CN117480390A - 荧光染色方法 - Google Patents

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CN117480390A CN202380012225.6A CN202380012225A CN117480390A CN 117480390 A CN117480390 A CN 117480390A CN 202380012225 A CN202380012225 A CN 202380012225A CN 117480390 A CN117480390 A CN 117480390A
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Wujihua Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明开发一种能够进行清晰的三维观察的荧光染色方法，其是能够与对含二醇基的物质例如含有大量多糖类的结构物(粘液、基底膜等)进行染色的特殊染色PAS染色互换的荧光染色方法。本发明提供一种对组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的方法，其包括使以下的通式(I)所示的化合物或其盐与该组织或细胞样品接触的步骤。

Description

荧光染色方法
技术领域
本发明涉及对组织或细胞中的含二醇基的物质进行特异性染色的荧光染色方法。
背景技术
病理组织诊断是通过显微镜诊断病变部的组织学形态变化的医疗行为，决定患者的治疗策略的核心相关的重要诊断技术。病理组织诊断是通过对薄切片的组织用苏木精、伊红染色(HE染色)进行染色制作的载玻片由训练有素的病理诊断医生进行镜检而实施的。除此以外，为了进行更准确的诊断，并用被称为特殊染色的PAS染色或PAM染色、阿尔新蓝(Alcian Blue)染色这样的对组织内的特定结构物进行染色的方法的观察在很多疾病的确定诊断中有效。
另一方面，在基础生命科学领域中，各种最尖端的成像技术近年来取得了令人瞩目的进展。特别是通过对组织进行透明化才能实现的三维成像方法是近年来引起广泛关注的一项技术，CUBIC(清晰无障碍的大脑/身体成像鸡尾酒和计算分析，Clear，UnobstructedBrain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)法是其代表方法之一。在使用CUBIC法的三维观察中，据报道，通过与现有的荧光探针或标记化抗体的组合，能够以单细胞水平的分辨率，观察组织的立体结构(非专利文献1)。
在这样的最尖端的三维成像法中，尖端荧光显微镜成为技术的基础，因此需要利用荧光探针或荧光标记抗体进行组织的全组织包埋(Whole-Mount)染色(不进行薄切片，而将组织片整体染色的方法)。关于荧光探针，只有对应于细胞核或肌动蛋白这样的一部分结构物的探针，从与临床病理诊断中的特殊染色充分对应的角度开发的荧光探针目前为止基本不存在。例如，在专利文献1中，提出了对薄切得到的组织切片的细胞中的具有醛基的物质进行染色的方法，但用专利文献1的方法难以进行这些的清晰三维成像。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2018－162986号公报
非专利文献
非专利文献1：Satoshi Nojima et al.，Scientific Reports(2014)7：9269
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的之一是开发一种能够进行清晰的三维观察的荧光染色方法，其是能够与对含二醇基的物质、例如含有大量多糖类的结构物(粘液、基底膜等)进行染色的特殊染色PAS染色互换的荧光染色方法。
用于解决技术问题的技术方案
本发明的发明人着眼于在专利文献1的方法中使用的荧光探针的激发波长，基于该激发波长为短波长，因此激发光的组织穿透性低，结果难以实现清晰的三维成像(3D成像)的预测，使用激发波长为较长波长的各种化合物尝试了荧光染色。其结果发现，在使用具有荧光素骨架的化合物的情况下，为能够与PAS染色互换的特殊染色，且通过与组织透明化技术和3D成像技术组合，能够实现清晰的三维观察。
即，根据本发明的一个方面，提供了一种对组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的方法，其包括：使以下的通式(I)所示的化合物或其盐与该组织或细胞样品接触的步骤。
[通式(I)中，
R1表示羧基、可以被取代的烷基、可以被取代的烷氧基或卤原子；
R2、R3、R4、R5、R6和R7分别独立地表示氢原子、羟基(OH基)、卤原子或可以被取代的直链或支链烷基；
X表示酰肼基、氨基脲基、氨基硫脲基、肼基、羟基氨基、氨基或烷基氨基；
Y不存在，或者表示酰胺基、酯基、脲基、硫脲基、氨基甲酸酯基、碳酸酯基或氧原子；
L表示－(直链或支链亚烷基)n－(n为1～10的整数)、－(直链或支链亚烷基－O－)n－(n为1～10的整数)或－(直链或支链亚烷基－O－)n－(直链亚烷基)m－(n和m分别独立地为1～10的整数)，或者表示单键；
p表示0～4的整数，在p为2以上的情况下，R1可以相同也可以不同；
q表示1～2的整数，在q为2的情况下，(X－L－Y)所示的结构可以相同也可以不同，p与q之和为5以下的整数。]
根据本发明的其他方面，提供一种检测组织或细胞样品中的含二醇基的物质的方法，其包括：通过上述荧光染色方法，对该组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的步骤；和测定从上述化合物发出的荧光的步骤。
根据本发明的其他方面，提供一种使含有含二醇基的物质的组织或细胞可视化的方法，其包括：通过上述荧光染色方法，对组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的步骤；和对从上述化合物发出的荧光进行测定并图像化的步骤。
根据本发明的其他方面，提供一种判定组织或细胞样品中的大量含有含二醇基的物质的组织和/或病变的方法，其包括：通过上述荧光染色方法，对组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的步骤；和判定在被染色的部位存在该组织和/或病变的步骤。
根据本发明的其他方面，提供一种筛选伴随含有含二醇基的物质的组织或细胞的病变的疾病的治疗药的方法，其包括：对患有该疾病的个体投予治疗药候补物的步骤；从该个体采集产生该病变的组织或细胞样品的步骤；通过上述荧光染色方法，对该组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的步骤；对从上述化合物发出的荧光进行测定并图像化，将含有含二醇基的物质的组织或细胞可视化的步骤；和根据可视化的该含有含二醇基的物质的组织或细胞的图像，判定治疗药候补物的治疗效果的步骤。
根据本发明的其他方面，提供一种荧光染色用组合物，其包含上述通式(I)所示的化合物或其盐，上述荧光染色用组合物用于将含有含二醇基的物质的组织或细胞可视化。
根据本发明的其他方面，提供一种伴随含有含二醇基的物质的组织或细胞的病变的疾病的诊断用组合物，其包含上述通式(I)所示的化合物或其盐。
发明的效果
根据本发明，通过使用上述通式(I)所示的化合物(以下，有时称为化合物(I))作为染色剂，能够对含二醇基的物质进行特异性荧光染色。另外，通过将本发明的荧光染色方法与组织透明化技术和3D成像技术组合，能够将存在于组织深处的该物质染色，并能够将含该物质的组织、细胞或结构三维可视化。
附图说明
图1是表示在DAF－2和化合物2中添加醛之前和添加醛之后的荧光光谱的谱图(A为DAF－2，B为化合物2)。
图2表示使用DAF－2或化合物2，对大肠粘膜上皮的杯状细胞染色后的照片。照片上部表示使用的染色剂。照片从上段依次表示利用各染色剂的染色的结果、DAPI染色的结果、和将它们合并(merge)后的结果。
图3表示使用DAF－2或化合物2，对肾小球的基底膜染色后的照片。照片上部表示使用的染色剂。照片从上段依次表示利用各染色剂的染色的结果、DAPI染色(对细胞核染色)的结果、和将它们合并后的结果。
图4A表示并用通过DAF－2的染色和CUBIC法的大肠粘膜上皮的3D成像的结果。
图4B表示并用通过化合物2的染色和CUBIC法的大肠粘膜上皮的3D成像的结果。
图5是表示对人大肠粘膜组织的冷冻切片标本进行荧光染色后的结果的图。
图6是表示将人大肠粘膜组织透明化和荧光染色的结果的图。
图7是表示将人大肠粘膜组织透明化和使用FAM酰肼进行荧光染色后的结果的图。
图8是表示将人大肠粘膜组织透明化和使用FAM酰肼进行荧光染色后的结果的图。
图9是表示将人大肠粘膜组织透明化和使用FAM酰肼进行荧光染色后的结果的图。
图10是表示使用FAM酰肼和化合物1，将人大肠粘膜组织透明化和荧光染色后的结果的图。
图11是表示将从患有溃疡性大肠炎的人采集的大肠组织检体透明化和使用FAM酰肼进行荧光染色后的结果的图。
图12是表示将从患有溃疡性大肠炎的人采集的大肠组织检体透明化和使用FAM酰肼进行荧光染色后的结果的图。
图13是表示将从患有溃疡性大肠炎的人采集的大肠组织检体透明化和使用FAM酰肼进行荧光染色后的结果的图。
图14是表示将大肠组织透明化和使用FAM酰肼进行荧光染色后的结果、HE染色后的结果和PAS染色后的结果的图。
图15是说明隐窝的椭圆率和弯曲度的图。
图16是表示对所有病例，以体积、椭圆率和弯曲度为参数来分析隐窝的扭曲的结果的图。
图17是表示对于病理诊断医生诊断为非特异性肠炎的病例，以体积、椭圆率和弯曲度为参数分析隐窝的扭曲的结果的图。
图18是表示对于隐窝的扭曲进行三维形态学观察的结果的图。
图19是表示对人大肠粘膜组织进行3D组织染色后的结果的图。
图20是表示对真菌菌丝进行3D组织染色后的结果的图。
具体实施方式
A.荧光染色方法
本发明的实施方式涉及的荧光染色方法为对组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的方法，其包括使化合物(I)或其盐与组织或细胞样品接触的步骤。本实施方式的荧光染色方法还可以包括在使化合物(I)或其盐与组织或细胞样品接触之前，使组织或细胞样品中的二醇基氧化而生成醛基的步骤。另外，本实施方式的荧光染色方法还可以包括通过用透明化剂处理组织或细胞样品而将其透明化的步骤。
A－1.化合物I
化合物I由下述通式(I)所示。
[通式(I)中，
R1表示羧基、可以被取代的烷基、可以被取代的烷氧基或卤原子；
R2、R3、R4、R5、R6和R7分别独立地表示氢原子、羟基(OH基)、卤原子或可以被取代的直链或支链烷基；
X表示酰肼基、氨基脲基、氨基硫脲基、肼基、羟基氨基、氨基或烷基氨基；
Y不存在，或者表示酰胺基、酯基、脲基、硫脲基、氨基甲酸酯基、碳酸酯基或氧原子；
L表示－(直链或支链亚烷基)n－(n为1～10的整数)或－(直链或支链亚烷基－O－)n－(n为1～10的整数)或－(直链或支链亚烷基－O－)n－(直链亚烷基)m－(n和m分别独立地为1～10的整数)，或者表示单键；
p表示0～4的整数，在p为2以上的情况下，R1可以相同也可以不同；
q表示1～2的整数，在q为2的情况下，(X－L－Y)所示的结构可以相同也可以不同，p与q之和为5以下的整数。]
在本说明书中，“烷基”或其他基团中的“烷基”部分是指直链或支链的饱和烃基，优选碳原子数为1～6个的饱和烃基，可以列举例如：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、戊基、异戊基、2,3－二甲基丙基、和己基等，更优选为C1～5烷基，可以列举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、戊基、异戊基、或2,3－二甲基丙基。更加优选为C1～3烷基，例如为甲基、乙基、正丙基、和异丙基，最优选为甲基或乙基。另外，“亚烷基”是通过从上述烷基去掉1个氢原子后得到的2价基团。
在本说明书中，“烷氧基”是上述烷基经由氧原子进行结合的基团((烷基)－O－基)，该烷基部分如上述定义的那样。例如，烷氧基中，烷基部分的碳原子数可以为1～6个。作为烷氧基，可以列举例如甲氧基、乙氧基、1－丙氧基、2－丙氧基、2－甲基－1－丙氧基、2－甲基－2－丙氧基、2,2－二甲基－1－丙氧基、1－丁氧基、2－丁氧基、2－甲基－1－丁氧基、3－甲基－1－丁氧基、2－甲基－2－丁氧基、3－甲基－2－丁氧基、1－戊氧基、2－戊氧基、3－戊氧基、2－甲基－1－戊氧基、3－甲基－1－戊氧基、2－甲基－2－戊氧基、3－甲基－2－戊氧基、1－己氧基、2－己氧基、3－己氧基等。作为C1～6烷氧基，优选为C1～5烷氧基，更优选为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、异丁氧基、戊氧基、异戊氧基、和2,3－二甲基丙氧基。
在本说明书中，“卤原子”是指氟原子、氯原子、溴原子和碘原子，优选为氟原子、氯原子和溴原子，更优选为氟原子或氯原子。
在本说明书中，“羧基”是指－C(＝O)－OH所示的基团。
在整个本说明书中，作为烷基或其他基团的烷基部分中的取代基，能够列举：卤原子、羟基、二烷基氨基、巯基、烷基巯基、磺酰基、烷基磺酰基、烷氧基、环状醚、羧基、烷基羰基、烷氧基羰基、烷氧基羰基氨基、烷基羰基氧基、烷基氨基羰基、烷基羰基氨基、羰基氨基。在烷基被取代的情况下，该取代基的数量例如可以设为1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个、2个、或3个。
R1优选为羧基、烷基或烷氧基，更优选为羧基、甲基或甲氧基。p优选为0～2的整数，更优选为1。
R2优选为氢原子。
R3优选为氢原子。
R4优选为氢原子或氟原子。
R5优选为氢原子或氟原子。
R6优选为氢原子。
R7优选为氢原子。
X优选为酰肼基、氨基脲基、氨基或烷基氨基，更优选为酰肼基。
Y优选不存在，或者为酰胺基。
L优选表示单键，或者为－(直链或支链亚烷基)n－(n为1～10的整数)。
例如，在上述式(I)中，X－L－Y－所示的基团可以为选自以下的基团(式中，m为1～6的整数，n为1～3的整数)。
另外，例如在上述式(I)中，
所示的部分结构可以为以下的式子所示的结构。
在一个实施方式中，通式(I)中，
R1表示羧基、可以被取代的烷基、可以被取代的烷氧基或卤原子；
R2、R3、R6和R7分别独立地表示氢原子、羟基(OH基)、卤原子或可以被取代的直链或支链烷基；
R4和R5分别表示氟原子；
X表示酰肼基、氨基脲基、氨基硫脲基、肼基或羟基氨基；
Y不存在，或者表示酰胺基、酯基、脲基、硫脲基、氨基甲酸酯基、碳酸酯基或氧原子；
L表示－(直链或支链亚烷基)n－(n为1～10的整数)、－(直链或支链亚烷基－O－)n－(n为1～10的整数)或－(直链或支链亚烷基－O－)n－(直链亚烷基)m－(n和m分别独立地为1～10的整数)，或者表示单键；
p表示0～4的整数，在p为2以上的情况下，R1可以相同也可以不同；
q表示1～2的整数，在q为2的情况下，(X－L－Y)所示的结构可以相同也可以不同，p与q之和为5以下的整数。
在一个实施方式中，通式(I)中，
R1表示可以被取代的烷基、可以被取代的烷氧基或卤原子；
R2、R3、R4、R5、R6和R7分别独立地表示氢原子、羟基(OH基)、卤原子或可以被取代的直链或支链烷基；
X表示氨基或烷基氨基；
Y不存在；
L表示单键；
p表示0～4的整数，在p为2以上的情况下，R1可以相同也可以不同；
q表示1～2的整数，在q为2的情况下，(X－L－Y)所示的结构可以相同也可以不同，p与q之和为5以下的整数。
作为化合物(I)的具体例，能够列举例如以下的化合物。
作为化合物(I)的盐，能够列举碱加成盐、酸加成盐、氨基酸盐等。作为碱加成盐，能够列举例如：锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等的金属盐；铵盐、甲基胺盐、二甲基胺盐、二环己基胺盐、三(羟基甲基)氨基甲烷盐、N,N－双(羟基乙基)哌嗪盐、2－氨基－2－甲基－1－丙醇盐、乙醇胺盐、N－甲基葡糖胺盐、L－葡糖胺盐、三乙基胺盐、哌啶盐、吗啉盐等的有机胺盐；或与赖氨酸、δ－羟基赖氨酸、精氨酸等的碱性氨基酸的盐。作为酸加成盐，能够列举例如：盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等的无机酸盐；甲烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、乙酸盐、丙酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、扁桃酸盐、肉桂酸盐、乳酸盐、乙醇酸盐、葡萄糖醛酸盐、抗坏血酸盐、烟酸盐、水杨酸盐、三氟乙酸盐等的有机酸盐。作为氨基酸盐，能够例示甘氨酸盐等。本发明的化合物的盐不特别限定于这些盐。
化合物(I)有时根据取代基的种类具有1个或2个以上的手性碳，有时存在光学异构体或非对映异构体等的立体异构体。纯粹形态的立体异构体、立体异构体的任意的混合物、消旋体等都包含在本发明的范围内。另外，通式(I)所示的化合物或其盐有时作为水合物或溶剂合物存在，这些物质均包含在本发明的范围内。形成溶剂合物的溶剂的种类没有特别限定，能够例示例如乙醇、丙酮、异丙醇等的溶剂。在本说明书中“化合物(I)”的提及，除了其明显不适合的情况，在没有明确说明的情况下，也包括化合物(I)的异构体的任意的混合物或特定的立体异构体、化合物(I)的药理学上可接受的盐、水合物和溶剂合物、以及化合物(I)的药理学上可接受的盐的水合物或溶剂合物。此外，化合物(I)能够利用实施例中记载的合成方案和该技术领域中公知的合成方法进行合成。
A－2.组织或细胞样品
组织或细胞样品只要是含有确认含二醇基的物质的存在的对象的组织或细胞的样品，就没有特别限制。代表性地，组织或细胞样品来自人或人以外的哺乳类，可以使用从人或人以外的哺乳类摘出或切除的组织或细胞。
其中，“组织”可以是来自生物体的组织或脏器整体，也可以是组织或脏器的一部分(例如组织片)，或者是指实验动物其本身等生物个体整体。另外，本说明书中的组织或细胞样品所含有的组织并不是需要具有通常所认为的作为“组织”的功能或结构，因此还包括不具有作为特定的组织所期待的结构或功能的细胞团或培养细胞。例如可以是人的存在包含癌细胞的可能性的组织或通过癌切除而切除得到的组织片等。
其中，“细胞”是指来自生物体的全部细胞。其是指将在生物体的体液或组织中存在的细胞分离得到的细胞、包含对生物体进行特定的实验处理而人工制作的细胞的所有细胞检体。作为这样的实验处理，还包括如后所述的福尔马林固定、石蜡包埋和脱石蜡化处理、以及组织透明化处理等。另外，可以是通过培养形成的细胞团，这样的细胞团可以是干细胞以及通过将干细胞分化诱导处理而得到的细胞团。
组织或细胞样品优选具有三维立体结构。“三维立体结构”是指在三维方向上具有厚度的结构，为了与以下的检体(薄切切片)在其结构上进行区分的目的而使用，上述检体是在进行病理组织诊断时制作标准上使用的载玻片，此时所需的经过组织薄切的检体。因此，即使是具有板状或扁平状的结构的组织标本，在具有足以与薄切切片相区分的程度的厚度的情况(具有例如50μm以上、另外具有例如500μm以上的厚度的情况)下，也包括在具有三维立体结构的组织中。这里，组织薄切也可以换而言之是指使用切片机进行的技术。另外，具有三维立体结构的组织中除了组织片或细胞团以外，还包括脏器本身、以及个体本身。
组织或细胞样品可以直接是从生物体采集得到的状态，也可以是实施了前处理的状态。例如，将包埋于石蜡块的组织或细胞样品在染色前进行脱石蜡化处理，由此可以用于本发明的方法(参照Satoshi Nojima et al.，Scientific Reports(2017)7：9269)。
在一个实施方式中，对于组织或细胞样品，在与化合物(I)接触之前，实施通过使该组织或细胞样品中的二醇基氧化而生成醛基的处理。或者，本发明的实施方式涉及的荧光染色方法可以包括在使化合物(I)与组织或细胞样品接触之前，使组织或细胞样品中的二醇基氧化而生成醛基的步骤。因为化合物(I)与醛基结合而染色。
二醇基的氧化处理已经在PAS染色法中为人所熟知。氧化处理代表性地可以通过用0.5％～1％高碘酸水溶液对组织或细胞样品进行10分钟以上、例如10分钟～30分钟处理来进行。
在一个实施方式中，组织或细胞样品是在与化合物(I)接触之前进行了透明化处理的组织或细胞样品。或者，本发明的实施方式所涉及的荧光染色方法还可以包括将组织或细胞样品通过用透明化剂进行处理而透明化的步骤。此时，组织或细胞样品的透明化与化合物(I)和组织或细胞样品的接触的顺序没有限定，它们可以根据透明化处理方法等在任意的适当时期进行。例如，可以在透明化处理之前、与透明化处理同时、在透明化处理的途中或透明化处理之后使化合物(I)与组织或细胞样品接触。化合物(I)可以渗透到具有三维立体结构的组织或细胞样品的内部进行染色。因此，可以在化合物(I)渗透到透明化的组织或细胞样品的内部，与含二醇基的物质结合后，测定从化合物(I)发出的荧光，由此进行具有三维立体结构的组织或细胞样品的内部或全体中的含二醇基的物质的检测。
透明化处理可以通过将组织或细胞样品用亲水性或疏水性透明化剂处理、或者包埋在水凝胶中进行电泳法来进行。其中，作为使用亲水性透明化剂的组织或细胞样品的透明化处理法，本领域技术人员已经广泛知道各种方法。特别是作为本说明书中的透明化处理法，优选已知为清晰无障碍的大脑/身体成像鸡尾酒和计算分析(CUBIC)法的方法(参照Susaki et al.，(2014)Cell；157：726－739；Tainaka K et al.，(2014)Cell；159：911－924.)。
CUBIC法中使用的试剂有市售，能够按照对于每种对象组织所推荐的该试剂制造者提供的实验步骤(protocol)进行透明化处理(“动物透明化试剂CUBIC”、东京化成工业株式会社、东京、日本)。作为典型的方法，能够列举以下的方法。CUBIC－1(试剂1)是将25重量％尿素、25重量％的N,N,N’,N’－四(2－羟基丙基)乙二胺、和15重量％聚乙二醇单对异辛基苯基醚/Triton X－100的混合物制备成水溶液。CUBIC－2(试剂2)是将50重量％蔗糖、25重量％尿素、和10重量％2,2’,2”－次氮基三乙醇的混合物制备成水溶液。作为将利用CUBIC法的透明化处理与和化合物(I)的接触组合进行时的步骤，为：将固定组织样品用PBS充分清洗后，一边缓慢振荡一边在室温浸渍到将试剂1用蒸馏水稀释到1/2的溶液中。然后，一边缓慢振荡一边在室温在试剂1中浸渍3～7天。在此期间，以1～2天一次的间隔，将试剂1更换成新的试剂。然后，用PBS充分清洗，之后浸渍在含20～30％(w/v)蔗糖的PBS中。然后，使用冰冻组织切片制作用包埋剂(例如，Sakura Finetech Japan,Tissue TechO.C.T.Compound)制作冰冻块，在该状态下在－80℃冰箱长期保存。将它们溶解后，用PBS充分清洗，根据需要进行前处理，使用化合物(I)进行全组织包埋(Whole-Mount)染色。然后，根据需要进行使用接头的处理，浸渍在将试剂2用蒸馏水稀释为1/2的溶液中，在室温缓慢振荡。然后，一边缓慢振荡一边在室温在试剂2中浸渍1～3天。在该状态下能够使用荧光显微镜进行3D成像。
关于CUBIC试剂，除了上述的CUBIC－1和CUBIC－2以外，还存在包括CUBIC－L、CUBIC－R+、CUBIC－B、CUBIC－HL、CUBIC－P、CUBIC－X1、CUBIC－X2的各种各样的CUBIC试剂，可以根据脏器的种类分别使用。作为本发明中能够适用的CUBIC试剂，包括它们全部。
另外，本发明中能够适用的透明化处理法不限于CUBIC法。作为其他方法，包括使用疏水性透明化剂的、“BABB”(参照Dodt HU et al.，(2007)Nat Methods；4：331－336.)、“3DISCO”(参照Erturk A et al.，(2012)Nat Protoc；7：1983－1995.)、“uDISCO”(参照PanC et al.，(2016)Nat Methods；13：859－867.)或成为它们的亚型的方法、使用水溶性透明化剂的、“Scale”(参照Hama H et al.，(2011)Nat Neurosci；14：1481－1488.)、“SeeDB”(参照Ke MT et al.，(2013)Nat Neurosci；16：1154－1161.)或成为它们的亚型的方法、基于通过电泳法去除光散射体的原理的、“CLARITY”(参照Chung K et al.，(2013)Nature；497：332－7.)、“PACT”(参照Tomer R et al.，(2014)Nat Protoc；9：1682－97.)或成为它们的亚型的方法。
A－3.接触
化合物(I)与组织或细胞样品的接触可以根据目的在任意适当的条件下进行。代表而言，通过在包含化合物(I)的染色液中浸渍组织或细胞样品，使化合物(I)与组织或细胞样品接触。染色液中的化合物(I)的浓度、添加剂、稀释液、清洗液、接触时间、接触温度等的接触条件可以由本领域技术人员适当选择。
例如在化合物(I)具有酰肼基、肼基或羟基氨基的情况下，该取代基与醛的缩合反应通过苯胺衍生物或吲哚满衍生物被催化，高效地形成对应的酰基腙、腙、肟(OrganicLetters，2020，22，6035－6040)。此外，由二氨基苯结构和醛形成苯并咪唑结构的反应通过使用过氧化氢水(Synthesis，2007，4，547－550)或氯化铵(Indian Journal ofChemistry，2013，52B，1152－1156，)、亚硫酸钠(Chemical Papers，2018，72，1265－1276)以及加热条件(Molecular Diversity，2015，19，263－272)而被促进。不限于上述例子，为了提高取代基X与醛的反应效率，可以适当选择添加剂和染色条件。
在与化合物(I)接触后，可以根据需要，通过在PBS等清洗液中的浸渍，来清洗组织或细胞样品。
A－4.含二醇基的物质
“含二醇基的物质”的代表例为含糖的物质。作为含糖的物质，可以列举糖原、淀粉、粘多糖、甘油糖脂、鞘糖脂等。作为二醇基，可以列举例如α－二醇基。
A－5.用途
本发明的实施方式涉及的荧光染色方法能够对含二醇基的物质进行特异性染色，因此能够对含该物质的组织、病变或结构物、优选含有(与其他组织或细胞相比)大量该物质的组织、病变或结构物进行特异性染色。作为含有大量含二醇基的物质的组织、病变或结构物，可以列举例如肌肉(横纹肌组织、平滑肌组织、心肌组织等)、粘液、粘膜上皮、基底膜(肾小球基底膜、消化道粘膜基底膜等)、细胞质内糖原颗粒、细菌、真菌、寄生虫等。作为本发明的实施方式涉及的荧光染色方法可用的疾病的例子，设想为炎症性肠道疾病、来自包含粘液的腺体的癌、肾小球肾炎、心肌病、感染症等。因此，在本说明书中，“含二醇基的物质的荧光染色方法”也可以适当称为“与其他组织或细胞相比含有较多含二醇基的物质的组织和/或病变的荧光染色方法”。
在本说明书中，作为“炎症性肠道疾病”，不限于此，能够列举溃疡性大肠炎、克罗恩病等。
在本说明书中，作为“癌”，不限定于此，可以列举：肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、肾上腺皮质癌、AIDS(艾滋病)相关癌、AIDS(艾滋病)相关淋巴瘤、小儿小脑星形细胞瘤、小儿大脑星形细胞瘤、基底细胞癌、皮肤癌(非黑色素瘤)、胆道癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、骨与关节癌、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、脑癌、脑肿瘤、脑干神经胶质瘤、小脑星形细胞瘤、神经胶质瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、头颈部癌、转移性颈部鳞状上皮癌、支气管腺瘤/类癌、类癌肿瘤、神经系统淋巴瘤、中枢神经系统癌、中枢神经系统淋巴瘤、神经母细胞瘤、儿童癌、Seziary(塞扎里)综合征、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、唾液腺癌、口腔癌、口腔空洞癌、口咽癌、舌癌、食管癌、胃癌、消化道类癌肿瘤、消化道间质瘤(GIST)、小肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门直肠癌、肛门癌、生殖细胞肿瘤、肝细胞(肝脏)癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、咽癌、下咽癌、鼻咽癌、鼻窦和鼻腔癌、咽喉癌、胰岛细胞肿瘤(内分泌胰腺)、胰腺癌、甲状旁腺癌、肝癌、胆囊癌、阑尾癌、肾癌、尿道癌、肾盂和输尿管移行上皮癌和其他泌尿器官癌、鳞状细胞癌、阴茎癌、睾丸癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢低度恶性肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、乳腺癌、子宫癌、子宫肉瘤、子宫颈癌、子宫内膜癌、子宫体癌、阴道癌、外阴癌、维尔姆斯瘤、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、嗜铬细胞瘤、默克尔细胞皮肤癌、间皮瘤、恶性间皮瘤、多发性内分泌肿瘤综合征、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、松果体母细胞瘤和垂体肿瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、尤文瘤、软组织肉瘤、软组织肉瘤、蕈样肉芽肿、卡波西肉瘤等。这些之中，作为来自含粘液的腺体的癌，可以列举非小细胞肺癌(粘液性肺腺癌)、皮肤癌(乳房外佩吉特病)、胃癌、小肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、乳腺癌(乳房佩吉特病)、卵巢癌、胰腺癌、肝脏癌、胆囊癌和阑尾癌。
在本说明书中，作为“肾小球肾炎”，不限定于这些，但能够列举微小病变性肾病、膜性肾病、系膜增生性肾炎、导管内增生性肾小球肾炎、膜性增生性肾小球肾炎、导管外增生性肾小球肾炎、硬化性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、IgA肾病、紫癜性肾炎(Henoch－schonlein紫癜)、抗GBM肾小球肾炎(Goodpasture综合征)等。
在本说明书中，作为“心肌病”，不限定于这些，但能够列举扩张型心肌病、肥大型心肌病、限制型心肌病、致心律失常性心肌病。
在本说明书中，作为“感染症”，不限定于这些，可以设想由以下的细菌、真菌、寄生虫感染所引起的疾病。即，为：链球菌(A组β-溶血性链球菌、肺炎球菌等)、金黄色葡萄球菌(MSSA、MRSA)、表皮葡萄球菌、肠球菌、李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、致病性大肠埃希菌(O157：H7等)、克雷伯菌(肺炎杆菌)、变形杆菌、百日咳杆菌、铜绿假单胞菌、沙雷氏菌、柠檬酸杆菌、不动杆菌、肠杆菌、支原体、梭菌、结核/非结核性分枝杆菌、霍乱、鼠疫、白喉、痢疾、猩红热、炭疽、梅毒、破伤风、麻风病、军团菌肺炎(退伍军人病)、钩端螺旋体病、莱姆病、兔热病、Q热、立克次体病、衣原体病、曲霉菌病、念珠菌病、隐球菌病、癣菌病、组织胞浆菌病、肺孢子菌肺炎、阿米巴痢疾、疟疾、弓形虫病、利什曼病、隐孢子虫病、包虫病、日本血吸虫病、丝虫病、蛔虫病、阔节裂头绦虫病等。
B.检测方法
根据本发明的其他方面，提供一种检测组织或细胞样品中的含二醇基的物质的方法，其包括：通过A项中记载的方法，对该组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的步骤；和测定从化合物(I)发出的荧光的步骤。
从化合物(I)发出的荧光的测定例如可以通过使用荧光显微镜，对荧光染色后的组织或细胞样品照射化合物(I)的激发光，测定化合物(I)所发出的荧光强度来进行。在测定到比不照射激发光的情况下测定的荧光强度强的强度的荧光的部位，能够确认存在含二醇基的物质，根据其范围和/或强度能够检测存在量。
关于组织或细胞样品、含二醇基的物质和对该物质进行荧光染色的方法如A项所述。
C.可视化方法
根据本发明的其他方面，提供一种将含有含二醇基的物质的组织或细胞可视化的方法，其包括：通过A项中记载的方法，对组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的步骤；和对从化合物(I)发出的荧光进行测定并图像化的步骤。
从化合物(I)发出的荧光的测定和图像化例如可以通过使用荧光显微镜，对荧光染色后的组织或细胞样品照射化合物(I)的激发光，测定化合物(I)所发出的荧光强度，将使用图像解析软件得到的荧光强度数据图像化来进行。根据目的，也可以制成二维图像或三维图像的任意一种。作为图像解析软件，可以使用Imaris、Imagej、cellSens等公知的软件。
化合物(I)的激发光的波长在约400nm～约520nm的范围内，对具有厚度的组织或细胞样品内部的渗透性优异。因此，根据本发明的实施方式涉及的可视化方法，能够将含有含二醇基的物质且具有三维立体结构的组织或细胞合适地可视化。该组织或细胞优选被透明化处理。
作为本发明的实施方式涉及的可视化方法优选适用的组织或细胞，可以列举粘膜上皮、基底膜或真菌。例如哺乳类的粘膜上皮(例如，小肠或大肠粘膜上皮)存在无数管状的陷入部(隐窝)，各隐窝由包含产生粘液的杯状细胞的数种细胞构成。利用本发明的实施方式涉及的可视化方法，包含粘液的杯状细胞被特异性荧光染色，结果能够将各个隐窝的形状清晰地可视化。
关于含有含二醇基的物质的组织或细胞和对该物质荧光染色的方法如A项中所述。
D.判定方法
根据本发明的其他方面，提供一种判定组织或细胞样品中的含有大量含二醇基的物质的组织和/或病变的方法，其包括：通过A项中记载的方法，对组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的步骤；和判定在被染色的部位存在该组织和/或病变的步骤。本发明还提供一种提供用于判定组织或细胞样品中的含有大量含二醇基的物质的组织和/或病变的信息的方法，其包括：通过A项中记载的方法，对组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的步骤；和提供用于判定在被染色的部位存在该组织或病变的信息的步骤。此外，关于含有大量含二醇基的物质的组织和病变，如A项中所述。
含有大量含二醇基的物质的组织和/或病变的判定除了该组织或病变是否存在的判定以外，只要是其量、症状的程度、位置和/或形状的判定等能够从关于含二醇基的物质的存在的二维或三维图像数据进行的判定，则可以为任何判定。
大量含有含二醇基的物质的组织和/或病变的判定有时也可以单纯从染色的有无来进行，但根据需要，可以综合考虑检测到含二醇基的物质的位置或量(检测到荧光的位置或强度)、组织或细胞样品的来源部位、关于患者的信息、与含有二醇基的物质的存在模式相关的病理学领域中通常的见解等来进行。
例如，在组织或细胞样品为癌患者的癌切除组织片，作为病变，以癌为对象的情况下，通过调查显示癌特征性的含二醇基的物质的聚集的含二醇基的物质的存在位置或量，能够判定该组织或细胞样品中的癌的存在。
另外，例如在炎症性肠道疾病中，作为该疾病特征性的病变，可以列举隐窝的扭曲。根据使用本发明的方法的解析，三维地观察隐窝的扭曲，作为炎症性肠道疾病特异性病变、特别是溃疡性大肠炎特征性病变，发现了卷入多个隐窝的形式的扭曲。因此，在组织或细胞样品为来自存在患有炎症性肠道疾病的可能性的个体的大肠粘膜组织的情况下，通过解析隐窝的形状，能够判定该病变的存在。
具体而言，能够通过将大肠粘膜组织供于A项中记载的荧光染色方法，经由粘膜上皮中的包含粘液的杯状细胞和基底膜的染色得到隐窝的三维图像；以及根据所得到的三维图像三维地解析其形状，能够判定作为炎症性肠道疾病特征性的病变的隐窝扭曲的存在。
隐窝形状的三维解析例如可以使用图像解析软件，从隐窝的三维图像数据求出体积、椭圆率或弯曲度来进行。隐窝的体积在溃疡性大肠炎中，存在显示比非特异性肠炎和克罗恩病增大的值的倾向，椭圆率在溃疡性大肠炎和克罗恩病中存在显示比非特异性肠炎低的值的倾向，弯曲度存在如下倾向：在溃疡性大肠炎最高，接着克罗恩病和非特异性肠炎依次显示较高的值。因此，在椭圆率比规定的基准(例如患有非特异性肠炎的个体的椭圆率的基准范围)低的情况、弯曲度比规定的基准(例如，患有非特异性肠炎的个体的弯曲度的基准范围)高的情况等下，能够判定存在作为炎症性肠道疾病特征性病变的隐窝的扭曲。
另外，通过对隐窝的扭曲定量化或综合评价，能够评价样品来源个体患有炎症性肠道疾病的可能性。作为具体例，以隐窝的体积、椭圆率和弯曲度为参数，在确认到体积超过规定的基准(例如，非特异性肠炎或克罗恩病的体积的基准范围)、椭圆率低于规定的基准(例如，患有非特异性肠炎的个体的基准范围)、弯曲度高于规定的基准(例如，克罗恩病的弯曲度的基准范围)的隐窝的情况下，能够判定(诊断)为样品来源个体存在患有溃疡性大肠炎的可能性(或该可能性高)。作为另一个具体例，对于体积、椭圆率和弯曲度，分别设定对应于程度的分数(例如体积越大则分数越高、椭圆率越低则分数越高、弯曲度越高则分数越高)，在分数的合计超过规定基准的隐窝被确认到规定的数量以上或规定的比例以上的情况下，能够判定(诊断)为样品来源个体存在患有溃疡性大肠炎的可能性(或该可能性高)。
即，根据本发明的其他方面，提供一种判定个体患溃疡性大肠炎、克罗恩病等炎症性肠道疾病的可能性的方法，其包括：通过A项中记载的方法，对来自该个体的大肠粘膜组织样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的步骤；对从化合物(I)发出的荧光进行测定并图像化，得到隐窝的三维图像的步骤；和根据所得到的三维图像三维地解析隐窝的形状的步骤。隐窝形状的三维解析如上所述可以通过以体积、椭圆率和弯曲度为参数，对隐窝的扭曲进行定量化或综合评价来进行。
E.筛选方法
根据本发明的其他方面，提供一种筛选伴随含有含二醇基的物质的组织或细胞的病变的疾病的治疗药的方法，其包括：对患有该疾病的个体投予治疗药候补物的步骤；从该个体采集产生该病变的组织或细胞样品的步骤；通过A项中记载的方法，对该组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的步骤；对从化合物(I)发出的荧光进行测定并图像化，将含有含二醇基的物质的组织或细胞进行可视化的步骤；和根据可视化的该含有含二醇基的物质的组织或细胞的图像，判定治疗药候补物的治疗效果的步骤。
作为伴随含有含二醇基的物质的组织或细胞的病变的疾病，可以列举炎症性肠道疾病、来自包含粘液的腺体的癌、肾小球肾炎、心肌病、感染症等。另外，作为产生病变的组织或细胞，可以列举肌肉(横纹肌组织、平滑肌组织、心肌组织等)、粘液、粘膜上皮、基底膜(肾小球基底膜、消化道粘膜基底膜等)、细胞质内糖原颗粒、细菌、真菌、寄生虫等。
患有上述疾病的个体为人或人以外的哺乳类、例如实验动物，可以列举：小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔子、狗、迷你猪、猴子等。治疗药候补物的给药量和给药方法可以根据治疗药、个体的状态等适当设定。
关于将组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的方法和对从化合物(I)发出的荧光进行测定并图像化，将含有含二醇基的物质的组织或细胞可视化的方法分别如A项和C项所述。
治疗药候补物的治疗效果的判定可以根据可视化的该含有含二醇基的物质的组织或细胞的图像进行。例如在可视化的图像中，伴随治疗对象的疾病产生的病变(含有含二醇基的物质的组织或细胞的病变)与治疗药候补物的投予相比减轻或减少的情况或者疾病(病变)的进展被抑制的情况下，能够判定为治疗药候补物存在对该疾病具有治疗效果的可能性(或该可能性高)。另外，例如在伴随治疗对象的疾病产生的病变与治疗药候补物的投予前相比没有变化或增大的情况下，能够判定为治疗药候补物存在对该疾病没有治疗效果的可能性(或该可能性高)。
F.荧光染色用组合物
根据本发明的其他方面，提供一种用于将含有含二醇基的物质的组织或细胞可视化的荧光染色用组合物，其包含化合物(I)或其盐。如上所述，化合物(I)能够将含二醇基的物质特异性染色，另外，向组织或细胞内部的渗透性优异。因此，通过使含有含二醇基的物质、优选透明化处理后的组织或细胞与化合物(I)接触，其内部含二醇基的物质被染色，作为结果，可以将含有该物质的组织或细胞可视化。
作为可视化对象，只要是含有含二醇基的物质的组织或细胞即可，优选为具有三维立体结构的组织或细胞，更优选列举肌肉(横纹肌组织、平滑肌组织、心肌组织等)、粘膜上皮、基底膜(肾小球基底膜、消化道粘膜基底膜等)、细胞质内糖原颗粒、细菌、真菌、寄生虫等，更优选大肠粘膜上皮(肠隐窝)和真菌。
荧光染色用组合物可以根据需要还包含透明化剂、稀释剂、浑浊液剂等任意的构成成分。透明化剂优选为亲水性透明化剂。
荧光染色用组合物可以为将各构成成分混合而得到的混合液的形态，也可以为各个构成成分或一部分构成成分单独包装的形态(试剂盒)。利用后者的形态，可以由使用者混合各构成成分。
G.诊断用组合物
根据本发明的其他方面，提供一种伴随含有含二醇基的物质的组织或细胞的病变的疾病的诊断用组合物，其包含化合物(I)或其盐。如上所述，化合物(I)能够将含二醇基的物质特异性染色，另外，向组织或细胞内部的渗透性优异。因此，通过使化合物(I)与含有含二醇基的物质、优选透明化处理后的组织或细胞接触，在其内部，含二醇基的物质被染色，该组织或细胞被可视化。通过对可视化得到的组织或细胞的图像应用上述D项所记载的判定方法，能够判定病变的有无、数量、发生率等，根据该判定，能够判断患有伴随该病变的疾病的可能性。即，利用本发明的实施方式涉及的诊断用组合物，经由含有含二醇基的物质的组织或细胞的可视化，可以提供用于诊断伴随该组织或细胞的病变的疾病的信息。
患有上述疾病的可能性的判断(即、诊断)除了由医生进行以外，也可以使用人工智能(AI)进行。通过AI的诊断例如可以利用图像诊断辅助程序进行，该程序按照规定的基准解析可视化得到的组织或细胞的图像，根据该解析结果，计算患有上述疾病的可能性。或者，也可以使用AI，按照规定的基准解析可视化得到的组织或细胞的图像，医生根据该解析结果，判断患有上述疾病的可能性。
作为诊断对象的疾病，只要是伴随含有含二醇基的物质的组织或细胞的病变的疾病即可。作为其具体例，可以同样例示E项中记载的例子，其中，优选列举炎症性肠道疾病、更优选溃疡性大肠炎或克罗恩病。关于炎症性肠道疾病的诊断，能够以例如隐窝的扭曲和/或隐窝的扭曲的程度作为解析基准。
诊断用组合物可以根据需要还包含透明化剂、稀释剂、浑浊液剂等任意的构成成分。透明化剂优选为亲水性透明化剂。
诊断用组合物可以为将各构成成分混合得到的混合液的形态，也可以为各个构成成分或一部分构成成分单独包装的形态(试剂盒)。利用后者的形态，可以由使用者将各构成成分混合。
实施例
以下利用实施例对本发明进行更加详细的说明，但其并不限定本发明的范围。其中，在本申请说明书整体中引用的文献通过参照将其整体引入本申请说明书中。
[实施例1]化合物1的合成
通过以下的方案所记载的步骤，合成了化合物1。
在化合物3(364mg，1.32mmol)的THF(13mL)溶液中在－15℃滴加2M iPrMgCl/THF(2.6mL，5.27mmol)。搅拌1.5小时后，加入DMF(0.5ml，6.59mmol)，在室温搅拌2小时。加入1MHCl，搅拌1小时后，将反应溶液用己烷－乙酸乙酯＝3：1的混合溶液提取。将有机相用饱和食盐水清洗，用Na2SO4干燥。将溶剂减压蒸馏除去，以无色油状的形态得到粗纯化的化合物4。不进行进一步纯化，立即用于后续反应。
在上述所得到的化合物4与4－氟间苯二酚(4－Fluororesorcinol)(320mg，2.50mmol)的CH2Cl2－Et2O＝1：1的混合溶液(13ml)中在室温加入甲烷磺酸(1.3ml)，搅拌18.5小时。小心加入饱和碳酸氢钠，中和后，用浓盐酸将pH调整到约3附近。用乙酸乙酯提取，将有机相用饱和食盐水清洗，用Na2SO4干燥。将溶剂减压蒸馏除去，将所得到的残渣用硅胶柱色谱(CH2Cl2/MeOH＝20→15)纯化，得到化合物5(382mg，70％(2steps))。
1H NMR(400MHz，DMSO―d6)δ9.56(2H，s)，9.17(2H，s)，7.72(1H，d，J＝2.0Hz)，7.68(1H，dd，J＝8.0，2.0Hz)，6.85(1H，d，J＝8.0Hz)，6.45(2H，d，J＝8.0Hz)，6.19(2H，d，J＝12.0Hz)，5.83(1H，s)，3.81(3H，s)，2.15(3H，s)
在化合物5(5.5g，13.2mmol)的甲苯溶液(264ml)中加入PTS·H2O(25.1g，132mmol)，在120℃搅拌24小时。将反应溶液冷却到室温，加入2M氢氧化钾水溶液(100mL)，搅拌5小时。将反应溶液用二乙醚清洗，用浓盐酸将pH调整到约3。用乙酸乙酯提取，将有机相用Na2SO4干燥。将溶剂减压蒸馏除去，将得到的残渣用反相柱色谱(H2O(1％Et3N)/CH3CN＝90：10)纯化后，将三乙胺用盐酸除去，得到化合物7(412mg，8.2％(2steps))。
1H NMR(400MHz，DMSO－d6)δ8.05(1H，s)，7.97(1H，d，J＝8.0Hz)，7.41(1H，d，J＝8.0Hz)，6.78(2H，br－s)，6.60(2H，d，J＝11.2Hz)，2.09(3H，s)
在化合物7(34.1mg，89.1mmol)和N－羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)(15.3mg，134mmol)的THF(7ml)溶液中滴加DCC(23.9mg，116mmol)的THF(2ml)溶液。将反应溶液在室温搅拌5小时，将溶剂减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱(CH2Cl2/MeOH＝50→10)纯化，以橙色固体的形态得到化合物8(37.0mg，86％)。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.29(1H，s)，8.22(1H，d，J＝8.8Hz)，7.54－7.49(1H，m)，6.91(2H，d，J＝6.8Hz)，6.80－6.74(2H，m)，2.95(4H，s)，2.19(3H，s)
在化合物8(13.4mg，28.0mmol)的DMF溶液(0.56ml)中加入肼一水合物(0.0136mL，0.280mmol)，在室温搅拌2小时。在反应溶液中加入CH2Cl2(5mL)，滤取所析出的固体。将析出的固体溶解于2M盐酸，用反相硅胶柱纯化，得到化合物1(12.0mg，99％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.02(1H，s)、7.93(1H，dd，J＝8.0，1.6Hz)、7.48(1H，d，J＝8.0Hz)、6.87(2H，br－s)、6.63(2H，d，J＝10.8Hz)、2.11(3H，s)
HRMS(ESI+)：calcd for[M+H]+，397.0994；found，397.0973(－2.1mmu)
[实施例2]化合物2的合成
通过以下的方案中记载的步骤，合成了化合物2。
在化合物9(8.01g，65.5mmol)和吡啶(20ml，250mmol)的二氯甲烷溶液(150mL)中在0℃加入对甲苯磺酰氯(30.0g，157mmol)，在室温搅拌16小时。将反应溶液用2M盐酸水溶液、蒸馏水清洗，进行减压蒸馏除去，将得到的残渣用乙醇再结晶，以白色结晶的形态得到化合物10(25.9g，92％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.60(2H，dd，J＝8.8Hz)，7.53(2H，d，J＝8.8Hz)，7.23(2H，d，J＝3.6Hz)，7.21(2H，d，J＝3.6Hz)，7.03(1H，s)，6.93(1H，br－s)，6.79(1H，dd，J＝8.4，2.0Hz)，6.67(1H，d，J＝8.0Hz)，6.44(1H，br－s)，2.39(6H，s)，2.19(3H，s)
在化合物10(25.9g，60.2mmol)和乙酸钠(8.89g，108mmol)的乙酸溶液(200mL)中以0℃加入溴(4.0mL，78.2mmol)，加热回流3小时。使反应溶液恢复至室温后，加入蒸馏水，将生成的析出物过滤。将所得到的粗体用乙醇再结晶，以白色结晶的形态得到化合物11(20.4g，67％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.58(2H，dd，J＝8.4，1.6Hz)，7.55(2H，dd，J＝8.4，1.6Hz)，7.29－7.20(4H，m)，7.00(1H，d，J＝1.6Hz)，6.93(1H，br－s)，6.86(1H，br－s)，6.50(1H，br－s)，2.40(6H，s)，2.20(3H，d，J＝1.6Hz)
在化合物11(10.2g，7.91mmol)中加入浓硫酸(10mL)，以100℃加热搅拌30分钟。将反应溶液冰浴，用2M氢氧化钠水溶液调整到pH10后，用二氯甲烷提取。将有机相用硫酸钠干燥后，将溶剂减压蒸馏除去，以淡黄色固体的形态得到化合物12(2.22g，55％)。
1H NMR(400MHz，DMSO－d6)δ6.66(1H，s)，6.43(1H，s)，4.50(4H，s)，2.08(3H，s)
在化合物12(153mg，0.761mmol)的DMF溶液(3mL)中加入碳酸钠(968mg，9.13mmol)和溴化苄(0.54mL，4.57mmol)，在60℃搅拌16小时。使反应溶液恢复到室温后，加入蒸馏水，用乙酸乙酯提取。将有机相用硫酸钠干燥后，将溶剂减压蒸馏除去。将所得到的残渣用硅胶柱色谱(展开溶剂：己烷/乙酸乙酯＝15/1)纯化，以白色固体的形态得到化合物13(345mg，81％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.29－7.19(12H，m)，7.16－7.07(8H，m)，6.94(1H，s)，6.63(1H，s)，4.37(4H，s)，4.35(4H，s)，2.23(3H，s)
HRMS(ESI+)：calcd for[M+H]+，561.1900；found，561.1836(－6.4mmu)
化合物14通过文献中记载的方法合成(J.AM.Chem.Soc.(2005)127：4888)。
在化合物13(219mg，0.501mmol)的THF溶液(4mL)中在氮气氛下以－78℃加入sec－BuLi(0.48mL，0.501mmol)进行搅拌。在反应溶液中加入化合物14(209mg，0.458mmol)，升温到室温后搅拌20分钟。在反应溶液中加入2M盐酸水溶液，以室温搅拌30分钟后，用二氯甲烷提取。将有机相用硫酸钠干燥后，将溶剂减压蒸馏除去。将残渣用硅胶柱色谱(展开溶剂：二氯甲烷/甲醇＝98/2)纯化，以橙色固体的形态得到化合物15(140mg，44％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.32－7.23(6H，m)，7.21－7.10(10H，m)，7.07－7.01(4H，m)，6.87(2H，s)，6.86(2H，d，J＝9.2Hz)，6.79(2H，dd，J＝9.2，2.4Hz)，6.76(1H，s)，6.43(1H，s)，4.52(4H，s)，4.33(4H，s)，1.82(3H，s)
HRMS(ESI+)：calcd for[M+H]+，693.3112；found，693.3099(－1.3mmu)
在化合物15(72.9mg，0.105mmol)的MeOH－THF＝1：1混合溶液(3mL)中加入Pd/C(10mg)，在氢气氛下以室温搅拌2天。将反应溶液用硅藻土过滤，将滤液减压蒸馏除去。将残渣溶解于二氯甲烷－MeOH＝4：1的混合溶液(1mL)中，加入四氯醌(51.6mg，0.210mmol)，在室温搅拌30分钟后，将反应溶液减压蒸馏除去。将残渣用硅胶柱色谱(展开溶剂：二氯甲烷/甲醇＝98/2)纯化，以橙色固体的形态得到化合物2(5.3mg，12％)。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.17(2H，d，J＝8.8Hz)，6.71(1H，s)，6.50－6.60(4H，m)，6.52(1H，s)，1.83(3H，s)
HRMS(ESI+)：calcd for[M+H]+，333.1234；found，333.1223(－1.1mmu)
[实施例3]利用DAF－2的荧光发光
使丙醛作用于DAF－2(制品型号：SK1001－01、五稜化药)，得到了以下的化合物16。化合物16为荧光性的，确认到伴随苯并咪唑环的形成，荧光强度增大。与醛反应前的DAF－2由于二氨基苯结构而荧光消光，但作为与醛的反应产物的化合物16显示荧光性(表1)。通过与醛形成共价键，能够利用荧光发光进行检测。
[表1]
摩尔吸光系数 量子产率
DAF-21) 79,000(λabs:486nm) 0.005
化合物162) 63,000(λabs:489nm) 0.85
1)100mM磷酸钠缓冲液，pH7.4的数据
引自Analytical Chemistry,1998,70,2446
2)10mM磷酸钠缓冲液，pH7.4的数据
[实施例4]DAF－2和化合物2的光学特性的变化
在各0.02mmol/L的DAF－2和化合物2的10mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.4)中添加丙醛使其最终浓度为0.10mmol/L，在室温搅拌4天。测定醛添加前和添加后的各溶液的吸收-荧光光谱。其结果，如图1所示，在醛添加后(峰较大的光谱)，可以看到比添加前(峰较小的光谱)的荧光强度增加。
[实施例5]利用DAF－2和化合物2的染色
关于包含DAF－2或化合物2这样的二氨基苯结构的荧光探针，以人大肠粘膜组织的冷冻薄切切片为阳性对照检体，研究杯状细胞的粘液中的染色性。具体而言，从福尔马林固定后的大肠粘膜组织切出薄切冻结切片，使用候补的荧光探针群，对其进行染色，利用磷酸缓冲生理盐水清洗后，使用共聚焦荧光显微镜进行拍摄。
通过使用DAF－2和化合物2进行染色，能够将大肠粘膜、杯状细胞的粘液清晰地染色(图2)。具体而言，将福尔马林固定后的人大肠粘膜组织样品用PBS充分清洗后，浸渍到含30％(w/v)蔗糖的PBS中，然后，使用TISSUE-TEK O.C.T.切片包埋剂(O.C.T.compound)制作冻结块。将该冻结块切成8μm厚，制作冻结切片。将冻结切片用PBS清洗后，使用将DAF－2(50μM)或化合物2(50μM)用PBS稀释后的溶液，在室温染色1天。然后，用PBS充分清洗后用水溶性的封固剂进行封入，使用共聚焦显微镜进行拍摄。同样对于肾小球的基底膜，也能够通过使用DAF－2和化合物2进行染色而清晰地绘出(图3)。
另外，通过将利用DAF－2或化合物2的染色与利用CUBIC试剂的组织透明化法一起使用，还能够实现大肠粘膜上皮的3D成像。具体而言，将福尔马林固定后的人大肠粘膜组织样品用PBS充分清洗后，一边缓慢振荡一边在37℃浸渍在将CUBIC－L试剂用蒸馏水稀释为1/2的溶液中。然后，一边浸渍在CUBIC－L试剂中缓慢振荡一边在37℃处理，期间在1～2天以一次的间隔，将CUBIC－L更换成新的试剂。然后，用PBS充分清洗后，浸渍在含30％(w/v)蔗糖的PBS中，然后，使用TISSUE-TEK O.C.T.切片包埋剂制作冻结块。将其溶解后，用PBS充分清洗，用1％高碘酸水溶液进行前处理后，使用将DAF－2(50μM)用PBS稀释得到的溶液在室温染色3天。然后，用PBS充分清洗后，浸渍在将CUBIC－R+试剂用蒸馏水稀释为1/2的溶液中，在室温缓慢振荡。然后，一边缓慢振荡一边在室温浸渍在CUBIC－R+试剂中1天，使用共聚焦显微镜进行拍摄。将所得到的数据用Bitplane公司Imaris三维模型化得到的图像表示于图4A。关于利用化合物2的染色也同样将与利用CUBIC试剂的组织透明化法并用时的共聚焦显微镜图像和三维模型化的图像表示于图4B。
以下，说明试验例A～H中使用的实验步骤。
《组织切片的荧光染色》
将染色对象的组织用磷酸缓冲生理盐水(PBS)清洗，浸渍在PBS中的30％(w/v)蔗糖中，在O.C.T.切片包埋剂(45833、Sakura Finetek)中以－80℃冻结过夜。将冻结组织利用恒冷箱切片机(cryostat)(CM3050S、Leica Biosystems)切成10μm厚。将所得到的冻结切片用PBS清洗3次，用0.5％高碘酸(HIO4)溶液(86171、MUTO PURE CHEMICALS)在室温进行30分钟前处理。将切片用PBS清洗3次，在由PBS稀释的FAM酰肼5－异构体(50μM、24170、BroadPharm，在本说明书中，有时称为“FAM酰肼”)、Alexa Fluor 488酰肼(50μM、A10436、ThermoFisher Scientific)、BDP FL酰肼(50μM、11470、Lumiprobe)或荧光素(50μM、和光)中，在室温孵育过夜。然后，将切片用PBS清洗，用共聚焦显微镜获取图像。
《全组织包埋3D组织染色(组织透明化与荧光染色的并用)》
组织透明化中使用CUBIC－L和CUBIC－R+试剂(T3740和T3741、东京化成工业)。以下简单说明组织除去步骤。
将甲醛固定组织标本用PBS清洗，接着在50％(v/v)CUBIC－L试剂(水：CUBIC－L的1：1混合物)中浸渍过夜。进而，一边缓慢振荡一边在CUBIC－L试剂中以37℃浸渍5天或6天。然后，将这些标本用PBS清洗，浸渍在PBS中的30％(w/v)蔗糖中，在O.C.T.切片包埋剂中以－80℃冻结过夜。接着，将冻结的标本解冻，用PBS清洗，在0.5％高碘酸(HIO4)溶液(86171、MUTO PURE CHEMICALS)中以室温浸渍30分钟。用PBS清洗后，将标本与含0.5％(v/v)Triton X－100(12967、Nacalai Tesque)的PBS中的FAM酰肼5－异构体(50μM)、化合物1(50μM)、Alexa Fluor 488酰肼(50μM)、BDP FL酰肼(50μM)或荧光素(50μM)一起在室温轻轻振荡2天或3天，进行染色。在进行细胞核复染的情况下，碘化丙啶(PI)(10μg/mL、P21493、Life Technologies)或RedDot－2(1：100、40061－T、Biotium)也添加到染色液中。在该染色步骤后，将标本用PBS清洗，在50％(v/v)CUBIC－R+试剂(水：CUBIC－R+的1：1混合物)浸渍过夜，进而一边轻轻振荡一边在CUBIC－R+试剂中浸渍1天或2天。由此得到的透明组织标本供给利用共聚焦荧光显微镜或光片荧光显微镜的3D成像。作为FAM酰肼、化合物1、AlexaFluor 488酰肼、BDP FL酰肼、和荧光素的激发波长，均适用488nm，荧光检测波长范围均为490nm～562nm。
《显微镜观察和图像解析》
3D图像使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM880 Confocal/Multiphoton、Carl－Zeiss)或光片荧光显微镜(Zeiss Lightsheet 7、Carl－Zeiss)获得。所有的原始图像数据使用Imaris软件(版本9.2.1、Bitplane)进行重建和分析。
《统计解析》
2组数据的正态性以0.05的显著水平通过Kolmogorov-Smirnov检验进行评价。在组中确认到正态性的情况下，方差齐性以显著水平0.05通过F检验进行检验。在2个组具有等方差性且服从正态分布时，适用学生t检验，在不具有等方差性且服从正态分布时，适用韦尔奇t检验。在组中没有确认到正态性的情况下，使用曼-惠特尼U检验。
[试验例A]人大肠粘膜冷冻切片标本的荧光染色
对于从结肠直肠癌的外科标本的非肿瘤区域采样得到的人结肠直肠粘膜组织切片，使用FAM酰肼、Alexa Fluor 488酰肼、BDP FL酰肼或作为荧光骨架的荧光素作为染色剂进行荧光染色。将结果表示于图5。
如图5所示，在FAM酰肼和Alexa Fluor 488酰肼时，得到了杯状细胞粘液的清晰的阳性图像。这些信号在不进行利用HIO4的氧化处理时得不到，因此可以认为经由醛基与FAM酰肼和Alexa Fluor 488酰肼的NH2基的反应是染色原理。另外，BDP FL酰肼时得到的信号弱，另外，荧光素时观察不到荧光。
[试验例B]人大肠粘膜组织的透明化和荧光染色
对于切成约4mm大方形的福尔马林固定后人大肠粘膜组织，进行透明化处理和利用FAM酰肼、Alexa Fluor 488酰肼、BDP FL酰肼或荧光素作为染色剂的全组织包埋3D组织染色。将结果表示于图6～9。
如图6所示，在3D成像中，FAM酰肼时得到了清晰的立体图像，而在Alexa Fluor488酰肼和BDP FL酰肼时得到的信号弱，另外，荧光素时观察不到荧光。
另一方面，在使用FAM酰肼的情况下，大肠粘膜的隐窝中的杯状细胞和基底膜被清晰地染色，由此，能够将隐窝的立体结构极为清晰地成像(图7)。另外，通过并用三维图像解析，能够进行1个隐窝水平的成像(图8a)。由该观察可知，在正常的大肠隐窝中，杯状细胞所含有的粘液均匀，规律地排列。嗜中性粒细胞也是PAS染色阳性的细胞之一，但在使用FAM酰肼的3D组织染色中也可以被清晰地染色，这通过使用抗髓过氧化物酶(MPO)抗体的免疫组织染色确认(图8b、图中，“PAFhy”表示FAM酰肼)。另外，在不进行使用HIO4的氧化处理的情况下，没有确认到阳性信号，在使用CUBIC的3D成像法中，也可以认为在由氧化产生的醛基上结合FAM酰肼的NH2基是染色原理(图9)。
[试验例C]病理组织检体的3D成像
对于从患有溃疡性大肠炎的个体采集的大肠组织检体，进行透明化处理、和使用FAM酰肼或化合物1作为染色剂的全组织包埋3D组织染色。将结果表示于图10。
如图10所示，在3D成像中，化合物1与FAM酰肼同样地能够得到嗜中性粒细胞的清晰染色图像。
在上述实施例和试验例中使用的染色剂(DAF－2、化合物2、化合物1、FAM酰肼、Alexa Fluor 488酰肼、BDP FL酰肼)的激发波长均在400nm～520nm的范围内，产生绿色的荧光。作为绿色的荧光色素，从荧光量子产率和光稳定性的高度考虑，通常Alexa Fluor488为首选项，实际上通过使用Alexa Fluor 488，能够实现薄切切片的清晰的染色。而另一方面，关于透明化处理后的具有厚度的样品的染色，在使用Alexa Fluor 488和BDP FL酰肼的情况下，染色性不充分，可知具有荧光素骨架的化合物(DAF－2、化合物2、化合物1、FAM酰肼)的染色性特别优异。发挥这样的效果的理由不确定，推测是这些化合物的组织渗透性优异、以及不易受到透明化剂的影响等。
[试验例D]病理组织检体的3D成像
对于从患有溃疡性大肠炎的个体采集的大肠组织检体，进行透明化处理、和使用FAM酰肼作为染色剂的全组织包埋3D组织染色。另外，从与进行这些处理的检体连续的组织一并制作经典HE染色和PAS染色载玻片。将结果表示于图11～13。
如图11所示，在伴随高度炎症细胞浸润的1例中，隐窝炎的观察结果(所见)、即隐窝内浸润的嗜中性粒细胞(由▲所示)、和由于炎症而杯状细胞的粘液减少的观察结果(杯状细胞耗竭，Goblet cell depletion)被清晰地成像。接着，关注溃疡性大肠炎特征性的、隐窝脓肿的观察结果，结果在相同病例中确认到隐窝脓肿的观察结果(图12)。在该观察结果中，在底部形成微小脓肿，这些脓肿是由从隐窝斜下方浸润的嗜中性粒细胞(由▲所示)形成的，可知嗜中性粒细胞也沿着隐窝腔向上方分布。另外，在其他的隐窝脓肿的成像中，也看到了如下观察结果：脓肿部分以隐窝底部为主，隐窝几乎完全被破坏，与周围的边界不清晰(图13)。由以上可知，使用FAM酰肼的3D成像法能够进行溃疡性大肠炎的病理隐窝结构的三维观察，能够实现不能二维评价的嗜中性粒细胞的立体的分布模式。
[试验例E]炎症性肠道疾病的病理观察结果的3D成像和基于3D成像的病理诊断1
从溃疡性大肠炎(UC)、克罗恩病(CD)和非特异性肠炎(Non－IBD(非IBD)：大肠癌检体中的非肿瘤部)的手术材料切出组织小片，使用其一半，进行透明化处理和使用FAM酰肼作为染色剂的全组织包埋3D组织染色。另外，使用剩余的一半，制作经典HE染色和PAS染色的载玻片。
如图14所示，利用3D组织染色，能够将被视为溃疡性大肠炎的观察结果之一的隐窝的扭曲(distortion)三维地成像，不仅在溃疡性大肠炎中较多被观察到，而且在克罗恩病中也确认到。
接着，关于二维图像诊断困难的炎症性肠道疾病，研究了以隐窝的三维结构为基准进行诊断的可能性。具体而言，着眼于隐窝的扭曲的程度，为了对它们进行更加定量的评价，在隐窝的三维解析中，定义了体积(Volume)、椭圆率(Ellipticity(prolate))、弯曲度(Tortuosity)的3个参数，对于溃疡性大肠炎、克罗恩病和非特异性肠炎的检体进行它们的多学科观察和定量化。体积通过利用图像解析软件(Imaris)处理隐窝的3D图像而求得。椭圆率将隐窝的3D图像进行椭圆近似，从图15所示的式子算出。另外，弯曲度在将隐窝分割成5份的各个深度的光学切片中在隐窝的中心部设定点a～f，计算连接上端(点a)与下端(点f)的直线距离(Da－f)、和点a～f之间的相邻点彼此的距离(Da－b、Db－c、Dc－d、Dd－e、De－f)的总和，根据这些进行计算。
使用所有病例进行解析的结果，在体积、椭圆率和弯曲度的任意参数中，都得到统计学上的显著差异(图16)。具体而言，关于体积，在溃疡性大肠炎时与其他2者相比增加，关于椭圆率，在溃疡性大肠炎和克罗恩病时与非特异性肠炎相比确认到了值的降低。关于弯曲度，从高到低依次为溃疡性大肠炎、克罗恩病、非特异性肠炎，确认到了值的差。另外，即使在仅对病理诊断医生诊断为非特异性肠炎的病例进行解析的情况下，也基本为同样的结果，在3个参数中确认到统计学上的显著差异(图17)。由此表明通过以隐窝的扭曲为基准的三维定量值，能够诊断难以使用二维经典病理诊断法的炎症性肠道疾病。
在以往的溃疡性大肠炎、克罗恩病等的疾病的病理组织诊断中，通常隐窝脓肿或上皮样肉芽肿这样的特征性观察结果的有无是有用的线索。然而，在通过治疗改变等而炎症不明显的病例中有时得不到这样的观察结果，在该情况下，病理组织学上只能说是非特异性肠炎，实际上，不考虑临床信息，仅凭病理组织诊断难以做出明确诊断。事实上，在病理诊断医生诊断溃疡性大肠炎、克罗恩病、非特异性肠炎的HE染色、PAS染色载玻片时，溃疡性大肠炎的58.6％、克罗恩病的63.1％被诊断为非特异性肠炎，关于溃疡性大肠炎的31.0％、克罗恩病的26.3％在病理医生之间的诊断不一致。此外，这些组织检体采自不同的色调的部位，关于其炎症的程度不存在显著差异。
[试验例F]炎症性肠道疾病的病理观察结果的3D成像和基于3D成像的病理诊断2
关于试验例E中得到的3D图像，对隐窝的扭曲，进行了更详细的三维形态学观察，结果得知在溃疡性大肠炎中，扭曲的结构以多个隐窝卷入的形式存在(图18a)。在该结构中，多个隐窝均向相同方向扭曲。将这样的相邻的2个以上的隐窝向相同方向扭曲的三维的观察结果定义为“螺旋楼梯样隐窝，Spiral staircase－like crypts”(SSCs)(图18b)，统计其观察结果的数量。
其结果，溃疡性大肠炎的46.4％看到了该观察结果，其频度比克罗恩病的22.2％多(图18c、d)。另外，非特异性肠炎中没有观察到。这些结果表明根据炎症性肠道疾病特有的观察结果的有无，能够诊断难以用二维经典病理诊断法的炎症性肠道疾病。此外，该观察结果被推测是在每个相邻的多个隐窝卷入的同一区域，可能由于炎症或纤维化造成的压力差而扭曲是成立原因(图18e)。
[试验例G]人大肠粘膜组织的3D成像
使用FAM酰肼和碘化丙啶(PI)作为染色剂，将人大肠腺瘤息肉整体进行3D组织染色，用光片显微镜进行观察和3D成像。将结果与HE染色和PAS染色图像一起表示于图19。
如图19所示，观察到人大肠腺瘤息肉表层的复杂的隆起性结构。
[试验例H]真菌菌丝的3D成像
使用FAM酰肼和RedDot(R)2作为染色剂，将肺曲霉病组织中的真菌菌丝进行3D组织染色，用共聚焦显微镜进行观察和3D成像。将结果与HE染色和PAS染色图像一起表示于图20。
如图20所示，能够清晰地绘出真菌菌丝的结构。
产业上的可利用性
利用本发明的荧光染色方法，能够适合检测具有三维立体结构且透明化处理后的组织或细胞样品中的含二醇基的物质，因此例如能够有助于确认肠隐窝的立体结构中的病变。

Claims (21)

1.一种对组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的方法，其特征在于，包括：
使以下的通式(I)所示的化合物或其盐与该组织或细胞样品接触的步骤，
通式(I)中，
R1表示羧基、可以被取代的烷基、可以被取代的烷氧基或卤原子；
R2、R3、R4、R5、R6和R7分别独立地表示氢原子、羟基(OH基)、卤原子或可以被取代的直链或支链烷基；
X表示酰肼基、氨基脲基、氨基硫脲基、肼基、羟基氨基、氨基或烷基氨基；
Y不存在，或者表示酰胺基、酯基、脲基、硫脲基、氨基甲酸酯基、碳酸酯基或氧原子；
L表示－(直链或支链亚烷基)n－、－(直链或支链亚烷基－O－)n－或－(直链或支链亚烷基－O－)n－(直链亚烷基)m－，或者表示单键，其中，式－(直链或支链亚烷基)n－中，n为1～10的整数，式－(直链或支链亚烷基－O－)n－中，n为1～10的整数，式－(直链或支链亚烷基－O－)n－(直链亚烷基)m－中，n和m分别独立地为1～10的整数；
p表示0～4的整数，在p为2以上的情况下，R1可以相同也可以不同；
q表示1～2的整数，在q为2的情况下，(X－L－Y)所示的结构可以相同也可以不同，p与q之和为5以下的整数。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：
在使所述化合物或其盐与所述组织或细胞样品接触之前，使所述组织或细胞样品中的二醇基氧化生成醛基的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述组织或细胞样品具有三维立体结构。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述组织或细胞样品为经透明化处理的组织或细胞样品。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
还包括通过用亲水性透明化剂处理所述组织或细胞样品进行透明化的步骤。
6.一种检测组织或细胞样品中的含二醇基的物质的方法，其特征在于，包括：
通过权利要求1～5中任一项所述的方法，对该组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的步骤；和
测定从所述化合物发出的荧光的步骤。
7.一种使含有含二醇基的物质的组织或细胞可视化的方法，其特征在于，包括：
通过权利要求1～5中任一项所述的方法，对组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的步骤；和
对从所述化合物发出的荧光进行测定并图像化的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述含有含二醇基的物质的组织或细胞为粘膜上皮、基底膜或真菌。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：
其为对隐窝进行可视化的方法。
10.一种判定组织或细胞样品中的大量含有含二醇基的物质的组织和/或病变的方法，其特征在于，包括：
通过权利要求1～5中任一项所述的方法，对组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的步骤；和
判定在被染色的部位存在该组织和/或病变的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：
所述病变为隐窝的扭曲。
12.一种筛选伴随含有含二醇基的物质的组织或细胞的病变的疾病的治疗药的方法，其特征在于，包括：
对患有该疾病的个体投予治疗药候补物的步骤；
从该个体采集产生该病变的组织或细胞样品的步骤；
通过权利要求1～5中任一项所述的方法，对该组织或细胞样品中的含二醇基的物质进行荧光染色的步骤；
对从所述化合物发出的荧光进行测定并图像化，将含有含二醇基的物质的组织或细胞进行可视化的步骤；和
根据可视化的该含有含二醇基的物质的组织或细胞的图像，判定治疗药候补物的治疗效果的步骤。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：
所述疾病为炎症性肠道疾病。
14.一种荧光染色用组合物，其特征在于：
包含下述通式(I)所示的化合物或其盐，该荧光染色用组合物用于将含有含二醇基的物质的组织或细胞可视化，
通式(I)中，
R1表示羧基、可以被取代的烷基、可以被取代的烷氧基或卤原子；
R2、R3、R4、R5、R6和R7分别独立地表示氢原子、羟基(OH基)、卤原子或可以被取代的直链或支链烷基；
X表示酰肼基、氨基脲基、氨基硫脲基、肼基、羟基氨基、氨基或烷基氨基；
Y不存在，或者表示酰胺基、酯基、脲基、硫脲基、氨基甲酸酯基、碳酸酯基或氧原子；
L表示－(直链或支链亚烷基)n－、－(直链或支链亚烷基－O－)n－或－(直链或支链亚烷基－O－)n－(直链亚烷基)m－，或者表示单键，其中，式－(直链或支链亚烷基)n－中，n为1～10的整数，式－(直链或支链亚烷基－O－)n－中，n为1～10的整数，式－(直链或支链亚烷基－O－)n－(直链亚烷基)m－中，n和m分别独立地为1～10的整数；
p表示0～4的整数，在p为2以上的情况下，R1可以相同也可以不同；
q表示1～2的整数，在q为2的情况下，(X－L－Y)所示的结构可以相同也可以不同，p与q之和为5以下的整数。
15.如权利要求14所述的荧光染色用组合物，其特征在于：
用于将隐窝可视化。
16.如权利要求14所述的荧光染色用组合物，其特征在于：
还包含亲水性透明化剂。
17.一种伴随含有含二醇基的物质的组织或细胞的病变的疾病的诊断用组合物，其特征在于：
包含下述通式(I)所示的化合物或其盐，
通式(I)中，
R1表示羧基、可以被取代的烷基、可以被取代的烷氧基或卤原子；
R2、R3、R4、R5、R6和R7分别独立地表示氢原子、羟基(OH基)、卤原子或可以被取代的直链或支链烷基；
X表示酰肼基、氨基脲基、氨基硫脲基、肼基、羟基氨基、氨基或烷基氨基；
Y不存在，或者表示酰胺基、酯基、脲基、硫脲基、氨基甲酸酯基、碳酸酯基或氧原子；
L表示－(直链或支链亚烷基)n－、－(直链或支链亚烷基－O－)n－或－(直链或支链亚烷基－O－)n－(直链亚烷基)m－，或者表示单键，其中，式－(直链或支链亚烷基)n－中，n为1～10的整数，式－(直链或支链亚烷基－O－)n－中，n为1～10的整数，式－(直链或支链亚烷基－O－)n－(直链亚烷基)m－中，n和m分别独立地为1～10的整数；
p表示0～4的整数，在p为2以上的情况下，R1可以相同也可以不同；
q表示1～2的整数，在q为2的情况下，(X－L－Y)所示的结构可以相同也可以不同，p与q之和为5以下的整数。
18.如权利要求17所述的诊断用组合物，其特征在于：
所述疾病为炎症性肠道疾病。
19.如权利要求17所述的诊断用组合物，其特征在于：
还包含亲水性透明化剂。
20.一种下述通式(I)所示的化合物或其盐，其特征在于：
通式(I)中，
R1表示羧基、可以被取代的烷基、可以被取代的烷氧基或卤原子；
R2、R3、R6和R7分别独立地表示氢原子、羟基(OH基)、卤原子或可以被取代的直链或支链烷基；
R4和R5分别表示氟原子；
X表示酰肼基、氨基脲基、氨基硫脲基、肼基或羟基氨基；
Y不存在，或者表示酰胺基、酯基、脲基、硫脲基、氨基甲酸酯基、碳酸酯基或氧原子；
L表示－(直链或支链亚烷基)n－、－(直链或支链亚烷基－O－)n－或－(直链或支链亚烷基－O－)n－(直链亚烷基)m－，或者表示单键，其中，式－(直链或支链亚烷基)n－中，n为1～10的整数，式－(直链或支链亚烷基－O－)n－中，n为1～10的整数，式－(直链或支链亚烷基－O－)n－(直链亚烷基)m－中，n和m分别独立地为1～10的整数；
p表示0～4的整数，在p为2以上的情况下，R1可以相同也可以不同；
q表示1～2的整数，在q为2的情况下，(X－L－Y)所示的结构可以相同也可以不同，p与q之和为5以下的整数。
21.一种下述通式(I)所示的化合物或其盐，其特征在于：
通式(I)中，
R1表示可以被取代的烷基、可以被取代的烷氧基或卤原子；
R2、R3、R4、R5、R6和R7分别独立地表示氢原子、羟基(OH基)、卤原子或可以被取代的直链或支链烷基；
X表示氨基或烷基氨基；
Y不存在；
L表示单键；
p表示0～4的整数，在p为2以上的情况下，R1可以相同也可以不同；
q表示1～2的整数，在q为2的情况下，(X－L－Y)所示的结构可以相同也可以不同，p与q之和为5以下的整数。
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