WO1998012560A1

WO1998012560A1 - Composition de coloration immunohistochimique

Info

Publication number: WO1998012560A1
Application number: PCT/JP1997/003306
Authority: WO
Inventors: Seiichi Shibamura; Susumu Ito; Kazuhiro Takesako; Tatsuro Irimura
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
Priority date: 1996-09-19
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 1998-03-26
Also published as: DE69731654D1; EA199900302A1; KR20000036240A; EA002222B1; CA2266405A1; AU4318897A; NO991317L; DE69731654T2; EP0935139A1; AU719676B2; NO991317D0; EP0935139B1; CN1130563C; ATE282827T1; EP0935139A4; CN1238042A

Description

明細書免疫組織化学的染色用組成物技術分野

本発明は、免疫組織化学的染色用組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は、組織障害性の少ない近赤外線あるいは遠赤外線の照射により励起されて蛍光を発する標識用化合物に対してガン細胞などを特異的に認識する抗体などを結合させた診断用マーカーを含み、蛍光強度に優れた免疫組織化学的染色用組成物に関するものである。背景技術

近年、電子内視鏡の普及によって内視鏡診断が容易になり、胃ガンや大腸ガンなどが初期ガンの状態で確実に発見できるようになつている。もっとも、微小ガンの診断に関しては、電子内視鏡と通常内視鏡を用いた場合の診断能はほとんど同程度である。これは電子内視鏡の機能を活かした新しい診断方法が未だ確立されていないことを意味している。通常内視鏡では識別できない程度の微小病変でも、電子內視鏡下に検知し得る標識抗体で微小病変を標識することができれば、コンピュータ一処理を用いて画像化することにより容易に検出することができる可能性があるが、このような方法は未だ実用化されていない。

電子内視鏡を用いた上記のような診断方法を確立するためには、免疫組織化学的染色法により生体組織を直接染色することが必要である。固定化標本の染色法はすでに確立された技術である。しかしながら、非固定化標本の染色法は未だ当業者に利用可能な技術ではない。例えば、非固定化標本の免疫染色法については報告があるが（四国医学雑誌， 29, 180, 1987)、近赤外線を用いた当該領域やの切除新鮮標本や生体組織そのものの免疫染色法は未だ報告されていない。

一方、上記の診断方法には電子内視鏡下に検知し得る診断用マーカー（標識化された抗体など）も必要である。紫外線による励起されて紫外 ·可視光の蛍光を発する標識用化合物を抗体に結合した診断用マーカーが知られており、生体外に摘出された組織中に存在するガン細胞やガン組織の検出に汎用されている。しかしながら、紫外線により励起する蛍光性の診断用マ—カーを用いる方法は、紫外線により生体組織や DNA の損傷を惹起するので生体に適用することはできない。生体に直接適用できる診断用マーカ一は未だ知られていない。

ィンドシアニングリーン（ICG) は赤外線内視鏡下で特異な吸収を示して蛍光を発することが知られている。赤外線内視鏡を用いてィンドシアニングリ一ンを使用した例が知られているが（Gastroenterological Endoscopy, 34, pp. 2287-2296, 1992 ; 及び Gastrointestinal Endoscopy, 40, pp. 621-2 : 628, 1994)、これらはいずれも血管内に ICG を投与したものである。また、一般的に、インドシァニングリーンをはじめとする蛍光性物質は疎水性が高く、単体で腸管内に投与された場合に速やかに吸収されるので、母核あるいは側鎖部分に親水性のスルホニル基などを導入することにより水溶性を高め、測定効率の向上と吸収後の毒性の問題を回避する試みがなされている（以上の背景技術に関する総説として、喜納兼勇著「2 . 臨床検査用（診断用）色素」の項、 pp. 223- 230、入江正浩監修「機能性色素の最新応用技術」、株式会社シーエムシー発行、 1996年などを参照のこと）。本発明者らは、ィンドシアニングリ一ンの誘導体を種々合成することにより、近赤外線ないし遠赤外線により励起され蛍光を発するィンドシアニングリーン誘導体を製造することに成功するとともに、上記のィンドシアニングリ一ン誘導体を標識用化合物として用いて抗ガン抗原抗体等と反応させることにより、生体に直接適用可能な診断用のマーカーを製造することができること、並びに、そのような診断用マーカーが免疫組織化学的染色法により生体組織を直接染色するのに有用であることを見出し、これらの発明について特許出願した（特願平 7- 12283 号）。

また、本発明者らは水溶性に優れた診断用マーカ一を提供すベく鋭意研究を行つた結果、.上記のインドシアニングリーン誘導体のうち、分子内対イオン（ツビッタ一イオン）を形成可能な化合物については、対イオンの形成により分子のィオン性が低下して水溶性が損なわれる場合があるが、該誘導体にヨウ化ナ卜リゥムなどを作用させると分子内で対ィオンが形成されず、分子全体のィォン性が保たれて水溶性が顕著に増大することを見い出し、これらの発明についても特許出願した（特願平 7- 223613号）。

しかしながら、インドシアニングリ一ン誘導体などの蛍光性の標識用化合物を抗体に結合させた診断用マーカ一についてさらに研究を行った結果、これらの診断用マーカーの蛍光強度が、結合前のインドシアニングリーン誘導体（標識用化合物）自体の蛍光強度に比べて、約 10分の 1程度に減弱してしまうことが判明した。上記の診断用マーカーを用いて生体内での免疫組織化学的染色を行い、癌組織などの微小組織を検出するにあたり、通常の蛍光検出装置よりも格段に高感度な装置を用いればこの問題を回避できる可能性があるが、高性能装置の開発と実用化には多大な労力と投資が必要である。一方、蛍光性の標識用化合物を抗体に結合させた診断用マーカーに特異的に作用してその蛍光強度を増強する蛍光強度増強剤を提供できれば、従来利用可能な検出装置を用いて染色組織を簡便かつ確実に検出できる可能性がある。発明の開示

本発明の目的は、ィンドシアニングリーン誘導体などの蛍光性の標識用化合物を抗体に結合させた診断用マーカーに作用し、その蛍光強度を増強する物質を提供することにある。また、上記の診断用マーカーを生体内での免疫組織化学的染色に用いるにあたり、その蛍光強度を顕著に増強させた免疫組織化学的染色用の組成物を提供することが本発明の目的である。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、ジミリス卜ィルホスファチジン酸及びジステアロイルホスファチジン酸などのァシルグリセ口一ルリン酸や、ジステアロイルホスファチジルコリンなどのァシルグリセロールホスホコリンなどのグリセロリン脂質；ステアリン酸などの脂肪酸；並びに、ォクチルダルコシドなどの糖誘導体の界面活性剤からなる群から選ばれる物質が、ィンドシァニングリ一ン誘導体などの蛍光性標識用化合物を抗体に結合させた診断用マーカーの蛍光強度を顕著に増強することを見いだした。また、これらの物質と診断用マーカーとを含む組成物が生体に適用可能な免疫組織化学的染色用の組成物として極めて有用であり、さらに上記組成物においてォクチルグルコシドなどの糖誘導体の界面活性剤を必須成分として用いると、溶解性に優れた安定な組成物を提供できることを見いだした。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。

すなわち本発明は、免疫組織化学的染色用の組成物であって、蛍光性官能基が結合した抗体を含む診断用マーカーと、グリセ口リン脂質、脂肪酸、及び糖誘導体である界面活性剤からなる群から選ばれる物質とを含むことを特徴とする組成物を提供するものである。この発明の好ましい態様によれば、グリセ口リン脂質がァシルグリセ口一ルリン酸である組成物；ァシルグリセ口一ルリン酸が 2個の C_{1 Q}— _2Q脂肪酸残基を含む 1 , 2-ジァシル- sn-グリセロール 3— リン酸である組成物； 1. 2-ジァシル- sn-グリセロール 3—リン酸がジミリストイルホスファチジン酸又はジステアロイルホスファチジン酸である組成物；グリセ口リン脂質がァシルグリセロールホスホコリンである組成物；アンルグリセロールホスホコリンが 2 1面の C_{1 ()}__2Q脂肪酸残基を含む 1, 2-ジァシル -sn-グリセロール 3—ホスホコリンである組成物； 1, 2-ジァシル _sn-グリセロール 3—ホスホコリンがジステアロイルホスファチジルコリンである組成物；並びに、該界面活性剤がォクチルグルコシドである組成物が提供される。

また、本発明により、グリセ口リン脂質及び脂肪酸からなる群から選ばれる物質と上記界面活性剤とを含む上記組成物；該蛍光性官能基がィンドシアニングリンーン誘導体に由来する官能基である上記組成物；蛍光性官能基がィンドシァ二ングリ一ン -N—ヒドロキシスルホスクシンィミドエステルに由来する官能基である上記組成物；並びに抗体が抗ガン抗原抗体である上記組成物が提供される。さらに本発明の別の態様により、蛍光性官能基が結合した抗体を含む免疫組織化学的染色用の診断用マーカーの蛍光強度増強剤であって、グリセロリン脂質、脂肪酸、及び糖誘導体である界面活性剤からなる群から選ばれる物質を含む蛍光強度増強剤；蛍光性官能基が結合した抗体を含む診断用マーカ—と、グリセロリン脂質、脂肪酸、及び糖誘導体である界面活性剤からなる群から選ばれる物質とを含むことを特徴とする組成物を用いて免疫組織化学的に生体組織を染色する方法；並びに、蛍光性官能基が結合した抗体を含む診断用マーカーと、グリセロリン脂質、脂肪酸、及び糖誘導体である界面活性剤からなる群から選ばれる物質とを含むことを特徴とする組成物を用いて免疫組織化学的に癌を診断する方法が提供される。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の組成物を滴下した木綿ガーゼ糸の繊維組織を通常光及び赤外光照射下で顕微鏡撮影した写真である。図中、（a) は通常光下で撮影した結果を示し、（b) は赤外光照射下で撮影した結果を示す。

第 2図は、 ICG-sulfo-OSu を結合させたマウス抗ムチン抗体に対して、蛍光強度増強剤であるジミリストィルホスファチジン酸及びォクチルグルコシドを添加する前後での吸収スぺクトル及び蛍光スぺクトルの変化を示す図である。図中、 (c) は蛍光強度増強剤添加前の吸収スぺクトル；（c ' )は蛍光強度増強剤添加後の本発明の組成物の吸収スぺクトル；（d) は蛍光強度増強剤添加前の蛍光スぺクトル；及び、（d ' )は蛍光強度増強剤添加後の本発明の組成物の蛍光スぺクトルを示す。発明を実施するための最良の形態

本発明の組成物は、免疫組織化学的染色用の組成物であり、蛍光性官能基が結合した抗体を含む診断用マーカーと、グリセ口リン脂質、脂肪酸、及び糖誘導体である界面活性剤からなる群から選ばれる物質とを含むことを特徴としている。また、本発明の好ましい態様の組成物では、蛍光性官能基が結合した抗体を含む診断用マーカー、グリセ口リン脂質及び脂肪酸からなる群から選ばれる物質、並びに糖誘導体である界面活性剤を含むことを特徴としている。

本明細書において、「グリセロリン脂質（glycerophospholipid)」とは、グリセロールを基本骨格とするリン脂質を意味しており、より具体的にはグリセロールリン酸（またはグリセ口リン酸とも呼ばれる： glycerol phosphate) を基本骨格として含むリン脂質を意味している。例えば、 1, 2-ジァシル -sn-グリセロール 3—ホスホコリン（ホスファチジルコリン）などのァシルグリセロールホスホコリン類；

1, 2-ジァシル- sn-グリセロール 3—ホスホエタノールアミン（ホスファチジルエタノールアミン）などのァシルグリセロールホスホエタノールァミン類； 1, 2-ジァシル -sn-グリセロール 3 -ホスホ- L- セリン（ホスファチジルセリン）などのァシルグリセロールホスホセリン類；ホスファチジルイノシトール類； 1, 2-ジァシル -sn -グリセロール 3—リン酸（ホスファチジン酸）などのァシルグリセロールリン酸類；及びジホスファチジルグリセロールなどはグリセ口リン脂質の代表的な化合物である。

上記のグリセロリン脂質を構成するグリセ口一ルリン酸としては、グリセロール 1—リン酸、グリセロール 2—リン酸、又はグリセロール 3—リン酸のいずれの異性体であってもよく、立体配置は特に限定されないが、天然型の sn-グリセロール 3—リン酸（L- a - グリセロールリン酸）により構成されるグリセ口リン脂質を好適に用いることができる（グリセロール 3—リン酸は、 HOCHo- CH(OH)- CH₉0- P0₃H₂ で表される）。上記のグリセ口リン脂質のうち、本発明の組成物において好適に用いられるのは、ァシルグリセロールリン酸又はァシルグリセロールホスホコリンである。

本明細書において「ァシルグリセロールリン酸」という用語は、グリセロールリン酸のモノ脂肪酸エステル又はジ脂肪酸エステル、すなわち、下記式： A^OCl^ -CH(OA²)-CH₂0-PO₃H₂ (式中、 A¹及び A²はそれぞれ独立に水素原子又は脂肪酸の残基であるァシル基を示すが、 A¹及び A²が同時に水素原子となることはない）で表される化合物を意味している。上記式中、モノ脂肪酸エステル又はジ脂肪酸エステルを形成する脂肪酸残基（Α½Η及び/又は A²0Hで表される脂肪酸からそれぞれ- 0H で表される水酸基を除いた基のことである）としては、炭素数 8 ~ 22 ( _₂₂)程度、好ましくは炭素数 10〜20 (C_r 。o) 程度の脂肪酸残基を用いることができ、例えば、炭素数 10、炭素数 12、炭素数 14、炭素数 16、炭素数 18の脂肪酸由来の残基などが好適である。

このような脂肪酸残基は直鎖若しくは分枝鎖のいずれでもよく、飽和又は不飽和のいずれであってもよい。また、ジ脂肪酸エステルを構成する脂肪酸は、同一であっても異なっていてもよい。ァシルグリセロールリン酸として、例えば、 sn -グリセロール 3—リン酸のジステアロイルエステル（ジステアロイルホスファチジン酸）又はジミリス卜ィルエステル（ジミリストイルホスファチジン酸）などを好適に用いることができる。ァシルグリセロールリン酸としてアル力リ付加塩を用いてもよい。このようなアルカリ付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩を挙げることができる。これらのうち、ジステアロイルホスファチジン酸又はジミリス卜ィルホスファチジン酸のナ卜リゥム塩が好ましい。

本明細書において「ァシルグリセロールホスホコリン」という用語は、グリセロールホスホコリンのモノ脂肪酸エステル又はジ脂肪酸エステル、すなわち、下記式： A³0CH₉-CH(OA⁴)- CH_o0- P0(0H— )0CH_?CH₉N ^Ύ (CHg)g (式中、 A³及び A⁴はそれぞれ独立に水素原子又は脂肪酸の残基である了シル基を示すが、 Α^ϋ及び A⁴が同時に水素原子となることはない）で表される化合物を意味している。上記式中、モノ脂肪酸ェステル又はジ脂肪酸ェステルを形成する脂肪酸残基（Α³0Η及び Ζ又は A⁴0H で表される脂肪酸からそれぞれ- OH で表される水酸基を除いた基）としては、炭素数 8 ~22 (C₈_₂。)程度、好ましくは炭素数 10〜20 (C₁₀_₂₀) 程度の脂肪酸残基を用いることができ、例えば、炭素数 10、炭素数 12、炭素数 14、炭素数 16、炭素数 18 の脂肪酸由来の残基などが好適である。このような脂肪酸残基は直鎖若しくは分枝鎖のいずれでもよく、飽和又は不飽和のいずれであってもよい。また、ジ脂肪酸エステルを構成する脂肪酸は、同一であっても異なっていてもよい。ァシルグリセロールリン酸として、例えば、 sn-グリセロール 3—ホスホコリンのジステアロイルエステル（ジステアロイルホスファチジルコリン酸）などを好適に用いることができる。

脂肪酸としては、例えば、炭素数 8〜22 (C。 ₂。)程度、好ましくは炭素数 10〜20 (C₁₀_₂₀) 程度の脂肪酸を用いることができ、例えば、炭素数 10、炭素数 12、炭素数 14、炭素数 16、炭素数 18の脂肪酸由来の残基などが好適である。脂肪酸は直鎖若しくは分枝鎖のいずれでもよく、飽和又は不飽和のいずれであってもよい。例えば、ステアリン酸などを好適に用いることができる。糖誘導体である界面活性剤としては、タンパク質を実質的に変性させず、皮膚や粘膜などの生体組織に対する刺激性が低いものであれば特に限定されないが、例えば、ォクチルグルコシド、ヘプチルダルコシド、ォクチルチオグルコシド、又はへプチルチオグルコシドなどを用いることができる。

本発明の組成物は、グリセ口リン脂質、脂肪酸、及び糖誘導体である界面活性剤からなる群から選ばれる物質の 1種又は 2種以上を蛍光増強剤として含んでいてもよい。上記の糖誘導体はそれ自体で蛍光強度増強作用を有しているが、グリセロリン脂質及び脂肪酸からなる群から選ばれる物質が水に対して難溶である場合には、グリセロリン脂質及び脂肪酸からなる群から選ばれる物質と組み合わせて用いるのが好適である。上記糖誘導体の界面活性作用によりァシルグリセ口— ルリン酸などの水不溶性物質を水に可溶化することができるので、組成物の調製が容易になり、かつ製品の安定性を顕著に改善できる場合がある。また、糖誘導体とグリセ口リン脂質及び脂肪酸からなる群から選ばれる物質とを組み合わせて用いることにより、相乗的な蛍光強度増強を期待できる場合もある。例えば、ォクチルグルコシドとジステアロイルホスファチジン酸とを含む組成物、ォクチルダルコシドとジミルストィルホスファチジン酸とを含む組成物は本発明の好適な態様である。

上記の蛍光強度増強剤の配合量は特に限定されず、使用する診断用マーカ—の種類や励起光の種類などに応じて適宜選択することができる。また、上記糖誘導体とグリセ口リン脂質及び脂肪酸からなる群から選ばれる物質とを組み合わせて用いる場合には、グリセロリン脂質及び脂肪酸からなる群から選ばれる物質を可溶化できるように適宜の量の糖誘導体を配合することができる。例えば、糖誘導体を臨界ミセル澳度付近（ォクチルグルコシドでは約 25 mM 程度）の濃度で用いることが好ましい場合がある。

本発明の組成物に含まれる診断用マーカ一としては、蛍光性官能基が抗体に結合した診断用マーカーであって、免疫組織化学的染色用に使用可能なものであれば特に限定されない。例えば、 600 〜800 nmの波長の励起光を照射することにより 780 nm以上、好ましくは 780〜840 nm以上の波長の蛍光を発する診断用マーカ一を好適に用いることができる。これらのうち、近赤外線ないし遠赤外線により励起することができ、 810 nm以上、好ましくは 820 nm以上の蛍光を発する診断用マーカーは、診断にあたり生体組織や DNA の損傷を惹起することがないので本発明の組成物に特に好適に用いられる。また、水溶性の高い診断用マーカーを用いることも好ましい。本発明の組成物は 1種又はそれ以上の診断用マーカーを含んでいてもよい。

本明細書において「蛍光性官能基」という用語は、蛍光性の標識用化合物に由来する蛍光性の部分構造であって、標識用化合物と抗体とを反応させることによつて抗体上に結合した化学構造の意味で用いる。抗体に対して蛍光性官能基を結合させるために用いる標識用化合物としては、例えば、インドシアニングリーン誘導体を用いることができる。好ましい標識用化合物として、例えば、 Biooraganic & Medicinal Chemistry Letters. 5(22)， pp. 2689-2694, 1995に記載されたインドシアニングリーン- N—ヒドロキシスクシンイミドエステル（ICG-OSu)やインドシアニングリーン- N—ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（ICG-sulfo- OSu) などを用いることができる。これらの標識用化合物を用いると、蛍光性官能基としてインドシアニングリーン誘導体の母核構造全体を抗体上に容易に導入することが可能である。

蛍光性官能基と抗体とは直接結合していてもよいが、蛍光性官能基と抗体とをリンカ一あるいはアルブミン等の夕ンパク質を介して結合してもよい。アルブミン等の蛋白には、上記の蛍光性官能基を 1または 2以上、好ましくは約 10個以上導入することができ、抗体の導入も容易にできるので、このような蛋白を用いた診断用マーカ一は好ましい態様である。

本発明の組成物に含まれる診断用マーカーのうち、好ましい診断用マーカーとして、

① (a) 抗体と、（b) 該抗体に結合した下記の式（I ) ：

(式中、 R¹及び R²はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、ァリール基、アルコキシ基、又はスルホン酸基を示し； R³はアルキル基、スルホン酸アルキル基又はアミノ置換アルキル基を示し： X ― は必要に応じてァニオン種を示し； Y は炭素数 1ないし 10のアルキレン基、または酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1以上の原子を含む炭素数 1ないし 10のアルキレン基を示す）で示される蛍光性官能基とを含む診断用マーカー；又は

②（a) 抗体と、（b) 該抗体に結合した下記の式（Π )：

(式中、 R⁴及び R⁵はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はスルホネート基を示し； R⁶はアルキレン基を示し； M + はアル力リ金厲イオンを示し； Q ― はハロゲンイオン、過塩素酸イオン、又はチォシアン酸イオンを示し； Y は炭素数 1ないし 10のアルキレン基、または酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1以上の原子を含む炭素数 1ないし 10のアルキレン基を示す）で示される蛍光性官能基とを含む診断用マ —カー；

を挙げることができる。

上記一般式（I ) 及び（Π )で示される蛍光性官能基は、母核に結合した- Y- CO-基のカルボ二ル基を介して抗体と結合している。上記一般式（I ) 中、 R¹及び R²はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はスルホン酸基 (_S0₃H) を示す。 R¹及び ^は、それぞれフヱニル基上の任意の位置に置換することができる。アルキル基としては、炭素数 1ないし 6程度の直鎖又は分枝の低級アルキル基、好ましくは炭素数 1ないし 4の直鎖又は分技鎖の低級アルキル基を用いることができる。例えば、メチル基、ェチル基、プロピル基、イソプロピル基、 n-ブチル基、 sec- ブチル基、 tert- ブチル基などが好適である。

R¹及びが示すァリール基としては置換又は無置換のフエ二ル基、ナフチル基、ピリジル基などを用いることができる。アルコキシ基としては、炭素数 1ないし 6程度、好ましくは炭素数 1ないし 4の直鎖又は分枝鎖の低級アルコキシ基を用いることができ、より具体的には、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ィソプロポキシ基、 n-ブトキシ基、 sec-ブトキシ基、 tert- ブトキシ基などを用いることが好適である。スルホン酸基としては、遊離形態の - S0₃H基の他、スルホン酸基の塩基付加塩（スルホネー卜基）、例えば、ナ卜リゥム塩、力リゥム塩などを用いることができる。これらのうち、及び R²がそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はスルホネート基であることが好ましい。

R³はアルキル基、スルホン酸アルキル基又はアミノ置換アルキル基を示す。これらの基において、アルキル基としては、例えば上記のものを使用することができる。スルホン酸アルキル基のスルホン酸基あるいはァミノ置換アルキル基のァミノ基は、それぞれアルキル基上のいかなる位置に置換していてもよいが、例えば、アルキル基の末端に置換したものを用いることができる。

スルホン酸基及びアミノ基は、それぞれ塩基付加塩及び酸付加塩を形成していてもよい。例えば、スルホン酸がナトリゥム塩や力リゥム塩を形成したものや、ァミノ基がアンモニゥムハライド等の塩を形成したもの、ァミノ基が 4級化されたものなども好ましい。また、アミノ基として置換または無置換のアミノ基を用いることができる。スルホン酸アルキル基又はァミノ置換アルキル基の例として、例えば、スルホン酸メチル基（- CH₂S0₃H)、スルホン酸ェチル基、アミノメチル基、アミノエチル基、メチルアミノエチル基、およびこれらの塩などを挙げることができる。式（I ) で示される蛍光性官能基において、 X ― は必要に応じて存在していてもよいァニオン種、例えばハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸ィオンなどを示す。 X ― で示されるこれらのァニオン種は、 Y-C0- 基が置換する母核内の窒素原子上の陽電荷を打ち消し、式（I) で示される蛍光性官能基を全体として中性に維持するために作用する。従って、例えば、式（I) で示される蛍光性官能基中の!?¹, R², 及び R³のうちの一つの基がァニオン性の基である場合には、その基の陰電荷が母核内の 4級窒素原子上の陽電荷を打ち消して分子内ッビッター 'ィォンが形成されるので、 Γ が不要になる場合がある。一方、例えば、 R¹又は R²のいずれかがスルホン酸基であり、 R³がァミノ置換アルキル基である場合には、これらの基の間で電荷が釣り合うので、 Γ が必要になる場合がある。

上記一般式（ Π )で示される蛍光性官能基において、 R⁴及び R⁵はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はスルホネート基を示す。 R⁴及び ^は、それぞれフヱニル基上の任意の位置に置換することができる。アルキル基及びァルコキシ基としては上記のものを用いることができ、スルホネート基（- S0₃_ M ' ： M+ はアルカリ金属イオンを示し、 Q— の対イオンである Μ^τ とは同一でも異なっていてもよい）としては、例えばナトリウムスルホネー卜基又は力リゥムスルホネート基などを用いることができる。

R⁶は直鎖又は分枝鎖のアルキレン基を示し、例えば、炭素数 1〜6 程度、好ましくは炭素数 2〜5 の直鎮又は分枝鎖の低級アルキレン基、より好ましくは、トリメチレン基、テトラメチレン基、又はペンタメチレン基を用いることができる。

R⁶に置換する- S0₃—基は、該アルキレン基の任意の位置に置換することができるが、例えばアルキレン基の末端に置換したものを用いるのが好適である。より具体的にいうと、 R^o-S0₃— として、例えば- (CH₂)_k -S0g~ (kは 2-4 の整数を示す）で示される基などが好適である。

M⁺ はアル力リ金厲イオンを示す。アル力リ金属イオンとして、好ましくはナトリウムイオン又はカリウムイオンを用いることができる。 Q— はハロゲンイオン、過塩素酸イオン、又はチォシアン酸イオンを示し、好ましくは、塩素イオン、臭素イオン、又はヨウ素イオンなどを用いることができる。これらのうち、ヨウ素イオンが特に好ましい。いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、上記の蛍光性官能基は、 Y- CO-基が置換する窒素原子上の陽電荷（上記式中 N+ で示す）に由来する陰電荷とを有しているが、 M ⁺ Q で示されるアル力リ金属ると、窒素原子上の陽電荷（上記式中 N+ で示す）と Q— との間、並びと IT との間で、それぞれイオン結合が形成される。この結果、分子内

での対イオン形成が阻止され、分子全体のィォン性が維持されて水溶性が顕著に増大する。

上記一般式（I) 及び（I I)において、 Y は炭素数 1ないし 10の直鎖または分枝のアルキル基、好ましくは炭素数 3〜5 の直鎖若しくは分枝鎖のアルキレン基、より好ましくは、卜リメチレン基、テトラメチレン基、又はペンタメチレン基を示す。または、 Y は酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1以上の原子を含む炭素数 1ないし 10の直鎖または分枝のアルキル基を示す。 -Y- CO-で示される基としては、例えば、 - CH_n-C0-； - (CHり） ₂- CO -； - (CH₂)₉- CO-； - (CH₉)₄ - CO-; - (CH₂)₅- CO-； - CH。- CO- NH- (CH₂)₅- CO-； - (CH₂)₀- CO- NH- (CH。）₅- CO- ; - (CH₂)₃- CO -NH-(CH₂) ₅- CO-； - (CH₂)₄- CO- NH- (CH₂) ₅- CO-； -CHg-CO-NH- (CH₀) _r -CO- NH- (CH₂) ₀ -CO- ; - (CH_o) -C0- (Ν, Ν ' - piperadinyl)- (CH₂)₂- CO (Ν' N' - piperadinylは、ピペラジンの 1-位に- (CH₂)₄-CO- 基が置換されており、 4-位に- (CH₂)₂- Z基が置換されていることを示す。以下、同様である。 ) ；または- CH₂- CO- NH- (CH₂)₅-CO- (Ν, Ν ' - piperadinyl)- (CH₂)₂-CO-などを利用することができる。

また、 -Y- CO-基のカルボニル基が、さらに炭素数 1〜10の直鎖または分枝のァルキレン基；酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1以上の原子を含む炭素数 1〜10の直鎖または分枝のアルキレン基；または - NH- NH-基などを介して抗体と結合していてもよい。なお、上記の好ましい診断用マーカ一は、特願平 7- 12283 号明細書及び特願平 7-223613号明細書に具体的に開示されており、その製造方法も上記明細書に詳細に記載されているので、当業者はこれらの開示を基にして、上記の好ましい診断用マーカーを容易に製造可能である。また、上記の式（I) 及び（Π)で示される蛍光性官能基を抗体と結合させるための標識用化合物も同様に上記明細書に開示されている。なお、式（I) 及び（I I)で示される蛍光性 5 P T/J 97 官能基においては、便宜上、窒素原子上の陽電荷（上記式中 N⁺ で示す）を母核内の一の窒素原子上に固定して記載したが、共役二重結合を介して陽電荷がもう一つの窒素原子に移動可能であることは当業者に容易に理解されよう。

診断用マーカ一を構成する抗体としては、ガンに特異性の高い抗体など各種の抗原を認識する抗体を利用することができる。例えば、ガン細胞やガン組織、好ましくは初期ガン細胞や初期ガン組織に特異的に結合する抗ガン抗原抗体を用いることができ、より具体的には、 CEA, AFP, CA19 - 9, NSE, DU- PAN- 2, CA50, SPan -1, CA72-4, CA125, HCG, p53, STN (シァリル Tn抗原）， c- erbB- 2 蛋白に特異的に反応する胃に関する抗腫瘍抗体. 抗ムチン抗体，抗糖鎖抗体などの他、食道ガン、大腸ガン、直腸ガン、皮膚ガン、子宮ガン等の腫疡抗原に特異的に反応する抗腫瘍抗体を用いることができる。また、抗病原体蛋白抗体や、抗ガン抗原抗体にァビジン又はビォチンなどの増幅系を結合させた抗体などを用いてもよい。もっとも、上記の説明した抗体は例示のためのものであり、診断用マーカーに用いることができる抗体は上記のものに限定されることはなく、検査 '診断の目的となる標的細胞や標的組織に実質的に特異的に結合する性質を有する抗体ならば、いかなるものを用いてもよい。

診断用マーカーを構成する抗体は、ガン抗原などに特異的に結合するので、ガン細胞やガン組織などの病巣が診断用マーカーにより免疫的に染色される。その後、赤外線レーザ一などを用いて近赤外線ないし遠赤外線を照射することにより蛍光を発する病巣を確認することができるが、本発明の組成物に含まれる蛍光強度増強剤が診断用マーカーの蛍光強度を数倍〜数十倍程度に増強するので、これらの蛍光測定装置によってより容易に病巣を確認することが可能になる。

本発明の組成物は、一般的には、水性組成物の形態、又は微粒子伏粉末若しくは凍結乾燥粉末などの固体状態で提供される。蛍光強度増強剤として糖誘導体とァシルグリセロールリン酸とを含む好適な水性組成物は、例えば、ォクチルグルコシドなどの界面活性剤を生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水などの水性媒体に必要に応じて溶解した後、例えばジステアロイルホスファチジン酸のナトリウム塩を添加して室温〜約 60°C程度、好ましくは約 50°C程度、より好ましくは約 40°Cの加温下で溶解し、その後、診断用マーカーを生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水などの水性媒体に溶解した溶液を加えて混合することにより調製できる。もっとも、本発明の組成物の調製方法は上記の方法に限定されることはなく、当業者が適宜の方法を選択できることはいうまでもない。上記の水性組成物を凍結乾燥することにより凍結乾燥粉末の形態の組成物として本発明の組成物を製造することも可能である。

また、本発明の組成物は、蛍光強度増強剤を含む水溶液、例えばァシルグリセロールリン酸と必要に応じて界面活性剤とを含む水溶液を、診断用マーカーを含む水溶液とは別に調製しておき、診断の直前に両者の溶液を用時混合して調製してもよい。さらに、診断用マーカーを含む水溶液を投与した後、蛍光強度増強剤を含む水溶液を別途に投与して診断を行なうことも可能である。

本発明の組成物を製造するには、薬理学的、製剤学的に許容しうる添加物として、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壤補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、 pH調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。例えば、ブドウ糖、乳糖、 D- マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、力オリン、グリセリン、精製水、又はハ一ドファット等の基剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、 D-マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等の pH調節剤；ビタミン A、ビタミン E、コェンザィム Qなど安定化に寄与しうる薬剤等の製剤用添加物を添加してもよい。

本発明の免疫組織化学的染色用の組成物を診断薬として用いる場合の例として赤外線内視鏡を用いた検査方法について説明すると、病巣の存在が疑われる組織に対して内視鏡的に上記診断薬（濃度 0. 1〜1, 000 mg/ml 程度のもの）を噴霧あるいは塗布して病変部を染色し、適宜洗浄を行って余分な診断薬を組織から除去した後、近赤外線ないし遠赤外線、より具体的には、例えば 600〜800 nm、好ましくは 768 nm程度の波長の光線、好ましくはレーザー励起光などを照射することにより、蛍光を発する病巣部を検出することかできる。本発明の組成物は生体に直接適用でき、かつ、蛍光強度に優れる点に特徴があるが、本発明の組成物の使用態様は生体に適用するものに限定されることはなく、パラフィン固定化標本などの固定化標本に対して適用可能であることは言うまでもない。

蛍光の検出には、例えば、赤外線内視鏡あるいは赤外線顕微鏡などの手段を用いることができ、例えば、透過特性を合わせたフィルタ—、具体的には、励起光遮断特性を有するフィルターと蛍光検出用フィルターを 1枚あるいは 2枚以上を組み合わせて用いることができる。本発明の組成物を生体に適用して内視鏡検査を行う際には、内視鏡としては倍率が 10〜1, 000 程度のものを用いることができ、例えば、顕微鏡レベルの倍率を有する赤外線内視鏡などは用いることが好ましい。また、内視鏡には、本発明の組成物を噴霧ないし塗布する手段と、洗浄手段とが設けられていてもよい。

生体外に摘出した組織や標本などに本発明の組成物を適用する場合には、蛍光の検出に赤外線顕微鏡を用いることができる。また、通常光下にプレパラートを観察して染色部位を確認した後に、暗室内で赤外線光源下に赤外線フィルムで撮影を行うか、ビデオフィルムなどの記録媒体に収録してコンピューターによる面像解析を行うことも可能である。実施例

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されることはない。

例 1

ィンドシアニングリーン誘導体として ICG- sulfo- OSu (Biooraganic & Medicinal Chemistry Letters, 5(22). pp. 2689-2694, 1995) を用い、この刊行物に記載された方法に準じてマウス抗 CEA 抗体 1分子あたり約 16分子の ICG- sulfo- OSu を結合させた診断用マーカーを製造した。この診断用マーカーは使用直前まで凍結乾燥状態で保存した。この診断用マーカーを 37. 5 mMのォクチルグルコシドを含む PBS ― に溶解して、吸光スぺクトル及び蛍光スぺクトルを測定した。その結果、最大吸収波長： 802. 8 nm、モル吸光係数： 3. 90 x l0⁵M— cm—¹ (スリット幅： 0. 2 nm、対照： 37. 5 mM ォクチルグルコシドを含む PBS— 、常温測定）；励起波長； 768 nm、蛍光波長 820 nm (励起光側スリット幅： 5. 0 nm、蛍光側スリット幅： 5. 0 nm) であつた。

一方、リン酸緩衝生理食塩水（10 ml, pH 7. 4)にォクチルグルコシド（株式会社同仁化学研究所製、 880 mg) を静かに加えて、 40°Cの水浴上で攪拌しながら溶解させた。続いて、この溶液にジステアロイルホスファチジル酸ナトリウム（148. 8 mg) を加え、 60°Cの水浴上で攪拌しながら溶解させた後、リン酸緩衝生理食塩水を加えて最終液量を 20 mlとし、室温に戻した後に 1 ml ずつ分注して使用時まで凍結保存した。この溶液のジステアロイルホスファチジル酸ナ卜リゥム及びォクチルグルコシドの最終濃度は、それぞれ 10 mM及び 150 mM であった。

凍結乾燥状態の上記診断用マーカー（54 g)に 10!¾(v/_V) ジメチルスルホキシド（MS0)—リン酸緩衝生理食塩水（20 1， H 7. 4)を添加して溶解し、この溶液各 5 ^ 1 に加温したジステアロイルホスファチジル酸ナトリゥム及びォクチルグルコシドの上記溶液（5 1)を加えて、マイクロピぺッ卜で静かに吸排を繰り返して混合し、水溶液形態の本発明組成物を得た。また、診断用マーカー溶液に替えてインドシアニングリーン（ICG)溶液、 ICG- sulfo- OSu 嫌、及び水（対照）を用いて、同様の操作により水性組成物を作成した。上記の各試料溶液（添加群）と、ジステアロイルホスファチジル酸ナトリウム及びォクチルグルコシドを含む溶液を添加しない試料（非添加群）について 800 nm以上の蛍光発光を観察してジステァロイルホスファチジル酸ナトリゥム添加による蛍光強度の増加を評価した。診断用マーカーにジステアロイルホスファチジル酸ナ卜リゥム溶液を添加した群では、明らかに蛍光の增強が認められた。

また、可視光から近赤外光域まで観察可能な赤外線顕微鏡としてオリンパス光学社製の BHSM- IRを用い、試料の下側に 710- 790 nmの光を透過する励起光透過フィルター（朝日分光社製）を配置し、試料上側に 810- 920 nraの光を透過する励起光力ッ卜フィルター（朝日分光社製）を配置した。 CCD として日立電子社製 KP- Mlを用い、 CCD を経由した蛍光を画像取り込み装置（オリンパス光学社製， EVIP- 230) に取り込み、増幅システム（ォリンパス光学社製）を経て画像記録装置（ォリンパス光学社製， S321S)に記録した。

上記試料各 5 1 をスライドグラス上に置いた木綿ガーゼ糸（1 cm) 上に滴下して、上記の光学系を用いて通常光及び赤外光照射下での画像を得た。蛍光強度は、画像上で全く蛍光が観察できないものを（-）とし、僅かに蛍光が識別できるものを（+) 、明瞭に描出されたものを（++++)とし、その中間を（++)及び（+++) の 2段階に分けて評価した。なお、記録画像は、前述の機器により、原画像の積算処理、背景画像の積算処理、減算画像の作成、フィルタリング画像の作成、及びコントラスト強調の工程を含む画像処理を行って最終画像に変換した。結果を以下の表 1 に示す。診断用マーカーにジステアロイルホスファチジル酸ナ卜リゥムを添加した群では、明らかに蛍光の増強が認められた。表中、濃度は全て I C G換算濃度を示している。また、図 1は、本発明の組成物を滴下した木綿ガーゼ糸を上記の光学系を用いて通常光及び赤外光照射下で撮影した写真である。図中、（a) は通常光下で撮影した結果を示し、（b) は赤外光照射下で撮影した結果を示す。

表 1 被検試料 I CG換算濃度非添加群添加群

ICG 1 mg/ml ++ ++

10 u g/ml

1 β g/ml

ICG-sulfo-OSu 100 g/ml + ++

10 g/ml

1 g/ml

ICG-sulfo-OSu- 120 μ g/ml +++

標識抗体 10 g/ml ++

1 fi g/ml

水

+++ 明確に明るく見える

++ 明るく見える

+ 見える

+ かすかに見える例 2

例 1 と同様にして、マウス抗ムチン抗体（抗 MUC- 1 : Yamamoto, H. , et al. , Japanese Journal of Cancecer Recearch, 87 (5), pp. 488-496, 1996)に対して ICG -sulfo-OSu を抗体 1分子あたり約 16分子の割合で結合させた診断用マ—カーを製造した。この診断用マ一カーは使用直前まで凍結乾燥状態で保存した。例 1と同様の方法で吸光スぺクトル及び蛍光スぺクトルを測定したところ、最大吸収波長： 802.8 nm、モル吸光係数： β.θθχΐθ⁵»!—¹· cm"¹ (スリッ卜幅： 0.2 nm、対照： 37. 5 mM ォクチルグルコシドを含む PBS— 、常温測定）；励起波長； 768 nm、蛍光波長 820 (励起光側スリット幅： 5.0 nra、蛍光側スリット幅： 5.0 nra) であった。また、マウス抗スルホムチン抗体（91.9H: Irimura, T.， et al. , Cancer Res. , 51, p.5728-5735, 1991)に対して ICG- sulfo-OSu を抗体 1分子あたり約 16分子の割合で結合させた診断用マー力一を製造した。この診断用マーカ一は使用直前まで凍結乾燥状態で保存した。例 1と同様の方法で吸光スぺクトル及び蛍光スぺクトルを測定したところ、最大吸収波長： 802.8 ηαι、モル吸光係数： 3·89Χ10⁵Μ ^_1- cm—¹ (スリット幅： 0.2 nm、対照： 37.5 mM ォクチルグルコシドを含む PBS " 、常温測定）；励起波長； 768 nm, 蛍光波長 820 nm (励起光側スリット幅： 5. 0 nm、蛍光側スリッ卜幅： 5.0 nm) であった。さらに、ヒト抗 CEA抗体、ヒト抗ムチン抗体、及びヒト抗スルホムチン抗体を用いて、 ICG- sulfo-OSu をそれぞれの抗体 1分子あたり約 16分子の割合で結合させた診断用マーカ一を製造した。これらの診断用マーカーは、それぞれ、対応するマウス抗体から製造された診断用マ一カーと同じ分光学的スぺクトルデータを与えた。

マウス抗ムチン抗体から得られた上記の診断用マーカーの凍結乾燥品 lOO^g にリン酸緩衝生理食塩水 4.0 ml を加えて溶解し、この溶液 1.5 ml に本発明の蛍光強度増強剤溶液 1.5 ml を加え、 50 の水浴中で加温して最終の試料を調製した。コントロールとして同様にリン酸緩衝生理食塩水 1.5 ml を加えた溶液を調製した。最終的に診断用マーカー中の抗体濃度は 83.3 nM、 ICG-sulfo-OSu 濃度は 1.33 M であった。

曰立分光光度計 650- 40を用いて各試料の蛍光スぺクトルを測定した。スリッ卜は励起光及び蛍光とも 5 nm とした。標準として 1 ppmの硫酸キニーネの蛍光強度を測定したところ、測定前 68.0( i_ex = 255 nm, A_em = 451 nm) 、測定後 69.5U_e„ = 255 nm, λ_6Π) = 451 nm) であった。結果を表 2に示す。表 2 組成物蛍光強度増強剤励起波長 (nm) 蛍光波長 (nm) 蛍光強度（nm) l^a DSPA + 0G 768 825 (807) 0. 95 (0. 19)

DSPA + 0G 768 825 (807) 1. 01 (0. 23)

0G 768 820 (807) 0. 92 (0. 20)

4 0G 768 825 (807) 0. 96 (0. 25) 5 DSPC + 0G 768 825 (807) 1. 10 (0. 26) 6 DMPA + 0G 768 825 (807) 1. 20 (0. 29) 7 STAD + 0G 768 825 (807) 1. 17 (0. 28)

8 (対照） PBS 768 807 (807) 0. 25 (0. 24)

0G ：ォクチルグルコシド（37. 5 mM)

DSPA ：ジステアロイルホスファチジン酸（2. 5 IDM)

DSPC ：ジステアロイルホスファチジルコリン（2. 5 mM)

DMPA ：ジパルミトイルホスファチジン酸（2. 5 mM)

STAD ：ステアリン酸（2. 5 mM)

PBS ：リン酸緩衝生理食塩水（対照）

a ：常温で測定、他の組成物については 50て加温した直後に測定

b ：カツコ内は蛍光強度増強剤の添加前の値

力ッコ内は蛍光強度増強剤の添加前の値また、表中の組成物 6について、蛍光強度増強剤であるジミリストィルホスファチジン酸とォクチルダルコシドとを添加する前後での吸収スぺクトル及び蛍光スぺクトルの変化を図 2に示す。図中、（c) は蛍光強度増強剤添加前、（c ' )は蛍光強度増強剤添加後の吸収スぺクトルを示し、（d) は蛍光強度増強剤添加前、（d ' ) は蛍光強度増強剤添加後の蛍光スぺクトルを示す。蛍光強度増強剤を含む本発明の組成物では吸収スぺクトル及び蛍光スぺクトルの強度が顕著に増大しており、蛍光のエミッションスぺクトルでは、最大蛍光波長が約 18 nm 程度長波長側にシフトしていることが認められた。例 3

ォクチルグルコシドの蛍光強度増強作用と濃度との関係を調べるために、例 2 で調製した ICG- sulfo-OSu標識抗ムチン抗体の凍結乾燥品を 16.0 mlのリン酸緩衝生理食塩水に溶解した溶液を調製し、その溶液各 1.5 ml に種々の濃度のォクチルグルコシド溶液 1.5 ml を加え、 50°Cでィンキュベートした。最終的に診断用マ一カー中の抗体濃度は 83.3 nM、 ICG-sulfo-OSu 濃度は 1.33 //M であった。例 2と同様にして試料の蛍光スぺクトルを測定した。スリッ卜は励起光及び蛍光とも 2 nm とし、標準として 1 ppmの硫酸キニーネの蛍光強度を測定したところ、測定前 100.0(ス =251 nm, ス =450 nm) 、測定後 96.0(ス =251 ， λ _em = 450 nm) であった。結果を表 3に示す。ォクチルグルコシドの臨界ミセル濃度（25 mM) 付近で蛍光強度の急激な増加が認められ、それ以上の濃度では穏やかな蛍光強度の増加が認められた。蛍光波長の長波長側へのシフトについても、臨界ミセル濃度付近で急激にシフ卜の増大が認められた。

表 3

OG濃度（mM) 蛍光強度励起波長（nm) 蛍光波長 (rra)

0. 0 0. 153 768 804

1. 0 0. 150 768 806

5. 0 0. 150 768 804

10. 0 0. 189 768 809

20. 0 0. 436 768 817

37. 5 0. 520 768 817

50. 0 0. 515 768 820

75. 0 0. 525 768 816

100 0. 600 768 816

150 0. 588 768 821

OG ：ォクチルグルコシド産業上の利用可能性

本発明の組成物は生体免疫組織染色に有用であり、例えば、赤外線内視鏡などを用いて準体内的に食道ガン、胃ガン、または大腸ガンなどの上皮性組織の悪性新生物の早期診断や、外科手術時の病巣の特定 ·診断に有用である。本発明の組成物は蛍光強度に優れているという特徴を有しており、紫外線励起による生体組織や DNA の損傷の心配がないので、生体位のまま通常の蛍光検出装置を用いて直接検査や診断を行うことができるので有用である。特に、本発明の蛍光強度増強剤を用いると、蛍光のピーク波長が長波長側にシフトし、かつ、ピーク波長における吸光強度が顕著に増大するので、励起光の干渉を受けずに蛍光を観測することが容易になり、蛍光フィルターなどを含む測定システム全体の設計の許容度が大幅に改善されるという特徴がある。

Claims

請求の範囲

1 . 免疫組織化学的染色用の組成物であって、蛍光性官能基が結合した抗体を含む診断用マーカーと、グリセロリン脂質、脂肪酸、及び糖誘導体である界面活性剤からなる群から選ばれる物質とを含むことを特徴とする組成物。

2 . グリセ口リン脂質がァシルグリセロールリン酸である請求の範囲第 1項に記載の組成物。

3 . ァシルグリセロールリン酸が 2個の C_{1 Q}— ₂o脂肪酸残基を含む 1, 2-ジァシル -sn -グリセロール 3—リン酸である請求の範囲第 2項に記載の組成物。

4 . 1, 2-ジァシル- sn-グリセロール 3—リン酸がジミリストイルホスファチジン酸又はジステアロイルホスファチジン酸である請求の範囲第 3項に記載の組成物。

5 . グリセロリン脂質がァシルグリセロールホスホコリンである請求の範囲第 1 項に記載の組成物。

6 . ァシルグリセロールホスホコリンが 2個の C_{1 Q}_₂₍₎脂肪酸残基を含む 1，2-ジァシル- sn-グリセロール 3—ホスホコリンである請求の範囲第 5項に記載の組成物。

7 . 1, 2-ジァシル- sn-グリセロール 3—ホスホコリンがジステアロイルホスファチジルコリンである請求の範囲第 6項に記載の組成物。

8 . 該界面活性剤がォクチルグルコシドである請求の範囲第 1項に記載の組成物。

9 . グリセ口リン脂質及び脂肪酸からなる群から選ばれる物質と上記界面活性剤とを含む請求の範囲第 1項ないし第 8項のいずれか 1項に記載の組成物。

1 0 . 該蛍光性官能基がインドシアニングリン—ン誘導体に由来する官能基である請求の範囲第 1項ないし第 9項のいずれか 1項に記載の組成物。

1 1 . 蛍光性官能基がィンドシアニングリーン- N—ヒドロキシスルホスクシンィミドエステルに由来する官能基である請求の範囲第 10項に記載の組成物。

1 2 . 抗体が抗ガン抗原抗体である請求の範囲第 1項ないし第 11項のいずれか 1項に記載の組成物。

1 3 . 蛍光性官能基が結合した抗体を含む免疫組織化学的染色用の診断用マーカーの蛍光強度増強剤であって、グリセ口リン脂質、脂肪酸、及び糖誘導体である界面活性剤からなる群から選ばれる物質を含む蛍光強度増強剤。

1 4 . 蛍光性官能基が結合した抗体を含む診断用マ—カーと、グリセ口リン脂質、脂肪酸、及び糖誘導体である界面活性剤からなる群から選ばれる物質とを含む、とを特徴とする組成物を用いて免疫組織化学的に癌細胞を染色する方法。

1 5 . 蛍光性官能基が結合した抗体を含む診断用マーカーと、グリセロリン脂質、脂肪酸、及び糖誘導体である界面活性剤からなる群から選ばれる物質とを含む: とを特徴とする組成物を用いて免疫組織化学的に癌を診断する方法。