CN103460042A - Glu-微管蛋白作为对呋咱并苯并咪唑类的药物反应的生物标志物的用途 - Google Patents

Glu-微管蛋白作为对呋咱并苯并咪唑类的药物反应的生物标志物的用途 Download PDF

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Abstract

Glu-微管蛋白作为生物标志物用于预测对化合物的反应的用途，所述反应优选是个体中的疾病例如癌症对所述化合物的耐药性，其中所述化合物是通式(I)的呋咱并苯并咪唑化合物。
Figure DDA00003535957700011

Description

GLU-微管蛋白作为对呋咱并苯并咪唑类的药物反应的生物标志物的用途
本发明涉及Glu-微管蛋白作为生物标志物用于预测疾病对通式I化合物的响应的用途，其中所述疾病诸如肿瘤或自身免疫性疾病，优选癌症，所述通式I化合物诸如3-4-{1-[2-(4-氨基-苯基)-2-氧代-乙基]-1H-苯并咪唑-2-基}-呋咱-3-基氨基)-丙腈(BAL27862)。在其它方面，本发明还涉及包含使用该生物标志物的方法和试剂盒，以及治疗方法。
微管是细胞骨架的组件之一，由α-和β-微管蛋白的异源二聚体组成。靶向微管的试剂是最有效的细胞毒化疗剂之一，具有广谱活性。微管去稳定剂(如长春花生物碱，诸如长春新碱、长春花碱和长春瑞滨)例如用于治疗多种血液系统恶性肿瘤，如淋巴母细胞性白血病和淋巴瘤，以及实体瘤，诸如肺癌。微管稳定剂(如紫杉烷类化合物，诸如紫杉醇、多西他赛)例如用于治疗实体肿瘤，包括乳腺癌、肺癌和前列腺癌。
然而可能发生对这些已知的微管靶向试剂的耐药性。耐药性可以是固有的或在暴露于这些试剂后获得的。这样的耐药性因此影响患者的存活率，以及对治疗方案的选择。已经确定几个可能的耐药机制，并包括微管靶点的缺陷，诸如β-微管蛋白亚型III水平升高，以及已知能降低紫杉烷结合的β-微管蛋白亚型I的获得性突变。此外，已经提出其他细胞蛋白的缺陷与对某些微管靶向剂的耐药性相关，诸如外排泵P-糖蛋白(P-gp泵，也称为多药耐药蛋白1或MDR1)的过表达。这些因子可能被用来作为对这些传统微管靶向剂耐药性的生物标志物。
近期发现的一类微管去稳定剂是由下面给出的通式包括的化合物：
其中
R代表苯基、噻吩基或吡啶基
其中苯基任选地被一个或两个独立地选自烷基、卤代低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基(其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基)、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧羰基、氰基、卤素和硝基的取代基所取代；并且其中两个相邻的取代基是亚甲二氧基；
以及其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示基团C=Y，其中Y代表氧或被羟基或低级烷氧基取代的氮;
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基低级烷基;
R2、R3和R6表示氢;
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
或R4和R5一起表示亚甲二氧基；
以及它们的可药用盐；
或其中R表示苯基或吡啶基
其中苯基任选地被一个或两个独立地选自烷基、卤代低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基(其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基)、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧羰基、甲酰基、氰基、卤素和硝基的取代基所取代；并且其中两个相邻的取代基是亚甲二氧基；
以及其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示氧;
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基低级烷基;
R2、R3和R6表示氢;
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
或R4和R5一起表示亚甲二氧基；
以及它们的可药用盐；
并且其中前缀“低级”表示具有至多并包括最多7个，尤其是至多并包括最多4个碳原子的基团。
这些化合物公开在WO2004/103994A1中，在此通过交叉引用引入本文。已证明这些化合物阻止肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡。
式I化合物的合成在WO2004/103994A1第29-35页一般地描述，具体描述是在第39-55页，其通过交叉引用的方式并入本文。它们可以如公开地那样制备，或通过与其中描述的方法类似的方法制备。
属于这一类的一种化合物称为BAL27862，并在WO2004/103994A1作为实施例58显示，其特别引入本文作为参考，具有如下给出结构及化学名称：
Figure BDA00003535957500031
化学名：3-(4-{1-[2-(4-氨基-苯基)-2-氧代-乙基]-1H-苯并咪唑-2-基}-呋咱-3-基氨基)-丙腈。
或在本文中称为化合物A，
其他的化合物分别例示在WO2004/103994A1实施例50和79中，并且也通过交叉引用并入本文，其具有如下给出的结构和化学名：
Figure BDA00003535957500041
化学名：2-[2-(4-氨基-呋咱-3-基)-苯并咪唑-1-基]-1-(4-氨基-苯基)-乙酮
或在本文中称为化合物B，
以及
化学名：3-(4-{1-[2-(6-氨基-吡啶-3-基)-2-氧代-乙基]-1H-苯并咪唑-2-基}-呋咱-3-基氨基)-丙腈
或在本文中称为化合物C。
BAL27862在实体瘤异种移植模型的广泛实验中具有活性。此外，即使被选择用于对传统微管靶向剂(包括长春花生物碱类的微管去稳定剂和微管稳定剂紫杉醇和埃坡霉素B)具有耐药性的肿瘤模型，其也具有活性。在体外以及人乳腺肿瘤异种移植物模型的任何模型测试中，BAL27862活性不受P-gp泵过表达的影响。而且，即使β-微管蛋白亚型III水平升高，以及在微管蛋白亚型I中有突变，BAL27862仍然保持其活性。
因此，BAL27862活性不受赋予对传统微管靶向剂耐药性的一些因素的影响。
此外，已知与其他微管靶向剂、包括其他微管去稳定剂相比，通式I化合物对细胞表型具有不同的效果。在衍生自各种器官(例如肺、子宫颈和乳腺)的肿瘤细胞系中，通式I化合物的治疗诱导一致的微管表型，如图1所示。用抗-α-微管蛋白抗体在这些细胞中对微管染色显示，在处理后的细胞中只有点状结构可见，而不是未经处理的细胞中的有丝分裂纺锤体纤维。这种相同的效果还显示在用化合物C和B处理肺癌细胞系A549时，分别如图2A和2B所示。然而，这与分别显示在图3B、3C、3D和4中的传统微管靶向剂长春花碱、秋水仙素、紫杉醇和诺考达唑的观察结果非常不同。微管用抗-α-微管蛋白抗体染色，并在1000×放大倍数下观察细胞(图3、4)。对于用BAL27862处理的细胞，可见多个点状结构，而与之形成鲜明对比的是，其他传统药物产生丝状微管结构，或密集的微管聚集结构。这些在表型水平上、在被认为抗增殖作用最佳的化合物剂量下表现出的差异，表明了在分子水平上的作用方式的不同。
此外，已知BAL27862在其他微管靶向剂的存在下引发显性微管表型。长春花碱、秋水仙素、紫杉醇或诺考达唑单独治疗诱导这些试剂的微管表型特征(分别为图5A、5D、5G、6C-6F)。然而，与BAL27862联合治疗持续4小时导致这些表型的断裂，即使继续存在长春花碱、秋水仙素、紫杉醇或诺考达唑(分别为图5B、5E、5H、6G-6J)。相反，先用BAL27862处理并随后与长春花碱、秋水仙素、紫杉醇或诺考达唑联用处理4小时对表型的产生没有任何影响，其与BAL27862处理一致(分别为图5C、5F、5I、6K-6N)。
这些数据都表明BAL27862以与传统微管靶向剂不同的方式影响微管的生物学。
因此，从传统微管靶向剂有关的信息，无法预测特定基因是否或如何参与式I化合物的作用。
本发明的一个目的是鉴定与对式I化合物或其可药用衍生物的响应相关的因素，例如，以鉴定与如下文定义的通式I化合物、尤其是BAL27862或其可药用衍生物耐药性相关联的因素。
已经令人惊奇地发现，Glu-微管蛋白可以用作对下文定义的通式I化合物或其可药用衍生物治疗的反应的生物标志物。
在本发明的一个优选的实施方案中，肿瘤样品中相对高的Glu-微管蛋白水平与固有的及获得性的对BAL27862的抗性相关，如下所述。
微管蛋白会进行各种翻译后修饰，包括去酪氨酰化/酪氨酰化、乙酰化、谷氨酰化、聚甘氨酰化、丝氨酸残基的磷酸化和酪氨酸残基的磷酸化，使其成为已知最多修饰的蛋白之一。许多α-微管蛋白基因的最新预测微管蛋白上存在羧基末端酪氨酸。目前认为，一旦微管蛋白聚合并组装成微管，在某些情况下，羧肽酶(微管蛋白羧肽酶或微管蛋白酪氨酸羧肽酶，TTCP)的作用移除α-微管蛋白的C-末端酪氨酸，暴露出倒数第二个谷氨酸。另一种酶微管蛋白酪氨酸连接酶(TTL)，可以重新连接此酪氨酸。去酪氨酰化/酪氨酰化循环在细胞的确切功能尚未阐明。
在其C-末端不具有酪氨酸而具有谷氨酸的α-微管蛋白形式被称为Glu-微管蛋白或者glu微管蛋白或去酪氨酰化微管蛋白。本文所用的术语Glu-微管蛋白是指谷氨酸作为C-末端氨基酸的α-微管蛋白形式。名称Glu-微管蛋白也包括其中还可能存在其他翻译后修饰的形式。已知形成Glu-微管蛋白基础的α-微管蛋白存在多个变体、亚型和同种型，以及存在多个α-微管蛋白基因来产生他们，并且所有这些也应包括在名称Glu-微管蛋白之中，只要谷氨酸为C-末端氨基酸。优选地，其涉及α-微管蛋白的人变体、亚型和同种型，只要谷氨酸是C-末端氨基酸。在更优选的实施方案中，经翻译后修饰的α-微管蛋白的C-末端氨基酸是谷氨酸，而不是酪氨酸。α-微管蛋白的亚型包括但不限于微管蛋白α-1A、微管蛋白α-1B、微管蛋白α-1C和微管蛋白α-3C/D。这些亚型的蛋白序列分别通过以下国家生物技术信息中心(NCBI)的参考号NP_006000、NP_006073、NP_116093和NP_005992获得。这些也列在图11-14中(NP_006000.2、NP_006073.2、NP_116093.1、NP_005992.1)，分别作为SEQ ID NO1-4。如上所述，在SEQ.ID.NO.1-4所列序列上Glu-微管蛋白不具有C-末端氨基酸酪氨酸。
本发明的一个方面涉及Glu-微管蛋白作为预测对化合物反应的生物标志物的用途，其中所述化合物是通式I化合物，
Figure BDA00003535957500071
其中
R代表苯基、噻吩基或吡啶基
其中苯基任选地被一个或两个独立地选自烷基、卤代低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基(其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基)、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧羰基、氰基、卤素和硝基的取代基所取代；并且其中两个相邻的取代基是亚甲二氧基；
以及其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示基团C=Y，其中Y代表氧或被羟基或低级烷氧基取代的氮;
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基低级烷基;
R2、R3和R6表示氢;
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
或R4和R5一起表示亚甲二氧基；
以及它们的可药用衍生物；
或其中
R表示苯基或吡啶基
其中苯基任选地被一个或两个独立地选自烷基、卤代低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基(其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基)、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧羰基、甲酰基、氰基、卤素和硝基的取代基所取代；并且其中两个相邻的取代基是亚甲二氧基；
以及其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示氧;
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基低级烷基;
R2、R3和R6表示氢;
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
或R4和R5一起表示亚甲二氧基；
以及它们的可药用衍生物；
并且其中前缀“低级”表示具有至多并包括最多7个，尤其是至多并包括最多4个碳原子的基团。
优选地，所述反应可能是个体的疾病。还优选的反应可能是治疗，即用通式I化合物或其可药用衍生物的治疗。
在从人体或动物体、优选从人体获得的样品或多个样品中离体测量生物标志物Glu-微管蛋白。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及Glu-微管蛋白作为预测个体的疾病对如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物的耐药性的生物标志物的用途。
优选的可药用衍生物选自如上所定义的通式I化合物的盐、溶剂化物、前药、前药的盐、多晶型物和异构体。前药优选为天然存在的氨基酸的酯和酰胺、小肽或聚乙二醇化羟基酸。更优选地，前药是由存在于通式I化合物R基团内的氨基与甘氨酸、丙氨酸或赖氨酸的羧基形成的酰胺。
特别优选的化合物是
Figure BDA00003535957500091
或其可药用盐，优选其盐酸盐，最优选二盐酸盐。
本发明另一方面涉及用于预测个体的疾病对如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物的反应的方法，其包括以下步骤：
a)测量预先从个体获得的样品中的Glu-微管蛋白水平，获得代表该水平的值；以及
b)将步骤a)的值与标准值或标准值集合相比较。
更优选地，预测的反应是耐药性。
Glu-微管蛋白水平的测量在从个体预先得到的一个或多个样品中体外进行。预先获得是指这样的事实，即在进行涉及测量生物标志物水平的任何方法之前获得样品，而且预先获得不能理解为与治疗相关。在优选的实施方案中，从个体获得的样品中相对标准值或标准值集合更高的Glu-微管蛋白水平预测了耐药性。
还优选地，该疾病是肿瘤或自身免疫性疾病。更优选的疾病是癌症。特别优选地，癌症选自乳腺癌、前列腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌(即包括结肠癌和直肠癌)、胰腺癌，肝癌、脑癌、神经内分泌癌、肺癌、肾癌、血液系统恶性肿瘤、黑色素瘤和肉瘤。更特别优选地，癌症选自乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠直肠癌、黑色素瘤和肺癌。在一个特别优选的实施方案中，癌症选自肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、结肠直肠癌。在其中确定固有耐药性的特别优选的实施方案中，癌症选自肺癌、黑色素瘤或结肠直肠癌。在确定获得性耐药性的另一个特别优选的实施方案中，癌症是肺癌或卵巢癌。
在其他方面，本发明涉及在需要的个体中治疗肿瘤或自身免疫性疾病、优选癌症的方法，其包括：测量个体样品中的Glu-微管蛋白水平，获得代表这一水平的值，如果所述样品中Glu-微管蛋白的水平不高于标准值或标准值集合，则用如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物治疗该个体。
在其他方面，本发明涉及Glu-微管蛋白，用于治疗肿瘤或自身免疫性疾病，优选癌症，其包括：测量个体样品中的Glu-微管蛋白水平，获得代表这一水平的值，并且如果Glu-微管蛋白的水平不高于标准值或标准值集合，则用如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物治疗该个体
Glu-微管蛋白水平的测量在从个体中预先获得的样品中体外进行。
另一方面，本发明还涉及治疗肿瘤或自身免疫性疾病，优选癌症的方法，其包括首先降低其样品水平比标准水平或标准水平集更高的个体的Glu-微管蛋白水平，然后用如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物治疗该个体。
在另一方面，本发明涉及预测对如上定义的通式I化合物或其可药用衍生物的反应的试剂盒，其包含用于测量样品中Glu-微管蛋白水平所需的试剂。更优选地，该试剂盒还包含比较器模块，其包括用于将样品中的Glu-微管蛋白水平与之进行比较的标准值或标准值集合。
更优选地，该试剂盒包含如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物。在一个特别优选的实施方案中，该试剂盒包含下式化合物或其可药用盐：
Figure BDA00003535957500111
化学名：S-2,6-二氨基己酸[4-(2-{2-[4-(2-氰基-乙基氨基)-呋咱-3-基]-苯并咪唑-1-基}乙酰基)-苯基]-酰胺
在特别优选的实施方案中，可药用盐是二盐酸盐。
本发明的另一个其他方面涉及用于预测对如上定义的通式I化合物或其可药用衍生物反应的装置，其包含用于测量样品中Glu-微管蛋白水平所需的试剂和比较器模块，所述比较器模块包括用于将样品中的Glu-微管蛋白水平与之进行比较的标准值或标准值集合。
在优选的实施方案中，该试剂盒或装置中的试剂包含捕获试剂以及检测试剂，其中所述捕获试剂包含用于Glu-微管蛋白的检测剂。特别优选地，所述捕获试剂是抗体。还优选的是，当Glu-微管蛋白相对于标准值或标准值集合更高时，疾病被预测为对所述化合物的治疗有耐药性。在优选的实施方案中，比较器模块包含在试剂盒的使用说明中。在另一个优选的实施方案中，比较器模块为显示装置的形式。
现在将通过举例的方式，参照附图描述本发明的实施方案。然而，本发明不应该理解为仅限于这些实施方案。
附图说明
图1：显示用50nM BAL27862处理来自不同组织型的人类肿瘤细胞系。在用50nM BAL27862或溶媒对照处理24小时后对有丝分裂或G2/M期停滞的细胞的微管进行染色。
图1A和1B:A549NSCLC细胞;
图1C和1D:HeLa宫颈癌细胞;
图1E和1F:SKBR3乳腺癌细胞
溶媒对照处理：图1A、1C和1E，
BAL27862处理:图1B、1D和1F。
图2：显示用化合物B和C对A549NSCLC细胞的处理。有丝分裂或G2/M期停滞的A549NSCLC细胞的微管在分别用80nM或20nM化合物B和C处理24小时后进行染色。白色的标尺表示10微米。
图2A:用20nM化合物2C处理
图2B:用80nM化合物2B处理
图3：显示BAL27862与传统微管靶向剂处理细胞的比较。有丝分裂或G2/M期停滞的A549NSCLC细胞的微管在用50nM的A：BAL27862、B：长春花碱、C：秋水仙素、D：紫杉醇处理24小时后进行染色。每1μm图像的堆叠用ImageJ软件处理。
图4：显示BAL2786与诺考达唑对A549NSCLC细胞处理的比较。
有丝分裂或G2/M期停滞的细胞的微管在用各种浓度的诺考达唑(B、C&D)和BAL27862(E、F&G)处理24小时后进行染色。A：对照；B：诺考达唑50nM；C：诺考达唑100nM；D：诺考达唑200nM；E：BAL2786220nM；F：BAL2786230nM以及G：BAL2786250nM。白色的标尺表示10微米。显示了观察到的微管表型的代表图像。
图5：显示BAL27862与传统微管靶向剂的组合处理。有丝分裂或G2/M期停滞A549NSCLC的微管在处理如下所示时间后进行染色。使用了50nM BAL27862、50nM长春花碱、50nM秋水仙素和25nM紫杉醇。白色的标尺表示10微米。
图5A:24小时长春花碱处理;
图5B:24小时长春花碱处理，最后4小时包括BAL27862;
图5C:24小时BAL27862处理，最后4小时包括长春花碱。
图5D:24小时秋水仙素处理;
图5E:24小时秋水仙素处理，最后4小时包括BAL27862;
图5F:24小时BAL27862处理，最后4小时包括秋水仙素。
图5G:24小时紫杉醇处理;
图5H:24小时紫杉醇处理，最后4小时包括BAL27862;
图5I:24小时BAL27862处理，最后4小时包括紫杉醇。
图6：显示BAL27862和诺考达唑的联合处理。有丝分裂或G2/M期停滞A549NSCLC的微管在处理如下所示时间后进行染色。使用了25nMBAL27862和如下所示浓度的诺考达唑。白色的标尺表示10微米。
图6A:24小时对照处理;
图6B:24小时25nM BAL27862处理;
图6C:24小时50nM诺考达唑处理
图6D:24小时100nM诺考达唑处理
图6E:24小时150nM诺考达唑处理
图6F:24小时200nM诺考达唑处理
图6G:24小时50nM诺考达唑处理，最后4小时包括25nMBAL27862;
图6H:24小时100nM诺考达唑处理，最后4小时包括25nMBAL27862;
图6I:24小时150nM诺考达唑处理，最后4小时包括25nMBAL27862;
图6J:24小时200nM诺考达唑处理，最后4小时包括25nMBAL27862;
图6K:24小时25nM BAL27862处理，最后4小时包括50nM诺考达唑;
图6L:24小时25nM BAL27862处理，最后4小时包括100nM诺考达唑;
图6M:24小时25nM BAL27862处理，最后4小时包括150nM诺考达唑;
图6N:24小时25nM BAL27862处理，最后4小时包括200nM诺考达唑;
图7：显示从皮下异种移植的小鼠得到的衍生自患者的结肠直肠癌(图7A)、肺癌(图7B)和黑色素瘤(图7C)制备的蛋白提取物，并通过免疫印迹法分析Glu-微管蛋白表达，包括肌动蛋白作为上样量对照。在每种情况下(1-3)分析了三个独立的肿瘤。BAL27862、紫杉醇和长春花碱的耐药性和敏感性如表1所定义。
图8：通过免疫组化显示在衍生自患者的异种移植结肠直肠肿瘤细胞中Glu-微管蛋白水平升高，其中该结肠直肠肿瘤通过体外克隆产物分析被定义为BAL27862耐药性的。制备了衍生自患者的肿瘤异种移植物(保持在裸鼠体内)，采用免疫组织化学固定和染色glu-微管蛋白表达。BAL27862、紫杉醇和长春花碱的耐药性和敏感性如表1所定义。
图9：显示在化合物的存在下通过体外培养选择的对BAL27862耐药的肿瘤细胞株。根据IC50测定，与亲本系相比的BAL27862耐药性因素为：A549(3.0倍)；SKOV3(7.6倍-耐1系)、H460(5.3倍)(见表2)。从亲本系和耐药系制备全细胞蛋白提取物，并通过免疫印迹法分析Glu-微管蛋白的表达。肌动蛋白水平作为上样量对照。
图10：显示SKOV3肿瘤系在耐药性发展期间保持了升高的Glu-微管蛋白水平。在存在BAL27862的情况下，通过体外培养更长时间，选择了BAL27862耐药性的SKOV3肿瘤细胞株。根据IC50测定，与亲本系相比的BAL27862耐药性因素为：SKOV3耐药1(7.6倍)、SKOV3耐药2(11.6倍)(见表2)。从亲本系和耐药系制备全细胞蛋白提取物，并通过免疫印迹法分析Glu-微管蛋白的表达。肌动蛋白水平作为上样量对照。
图11：显示微管蛋白α-1A链[人]的蛋白质序列(SEQ.ID.No.1)
图12：显示微管蛋白α-1B链[人]的蛋白质序列(SEQ ID No.2)
图13：显示微管蛋白α-1C链[人]的蛋白质序列(SEQ ID No.3)
图14：显示微管蛋白α-3C/D链[人]的蛋白质序列(SEQ ID No.4)
发明详述
式I化合物
根据本发明的化合物如通式I所示，
Figure BDA00003535957500151
其中
R代表苯基、噻吩基或吡啶基
其中苯基任选地被一个或两个独立地选自烷基、卤代低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基(其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基)、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧羰基、氰基、卤素和硝基的取代基所取代；并且其中两个相邻的取代基是亚甲二氧基；
以及其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示基团C=Y，其中Y代表氧或被羟基或低级烷氧基取代的氮;
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基低级烷基;
R2、R3和R6表示氢;
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
或R4和R5一起表示亚甲二氧基；
以及它们的可药用衍生物；
或其中
R表示苯基或吡啶基
其中苯基任选地被一个或两个独立地选自烷基、卤代低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基(其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基)、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧羰基、甲酰基、氰基、卤素和硝基的取代基所取代；并且其中两个相邻的取代基是亚甲二氧基；
以及其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示氧;
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基低级烷基;
R2、R3和R6表示氢;
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
或R4和R5一起表示亚甲二氧基；
以及它们的可药用衍生物；
并且其中前缀“低级”表示具有至多并包括最多7个，尤其是至多并包括最多4个碳原子的基团。
杂环基优选定义为饱和、部分饱和或不饱和的，含有4-10个原子的单环或双环，其包含一个、两个或三个选自氮、氧和硫的杂原子，除另有说明外，它们可以是碳或氮连接的，其中环氮原子可任选地被选自低级烷基、氨基-低级烷基、芳基、芳基-低级烷基和酰基的取代基取代，以及环碳原子可被低级烷基、氨基-低级烷基、芳基、芳基-低级烷基、杂芳基、低级烷氧基、羟基或氧代基的取代基所取代。杂环基的例子是吡咯烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、二氧戊环基和四氢吡喃基。
酰基例如是烷基羰基、环己基羰基、芳基羰基、芳基-低级烷基羰基或杂芳基羰基。低级酰基优选为低级烷基羰基，尤其是丙酰基或乙酰基。
优选地，根据本发明的通式I化合物被定义为其中R1选自氢、乙酰基、CH2CH2CN和CH2CH2CH2OH。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的通式I化合物选自：
4-(1-苯甲酰甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-呋咱-3-基胺，
4-[1-(4-溴苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基胺肟
N-{4-[1-(4-氯苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基}-乙酰胺
4-[1-(4-氯苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基-N-(2-氰基乙基)-胺
4-[1-(4-氯苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基-N-(3-羟基丙基)-胺，
4-[1-(3-氨基-4-氯苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基胺
4-[1-(3-甲氧基-4-甲氧基甲氧基-苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基胺，
及其可药用衍生物。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的通式I化合物选自：
其中
R、Y和R1的定义如下：
Figure BDA00003535957500181
Figure BDA00003535957500201
Figure BDA00003535957500211
Figure BDA00003535957500221
Figure BDA00003535957500231
或其可药用衍生物。
在又一个优选的实施方案中，根据本发明的通式I的化合物选自：
4-(1-苯氧基甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-呋咱-3-基胺，
4-[1-(4-氟苯氧基甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基胺，
4-[1-(3,4-二甲基苯氧基甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]呋咱-3-基-N-(2-氰基乙基)胺
和由下式表示的化合物：
Figure BDA00003535957500232
其中R和R1的定义如下
Figure BDA00003535957500241
Figure BDA00003535957500251
及其可药用衍生物。
在又一个优选的实施方案中，根据本发明的通式I化合物是：
Figure BDA00003535957500261
其中R、R4和R5的定义如下
或其可药用衍生物。
更优选地，根据本发明的化合物是是通式I化合物：
Figure BDA00003535957500271
其中
R表示苯基或吡啶基
其中苯基任选被一个或两个独立地选自低级烷基、低级烷氧基、氨基、乙酰氨基、卤素和硝基的取代基取代;
并且，其中吡啶基任选地被氨基或卤素取代;
X表示基团C=O；
R1表示氢原子或氰基-低级烷基;
R2、R3、R4、R5和R6表示氢；
及其可药用衍生物，
并且其中前缀“低级”表示具有至多并包括最多7个，尤其是至多并包括最多4个碳原子的基团。
特别优选地，根据本发明的化合物是由下式表示：
Figure BDA00003535957500272
其中，R、Y和R1定义如下：
或其可药用衍生物。
更特别优选地，根据本发明的化合物由下式表示
Figure BDA00003535957500282
其中R、Y和R1的定义如下：
Figure BDA00003535957500283
或其可药用衍生物。
特别优选地，根据本发明的化合物是
Figure BDA00003535957500291
或其可药用衍生物。
短语通式I化合物的“可药用衍生物”中的术语衍生物涉及它的盐、溶剂化物及其复合物、以及涉及其盐的溶剂化物及复合物，以及它的前药、多晶型物和异构体(包括光学、几何异构和互变异构的异构体)及其前药的盐。在更优选的实施方案中，其涉及盐和前药，及其前药的盐。
盐优选为酸加成盐。盐优选从含碱性氮原子的式(I)化合物与有机或无机酸形成，尤其是其可药用盐。合适的无机酸例如是氢卤酸(诸如盐酸)、硫酸或磷酸。合适的有机酸例如是羧酸，膦酸，磺酸或氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、辛酸、癸酸、十二烷酸、羟基乙酸、乳酸、富马酸、琥珀酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸，氨基酸，如谷氨酸或天冬氨酸，马来酸，羟基马来酸，甲基马来酸，环己烷羧酸，金刚烷羧酸，苯甲酸，水杨酸，4-氨基水杨酸，邻苯二甲酸，苯乙酸，扁桃酸，肉桂酸，甲磺酸或乙磺酸，2-羟基乙磺酸，乙烷-1,2-二磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，1,5-萘-二磺酸，2-、3-或4-甲基苯磺酸，甲基硫酸，乙基硫酸，十二烷基硫酸，N-环己基氨基磺酸，N-甲基、N-乙基或N-丙基-氨基磺酸，或其他有机质子酸，如抗坏血酸。
根据本发明的化合物可作为前药形式施与，该前药可在人体或动物体中降解得到式I化合物。前药的实例包括体内可水解的式I化合物的酯和酰胺。可考虑的特别的前药是天然存在的氨基酸的酯和酰胺，以及小肽(尤其是由最多五个，优选两个或三个氨基酸组成的小肽)的酯或酰胺，以及聚乙二醇化的羟基酸(优选羟基乙酸和乳酸)的酯或酰胺。前药酯由氨基酸或肽C端的酸官能团与式I化合物的合适羟基基团形成。前药酰胺由氨基酸或肽N端的氨基官能团与式I化合物的合适羧基基团形成；或由氨基酸或肽C端的酸官能团与式I化合物的合适氨基基团形成。尤其优选的前药酰胺由存在于式I的R基团中的氨基形成。
更优选地，前药由将甘氨酸、丙氨酸或赖氨酸加成至式I化合物形成。
甚至更优选地，通式I化合物为选自下式化合物的前药形式：
Figure BDA00003535957500301
Figure BDA00003535957500311
在特别优选的实施方案中，通式I化合物为具有下式的前药的形式
Figure BDA00003535957500312
在最特别优选的实施方案中，根据本发明的化合物是下式化合物的可药用盐，优选盐酸盐，最优选为二盐酸盐
Figure BDA00003535957500321
在这种情况下，体内的药物活性代谢产物是BAL27862。
这些前药可以通过本身已知的方法制备，特别是以下方法，其中将式(II)化合物，
Figure BDA00003535957500322
其中，R1如式(I)的定义，且Z是CH或Ν，或包含被保护形式的官能团的该化合物的衍生物，
或其盐
(1)用式(III)的氨基酸酰化
Figure BDA00003535957500323
其中R10选自氢(Gly)、甲基(Ala)和被保护的氨基丁基(Lys)，R11是合适的氨基保护基团，以及
(2)除去所得化合物的被保护衍生物中的任何保护基团，得到如上文所示的前药，并且，在需要时，
(3)通过用酸处理将所述前药转化成盐，或将式(II)化合物的盐转化为式(II)相应的游离化合物或转化为另一种盐，和/或将异构体产物化合物的混合物分离为单独的异构体。
式(II)化合物与式(III)的氨基酸的酰化反应通过本身已知的方法进行，通常是在适宜的极性或偶极非质子性溶剂的存在下，根据需要冷却或加热，例如，在约零下80℃至约零上150℃，更优选为零下30℃至零上120℃，特别是在约0℃至所用溶剂的回流温度下的范围内进行。任选地加入合适的碱，特别是芳族碱，如吡啶或可力丁或叔胺碱，诸如三乙胺或二异丙基乙胺，或无机碱盐，如碳酸钾或碳酸钠。
酰化反应可在肽化学中本身已知的用于酰胺形成的条件下进行，例如使用羧基的活化剂，诸如碳化二亚胺，如Ν,Ν’-二乙基-、Ν,Ν’-二丙基-、Ν,Ν’-二异丙基、Ν,Ν’-二环己基碳化二亚胺和N-(3-二甲氨基异丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，或使用如下试剂，诸如1-羟基苯并三唑(HOBt)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)-
Figure BDA00003535957500331
六氟磷酸盐(BOP)、O-(7-氮杂-苯并三唑-1-基)-Ν,Ν,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、2-(2-氧代-1-(2H)-吡啶基)-1,1,3,3-四甲基脲
Figure BDA00003535957500333
四氟硼酸盐(TPTU)，可任选在合适的碱、催化剂、辅助试剂的存在下进行。羧基也可被活化为酰基卤化物，优选为酰氯，例如，通过与亚硫酰氯或草酰氯反应，或活化为对称或不对称的酸酐，例如通过与卤代甲酸酯，如氯甲酸乙酯反应，任选地在合适的碱、催化剂或辅助试剂的存在下反应。
如果式(II)或(III)的化合物中一个或多个其它官能团，例如羧基、羟基或氨基，由于不应参与到反应中而受到或需要受到保护，则这些是在酰胺类合成，特别是肽类化合物、头孢菌素类、青霉素类、核酸衍生物和糖的合成中通常应用的保护基，这是本领域技术人员公知的。合适的氨基的保护基团例如是氨基甲酸叔丁酯、氨基甲酸苄基酯或氨基甲酸9-芴基甲基酯。
这些保护基可已经存在于前体中，并应当保护相关的官能团不进行不想要的副反应，如烷基化、酰基化、醚化、酯化、氧化、溶剂解以及类似的反应。保护基的特点是它们本身能很容易地被除去，即没有不需要的副反应，通常通过溶剂解、还原、光解或也可以通过酶的活性(例如，在类似生理条件的条件下)除去，并且它们不存在于终产物当中。专业人士知道或者可以很容易地确定，哪些保护基适于上文和下文提及的反应。
通过此类保护基保护此类官能团、保护基本身以及除去它们的反应，例如描述于用于肽合成的标准参考书以及关于保护基的专业书籍中，诸如：
J.F.W.McOmie,″Protective Groups in Organic Chemistry″,Plenum Press,London and New York1973,in″Methoden der organischenChemie″(有机化学方法),Houben-Weyl,第4版，卷15/I,Georg ThiemeVerlag,Stuttgart1974，以及T.W.Greene,G.M.Wuts″Protective Groupsin Organic Synthesis″(有机合成中的保护基),Wiley,New York,2006。
疾病
根据本发明的通式I化合物已被证明能够停止细胞增殖，以及例如通过细胞凋亡诱导细胞死亡。
细胞增殖的失调或缺乏适当的细胞死亡具有广泛的临床牵连。与该失调相关的许多疾病涉及过度增殖、炎症、组织重构和修复。在该范畴内常见的适应症包括癌症、再狭窄、新内膜增生、血管生成、子宫内膜异位、淋巴细胞增殖性疾病、与移植相关的病状(移植排斥)、息肉病、在组织重构的情况中丧失神经功能等。
癌症与异常的细胞增殖和细胞死亡率相关。由于在大多数增殖性、肿瘤性疾病中细胞凋亡被抑制或延迟，因此诱导细胞凋亡是用于治疗癌症、特别是用于治疗对经典的化学疗法、放射和免疫疗法表现出抗性的癌症类型的一种选择(Apoptosis and Cancer Chemotherapy，Hickman和Dive编辑，Blackwell Publishing，1999)。此外，在自身免疫和移植相关的疾病和病理中，可用诱导细胞凋亡的化合物来恢复正常的细胞死亡过程，因此可根除该症状并且可能治愈该疾病。可诱导细胞凋亡的化合物的其它应用可以是再狭窄，即，动脉壁内血管平滑肌细胞的蓄积，以及由于不能根除细菌和病毒感染的细胞所引起的持续感染。此外，可在上皮细胞内、内皮细胞内、肌肉细胞内以及不与细胞外基质接触的其它细胞内诱导或重新建立细胞凋亡。
根据通式I的化合物或其可药用衍生物可用于预防性或尤其是治疗性治疗人或动物体，尤其是用于治疗肿瘤性疾病、自身免疫性疾病、与移植相关的病状和/或变性疾病。此类肿瘤疾病的例子包括但不限于上皮肿瘤、鳞状细胞瘤、基底细胞瘤、移行细胞乳头状瘤和癌、腺瘤和腺癌、附件或皮肤附件瘤、粘膜表皮样肿瘤、囊性肿瘤、粘液和浆状的肿瘤、导管、小叶和髓质肿瘤、腺泡细胞肿瘤、复合型上皮瘤、泛发的性腺瘤、副神经节瘤和血管球瘤、痣和黑色素瘤、软组织肿瘤和肉瘤、纤维瘤、粘液瘤、脂肪瘤、肌瘤、复合型混合的和基质瘤、纤维上皮瘤、滑膜样肿瘤、间皮瘤、生殖细胞瘤、滋养细胞瘤、中肾瘤、血管肿瘤、淋巴管肿瘤、骨和软骨瘤、巨细胞肿瘤、混杂的骨肿瘤、牙原性肿瘤、神经胶质瘤、神经上皮瘤、脑膜瘤、神经梢肿瘤、粒细胞肿瘤和腺泡状软组织肉瘤、何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、其它的淋巴网状内皮细胞瘤、浆细胞肿瘤、肥大细胞肿瘤、免疫增殖性疾病、白血病、混杂的骨髓增殖性病症、淋巴细胞增殖性疾病和骨髓增生异常综合征。
根据通式I的化合物或其可药用衍生物可用于治疗自身免疫性疾病。此类自身免疫性疾病的实例包括但不限于全身性、盘状或亚急性皮肤性红斑狼疮、类风湿性关节炎、抗磷脂综合征、CREST、进行性全身性硬化、混合性结缔组织疾病(Sharp综合征)、莱特尔氏综合征、少年关节炎、冷凝集素性疾病、原发性混合型冷球蛋白血症、风湿性发热、强直性脊椎炎、慢性多关节炎、重症肌无力、多发性硬化、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、格巴二氏综合征、皮肤肌炎/多肌炎、自身免疫性溶血性贫血、血小板减少性紫癫、中性白细胞减少症、I型糖尿病、甲状腺炎(包括桥本甲状腺炎和格雷夫斯病)、阿狄森氏病、多腺综合征、天疱疮(寻常天疱疮、落叶型天疱疮、皮脂型天庖疮和增殖型天庖疮)、大疱性和瘢痕性类天疱疮、妊娠性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、线状IgA疾病、萎缩性硬化性苔藓、杜林病、寻常型银屑病、滴状银屑病、泛发性脓疱性银屑病和局限性脓疱性银屑病、白癜风、斑秃、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、所有形式的肾小球肾炎、肺出血(肺出血肾炎综合征)、IgA肾病、恶性贫血和自身免疫性肾炎、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)、白塞氏病、西力克-施普鲁病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性心肌炎、肉芽肿性睾丸炎、不具有睾丸炎的精子形成缺乏、特发性和继发性肺纤维化、具有自身免疫性病因的可能性的炎性疾病，例如坏疽性脓皮病、毛发红糠疹、结节病(包括勒夫格伦和皮肤/皮下型)、环形肉芽肿、I型和IV型过敏性免疫反应、支气管哮喘、花粉热、特应性、接触性和空气传播性皮炎、大血管炎(巨细胞性动脉炎和高安动脉炎)、中型血管炎(结节性多动脉炎、川崎病)、小血管炎(韦格纳肉芽肿病、Churg-Strauss综合征、显微镜下多血管炎、亨诺-许兰氏紫癜、原发性冷球蛋白性血管炎、皮肤白细胞破坏脉管炎)、过敏综合征、中毒性表皮坏死松解症(史蒂芬-约翰逊综合征、多形性红斑)、因药物副作用引起的疾病，所有形式的由I-vu型(库姆斯分类)免疫反应形式引起的皮肤、器官特异性和全身性作用，与移植相关的病状、例如急性和慢性移植物抗宿主病和宿主抗移植物病，其涉及所有器官(皮肤、心脏、肾、骨髓、眼、肝脏、脾脏、肺、肌肉、中枢和周围神经系统、结缔组织、骨、血液和淋巴管、生殖-泌尿系统、耳朵、软骨、原发性和继发性淋巴系统，包括骨髓、淋巴结、胸腺、胃肠道、包括口咽、食管、胃、小肠、结肠和直肠，包括低至单细胞水平和亚结构的上述器官的部分，例如干细胞)。
特别优选地，根据本发明的疾病是肿瘤或自身免疫性疾病。在特别优选的实施方案中，疾病是癌症。
就受影响的人体器官和部位而言的癌症的实例包括但不限于，乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌(包括结肠和直肠，即结肠直肠癌)、肺癌(包括小细胞性肺癌，非小细胞性肺癌、大细胞肺癌和间皮瘤)、骨癌、内分泌系统癌、肾上腺癌、胸腺癌、肝癌、胃癌、肠道癌(包括胃癌)、胰腺癌、骨髓瘤、血液系统恶性肿瘤(如淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴系统恶性肿瘤)、膀胱癌、尿道癌、肾癌、皮肤癌、甲状腺癌、脑癌、头部肿瘤、颈部肿瘤、前列腺癌和睾丸癌。癌症优选选自乳腺癌、前列腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、神经内分泌癌、肺癌、肾癌、血液系统恶性肿瘤、黑色素瘤和肉瘤。特别优选地，癌症选自乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠直肠癌、黑色素瘤和肺癌。更特别优选地，癌症选自肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、结肠直肠癌。在另一优选的实施方案中，当预测的耐药性是获得性耐药性时，癌症是肺癌或卵巢癌。在又一优选的实施方案中，当预测的耐药性是固有耐药性时，癌症选自结肠直肠癌、肺癌或黑色素瘤。
样品
Glu-微管蛋白水平的测量可在衍生自个体的生物组织样品上在体外进行。样品可以是从个体分离的任何生物材料，诸如例如正常组织、肿瘤组织、细胞系、全血、血清、血浆、脑脊液、淋巴液、循环肿瘤细胞、细胞裂解液、组织裂解液、尿和吸出物。优选地，所述样品衍生自正常组织、肿瘤组织或循环肿瘤细胞。更优选地，样品是衍生自肿瘤组织或循环肿瘤细胞。在一个特别优选的实施方案中，样品衍生自肿瘤组织。例如，可在新鲜的、冷冻的或福尔马林固定/石蜡包埋的肿瘤组织样品中测量Glu-微管蛋白水平
样品是在进行涉及测量生物标志物水平的方法步骤之前从个体中预先得到的。移除样品的方法是本领域已知的，并且其例如可以是通过活检从个体中移除，例如通过穿刺活检、针芯活检或抽吸细针穿刺活检、内视镜活检、或表面活检。血液可通过静脉穿刺收集，并根据标准技术进一步处理。循环肿瘤细胞也可例如基于尺寸(例如ISET-通过上皮肿瘤细胞尺寸的分离)或免疫磁细胞富集(例如Cellsearch
Figure BDA00003535957500371
,Veridex,Raritan,NJ)从而从血液中获得。
样品比较
根据本发明的个体可以是人或动物。优选地，个体是人。
在从人体或动物体，优选从人体获得的样品中在体外测定生物标志物Glu-微管蛋白。该样品从人体或动物体中预先获得，优选在进行涉及测量生物标志物水平的方法步骤之前从人体预先得到的。
生物标志物一般是用作生物反应指示物的物质，优选为对给定治疗的敏感性的指标，这在本申请中为通式I化合物或其可药用衍生物的治疗。
在特别优选的实施方案中，样品中相对于标准值或标准值集合更高的Glu-微管蛋白水平预测耐药性。
如本文所使用的那样，相对于标准值或标准值集合升高的、或相对高的、或高的、或更高的水平的意思是样品中的生物标志物的量或浓度在样品中相对于标准值或标准值集合可检测地更高。这包括相对于标准至少升高约1%或更高约1%的水平，优选相对于标准至少升高约5%。更优选地，其为相对于标准至少升高约10%或更高约10%的水平。更特别优选地，其为相对于标准至少升高约20%或更高约20%的水平。例如，此类升高或更高的水平可以包括但不限于，相对于标准至少高约1%、约10%、约20%、约30%、约50%、约70%、约80%、约100%、约150%或200%左右或更高。
优选地，样品中
i)相对于来自具有相同肿瘤组织型的个体的标准值或标准值集合；或
ii)治疗开始后获得，并与治疗开始前取自同一个体的样品相比较，或
iii)相对于来自正常细胞或组织的标准值或标准值集合
更高的Glu-微管蛋白水平预测了耐药性。
Glu-微管蛋白水平的测量在从个体中预先获得的样品中体外进行。进一步优选地，所预测的响应是耐药性。
更优选地，样品中
i)相对于来自具有相同肿瘤组织型的个体的标准值或标准值集合；或
ii)治疗开始后获得，并与治疗开始前取自同一个体的样品相比较；
更高的Glu-微管蛋白水平预测了耐药性。
特别优选地，相对于来自具有相同肿瘤组织型的个体的标准值或标准值集合，样品中更高的Glu-微管蛋白水平预测了耐药性。
在一个优选的实施方案中，对于情况i)，其中相对于来自具有相同肿瘤组织型的个体的样品(作为与其比较的样品)的标准值或标准值集合来比较测量值，从来自具有该癌症类型的一群个体的样品中建立该标准值或标准值集合。来自这些标准个体的样品例如可以衍生自肿瘤组织、循环肿瘤细胞或血液，只要标准品和待比较样品的样品起源是一致的。
在另一优选的实施方案中，对于情况ii)，其中在治疗开始后获得的样品中比较测量值，并与治疗开始前取自同一个体的样品相比较，优选该测量用于预测获得性耐药性。该样品与来自相同生物学起源的细胞或组织进行比较。获得性耐药的预测表明应停止该化合物的治疗。因此，该生物标志物被用于监测用该化合物进一步治疗是否可能得到所需的响应(例如，异常细胞减少)，或是否细胞已成为无响应的或对此类治疗耐药。
在又一优选的实施方案中，对于情况iii)，其中相对于来自正常细胞或组织的标准值或标准值集合对样品中的测量值进行比较，可从正常(例如，非肿瘤)细胞或组织或体液的样品建立该标准值或标准值集合。此类数据可从个体群体中收集，从而建立标准值或标准值集合。
该标准值或标准值集合从预先获得的样品中体外建立，所述样品可以来自细胞系、或优选为来自至少一个个体的生物材料，并且更优选来自多个个体(例如，n=2-1000或更多)的平均值。然后可将该标准值或标准值集合与用通式I化合物或其可药用衍生物治疗的相同细胞系或相同个体的反应相关联。从这一关联，可建立比较器模块，其例如是相对标度或打分系统形式，任选地包括截止值或阈值，其指示了生物标志物的水平，该水平与对式I化合物或其可药用衍生物反应水平谱相关。该反应水平谱可包含对该化合物治疗活性的相对敏感性(例如，高敏感性至低敏感性)，以及对治疗活性的耐药性。在优选的实施方案中，这一比较器模块包含截止值或阈值，其预测了对治疗的耐药性。
例如，如果应用免疫组织化学方法测量样品中的Glu-微管蛋白水平，则标准值可作为打分系统的形式。这样的系统可能会考虑其中存在Glu-微管蛋白染色的细胞的百分比。该系统还可考虑在单个细胞中染色的相对强度。然后可将Glu-微管蛋白水平的标准值或标准值集合与指示个体或组织或细胞系对式I化合物或其可药用衍生物的治疗活性的反应，尤其是耐药性相关联。然后，这样的数据可形成比较器模块的一部分。
反应是细胞系、或优选个体、或更优选是个体的疾病对通式I化合物或其可药用衍生物治疗活性的反应。反应水平谱可以包含对化合物治疗活性的相对敏感度(例如高敏感度至低敏感度)，以及对该治疗活性的耐药性。该反应数据可以例如以如下方式监测：客观反应率、疾病进展时间、无进展的生存以及总生存。
癌症的反应可以通过使用癌症治疗领域普通技术人员公知的标准来进行评价，例如但不限于：
实体瘤反应评价标准(RECIST)指导(Response Evaluation Criteria inSolid Tumors(RECIST)Guidelines)，来源：Eisenhauer EA,Therasse P,Bogaerts J,Schwartz LH,Sargent D,Ford R,Dancey J,Arbuck S,Gwyther S,Mooney M,Rubinstein L,Shankar L,Dodd L,Kaplan R,Lacombe D,Verweij J.New response evaluation criteria in solid tumours:revised RECIST guideline(版本1.1).Eur J Cancer.2009;45:228-47;
重度神经胶质瘤的RANO标准，来源:Wen PY,Macdonald DR,Reardon DA,Cloughesy TF,Sorensen AG,Galanis E,Degroot J,WickW,Gilbert MR,Lassman AB,Tsien C,Mikkelsen T,Wong ET,ChamberlainMC,Stupp R,Lamborn KR,Vogelbaum MA,van den Bent MJ,ChangSM.Updated response assessment criteria for high-grade gliomas:response assessment in neuro-oncology working group.J Clin Oncol.2010;28(11):1963-72；
卵巢癌反应的CA-125Rustin标准，来源:Rustin GJ,Quinn M,Thigpen T,du Bois A,Pujade-Lauraine E,Jakobsen A,Eisenhauer E,Sagae S,Greven K,Vergote I,Cervantes A,Vermorken J.Re:Newguidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors(ovariancancer).J Natl Cancer Inst.2004;96(6):487-8；以及
前列腺癌反应的PSA工作组2标准，来源:Scher HI,Halabi S,Tannock I,Morris M,Sternberg CN,Carducci MA,Eisenberger MA,Higano C,Bubley GJ,Dreicer R,Petrylak D,Kantoff P,Basch E,KellyWK,Figg WD,Small EJ,Beer TM,Wilding G,Martin A,Hussain M;Prostate Cancer Clinical Trials Working Group.Design and end points ofclinical trials for patients with progressive prostate cancer and castratelevels of testosterone:recommendations of the Prostate Cancer ClinicalTrials Working Group.J Clin Oncol.2008;26(7):1148-59。
耐药性与没有可观察到的和/或可测量的一个或多个以下这些情况的减少或缺乏有关：不正常的细胞、优选癌细胞的减少；或不存在异常细胞，优选癌细胞；对于癌症：肿瘤尺寸的减小；进一步的肿瘤生长的抑制(即，减缓至一定程度，优选停止)；肿瘤标志物，诸如PSA和CA-125的水平降低；癌细胞浸润到其他器官(包括癌细胞扩散进入软组织和骨)的抑制(即，减缓至一定程度，优选停止)；肿瘤转移的抑制(即，减缓至一定程度，优选停止)；一种或多种与特定癌症相关的症状的减轻；以及减少发病率和死亡率。
在优选的实施方案中，耐药性意味着没有可观察到的和/或可测量的一个或多个以下标准的减少，或一个或多个以下标准的缺乏：肿瘤尺寸的减小；进一步肿瘤生长的抑制，癌细胞浸润到其他器官的抑制；以及肿瘤转移的抑制。
在更优选的实施方案中，耐药性是指以下标准中的一个或多个：没有减小肿瘤尺寸；没有抑制进一步的肿瘤生长，没有抑制癌细胞浸润到其他器官；以及没有抑制肿瘤转移。
上述耐药性标准根据癌症治疗领域普通技术人员公知的临床指导测量，如上面列出的用于测量癌症反应的那些。
还可通过评估细胞的增殖和/或细胞死亡在体外建立反应。例如，可通过一个或多个以下建立的测试法来体外评估对细胞死亡或增殖的影响：A)用Hoechst33342染料进行核染色，提供有关核的形态和DNA片段化的信息，其为细胞凋亡的标志。B)钙磷脂结合蛋白V结合测试，其反映质膜的双分子外层的磷脂酰丝氨酸含量。这一事件被认为是细胞凋亡的早期标志。C)TUNEL测试法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)，其为评估细胞发生凋亡或坏死的荧光法，通过标记核酸末端而测量DNA片段。D)MTS增殖测试法，其测量细胞的代谢活动。在该测试中活细胞代谢活跃，而具有受损呼吸链的细胞显示出降低的活性。E)结晶紫染色测试法，通过直接染色细胞成分监测对细胞数量的影响。F)增殖测试法，其通过掺入溴脱氧尿苷(BrdU)监测DNA合成。可直接确定对生长/增殖的抑制作用。G)YO-PRO测试法，其包括膜不透过的荧光的单体酞菁的核酸染色，其允许在不干扰细胞活力的情况下分析细胞死亡(如细胞凋亡)。也可在细胞渗透后，分析对细胞数量的总体影响。H)细胞周期分布的碘化丙锭染色，其表明在细胞周期不同阶段之间分布的改变。可确定细胞周期停滞点。I)不依赖贴壁生长测试，诸如集落生成测试，其评估单细胞悬浮液在软琼脂中生长为集落的能力。
在涉及体外测定耐药性的优选实施方案中，耐药性意味着异常细胞的增殖速率没有减少和/或异常细胞数量没有减少。更优选地，耐药性意味着癌细胞增殖速率没有减少和/或癌细胞数量没有减少。异常细胞，优选癌细胞数量的减少可通过各种程序性和非程序性细胞死亡机制发生。细胞凋亡、不依赖半胱天冬酶的程序性细胞死亡和自噬性细胞死亡是细胞程序性死亡的实例。然而，本发明实施方案中所涉及的细胞死亡标准不被视为限制为任一种细胞死亡机制。
Glu-微管蛋白
α-微管蛋白(人α-微管蛋白)蛋白质序列的优选实例在SEQ.ID No.1-4，图11-14中列出。α-微管蛋白是Glu-微管蛋白的前体。如前所述，Glu-微管蛋白本身已除去C-末端酪氨酸。术语Glu-微管蛋白还包括由SEQ IDNO1-4所示序列的同系物、突变体形式、等位变体、异构体、剪接变体和等价物，其条件是谷氨酸为最终的C-末端氨基酸。更优选地，它包含与所述的序列具有至少75%的同一性、尤其优选至少约85%的同一性、特别优选至少约95%的同一性、以及更特别优选至少约99%的同一性的序列，在每一种情况下的条件是谷氨酸为C-末端的最终氨基酸。
Glu-微管蛋白的水平
Glu-微管蛋白水平可通过本领域技术人员已知的蛋白质分析技术来在样品中测定。本领域中已知的适于在蛋白质水平测量Glu-微管蛋白水平的实例包括但不限于：i)免疫组织化学(IHC)分析，ii)蛋白质印迹；iii)免疫沉淀；iv)酶联免疫吸附测试法(ELISA)；v)放射免疫法；vi)荧光激活细胞分选术(FACS)；vii)质谱，包括基质辅助激光解吸/电离(MALDI，如MALDI-TOF)和电喷雾离子化质谱分析(ESI-MS)。
上述一些方法中涉及的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体、抗体片段、和/或各种类型的合成抗体，包括嵌合抗体。该抗体可被标记，以使得其在与一个或多个其它物质反应后被检测或能够检测，例如使用被标记的、或能够产生可检测结果的二抗。α-微管蛋白的Glu-微管蛋白形式的特异性抗体可从Milipore市售获得，或可以通过本领域技术人员熟知的常规抗体产生方法来制备。
蛋白质分析的优选方法是ELISA、质谱技术、免疫组化和蛋白质印迹，更优选蛋白质印迹和免疫组化。蛋白质印迹也被称为免疫印迹，经标记的抗体可用于评估蛋白质水平，其中来自可检测标记物的信号强度对应于蛋白质量，并可以例如通过光密度量化。
免疫组化也使用经标记的抗体检测生物标志物的存在和相对量。它可用于评估存在生物标志物的细胞的百分比。它也可以被用来评估单个细胞中生物标志物的定位和相对量，后者被认为是染色强度的函数。
ELISA代表酶联免疫吸附测试法，因为它使用连接抗体或抗原的酶，用于检测特定的蛋白质。ELISA通常是如下进行(尽管存在其他方法变化)：在诸如96孔板的固相基质上包被第一抗体，该抗体识别生物标志物。被结合的生物标志物然后通过对该生物标志物特异性的二抗识别。其可能直接与酶结合，或可使用与酶结合的抗免疫球蛋白三抗。加入底物，酶催化反应，产生特定的颜色。通过测量这种颜色的光密度，可以确定生物标志物的存在和量。
生物标志物的用途
该生物标志物可用于预测个体的疾病对如上定义的通式I化合物或其可药用衍生物的固有耐药性。
该生物标志物可用于预测个体的疾病对如上定义的通式I化合物或其可药用衍生物的获得性耐药性。
该生物标志物可用于选择患有或易患疾病(优选癌症)的个体，其使用如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物进行治疗。也可以使用此类生物标志物的水平来识别响应或不响应或继续响应或不继续响应该试剂治疗的可能性。可对个体进行分类，以避免不必要的治疗方案。具体地，该生物标志物可用于鉴定其样品相对于标准值或标准值集合不显示更高水平的Glu-微管蛋白的个体，在此基础上该个体可选择使用如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物进行治疗。
该生物标志物也可用来辅助确定有关给药量和给药方案的治疗方案。此外，该生物标志物可用于辅助选择给予个体的药物组合，包括通式I化合物或其可药用衍生物以及其他化疗(细胞毒性)剂。此外，该生物标志物可用于辅助确定个体的治疗策略，包括是否将通式I化合物或其可药用衍生物与靶向治疗、内分泌治疗、放射治疗、免疫治疗或手术介入、或这些疗法的组合一起施用。
也可以使用Glu-微管蛋白与其他生物标志物的组合来预测对通式I化合物或其可药用衍生物的反应，以确定治疗方案。它还可与化疗敏感性测试联合使用，以预测耐药性并确定治疗方案。化疗敏感性测试包括将通式I化合物直接施用于来自个体的细胞，例如来自患有血液系统恶性肿瘤或可获取的实体瘤例如乳腺癌、头颈部癌或黑色素瘤的个体的细胞，从而确定细胞对该化合物的反应。
治疗方法
本发明在一些方面还涉及治疗方法，以及用于治疗方法的Glu-微管蛋白，其中首先相对于标准值或标准值集合或开始治疗前的水平确定Glu-微管蛋白的水平，然后，如果所述样品中的Glu-微管蛋白水平分别不比标准值或标准值集合更高、或相对于开始治疗前的水平没有升高，则施与如上定义的通式I化合物或其可药用衍生物。式I化合物或其可药用衍生物可在药物组合物中施与，如本领域技术人员公知的那样。合适的组合物和剂量例如公开在WO2004/103994A1第35-39页中，其引入本文作为参考。特别优选用于温血动物、尤其是人的肠内施与的组合物，如鼻、颊、直肠或特别是口服施与，以及肠胃外施与的组合物，如静脉内、肌内或皮下施与。更具体地，用于静脉内施与的组合物是优选的。
组合物包括活性成分和可药用载体。组合物的一个实例包括但不限于如下：5000个软明胶胶囊，每个包含作为活性成分的通式(I)化合物之一0.05g，按如下方法制备：250g粉碎的活性成分悬浮于2升Lauroglykol(丙二醇月桂酸酯，Gattefosse SA,Saint Priest,法国)并在湿式粉碎机中研磨，以产生颗粒尺寸为约1-3μm的颗粒。然后使用胶囊灌装机将0.419g混合物引入软明胶胶囊中。
本发明在一个方面还涉及治疗肿瘤或自身免疫性疾病(优选癌症)的方法，首先在具有与标准值或标准值集合或开始治疗前的水平相比更高的Glu-微管蛋白水平的样品的个体中，降低Glu-微管蛋白水平，然后用如上定义的通式I化合物或其可药用衍生物治疗该个体。可通过直接或间接的化学或遗传方法降低Glu-微管蛋白水平。此类方法的实例是用导致Glu-微管蛋白表达减少，靶向递送病毒、质粒或肽构建物、或抗体或siRNA或反义RNA以下调Glu-微管蛋白水平的药物进行治疗。例如，可以使用siRNA降低TTCP水平，或通过递送质粒来增加TTL的表达水平，从而降低细胞中的Glu-微管蛋白水平。该个体然后可用通式I化合物或其可药用衍生物治疗。
通式I化合物或其可药用衍生物可单独施与，或与一种或多种其它治疗剂联合施与。可能的组合疗法可采取固定组合的形式，或将本发明化合物和一种或多种其它治疗剂交错或彼此独立地给予，或将固定组合与一种或多种其它治疗剂联合施与。
除此之外或附加地，通式I化合物或其可药用衍生物可以与化疗(细胞毒治疗)、靶向治疗、内分泌治疗、放射治疗、免疫治疗、手术干预或其组合一起联合施与，尤其用于治疗癌症。长期治疗是同样可能的，作为如上所述其他治疗策略背景下的辅助治疗。其他可能的治疗是在肿瘤消退后维持患者的状态，或甚至是预防性化疗治疗，例如在有风险的患者中。
试剂盒和装置
在一个方面，本发明涉及用于预测反应的试剂盒，在另一个方面涉及用于预测反应的装置，优选预测个体疾病对如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物的反应，包括测量样品中Glu-微管蛋白水平所需的试剂。优选地，所述试剂包含捕获试剂，所述捕获试剂包含Glu-微管蛋白的检测剂，以及检测剂的试剂。
该试剂盒和装置还优选包含比较器模块，其包括将样品中的Glu-微管蛋白水平与之进行比较的标准值或标准值集合。在优选的实施方案中，比较器模块包含在试剂盒的使用说明中。在另一优选的实施方案中，比较器模块为显示装置的形式，例如颜色或数字编码材料的带状物，其被设计用来置于样品测量的读数旁边，以指示耐药性水平。标准值或标准值集合可如上所述那样确定。
该试剂优选为选择性结合Glu-微管蛋白的抗体或抗体片段。例如，它们可以是一种结合Glu-微管蛋白的特异性一抗形式，以及与该一抗结合的二抗，并且二抗本身是被标记的用于检测。备选地，一抗也可以被标记用于直接检测。该试剂盒或装置还可任选地含有洗涤溶液，在洗涤后，与其他生物标志物相比，该溶液选择性地允许与捕获试剂结合的生物标志物保留。然后这样的试剂盒可以用于ELISA、蛋白质印迹、流式细胞术、免疫组织化学或其他免疫化学方法以检测生物标志物水平。
更优选地，该试剂盒包含如上述定义的通式I化合物或其可药用衍生物。然后，根据通过包含在试剂盒中的试剂所测得的个体样品中生物标志物的水平，所述化合物可被施与个体。因此，根据本发明的试剂盒可以用于如上定义的根据本发明的治疗方法当中。在特别优选的实施方案中，该试剂盒包括下式化合物或其可药用盐
在特别优选的试剂盒实施方案中，可药用盐是二盐酸盐。另一方面，本发明涉及如上所述的试剂盒的用途。
此外，所述装置可以包括成像装置或测量装置(例如，但不限于，荧光测量)，其进一步处理测得的信号并将它们传送至比较器模块的标尺中。
在本说明书中，词语“包括”或“包含”应被理解为表示包括指定的项目或项目组，但不排除任何其他项目或项目组。
实验方法学
培养细胞的免疫荧光染色
将A549人非小细胞肺癌(NSCLC，ATCC参考号CCL-185)细胞、HeLa宫颈癌细胞(ATCC参考号CCL-2)和SKBR3乳腺癌细胞(ATCC参考号HTB-30)以50%的密度接种在圆形显微镜盖玻片上，并在含10%FCS(也称为FBS)的RPMI-1640中，在37℃、5%CO2中培养24小时。将待测化合物溶解于DMSO中。将细胞培养基替换为含有稀释的化合物(紫杉醇、长春花碱、秋水仙素和诺考达唑均购自Sigma-Aldrich)或溶媒的培养基。在处理如附图简述所述的时间后，洗涤盖玻片，并在甲醇/丙酮(1:1)中在室温下固定细胞5分钟，随后在封闭缓冲液中(含0.5%BSA和0.1%TX-100的PBS)在室温下温育30分钟。然后在封闭缓冲液中在室温下用抗α-微管蛋白(Sigma，1:2000)温育标本1小时。洗涤几次后，室温下用AlexaFluor-488山羊抗小鼠IgG(Molecular Probes，1:3000)温育细胞1小时，然后用封闭缓冲液洗涤若干次。用ProLong Gold antifade(Molecular Probes)包埋标本，用指甲油密封，并用Leica免疫荧光显微镜检查。用冷却的CCD相机捕捉图像并用ImageJ软件处理。
集落生长测试法
制备源自患者的肿瘤异种移植物(保持在裸鼠体内)的单细胞悬液液。为进行集落生长测试，根据Hamburger&Salmon(Primary bioassay ofhuman tumour stem cells,Science,1977,197:461-463)介绍的测试法将细胞接种在24孔板的软琼脂中。将0.2ml含0.4%琼脂的培养基中的2x104-6x104个细胞接种在0.75%琼脂的底层。测试化合物在0.2ml培养基中施用。每个24孔板中包含一式三份的未经处理的对照及样品。将培养物在37℃和7.5%CO2下温育5-28日。分析前24小时，用可代谢的四唑
Figure BDA00003535957500481
盐溶液(Alley MC等,Life Sci.1982,31:3071-3078)对活的集落进行染色，并用自动图像分析系统(Omnicon3600,Biosys GmbH)计数。
相对药物作用表示为处理孔和对照孔中平均集落数量的比例。通过化合物的浓度针对相对菌落计数绘图来确定IC70-值。
BAL27862耐药细胞系的产生和结晶紫测试法
人类非小细胞肺癌(H460ATCC参考号HTB-177；A549ATCC参考号CCL-185)、卵巢癌(SKOV3ATCC参考号HTB-77)细胞系通过在完全细胞培养基(含10%FCS的RPMI-1640，Sigma-Aldrich)中逐步增加BAL27862浓度进行长期选择，从而产生耐BAL27862的亚系。根据细胞系，选择过程进行8-12个月，以达到耐药性系数(耐药细胞系和相应的野生型细胞系的IC50比例)为3至11.6。在最高耐受BAL27862浓度下扩增耐药性亚系，并随后在液氮中冷冻保存。
以下列密度将细胞接种于96孔板中：A549：2000，H460：1000，SKOV3：2000，并在培养24小时后，与在完全培养基中稀释的DMSO、BAL27862、秋水仙素、诺考达唑、紫杉醇或长春花碱(DMSO终浓度最高为0.5%)温育72小时。除去培养基后，固定细胞，通过每孔添加50μl结晶紫染料(在50%甲醇中的0.2%结晶紫)染色。室温下孵育1小时。随后，轻轻倒出染料并用双蒸水洗涤板4次。风干板数小时。通过每孔加入100μl缓冲液(0.1M TrispH7.5、0.2%SDS、20％乙醇)并晃动板从而溶解染料。应用SpectraMaxM2e板读出器(Molecular Devices)测量590nm处的吸光度。使用GraphPadPrism软件，从浓度响应曲线计算出抗增殖的IC50值。按照耐药性细胞系变体的BAL27862IC50与亲本系的IC50的比值计算耐药性系数。
蛋白质提取
肿瘤提取：在冰冷的含有50mM HEPES(pH7.5)、150mM NaCl、25mMβ-甘油磷酸酯、25mM NaF、5mM EGTA、1mM EDTA、0.1%NP40、15mM焦磷酸、2mM原钒酸钠、10mM钼酸钠、亮肽素(10μg/mL)、抑肽酶(10μg/mL)和1mM苯甲磺酰氟(PMSF)的裂解缓冲液中提取肿瘤(每45mg肿瘤用1ml的提取体积)。通过Polytron匀浆后，将溶胞产物调节为1%NP40，并在冰上温育20分钟。离心澄清裂解液，并冷冻于-80℃。
肿瘤细胞系的提取：用冰冷的含1mM PMSF的PBS以及冰冷的无NP40的裂解缓冲液(见上文)洗涤细胞。细胞在含1%NP40的相同裂解缓冲液中提取。匀浆后，通过离心澄清裂解物，并冷冻于-80℃。
免疫印迹/蛋白质印迹
每条泳道使用20μg总蛋白进行免疫印迹。用BCA蛋白测试法(Pierce)测定总蛋白浓度。在10%SDS-凝胶上分离蛋白质，并运用半干印迹转移至PVDF膜(90min,50mA/凝胶)。用于免疫印迹法的一抗如下所示：
Glu-微管蛋白抗体(可从Milipore获得，参考号AB3201)，兔多克隆抗体，稀释1:1000，缓冲液条件：在PBS/0.1%吐温中的3%BSA
肌动蛋白抗体(可从Chemicon获得，参考号MAB1501)，小鼠单克隆抗体，稀释1:5000，缓冲液条件：在PBS/0.1%吐温中的3%BSA
用于免疫印记的二抗是过氧化物酶缀合的山羊抗兔或山羊抗小鼠(从Jackson ImmunoResearch Laboratories INC获得：参考号111-035-144JIR和115-035-146JIR)，稀释1:5000，缓冲条件：在PBS/0.1％吐温中的0.5%牛奶。使用Raytest Stella3200高效成像系统显现标记的条带。
免疫组化
在含4%甲醛的10%中性缓冲的福尔马林液中固定源自患者的肿瘤异种移植物(保持在裸鼠体内)，在室温下固定20-28小时。将固定的标本保持在70%乙醇溶液中最多1个星期，随后根据标准方法使用下面列出的条件进行脱水及石蜡包埋：
依次处理 时间(小时)
70%EtOH 1
80%EtOH 2
99%EtOH 1
100%异丙醇 0.5
100%异丙醇 1
二甲苯 0.5
二甲苯 1
二甲苯 1
石蜡 1
石蜡 2
石蜡 2
切下约2μm的石蜡切片，并通过使用自动免疫染色仪BenchmarkXT
Figure BDA00003535957500501
(Roche)运行标准加工程序进行处理。用5mg/ml浓度的DAB(3,3-二氨基联苯胺)作为显色底物显现特异性抗体的染色。染色中使用了以下的一抗和处理条件：
Figure BDA00003535957500502
详细实施例
实施例1：由通式I化合物诱导的独特有丝分裂表型
用化合物A(BAL27862)或化合物B或化合物C处理，在所有测试的肿瘤细胞系中诱导高度可重现的和独特的微管表型(图1显示了化合物A在A549细胞、HeLa细胞和SKBR3细胞中的作用；以及图2显示了在A549细胞中的化合物B和化合物C的作用)。在分裂的细胞中，发生可见的有丝分裂纺锤体断裂，从而形成点状结构(图1)。这一表型显示不同于用传统的微管靶向剂如微管稳定剂紫杉醇和微管去稳定剂长春花碱和秋水仙素(图3)以及诺考达唑(图4)所观察到的表型。
实施例2：BAL27862以优势方式克服了传统微管靶向药物诱导的微管表型
为显示其对微管的活性的独特性，使用A549细胞，对BAL27862与长春花碱、秋水仙素和紫杉醇(图5)以及诺考达唑(图6)进行联合测试。用长春花碱、秋水仙素、紫杉醇或诺考达唑单独治疗诱导了这些试剂特有的有丝分裂微管表型。然而，在最后4小时与BAL27862联合处理后，导致微管结构的破坏；产生了与仅用BAL27862处理相一致的表型，尽管长春花碱、秋水仙素、紫杉醇或诺考达唑还继续存在。与此相反，先用BAL27862处理，然后与长春花碱、秋水仙素、紫杉醇或诺考达唑联合处理4小时，对所观察到的微管表型没有任何影响，与用BAL27862处理一致。
这些数据表明，式I化合物持续地影响微管生物学，但以不同于传统微管靶向剂的方式。
根据本发明的详细实施例
实施例3：高Glu-微管蛋白表达水平与源自患者的肿瘤细胞对BAL27862处理的耐药性的关联。
基于集落生长测试法，使用在小鼠中作为异种移植物保持的来自6个患者的肿瘤的肿瘤细胞，从黑色素瘤、结肠直肠癌和肺癌鉴定BAL27862敏感性或相对耐药性的肿瘤细胞(见表1)。相对于对照观察到70%生长抑制的浓度(IC70)显示于表1。在此表中，对BAL27862敏感的肿瘤细胞的具有在低纳摩尔浓度范围内的IC70值，而BAL27862耐药性的肿瘤细胞被定义为IC70值>600nM。对该6个肿瘤模型中的5个提供了使用相同体外测试法的紫杉醇和长春花碱的数据。这5个模型都是抗紫杉醇治疗的，而5个这些肿瘤中的4个是对长春花碱治疗敏感的。
表1
Figure BDA00003535957500521
使用Milipore抗体进行了免疫印迹法分析，以便测量作为异种移植物保持的相同肿瘤中Glu-微管蛋白水平(图7)。在免疫印迹中包括了肌动蛋白水平作为上样量对照。
Glu-微管蛋白水平的分析表明，Glu-微管蛋白的表达在所有测量的肿瘤中有显著的差异(图7)。
基于集落生长测试法和相同的IC70标准，紫杉醇或长春花碱的耐药性和高Glu-微管蛋白水平之间没有任何关联。这是很明显的，因为例如，对于黑色素瘤肿瘤类型，这两种模型都是耐紫杉醇的，而MEXF1341的Glu-微管蛋白水平明显低于MEXF276。在黑色素瘤模型中，对于长春花生物碱类的长春花碱缺乏关联性也是真实的，因为两个这些肿瘤对长春花碱都是敏感的。因此，显示Glu-微管蛋白水平不适合作为源自患者的肿瘤模型对于传统微管剂紫杉醇和长春花碱耐药性的可靠生物标志物。
令人惊讶的是，与此相反，当将BAL27862耐药性数据与Glu-微管蛋白水平进行比较时，显示Glu-微管蛋白仅在耐药性肿瘤中更高，而在来自相同肿瘤组织学类型的敏感性肿瘤中则并非如此。升高的水平因此是对BAL27862耐药性的一贯性指示。因此，显示Glu-微管蛋白水平是对本发明化合物BAL27862的耐药性的生物标志物。
实施例4：结肠直肠肿瘤异种移植物的免疫组化分析
对结肠直肠肿瘤异种移植物进行免疫组织化学分析(图8)，揭示了在肿瘤模型CXF243中高的Glu-微管蛋白水平。再次观察到高Glu-微管蛋白水平与对BAL27862的耐药性之间的关联性(肿瘤模型CXF243是BAL27862耐药的，而肿瘤模型CXF1103是BAL27862敏感的；如在集落生长测试法中定义的那样)。因此，再次显示了Glu-微管蛋白水平是对本发明化合物BAL27862的耐药性的生物标志物。
实施例5：在针对通式I化合物的耐药性选择的肿瘤细胞系中观察到 更高的Glu-微管蛋白表达
针对BAL27862耐药性的体外选择产生了三个相对耐药的肿瘤细胞系，与亲本系相比具有以下的耐药性系数(基于使用结晶紫测试法测定的IC50)：A549(3.0倍)；SKOV3耐药性1(7.6倍)；SKOV3耐药性2(11.6倍)；H460(5.3倍)(表2)。
表2
Figure BDA00003535957500531
一般而言，与BAL27862相比，这些BAL27862-耐药性细胞对其它微管去稳定剂(诸如秋水仙素、诺考达唑和长春花碱)表现出不同水平的反应；并且在所有细胞系中确实观察到对微管稳定剂紫杉醇升高的敏感性(表2)。
提取并免疫印迹分析这些细胞系，以测量Glu-微管蛋白水平，然后与BAL27862耐药性数据进行比较，再次表明耐药系中的Glu-微管蛋白比亲本系更高(图9)。在SKOV3细胞耐药性的发展过程中，这一直得以保持(图10)。这些数据显示了升高的Glu-微管蛋白表达水平与获得性的BAL27862耐药性之间的关联。
缩略语表
Figure BDA00003535957500541
Figure BDA00003535957500561
Figure IDA00003535958100011
Figure IDA00003535958100021
Figure IDA00003535958100031
Figure IDA00003535958100041
Figure IDA00003535958100051
Figure IDA00003535958100061
Figure IDA00003535958100071
Figure IDA00003535958100081
Figure IDA00003535958100091

Claims (25)

1.Glu-微管蛋白作为预测对化合物反应的生物标志物的用途，其中所述化合物是通式I化合物，
Figure FDA00003535957400011
其中
R代表苯基、噻吩基或吡啶基
其中苯基任选地被一个或两个独立地选自烷基、卤代低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基的取代的氨基、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧羰基、氰基、卤素和硝基的取代基所取代；并且其中两个相邻的取代基是亚甲二氧基；
以及其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示基团C=Y，其中Y代表氧或被羟基或低级烷氧基取代的氮;
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基低级烷基;
R2、R3和R6表示氢;
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
或R4和R5一起表示亚甲二氧基；
以及它们的可药用衍生物；
或其中
R表示苯基或吡啶基
其中苯基任选地被一个或两个独立地选自烷基、卤代低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基的取代的氨基、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧羰基、甲酰基、氰基、卤素和硝基的取代基所取代；并且其中两个相邻的取代基是亚甲二氧基；
以及其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示氧;
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基低级烷基;
R2、R3和R6表示氢;
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
或R4和R5一起表示亚甲二氧基；
以及它们的可药用衍生物；
并且其中前缀“低级”表示具有至多并包括最多7个，尤其是至多并包括最多4个碳原子的基团。
2.根据权利要求1的用途，其中所述反应是个体疾病的反应，并且在从人体或动物体、优选从人体获得的一个样品或多个样品中离体测量生物标志物Glu-微管蛋白。
3.根据权利要求1或2的用途，其中所述化合物是通式I的化合物，其中
R表示苯基或吡啶基
其中苯基任选被一个或两个独立地选自低级烷基、低级烷氧基、氨基、乙酰氨基、卤素和硝基的取代基取代;
并且，其中吡啶基任选地被氨基或卤素取代;
X表示基团C=O；
R1表示氢原子或氰基-低级烷基;
R2、R3、R4、R5和R6表示氢；
及其可药用衍生物，
并且其中前缀“低级”表示具有至多并包括最多7个，尤其是至多并包括最多4个碳原子的基团。
4.根据权利要求1-3任一项的用途，其中所述化合物由下式表示
Figure FDA00003535957400031
其中R、Y和R1的定义如下：
Figure FDA00003535957400032
或其可药用衍生物。
5.根据权利要求1-4任一项的用途，其中所述化合物是
Figure FDA00003535957400033
或其可药用衍生物。
6.根据权利要求1-5任一项的用途，其中所述可药用衍生物选自如权利要求1-5任一项所定义的通式I化合物的盐、溶剂化物、前药、前药的盐、多晶型物和异构体。
7.根据权利要求6的用途，其中所述前药是由存在于权利要求1-5任一项所定义的通式I化合物的R基团内的氨基与甘氨酸、丙氨酸或赖氨酸的羧基形成的酰胺。
8.根据权利要求1-7任一项的用途，其中所述化合物是
Figure FDA00003535957400041
或其可药用盐，优选盐酸盐，最优选二盐酸盐。
9.根据权利要求1-8任一项的用途，其用于预测个体的疾病对所述化合物的耐药性。
10.根据权利要求1-9任一项的用途，其中所述疾病是肿瘤疾病或自身免疫性疾病，优选癌症。
11.根据权利要求1-10任一项的用途，其中所述疾病选自乳腺癌、前列腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌，肝癌、脑癌、神经内分泌癌、肺癌、肾癌、血液系统恶性肿瘤、黑色素瘤和肉瘤，以及优选的疾病选自乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌和黑色素瘤，更优选选自卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌和黑色素瘤。
12.根据权利要求2-11任一项的用途，其中来自个体的样品中Glu-微管蛋白相对于标准值或标准值集合更高的水平预测了耐药性。
13.根据权利要求12的用途，其中在样品中
i)相对于来自具有相同肿瘤组织型的个体的标准值或标准值集合；或
ii)治疗开始后获得，并与治疗开始前取自同一个体的样品相比较，或
iii)相对于来自正常细胞或组织的标准值或标准值集合
更高的Glu-微管蛋白水平预测了耐药性。
14.根据权利要求1-13任一项的用途，其中所述生物标记物用于选择罹患或倾向于罹患疾病、优选癌症的个体，用于用权利要求1-8任一项定义的通式I化合物或其可药用衍生物进行治疗。
15.根据权利要求2-14任一项的用途，其中所述样品衍生自正常组织、肿瘤组织、或循环肿瘤细胞，优选其中其衍生自肿瘤组织。
16.用于预测个体的疾病对权利要求1-8任一项定义的通式I化合物或其可药用衍生物的反应的方法，包括以下步骤：
a)测量预先从个体获得的样品中的Glu-微管蛋白水平，获得代表该水平的值；以及
b)将步骤a)的值与标准值或标准值集合相比较。
17.根据权利要求16的方法，其中所预测的反应是耐药性。
18.根据权利要求16或17的方法，其中来自个体的样品中的Glu-微管蛋白相对于标准值或标准值集合更高的水平预测了耐药性。
19.在有需要的个体中治疗肿瘤或自身免疫性疾病、优选癌症的方法，其包括：测量来自个体的样品中的Glu-微管蛋白水平，获得代表这一水平的值，并且如果所述样品中Glu-微管蛋白的水平不高于标准值或标准值集合，则用权利要求1-8任一项定义的通式I化合物或其可药用衍生物治疗所述个体。
20.用于治疗肿瘤或自身免疫性疾病、优选癌症的Glu-微管蛋白，其包括：测量来自个体的样品中的Glu-微管蛋白水平，获得代表这一水平的值，如果所述Glu-微管蛋白的水平不高于标准值或标准值集合，则用权利要求1-8任一项定义的通式I化合物或其可药用衍生物治疗所述个体。
21.治疗肿瘤或自身免疫性疾病、优选癌症的方法，其包括首先降低其样品的Glu-微管蛋白水平比标准水平或标准水平集合更高的个体的Glu-微管蛋白水平，然后用权利要求1-8任一项定义的通式I化合物或其可药用衍生物治疗所述个体。
22.用于预测对如权利要求1-8任一项定义的通式I化合物或其可药用衍生物的反应的试剂盒，其包含测量样品中Glu-微管蛋白水平所需的试剂，以及更优选地，还包含比较器模块，其包括将样品中的Glu-微管蛋白水平与之进行比较的标准值或标准值集合。
23.权利要求22的试剂盒，其中所述试剂包含捕获试剂以及检测试剂，其中所述捕获试剂包含Glu-微管蛋白的检测剂，优选其中所述捕获试剂为抗体。
24.权利要求22或23的试剂盒，其中所述试剂盒包含下式化合物或其可药用盐，尤其是其二盐酸盐：
Figure FDA00003535957400061
25.用于预测对如权利要求1-8任一项定义的通式I化合物或其可药用衍生物的反应的装置，其包含测量样品中Glu-微管蛋白水平所需的试剂，以及比较器模块，其包括将样品中的Glu-微管蛋白水平与之进行比较的标准值或标准值集合。
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