-8и-глицерол-3-фосфоэтаноламин(фосфатидилэтаноламин); ацилглицеролфосфосерины, такие как 1,2-диацил-кпглицерол-3-фосфо-Ь-серин (фосфатидилсерин); фосфатидилинозитолы; ацилглицеролфосфаты, такие как 1,2-диацил-§и-глицерол-3-фосфат(фосфатидная кислота); дифосфатидилглицерин и тому подобное.
Глицеролфосфат, составляющий указанный выше глицерофосфолипид, может находиться в форме любого из своих изомеров, т.е. глицерол-1-фосфата, глицерол-2-фосфата и глицерол-3-фосфата. Хотя его стехиометрия конкретно не ограничена, предпочтительно могут применяться глицерофосфолипиды, содержащие природный кп-глицерол-3-фосфат (Ь-αглицеролфосфат) (глицерол-3-фосфат представлен формулой: НОСН2-СН(ОН)-СН2О-РО3Н2). Среди указанных выше глицерофосфолипидов в композиции по настоящему изобретению предпочтительно применяются ацилглицеролфосфаты и ацилглицеролфосфохолины.
Как здесь используется, термин ацилглицеролфосфат означает моножирнокислый эфир или дижирнокислый эфир глицеролфосфата, т.е. соединение, представленное следующей формулой: А1ОСН2-СН(ОА2) -СН2О-РО3Н2, где А1 и А2 независимо представляют собой атом водорода или ацильную группу в виде остатка жирной кислоты при условии, что А1 и А2 не представляют собой атом водорода одновременно. В приведенной выше формуле остаток жирной кислоты, т. е. группа, образованная путем удаления гидроксильной группы, представленной в виде -ОН из жирных кислот, представленных в виде А1 ОН и/или А2ОН, который составляет указанный выше моножирнокислый эфир или дижирнокислый эфир, может представлять собой остаток жирной кислоты, содержащий приблизительно 8-22 атомов углерода (С8-22), предпочтительно, приблизительно 10-20 атомов углерода (Сю-2о)· Например, предпочтительно применяются остатки, являющиеся производными жирных кислот, содержащих 10, 12, 14, 16 или 18 атомов углерода.
Данные остатки жирных кислот могут являться неразветвленными или разветвленными и могут являться насыщенными или ненасыщенными. Остатки жирных кислот, составляющих дижирнокислый эфир, могут являться одинаковыми или различными. В качестве ацилглицеролфосфата могут быть адекватно применены дистеароилэфир §и-глицерол-3-фосфата (дистеароилфосфатидная кислота), димиристоилэфир 8и-глицерол-3-фосфата (димиристоилфосфатидная кислота) и тому подобное. Ацилглицеролфосфат может быть применен в виде щелочной соли. Примеры такой щелочной соли включают, например, соли натрия и соли калия. Среди них предпочтительными являются натриевые соли дистеароилфосфатидной кислоты и димиристоилфосфатидной кислоты.
Как здесь используется, термин ацилглицеролфосфохолин означает моножирнокислый эфир или дижирнокислый эфир глицеролфосфохолина, т.е. соединение, представленное следующей формулой: А4ОСН2-СН(ОА4)-СН2ОРО(ОН-)ОСН2СН2Ы+(СН3)3, где А3 и А4 независимо представляют собой атом водорода или ацильную группу в виде остатка жирной кисло34 ты при условии, что А и А не представляют собой атом водорода одновременно. В приведенной выше формуле остаток жирной кислоты, т.е. группа, образованная путем удаления гидроксильной группы, представленной в виде -ОН из жирных кислот, представленных в виде А3ОН и/или А4ОН, который составляет указанный выше моножирнокислый эфир или дижирнокислый эфир, может представлять собой остаток жирной кислоты, содержащий приблизительно 8-22 атомов углерода (С8-22), предпочтительно, приблизительно 10-20 атомов углерода (С10-20). Например, предпочтительно применяются остатки, являющиеся производными жирных кислот, содержащих 10, 12, 14, 16 или 18 атомов углерода. Данные остатки жирных кислот могут являться неразветвленными или разветвленными и могут являться насыщенными или ненасыщенными. Остатки жирных кислот, составляющих дижирнокислый эфир могут являться одинаковыми или различными. В качестве ацилглицеролфосфата могут быть адекватно применены дистеароилэфир §и-глицерол-3фосфохолина (дистеароилфосфатидилхолевая кислота) и тому подобное.
В качестве жирной кислоты могут быть применены, например, жирные кислоты, содержащие приблизительно 8-22 атомов углерода (С8-22) предпочтительно, приблизительно 10-20 атомов углерода (С£0-20). Например, предпочтительными являются жирные кислоты, содержащие 10, 12, 14, 16 или 18 атомов углерода. Данные жирные кислоты могут являться неразветвленными или разветвленными и могут являться насыщенными или ненасыщенными. Например, может быть адекватно применена стеариновая кислота и тому подобное. Поверхностноактивное вещество, которое представляет собой производное сахарида, не ограничивается кон кретно постольку, поскольку оно не приводит к существенной денатурации белков и оказывает небольшое раздражающее действие на живые ткани, такие как кожа и слизистая оболочка. Например, могут быть применены октилглюкозид, гептилглюкозид, октилтиоглюкозид, гептилтиоглюкозид и тому подобное.
Композиция по настоящему изобретению может содержать одно или несколько веществ в качестве усиливающего флюоресценцию средства, выбранных из группы, содержащей глицерофосфолипиды, жирные кислоты и поверхностно-активные вещества, представляющие собой производные сахаридов. Указанные здесь производные сахаридов как таковые оказывают эффект повышения интенсивности флюоресценции; однако, производные сахаридов, предпочтительно, могут быть применены в сочетании с веществом, выбранным из группы, содержащей глицерофосфолипиды и жирные кислоты, если вещество, выбранное из группы, содержащей глицерофосфолипиды и жирные кислоты, немного растворимо в воде. Водонерастворимое вещество, такое как ацилглицеролфосфат, может быть растворено в воде при помощи активирующего поверхность свойства производного сахарида, что может иногда облегчать приготовление композиции и значительно увеличивает стойкость продукта. Также можно ожидать синергического эффекта повышения интенсивности флюоресценции при применении производного сахарида и вещества, выбранного из группы, содержащей глицерофосфолипиды и жирные кислоты. Например, предпочтительными осуществлениями настоящего изобретения являются композиция октилглюкозида и дистеароилфосфатидной кислоты и композиция октилглюкозида и димиристоилфосфатидной кислоты.
Размер содержания указанного выше средства для увеличения интенсивности флюоресценции не ограничивается особо, и количество может быть надлежащим образом выбрано в зависимости от типа применяемого диагностического маркера, типа возбуждающего излучения и другого. Если указанное выше производное сахарида и вещество, выбранное из группы, содержащей глицерофосфолипиды и жирные кислоты, применяют в сочетании, производное сахарида может быть применено в количестве, подходящем для растворения вещества, выбранного из группы, содержащей глицерофосфолипиды и жирные кислоты. Например, иногда предпочтительным может быть применение производного сахарида в концентрации, близкой к критической концентрации мицеллообразования (приблизительно 25 мМ для октилглюкозида).
Диагностический маркер, содержащийся в композиции по настоящему изобретению, не ограничен особо, пока маркер содержит антитело, связанное с флюоресцентной функциональ ной группой, и может быть применен для иммуногистохимического окрашивания. Например, предпочтительно, могут быть применены диагностические маркеры, которые испускают флюоресценцию, имеющую длину волны 780 нм или более, предпочтительно 780-840 нм или более, при облучении возбуждающим излучением, имеющим длину волны 600-800 нм. Среди них наиболее предпочтительно применяют для композиции по настоящему изобретению те маркеры, которые способны быть возбуждены лучами ближней инфракрасной области и лучами дальней инфракрасной области и испускают флюоресценцию с длиной волны 810 нм и более, предпочтительно 820 нм и более, поскольку такие маркеры не будут повреждать живые ткани и ДНК во время проведения диагностики. Также предпочтительно применяют диагностические маркеры с высокой водорастворимостью. Композиция по настоящему изобретению может содержать один или несколько диагностических маркеров.
Как здесь используется, термин флюоресцентная функциональная группа означает химическую структуру, которая представляет собой флюоресцентную частичную структуру, являющуюся производным флюорецентного метящего соединения, и связывается с антителом посредством реакции между метящим соединением и антителом. В качестве метящего соединения, применяемого для связывания флюоресцентной функциональной группы с антителом, могут быть применены производные индоцианинового зеленого. В качестве предпочтительных метящих соединений могут быть применены, например, сложный эфир индоцианинового зеленого и Ν-гидроксисукцинимида (НЦЗ-О8и), сложный эфир индоцианинового зеленого и Ν-гидроксисульфосукцинимида (НЦЗ-сульфо-О8и), описанные в Вюогдашс & МеШста1 Сйеш181гу Ьейегз, 5(22), рр. 2689-2694, 1995, и другие. Применяя данные метящие соединения, вся циклическая структура производных индоцианинового зеленого в качестве флюоресцентной функциональной группы может быть с легкостью присоединена к антителу.
Флюоресцентная функциональная группа и антитело могут быть непосредственно связаны друг с другом, или, альтернативно, они могут быть связаны посредством линкера или белка, такого как альбумин. К белку, такому как альбумин, предпочтительно, может быть присоединена одна или несколько, предпочтительно, приблизительно 10 или более указанных выше флюоресцентных функциональных групп. Кроме того, также может быть с легкостью введено антитело. Диагностические маркеры с применением такого белка представляют собой предпочтительные осуществления настоящего изобретения.
Среди диагностических маркеров, которые могут содержаться в композиции по настояще му изобретению, предпочтительные диагностические маркеры включают (1) диагностические маркеры, которые содержат (а) антитело; и (б) флюоресцентную функциональную группу, которая присоединена к антителу и представлена следующей формулой (I)
где К1 и К2 независимо представляют собой атом водорода, алкильную группу, арильную группу, алкоксильную группу или сульфокислую группу; К3 представляет собой алкильную группу, сульфокислую-алкильную группу или аминозамещенную алкильную группу; Х- представляет собой анион, если требуется; Υ представляет собой С1-С10 алкиленовую группу или С1-С10 алкиленовую группу, содержащую один или несколько атомов, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом азота и атом серы; и (2) диагностические маркеры, которые содержат (а) антитело; и (б) флюоресцентную функциональную группу, которая присоединена к антителу и представлена следующей формулой (II)
где К4 и К5 независимо представляют собой атом водорода, алкильную группу, алкоксильную группу или сульфонатную группу; К6 представляет собой алкиленовую группу; М+ представляет собой ион щелочного металла; О представляет собой ион галогена, ион перхлората или ион тиоцианата; Υ представляет собой С1-С10 алкиленовую группу или С1-С10 алкиленовую группу, содержащую один или несколько атомов, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом азота и атом серы.
Флюоресцентная функциональная группа, представленная приведенными выше формулами (I) или (II), связывается с антителом посредством карбонильной группы -Υ-СО-группы, которая присоединена к циклической структуре. В приведенной выше формуле (I), К1 и К2 независимо представляют собой атом водорода, алкильную группу, алкоксильную группу или сульфокислую группу (-8О3Н). Каждый из К1 и К2 может замещать фенильную группу по любому положению. В качестве алкильной группы может быть применена неразветвленная или разветвленная низкоалкильная группа, содержащая от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно, неразветвленная или разветвленная низкоалкильная группа, содержащая от 1 до 4 атомов углерода. Например, предпочтительными являются метильная группа, этильная группа, пропильная группа, изопропильная группа, нбутильная группа, втор-бутильная группа, третбутильная группа и тому подобные.
В качестве арильной группы, представленной В1 и В2, может быть применена фенильная группа, нафтильная группа, пиридильная группа и тому подобные, которые являются замещенными или незамещенными. В качестве алкоксильной группы может быть применена неразветвленная или разветвленная низкоалкоксильная группа, содержащая от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно, неразветвленная или разветвленная низкоалкильная группа, содержащая от 1 до 4 атомов углерода. Более конкретно, предпочтительно применяют метоксигруппу, этоксигруппу, пропоксигруппу, изопропоксигруппу, н-бутоксигруппу, вторбутоксигруппу, трет-бутоксигруппу и тому подобные. В качестве сульфокислых групп могут быть применены -8О3Н-группа в свободной форме или сульфокислые группы в форме основных солей (сульфонатных групп), таких как соль натрия и соль калия. Среди них предпочтительными являются те, в которых В1 и В2 независимо представляют собой атом водорода, алкильную группу, алкоксильную группу или сульфонатную группу.
В3 представляет собой алкильную группу, сульфокислую-алкильную группу или аминозамещенную алкильную группу. В качестве алкильной группы в данных группах могут быть применены, например, группы, указанные выше. Сульфокислая группа сульфокислойалкильной группы или аминозамещенной алкильной группы может замещать алкильную группу по любому положению. Например, предпочтительно, могут быть применены алкильные группы с концевым замещением.
Сульфокислая группа и аминогруппа могут образовывать соли независимо или друг с другом. Например, предпочтительными являются группы, где сульфокислые группы образуют натриевые соли и калиевые соли, группы, где аминогруппы образуют соли, такие как галогениды аммония, и группы, где аминогруппы образуют четвертичные амины. В дополнение к этому, в качестве аминогруппы могут быть применены замещенные или незамещенные аминогруппы. Примеры сульфокислойалкильной группы или аминозамещенной алкильной группы включают сульфокислуюметильную группу, (-СН28О3Н) сульфокислуюэтильную группу, аминометильную группу, аминоэтильную группу, метиламиноэтильную группу и их соли.
В флюоресцентной функциональной группе, представленной формулой (I), Х- представляет собой вид аниона, если требуется, ион галогена, ион ацетата, ион перхлората и ион карбоната. Анион, представленный X-, компенсирует положительный заряд на атоме азота в кольце, которое замещено группой Υ-СО-, таким образом, что флюоресцентная функциональная группа, представленная формулой (I), в целом остается нейтральной. Таким образом, например, если одна из групп В1, В2 и В3 в флюоресцентной функциональной группе, представленной формулой (I), представляет собой анионную группу, Х- иногда может не потребоваться, поскольку отрицательный заряд группы компенсирует положительный заряд на четвертичном атоме азота циклической структуры таким образом, что формируется внутримолекулярный цвиттерион. С другой стороны, когда любой из В1 и В2 представляет собой сульфокислую группу, а В3 представляет собой аминозамещенную алкильную группу, заряды могут быть сбалансированы между данными группами, и как результат, иногда может возникнуть потребность в Х-.
В флюоресцентной функциональной группе, представленной формулой (II), В4 и В5 независимо представляют собой атом водорода, алкильную группу, алкоксильную группу или сульфонатную группу. Каждый из В4 и В5 может замещать фенильную группу по любому положению. В качестве алкильной группы или алкоксильной группы могут быть применены группы, указанные выше. Сульфонатная группа -8О3 -М+, где М+ представляет собой ион щелочного металла, который может являться одинаковым или отличным от М' как противоиона О-, может представлять собой, например, натрий сульфонатную группу или калийсульфонатную группу.
В6 представляет собой неразветвленную или разветвленную алкиленовую группу. Например, может быть применена неразветвленная или разветвленная низкоалкиленовая группа, содержащая от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно, группа, содержащая от 2 до 5 атомов углерода, и, более предпочтительно, триметиленовая группа, тетраметиленовая группа или пентаметиленовая группа. Группа -8О3-, замещающая В6, может присоединяться к алкиленовой группе по любому положению. Например, предпочтительно, могут быть применены алкиленовые группы с концевым замещением. Более конкретно, в качестве В6-8О3- предпочтительной является группа, представленная - (СН3)к-8О3 -, где к представляет собой целое число от 2 до 4 и тому подобное.
М' представляет собой ион щелочного металла. В качестве иона щелочного металла могут предпочтительно быть применены ион натрия или ион калия. О- представляет собой ион галогена, ион перхлората или ион тиоцианата. Предпочтительно, может быть применен ион хлора, ион брома, ион йода или тому подобные. Среди них особенно предпочтительным является ион йода. Хотя ограничение какой-либо особой теорией и не подразумевается, указанная выше флюоресцентная функциональная группа несет положительный заряд на атоме азота, по которому замещает группа -Υ-СО- (представленному в указанной выше формуле как Ν') , и отрицательный заряд, определяемый наличием Я3-8Оз-. Если при этом присутствует еще и соль щелочного металла М' О-. ионные связи образуются соответственно между положительным зарядом на атоме азота (представленному в указанной выше формуле как Ν') , и О-, равно как и между Я3-8О3 - и М4. Как результат, предотвращается образование внутримолекулярных ионных пар, поддерживается ионное свойство молекулы в целом, и значительно повышается водорастворимость.
В приведенных выше формулах (I) и (II), Υ представляет собой неразветвленную или разветвленную алкиленовую группу, содержащую от 1 до 10 атомов углерода, предпочтительно, неразветвленную или разветвленную алкиленовую группу, содержащую от 3 до 5 атомов углерода, и, более предпочтительно, триметиленовую группу, тетраметиленовую группу или пентаметиленовую группу. Альтернативно, Υ представляет собой неразветвленную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 1 до 10 атомов углерода, которая содержит один или несколько атомов, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом азота и атом серы. В качестве г^эуппы, представленной -Υ-СО-, например, могут быть применены группы -СН2-СО-; - (СН2)2СО-; -(СН2)3-СО-; -(СНЦ-СО-; -(СШЬ-СО-; -СН2СО-ЫН-(СН2)5-СО-; -(СН2)2-СО-1МН-(СН2)5-СО-; -(СН2)3-СО-ЯН-(СН2)5-СО-; -(СН2)4-СО-КН(СН2)5-СО-; -СН2-СО-КН-(СН2)5-СО^Н-(СН2)2СО-; -(СН2)4-СО-(К,К-пиперадинил)-(СН2)2СО-(КК-пиперадинил означает, что пиперазин замещен -(СН2)4-СО- по 1-положению и группой -(ί.Ή2)2-Ζ по 4-положению, и аналогично применяется здесь далее в спецификации), СН2-СО-КН-(СН2)5-СО-(М,М'-пиперадинил)(СН2)2-СО- и тому подобные.
Карбонильная группа группы -Υ-СО- может быть связана с антителом посредством дополнительной группы, такой как неразветвленная или разветвленная алкиленовая группа, содержащая от 1 до 10 атомов углерода; неразветвленная или разветвленная алкиленовая группа, содержащая от 1 до 10 атомов углерода, которая содержит один или несколько атомов, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом азота и атом серы; или группу -ΝΉΝΉ-. Указанные выше предпочтительные диагностические маркеры особо описаны в спецификациях заявок на патент Японии №№ (Не1) 712283/1995 и (Не1) 7-223613/1995, и подобное пояснение способов их получения также изложено в данных спецификациях. Специалисты в данной области с легкостью получат указанные выше предпочтительные диагностические маркеры в виду описаний. В дополнение к этому, в указанных выше спецификациях также описаны метящие соединения, применяемые для связы вания флюоресцентной функциональной группы, представленной приведенными выше формулами (I) или (II), с антителами. В флюоресцентных функциональных группах, представленных приведенными выше формулами (I) или (II), положительный заряд на атомах азота (представленному в указанных выше формулах как Ν' ) для удобства указывают в неизменном виде на одном атоме азота циклической структуры. Однако, специалисты в данной области прекрасно понимают, что положительный заряд способен перемещаться к другому атому азота посредством сопряженных двойных связей.
В качестве антитела, которое связывается с указанной выше флюоресцентной функциональной группой, могут быть применены антитела, распознающие различные антигены, такие как антитела, высокоспецифичные к опухолевым антигенам. В качестве антител, например, могут быть применены антитела против опухолевых антигенов, которые специфично связываются с раковыми клетками или с раковыми тканями, предпочтительно, с ранними раковыми клетками или с ранними раковыми тканями. Более конкретно, могут быть применены противоопухолевые антитела, антитела против муцина и антитела против полисахаридных цепей, относящиеся к желудку, которые специфично взаимодействуют с СЕА, АРР, СА19-9, Ν8Ε, Όυ-ΡΑΝ-2, СА50, 8Рап-1, СА72-4, СА125, НСС, р53, 8ΤΝ (сиалил-Тп-антиген), белками с-етЬВ-2 и другими, и противоопухолевые антитела, специфично взаимодействующие с опухолевыми антигенами рака пищевода, рака толстого кишечника, рака прямой кишки, рака кожи, рака матки и другими. Также могут быть применены антитела против патогенных белков, антитела против опухолевых антигенов и тому подобного, связанного с системой амплификации, такого как авидина и биотина. Однако, указанные выше антитела приведены лишь в качестве примеров, и антитела, которые могут быть применены для диагностического маркера, не ограничены антителами, указанными выше. Могут быть применены любые антитела при условии, что они обладают значительным свойством специфичного связывания с клетками-мишенями или тканями-мишенями, которые являются объектами исследования и диагностики.
Антитело, содержащееся в диагностическом маркере, специфично связывается с раковыми антигенами и другим, и как результат патологические очаги, такие как раковые клетки и раковые ткани, иммунологически окрашиваются диагностическим маркером. Затем патологические очаги, которые испускают флюоресценцию, могут быть выявлены с помощью облучения лучами ближней инфракрасной области и лучами дальней инфракрасной области с применением инфракрасного лазера или чего-либо другого. Средство для увеличения интенсивности флюоресценции, содержащееся в композиции по настоящему изобретению, увеличивает интенсивность флюоресценции диагностического маркера в несколько десятков раз, и, соответственно, становится возможным с легкостью выявлять патологические очаги с помощью детекторов флюоресценции.
Композиция по настоящему изобретению, как правило, обеспечивается в форме водных композиций или в виде композиций в твердом состоянии, таких как измельченные порошки или лиофилизированные порошки. Предпочтительные водные композиции, содержащие производное сахарида и ацилглицеролфосфат в качестве средства для увеличения интенсивности флюоресценции, могут быть приготовлены, например, путем растворения поверхностноактивного вещества, такого как октилглюкозид, в водной среде, такой как физиологический раствор и фосфатно-буферный раствор при необходимости, и затем добавления натриевой соли дистеароилфосфатидной кислоты, например, в среду, и растворения при температуре от комнатной до приблизительно 60°С, предпочтительно, приблизительно 50°С, более предпочтительно, приблизительно 40°С, с последующим добавлением раствора, полученного путем растворения диагностического маркера в водной среде, такой как физиологический раствор и фосфатно-буферный раствор, к указанному выше раствору и перемешиванием смеси. Однако, способ приготовления композиции по настоящему изобретению не ограничен указанным выше способом, и следует понимать, что специалистами в данной области могут быть выбраны подходящие способы. Композиция по настоящему изобретению может быть также приготовлена в виде композиции в форме лиофилизированного порошка путем лиофилизации указанной выше водной композиции.
Альтернативно, водный раствор, содержащий средство для увеличения интенсивности флюоресценции, такой как водный раствор, содержащий ацилглицеролфосфат и поверхностно-активное вещество при необходимости, может быть получен отдельно от водного раствора, содержащего диагностический маркер, с последующим смешиванием обоих растворов перед применением, т. е. непосредственно перед проведением диагностики, для приготовления композиции по настоящему изобретению. Далее возможно провести диагностику путем введения водного раствора, содержащего диагностический маркер, и последующего отдельного введения водного раствора, содержащего средство для увеличения интенсивности флюоресценции.
В качестве фармакологически и фармацевтически приемлемых добавок для приготовления композиции по настоящему изобретению могут быть применены, например, наполнители, дезинтеграторы, или дезинтегрирующие добавки, связывающие вещества, смазывающие средства, покрывающие средства, красящие вещест ва, разбавители, основные вещества, солюбилизаторы, или растворяющие добавки, вещества, модифицирующие изотоничность, вещества, модифицирующие рН, стабилизаторы, газывытеснители, загустители и тому подобное. Например, могут быть добавлены наполнители, такие как глюкоза, лактоза, Ό-маннитол, крахмал или кристаллическая целлюлоза; дезинтеграторы, или дезинтегрирующие добавки, такие как карбоксиметилцеллюлоза, крахмал или карбоксиметилцеллюлоза-кальций; основные вещества, такие как вазелин, жидкий парафин, полиэтиленгликоль, желатин, каолин, глицерин, очищенная вода или твердый жир; вещества, модифицирующие изотоничность, такие как глюкоза, хлорид натрия, Ό-маннитол или глицерин; вещества, модифицирующие рН, такие как неорганические кислоты, органические кислоты, неорганические основания или органические основания; вещества, которые повышают стойкость, такие как витамин А, витамин Е или кофермент О.
В качестве примера способа применения композиции для иммуногистохимического окрашивания по настоящему изобретению в качестве диагностического средства будет разъяснен способ исследования с применением инфракрасного эндоскопа. Фокусный участок, который испускает флюоресценцию, может быть выявлен путем окрашивания патологически измененного участка с помощью эндоскопического распыления и нанесения указанного выше диагностического средства (в концентрации от приблизительно 0,1 до 1000 мг/мл) на ткань, подозреваемую на содержание фокусных участков, проведения адекватных промываний в целях удаления избытка диагностического средства с ткани и затем облучения ткани лучами ближней инфракрасной области или лучами дальней инфракрасной области, более конкретно, излучением, имеющим длину волны, например, 600-800 нм, предпочтительно, приблизительно 768 нм, более предпочтительно, возбуждающим лазерным излучением. Хотя композиция по настоящему изобретению характеризуется тем, что она может быть непосредственно применена к живым организмам и проявляет прекрасную интенсивность флюоресценции, следует понимать, что способы применения композиции по настоящему изобретению не ограничиваются таковыми, применяемыми к живым организмам, и что композиция также применима к фиксированным образцам, таким как залитые парафином препараты.
Регистрация флюоресценции может быть проведена, например, с помощью инфракрасного эндоскопа, инфракрасного микроскопа и другого. Например, могут быть применены фильтр, обладающий данными пропускающими характеристиками, более конкретно, один фильтр или два или несколько фильтров в комбинации, выбранные из фильтров, обладающих эффектом экранирования от возбуждающего излучения, и фильтры для регистрации флюоресценции. Если эндоскопическое исследование проводят путем применения композиции по настоящему изобретению, к живому организму может быть применен эндоскоп, обладающий усилением приблизительно от 10 до 1000 раз. Например, предпочтительным может являться инфракрасный эндоскоп, обладающий микроскопическим уровнем усиления. Эндоскоп может быть обеспечен средством для распыления или нанесения композиции по настоящему изобретению и средством для промывания.
Если композицию по настоящему изобретению наносят на ткани или образцы, выделенные из живых организмов, для регистрации флюоресценции может быть применен инфракрасный микроскоп. Анализ изображения также может быть проведен путем изучения препаратов в видимом свете для выявления пятнистых участков и затем проведения фотографирования с применением инфракрасной пленки в темной комнате, в инфракрасных лучах или, альтернативно, например, записи на видеопленки в качестве носителя информации.
Примеры
Настоящее изобретение будет далее пояснено более конкретно путем отсылки к следующим примерам. Однако, сфера настоящего изобретения не ограничена следующими примерами.
Пример 1.
Применяя ИЦЗ-сульфо-О8и, (Вюотдашс & Ме61С1па1 Сйетщйу Ьейетк, 5(22), рр. 2689-2694, 1995) в качестве производного индоцианинового зеленого, в соответствии с методикой, описанной в литературе, получали диагностический маркер, содержащий мышиное анти-СЕА антитело, несущее приблизительно 16 молекул ИЦЗсульфо-О8и на одну молекулу антитела. Диагностический маркер хранили в замороженном состоянии вплоть до применения. Диагностический маркер растворяли в ФБР, содержащем 37,5 мМ октилглюкозида, и регистрировали спектр поглощения и спектр флюоресценции. В результате было обнаружено, что маркер обладает максимумом поглощения при длине волны 802,8 нм, коэффициент молярной экстинкции 3,90х105 М-1-ем-1 (ширина щели: 0,2 нм, контроль: ФБР, содержащий 37,5 мМ октилглюкозида, измерено при температуре окружающей среды); длина возбуждающей волны 768 нм и длина волны флюоресценции 820 нм (ширина щели на стороне испускания возбуждающего излучения: 5,0 нм, ширина щели на стороне регистрации флюоресценции: 5,0 нм).
Октилглюкозид (Эорпбо БаЬогаЮпек 880 мг) осторожно добавляли к фосфатнобуферному раствору (10 мл, рН 7,4) и растворяли путем перемешивания на водяной бане при 40°С. Дистеароилфосфатидат натрия (148,8 мг) добавляли к полученному раствору и растворя ли путем перемешивания на водяной бане при 60°С, и затем к раствору добавляли фосфатнобуферный раствор до конечного объема 20 мл. Раствор охлаждали до комнатной температуры и хранили в виде замороженных аликвот 1 мл объема вплоть до применения. Конечные концентрации дистеароилфосфатидата натрия и октилглюкозида в растворе составляли 10 мМ и 150 мМ соответственно.
К указанному выше диагностическому маркеру (54 мкг) в лиофилизированном состоянии добавляли 10% (по объему) диметилсульфоксид (ДМСО)/фосфатно-буферный раствор (20 мкл, рН 7,4) и растворяли. Указанный выше раствор дистеароилфосфатидата натрия и октилглюкозида (5 мкл) добавляли к 5 мкл полученного раствора, который заранее нагревали, и перемешивали путем повторного набора и выливания из микропипетки для получения композиции по настоящему изобретению в форме водного раствора. Применяя раствор индоцианинового зеленого (ИЦЗ), раствор ИЦЗ-сульфоО8и и воду (контроль) вместо раствора диагностического маркера, водные композиции получали тем же образом, что описано выше. Испускание флюоресценции указанных выше растворов образцов (группы с добавлениями) и образцов, к которым не добавляли раствор, содержащий дистеароилфосфатидат натрия и октилглюкозид (группы без добавления) наблюдалось при 800 нм и более, и было зарегистрировано увеличение интенсивности флюоресценции благодаря добавлению дистеароилфосфатидата натрия. В группах, где к диагностическому маркеру был добавлен раствор дистеароилфосфатидата натрия, отчетливо наблюдалось увеличение интенсивности флюоресценции.
В качестве инфракрасного микроскопа применяли ВН8М-1В (О1утрик Орйса1), что позволяет проводить изучение в интервале от видимого света до излучения ближней инфракрасной области. Микроскоп был оборудован пропускающим возбуждающее излучение фильтром, который пропускает излучения с длиной волны 710-790 нм (Акай1 Випко) под образцом и отсекающим возбуждающее излучение фильтром, который пропускает излучения с длиной волны 810-920 нм (Акай1 Випко) над образцом. В качестве ССЭ применяли КР-М1 от Нйасй1 Е1ес!топ1с Епдшеегшд, и флюоресценция, уловленная ССЭ. передавалась в воспринимающий изображение прибор (ЕУ1Р-230, О1утрик Орйса1) и записывалась записывающим изображение прибором (83218, О1утрик Орйса1) через систему усиления (О1утрик Орйса1).
мкл каждого образца капали на нить хлопковой марли (1 см), помещенную на предметное стекло, и изображения изучали при облучении видимым светом и инфракрасным излучением, применяя указанную выше оптическую систему. Интенсивность флюоресценции оценивали, применяя следующие критерии: (-) где флюоресценция на изображении не наблюдалась; (+) где флюоресценция наблюдалась слегка; и (++++) где изображение отчетливо наблюдалось, и промежуточные уровни оценивали, применяя критерии (++) и (+++). Записанные изображения преобразовывали в итоговые изображения через обработку изображения, включающую стадии интеграции исходного изображения, интеграции фонового изображения, формирования вычтенного изображения, формирования фильтрующего изображения и усиления контрастности путем применения указанного выше прибора. Результаты показаны в табл. 1, приведенной ниже. В группе, где к диагностическому маркеру был добавлен раствор дистеароилфосфатидата натрия, отчетливо наблюдалось увеличение интенсивности флюоресценции. В таблице все значения концентрации показывают таковые, рассчитанные на основе концентрации ИЦЗ. На фиг. 1 показаны фотографии нитей хлопковой марли с нанесенной композицией по настоящему изобретению, сделанные при облучении видимым светом и инфракрасным излучением. На фигуре (а) показан результат, полученный с применением видимого света, а на (б) показан результат, полученный с применением инфракрасного излучения.
Таблица 1
Тестируемый образец Концентрация в отношении ИЦЗ Группа без добавлений Группа с добавлениями
ИЦЗ 1 мг/мл ++ ++
100 мкг/мл - -
10 мкг/мл - -
1 мкг/мл - -
ИЦЗ-сульфо- О8и 100 мкг/мл ± ++
10 мкг/мл + +
1 мкг/мл - -
0,1 мкг/мл - -
ИЦЗ-сульфо- О8и-меченое антитело 120 мкг/мл + +++
10 мкг/мл - ++
1 мкг/мл - +
0,1 мкг/мл - ±
Вода - -
+++: Определенно ясно.
++: Ясно.
+: Заметно.
±: Слегка заметно.
Пример 2.
Аналогичным образом таковому из примера 1 получали диагностический маркер, содержащий мышиное антимуциновое антитело (апйМиС-1: УататоЮ. М., е! а1., 1арапеке 1оита1 οί Сапсег Кекеагсй, 87(5), рр. 488-496, 1996), несущее приблизительно 16 молекул ИЦЗ-сульфоО8и на одну молекулу антитела. Диагностический маркер хранили в замороженном состоянии вплоть до применения. Спектр поглощения и спектр флюоресценции регистрировали аналогичным образом таковому из примера 1, и было обнаружено, что маркер обладает максимумом поглощения при длине волны 802,8 нм, коэффициент молярной экстинкции 3,90х105 М-1-см-1 (ширина щели: 0,2 нм, контроль: ФБР, содер жащий 37,5 мМ октилглюкозида измерено при температуре окружающей среды; длина возбуждающей волны 768 нм и длина волны флюоресценции 820 нм (ширина щели на стороне испускания возбуждающего излучения: 5,0 нм, ширина щели на стороне регистрации флюоресценции: 5,0 нм).
Также получали диагностический маркер, содержащий мышиное антисульфомуциновое антитело (91.9Н: 1птига. Т., е! а1., Сапсег Кек., 51, рр. 5728-5735, 1991), несущее приблизительно 16 молекул ИЦЗ-сульфо-О8и на одну молекулу антитела. Диагностический маркер хранили в замороженном состоянии вплоть до применения. Спектр поглощения и спектр флюоресценции регистрировали аналогичным образом таковому из примера 1, и было обнаружено, что маркер обладает максимумом поглощения при длине волны 802,8 нм, коэффициент молярной экстинкции 3,89х105 М-1-см-1 (ширина щели: 0,2 нм, контроль: ФБР, содержащий 37,5 мМ октилглюкозида, измерено при температуре окружающей среды; длина возбуждающей волны 768 нм и длина волны флюоресценции 820 нм (ширина щели на стороне испускания возбуждающего излучения: 5,0 нм, ширина щели на стороне регистрации флюоресценции: 5,0 нм) . Кроме того, путем применения человеческого анти-СЕА антитела, человеческого антимуцинового антитела, человеческого антисульфомуцинового антитела получали диагностические маркеры, содержащие антитела каждого типа, несущие приблизительно 16 молекул ИЦЗ-сульфо-О8и на одну молекулу антитела. Каждый из данных диагностических маркеров проявлял такие же спектрофотометрические спектральные данные, что и таковые диагностического маркера, полученного с применением соответствующего мышиного антитела.
К указанному выше диагностическому маркеру в форме лиофилизированного продукта, полученному из мышиного антимуцинового антитела, (100 мкг) добавляли 4,0 мл фосфатнобуферного раствора и растворяли. К 1,5 мл полученного раствора добавляли 1,5 мл раствора, увеличивающего интенсивность флюоресценции средства по настоящему изобретению, и затем смесь нагревали на водяной бане при 50°С с получением итогового образца. В качестве контроля раствор готовили аналогичным образом путем добавления 1,5 фосфатно-буферного раствора. Конечная концентрация антитела в диагностическом маркере составляла 83,3 нМ, а концентрация ИЦЗ-сульфо-О8и составляла 1,33 мкМ.
Спектр флюоресценции каждого образца регистрировали, применяя спектрофотометр НйасЫ 650-40. Ширина щели составляла 5 нм как для возбуждающего излучения, так и для флюоресценции. Интенсивность флюоресценции хининсульфата при 1 м.д. измеряли в качестве стандарта, который оказался равным 68,0 (Лвозб = 255 нм, λ[ιοιι = 451 нм) до регистрации спектра и 69,5 (λΒΟ36 = 255 нм, λ^ = 451 нм) после регистрации спектра. Результаты приведены в табл. 2.
Таблица 2
Композиция Увеличивающее интенсивность флюоресценции средство Длина возбуждающей волны (нм) Длина волны флюоресценции (нм) Интенсив- ность флюоресценции
1а ДСФК+ОГ 768 825 (807)е 0,95 (0,19)в
2 ДСФК+ОГ 768 825 (807) 1,01 (0,23)
3а ОГ 768 820 (807) 0,92 (0,20)
4 ОГ 768 825 (807) 0,96 (0,25)
5 ДСФК+ОГ 768 825 (807) 1,10 (0,26)
6 ДМФК+ОГ 768 825 (807) 1,20 (0,29)
7 СК+ОГ 768 825 (807) 1,17 (0,28)
8 (контроль) ФБР 768 807 (807) 0,25 (0,24)
ОГ: октилглюкозид (37,5 мМ)
ДСФА: дистеароилфосфатидная кислота (2,5 мМ) ДСФХ: дистеароилфосфатидилхолин (2,5 мМ) ДМФК: дипальмитоилфосфатидная кислота (2,5 мМ) СК: стеариновая кислота (2,5 мМ)
ФБР: фосфатно-буферный раствор (контроль) а: измерено при температуре окружающей среды; что касается другой композиции, измерено непосредственно после нагревания до 50°С.
б: приведенные значения указывают значения до добавления увеличивающего интенсивность флюоресценции средства.
в: приведенные значения указывают значения до добавления увеличивающего интенсивность флюоресценции средства.
На фиг. 2 изображены изменения спектра поглощения и спектра флюоресценции Композиции 6 в таблице до и после добавления димиристоилфосфатидной кислоты и октилглюкозида в качестве увеличивающего интенсивность флюоресценции средства. На фигуре на (в) представлен спектр поглощения до добавления средства для увеличения интенсивности флюоресценции, на (в') представлен спектр поглощения после добавления средства для увеличения интенсивности флюоресценции, на (г) представлен спектр флюоресценции до добавления средства для увеличения интенсивности флюоресценции, и на (г') представлен спектр флюоресценции после добавления средства для увеличения интенсивности флюоресценции. В композиции по настоящему изобретению, содержащей средство для увеличения интенсивности флюоресценции, наблюдалось значительное увеличение значений интенсивности спектра поглощения и спектра флюоресценции. Было выявлено, что максимум длины волны флюоресценции сдвинулся в длинноволновую область приблизительно на 18 нм в спектре испускания флюоресценции.
Пример 3.
Для исследования взаимосвязи между эффектом повышения интенсивности флюоресценции и концентрацией октилглюкозида получали раствор путем растворения 400 мкг лиофилизированного мышиного антимуцинового антитела, меченного ИЦЗ-сульфо-О8и, которое получали в примере 2, в 16,0 мл фосфатнобуферного раствора и к 1,5 мл аликвотам полученного раствора добавляли 1,5 мл растворов октилглюкозида в различных концентрациях и затем смеси инкубировали при 50°С. Конечная концентрация антитела в диагностических маркерах составляла 83,3 нМ, а концентрация ИЦЗсульфо-О8и составляла 1,33 мкМ. Спектры флюоресценции образцов регистрировали таким же образом, что и в примере 2. Ширина щели составляла 2 нм как для возбуждающего излучения, так и для флюоресценции. Интенсивность флюоресценции хининсульфата при 1 м.д. измеряли в качестве стандарта, который оказался равным 100,0 (λ^ = 251 нм, Аисп = 450 нм) до регистрации спектра и 96,0 (λ^ = 251 нм, Аисп = 450 нм) после регистрации спектра. Результаты приведены в табл. 3. Резкие изменения интенсивности флюоресценции наблюдались при концентрациях, близких к критической концентрации мицеллообразования для октилглюкозида (25 мМ), а при более высоких концентрациях наблюдалось постепенное увеличение интенсивности флюоресценции. Что касается сдвига длины волны флюоресценции в длинноволновую область, резкие изменения интенсивности флюоресценции наблюдались при концентрациях, близких к критической концентрации мицеллообразования.
Таблица 3
Концентрация ОГ (мМ) Интенсивность флюоресценции Длина возбуждающей волны (нм) Длина волны флюоресценции (нм)
0,0 0,153 768 804
1,0 0,150 768 806
5,0 0,150 768 804
10,0 0,189 768 809
20,0 0,436 768 817
37,5 0,520 768 817
50,0 0,515 768 820
75,0 0,525 768 816
100 0,600 768 816
150 0,588 768 821
ОГ: октилглюкозид
Промышленная применимость
Композиция по настоящему изобретению применима для иммуногистохимического окрашивания ίη νίνο. Например, при применении инфракрасного эндоскопа или другого композиция применима для псевдовнутренней ранней диагностики злокачественных новообразований эпителиальных тканей, таких как рак пищевода, рак желудка и рак толстого кишечника, и выявления и диагностики патологических изменений в ходе хирургической операции. Композиция по настоящему изобретению характеризуется тем, что обладает прекрасной интенсивностью флюоресценции и не вызывает проблем, связанных с повреждением живых тканей и ДНК из-за облучения ультрафиолетовым излучением, и, следовательно, композиция применима, поскольку она делает возможной непосредственное исследование или диагностику, отражаю щие живое состояние путем применения обычного регистрирующего флюоресценцию прибора. В частности, поскольку максимальная длина волны флюоресценции сдвинулась в длинноволновую область, интенсивность поглощения при максимальной длине волны значительно увеличена с помощью применения средства для увеличения интенсивности флюоресценции по настоящему изобретению. Соответственно, композиция способствует регистрации флюоресценции без вмешательства возбуждающего излучения и значительно расширяет допущения к устройству регистрирующей системы в целом, включая фильтр флюоресценции.

Claims (11)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Композиция для иммуногистохимического окрашивания, которая содержит диагностический маркер, представляющий собой антитело, связанное с флуоресцентной функциональной группой, которая содержит вещество, выбранное из группы, содержащей глицерофосфолипид, жирную кислоту и поверхностноактивное вещество, состоящее из производного сахарида.
  2. 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что глицерофосфолипид представляет собой ацилглицеролфосфат.
  3. 3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что глицерофосфолипид представляет собой
    1,2-диацил-зп-глицерол-3 -фосфат, содержащий два остатка С10-20 жирных кислот.
  4. 4. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что 1,2-диацил-зп-глицерол-3-фосфат представляет собой димиристоилфосфатидную кислоту или дистеароилфосфатидную кислоту.
  5. 5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что глицерофосфолипид представляет собой ацилглицеролфосфохолин.
  6. 6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что глицерофосфолипид представляет собой
    1.2- диацил-зп-глицерол-3 -фосфохолин, содержащие два остатка С10-20 жирных кислот.
  7. 7. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что
    1.2- диацил-8п-глицерол-3 -фосфохолин представляет собой дистеароилфосфатидилхолин.
  8. 8. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что поверхностно-активное вещество представляет собой октилглюкозид.
  9. 9. Композиция по любому из пп.1-8, отличающаяся тем, что флуоресцентная функциональная группа представляет собой функциональную группу, образованную производным индоцианинового зеленого.
  10. 10. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что флюоресцентная функциональная группа представляет собой функциональную группу, являющуюся производным сложного эфира индоцианинового зеленого и Ν-гидроксисульфосукцинимида.
  11. 11. Композиция по любому из пп.1-10, отличающаяся тем, что антитело представляет собой антитело против антигена злокачественной опухоли.
EA199900302A 1996-09-19 1997-09-18 Композиция для иммуногистохимического окрашивания EA002222B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP24678296 1996-09-19
JP34788696 1996-12-26
JP4551697 1997-02-28
PCT/JP1997/003306 WO1998012560A1 (fr) 1996-09-19 1997-09-18 Composition de coloration immunohistochimique

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA199900302A1 EA199900302A1 (ru) 1999-10-28
EA002222B1 true EA002222B1 (ru) 2002-02-28

Family

ID=27292262

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA199900302A EA002222B1 (ru) 1996-09-19 1997-09-18 Композиция для иммуногистохимического окрашивания

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP0935139B1 (ru)
KR (1) KR20000036240A (ru)
CN (1) CN1130563C (ru)
AT (1) ATE282827T1 (ru)
AU (1) AU719676B2 (ru)
CA (1) CA2266405A1 (ru)
DE (1) DE69731654T2 (ru)
EA (1) EA002222B1 (ru)
NO (1) NO991317L (ru)
WO (1) WO1998012560A1 (ru)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8080097B2 (en) 2003-11-06 2011-12-20 Hewlett-Packard Development Company, L.P. System and a method for the creation of edible, optically invisible images
EP1901781A2 (en) * 2005-06-21 2008-03-26 Mallinckrodt, Inc. Optical imaging contrast agents
CN100345555C (zh) * 2005-07-18 2007-10-31 江苏省中医药研究院 一种止痛巴布膏的制备方法
EP2533049B1 (en) 2010-02-05 2015-08-05 Nichirei Biosciences Inc. Pretreatment solution for immunohistochemical staining and condensed solution thereof
JP5573499B2 (ja) * 2010-08-30 2014-08-20 コニカミノルタ株式会社 蛍光測定方法
US10996170B2 (en) * 2016-03-14 2021-05-04 Massachusetts Institute Of Technology Device and method for imaging shortwave infrared fluorescence
RU2707377C1 (ru) * 2019-03-19 2019-11-26 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ интраоперационной визуализации нарушения герметичности аппаратного шва при продольной резекции желудка

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5547836A (en) * 1990-08-30 1996-08-20 Tropix, Inc. Enhancement of chemiluminescent assays
US5521061A (en) * 1992-07-17 1996-05-28 Aprogenex, Inc. Enhancement of probe signal in nucleic acid-mediated in-situ hybridization studies
JP3135921B2 (ja) * 1993-05-03 2001-02-19 ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー 電気化学ルミネッセンアッセイ
JPH10502958A (ja) * 1994-07-15 1998-03-17 アボツト・ラボラトリーズ 化学発光信号の増強
JP3669752B2 (ja) * 1995-01-30 2005-07-13 第一化学薬品株式会社 診断用マーカー

Also Published As

Publication number Publication date
DE69731654D1 (de) 2004-12-23
WO1998012560A1 (fr) 1998-03-26
EA199900302A1 (ru) 1999-10-28
KR20000036240A (ko) 2000-06-26
CA2266405A1 (en) 1998-03-26
AU4318897A (en) 1998-04-14
NO991317L (no) 1999-05-19
DE69731654T2 (de) 2005-12-01
EP0935139A1 (en) 1999-08-11
AU719676B2 (en) 2000-05-18
NO991317D0 (no) 1999-03-18
EP0935139B1 (en) 2004-11-17
CN1130563C (zh) 2003-12-10
ATE282827T1 (de) 2004-12-15
EP0935139A4 (en) 2002-01-30
CN1238042A (zh) 1999-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100397020B1 (ko) 진단용마커
KR100531708B1 (ko) 근적외 형광 조영제 및 형광 영상화
EP0898574B1 (en) Fluorescent chelates as visual tissue specific imaging agents
JP3669752B2 (ja) 診断用マーカー
US8530459B2 (en) Swallowtail motifs for imparting water solubility to porphyrinic compounds
WO1997040055A9 (en) Fluorescent chelates as visual tissue specific imaging agents
Djanashvili et al. Development of a liposomal delivery system for temperature-triggered release of a tumor targeting agent, Ln (III)-DOTA-phenylboronate
AU2017234681A1 (en) CA IX-target NIR dyes and their uses
EP1370291B1 (en) Device and method for the photodynamic diagnosis of tumor tissue
US20040082863A1 (en) Device and method for the photodynamic diagnosis of tumor tissue
EA002222B1 (ru) Композиция для иммуногистохимического окрашивания
US20020028474A1 (en) Composition for immunohistochemical staining
US6905884B2 (en) Fluorescent cobalamins and uses thereof
ES2622399T3 (es) Cobalaminas fluorescentes y usos de las mismas
Muguruma et al. Labeled anti-mucin antibody detectable by infrared-fluorescence endoscopy
US20230086985A1 (en) Polymeric compounds including an acceptor dye and donor luminophore
WO2005061456A1 (ja) 近赤外蛍光造影剤
Muguruma et al. Endoscopic Molecular Imaging in Gastrointestinal Oncology
Cheng Near Infrared Fluorescence Probes: Towards Applications in Fluorescence Guided Surgery
AU2002255730A1 (en) Device and method for the photodynamic diagnosis of tumor tissue

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU