WO2022054755A1 - 蛍光色素剤及び腫瘍細胞の検出方法 - Google Patents

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WO2022054755A1
WO2022054755A1 PCT/JP2021/032637 JP2021032637W WO2022054755A1 WO 2022054755 A1 WO2022054755 A1 WO 2022054755A1 JP 2021032637 W JP2021032637 W JP 2021032637W WO 2022054755 A1 WO2022054755 A1 WO 2022054755A1
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staining
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正基 村上
良介 川上
照子 津田
浩二 佐山
健志 今村
陽輔 仁子
和貴 井上
沢 中山
慎悟 波多野
茂 渡邉
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国立大学法人愛媛大学
国立大学法人高知大学
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    • G01N2001/302—Stain compositions

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescent dye used for detecting tumor cells and a method for detecting tumor cells.
  • HE staining hematoxylin and eosin staining
  • HE staining not only tumor cells but also normal tissues are stained and the light transmission is deteriorated, so that thin slices of tissue specimens are required. Since sliced specimens have only two-dimensional information, it is necessary to prepare and observe many sections in order to determine the distribution range of tumor cells. In addition, preparation of tissue specimens requires advanced skills, is complicated and takes a long time.
  • Patent Document 1 a means for detecting a skin disease by irradiating light without using a dye for staining and utilizing the difference in Raman scattering between abnormal tissue and normal tissue has also been reported (for example, Patent Document 1).
  • Patent Document 1 a means for detecting a skin disease by irradiating light without using a dye for staining and utilizing the difference in Raman scattering between abnormal tissue and normal tissue has also been reported (for example, Patent Document 1).
  • Patent Document 1 a means for detecting a skin disease by irradiating light without using a dye for staining and utilizing the difference in Raman scattering between abnormal tissue and normal tissue has also been reported (for example, Patent Document 1).
  • Patent Document 1 a means for detecting a skin disease by irradiating light without using a dye for staining and utilizing the difference in Raman scattering between abnormal tissue and normal tissue has also been reported (for example, Patent Document 1).
  • solvatochromism a phenomenon in which the absorption maximum wavelength, the fluorescence wavelength, or both of them change due to a change in the polarity of surrounding molecules such as a solvent.
  • Compounds exhibiting solvatochromism are typically polarized by intramolecular charge transfer (ICT) when photoexcited. Since the stability of the excited state of the polarized molecule changes depending on the degree of polarity of the solvent molecule, the energy difference between the excited state and the ground state of the molecule changes based on the polarity of the solvent.
  • ICT intramolecular charge transfer
  • Non-Patent Document 1 describes 1-acetyl-6-piperidylpyrene (PK) and its aldehyde analog (PA) as a compound exhibiting such solvatochromism. It is also described that PK was used to stain normal tissue or HeLa cells.
  • PK 1-acetyl-6-piperidylpyrene
  • PA aldehyde analog
  • Non-Patent Document 1 does not describe an example in which a tissue containing both normal cells and tumor cells is stained with a compound exhibiting solvatochromism. Further, the document does not describe that normal cells and tumor cells can be distinguished from each other by the difference in fluorescence wavelength caused by solvatochromism.
  • the present inventors have found that tumor cells in a tissue can be easily detected by applying a fluorescent dye containing a compound exhibiting solvatochromism to staining a tissue derived from a living body, and the present invention has been made. Completed.
  • the present invention provides the following fluorescent dyes.
  • the compound comprises a condensed polycyclic ⁇ -conjugated structure having 2 to 6 rings.
  • the compound further contains one or more hydrophilic substituents containing one or more atoms selected from the group consisting of boron, nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur and halogen.
  • the compound is selected from the compounds represented by the following chemical formula (II), 1-acetyl-6-piperidylpyrene, Nile Red, POLARIC TM , Laurdan, di-4-ANEPPDHQ, Prodan and derivatives thereof.
  • the present invention provides the following method.
  • a method for detecting tumor cells which comprises staining a tissue derived from a living body with a fluorescent dye containing a compound exhibiting solvatochromism.
  • a method for identifying the extent of tumor removal in a tissue in the living body which comprises staining the living body with a fluorescent dye containing a compound exhibiting solvatochromism.
  • Use of compounds exhibiting solvatochromism for the production of therapeutic or diagnostic compositions for tumors.
  • Tumor cells stained with the fluorescent dye of the present invention can be easily distinguished from normal cells and detected.
  • the fluorescent dye of the present invention can easily and quickly stain living tissues.
  • FIG. 1 is a chart of (left) absorption spectrum measurement and (right) fluorescence spectrum measurement (normalization) of PC (Compound A) in an organic solvent in Examples.
  • FIG. 1A is a two-photon microscope image of the Paget's disease lesion tissue in Test Example 1. The area corresponding to one tumor cell (paget cell) is indicated by an arrowhead.
  • FIG. 2B is a two-photon microscope image of a healthy skin tissue.
  • FIG. 3A is a two-photon microscope image of the Paget's disease lesion tissue in Test Example 2.
  • FIG. 3B is a two-photon microscope image of the Paget's disease lesion tissue in Test Example 2.
  • the arrowhead represents a paget cell infiltrating around the hair follicle.
  • FIG. 4C is a two-photon microscope image of the melanoma lesion tissue in Test Example 2.
  • FIG. 4A is a two-photon microscope image of a healthy skin tissue in Test Example 3.
  • FIG. 4B is a two-photon microscope image of the Paget's disease lesion tissue in Test Example 3. Arrowheads represent Paget cells proliferated in the epidermis.
  • FIG. 4C is a two-photon microscope image of the melanoma lesion tissue in Test Example 3. Arrowheads represent melanoma cells proliferated in the epidermis.
  • FIG. 4A is a two-photon microscope image of a healthy skin tissue in Test Example 3.
  • FIG. 4B is a two-photon microscope image of the Paget's disease lesion tissue in Test Example 3. Arrowheads represent Paget cells proliferated in the epidermis.
  • FIG. 4C is a two-photon microscope image of the melanoma lesion tissue in Test Example 3. Arrowheads represent melanoma cells proliferated in the epidermis.
  • FIG. 4A is a two-photon microscope image of
  • Panel 5 is a two-photon microscope image of the mucosal epithelial tissue of the rectum in Test Example 4.
  • Panels A and B are healthy rectal parts, and panels C and D are well-differentiated adenocarcinoma parts of the rectum.
  • the term "compound exhibiting solvatochromism” refers to the polarity (hydrophobicity) around the compound. Represents a compound in which the absorption maximum wavelength, the fluorescence maximum wavelength, or both of them change depending on the change.
  • the SC compounds of the present invention have different cell membrane environments (eg, polarity and orientation of molecules in the membrane, membrane fluidity, etc.) in normal cells and tumor cells.
  • cell membrane environments eg, polarity and orientation of molecules in the membrane, membrane fluidity, etc.
  • the present invention is used for the detection of tumor cells in tissues derived from living organisms, and includes a fluorescent dye containing an SC compound.
  • the living body is not particularly limited as long as it is a multicellular animal, and is preferably a mammal (including humans and non-human mammals), and more preferably a human.
  • Tissues include, for example, skin, brain, spinal cord, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, duodenum, rectum, liver, pancreas, bile sac, bladder, kidney, heart, spleen, thoracic gland, prostate, uterus, ovary, testis, breast, lung. , Bronchi, eyeball, nose, sinus, oral cavity, pharynx, salivary gland, thyroid gland, parathyroid gland, adrenal gland, muscle, bone marrow, blood vessel, nerve, lymph node, peritoneum, diaphragm, blood and the like.
  • the tissue is the skin, eg, the epidermis, the dermis, or a combination thereof.
  • the tissue is the rectum.
  • the fluorescent dye agent of the present invention is applied to, for example, a tissue separated from a living body by surgical treatment such as excision, excision, puncture, blood sampling, or the above-mentioned tissue obtained from stool, urine, sweat or other body fluid. can do.
  • the morphology of the tissue can be appropriately selected depending on the detection method, but may be, for example, an organ or an organ itself, or a sliced section or a three-dimensional fragment thereof.
  • the above-mentioned structure may be subjected to, for example, a fixing treatment with formalin or the like, a paraffin embedding, a deparaffinizing treatment, a dehydration treatment, a clearing treatment, or the like.
  • the tumor detected by the fluorescent dye agent of the present invention may be benign or malignant (cancer, sarcoma cells, etc.), but is preferably a malignant tumor.
  • the type of tumor cells is not particularly limited, and examples thereof include tumors that develop in the above tissues.
  • the tumor is a skin tumor.
  • Such tumors include, for example, sweat glandular tumors (extramammary Paget's disease, breast Paget's disease, Eklin sweat pore cancer, microcystic appendage cancer, cutaneous mucous cancer, etc.), malignant sarcoma (melanoma), epidermis / hair.
  • Sacral tumors (basal cell carcinoma, spinous cell carcinoma, sunlight keratosis, Bowen's disease, scab disease, keratoacantoma, etc.), nervous system tumors (merkel cell carcinoma, malignant peripheral nerve sheath tumor, etc.), mesenchymal tumors (Prominent cutaneous fibrosarcoma, solitary fibrous sarcoma, muscular tumor, liposarcoma, angiosarcoma, capocystoma, spindle cell vascular endothelial tumor, allogeneic fibrous sarcoma, epithelial sarcoma, synovial sarcoma, undifferentiated polymorphism Cell sarcoma, etc.).
  • the tumor is extramammary Paget's disease or malignant melanoma.
  • the SC compound is not particularly limited as long as it is applicable to tissues derived from living organisms.
  • the SC compound may be used alone or in combination of two or more, but usually, a clear stained image can be obtained by using one SC compound alone.
  • the molecular weight of the SC compound can be, for example, 800 or less, 700 or less, 600 or less, 500 or less, or 450 or less. Further, the molecular weight of the SC compound can be, for example, 200 or more.
  • the SC compound can be distributed in the cell membrane and cells, and in a specific embodiment, the SC compound can be inserted into the cell membrane. In one embodiment, the SC compound exhibits strong fluorescence anisotropy on the cell membrane. In one embodiment, the SC compound has the property of having a lower fluorescence intensity extracellularly than in the cell membrane and / or intracellular. In certain embodiments, the SC compound is substantially non-fluorescent to be observed extracellularly. Although not particularly limited, for example, the extracellular fluorescence intensity of the SC compound is 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less or 1% of the intracellular fluorescence intensity.
  • the cells derived from the tissue to be the subject of the present invention are irradiated with light having a wavelength capable of exciting the SC compound, and then fluorescent under the condition that the light having the maximum fluorescence wavelength can be detected. This is done by taking microscopic images and comparing the average signal intensities of intracellular and extracellular fluorescence.
  • the SC compound comprises a condensed polycyclic ⁇ -conjugated structure having 2, 3, 4, 5 or 6 rings.
  • a fused polycyclic ⁇ -conjugated structure is a polycyclic structure in which two or more rings containing delocalized ⁇ electrons are condensed, and one or more heteroatoms (nitrogen, oxygen) such as a benzophenoxazine ring. , Sulfur, etc.) may be contained.
  • the fused polycyclic ⁇ -conjugated structure is a condensed polycyclic aromatic hydrocarbon structure (eg, naphthalene, azulene, anthracene, phenanthrene, pyrene, etc.).
  • the SC compound comprises a pyrene skeleton (4 rings) as a condensed polycyclic ⁇ -conjugated structure.
  • the SC compound containing a pyrene skeleton is particularly suitable for the application of the present invention because the fluorescence quantum yield is high even if the molecular size is reduced.
  • the SC compound comprises a structure in which 2, 3, 4, 5 or 6 conjugate rings are conjugate to each other.
  • the conjugated ring includes a benzene ring, a naphthalene ring, an anthracene ring, a phenanthrene ring, a fluorene ring, a pyridine ring, a thiophene ring, a pyrrole ring, a furan ring, a benzothiophene ring, a benzofuran ring, a benzopyrol ring, an imidazole ring, a quinoline ring, and an isoquinolin.
  • One or a combination of two or more selected from the group consisting of a ring, a carbazole ring, a thiazole ring and a dibenzothiophene ring can be mentioned.
  • the SC compound is hydrophilic and contains at least one atom selected from the group consisting of boron, nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur and halogen from the viewpoint of improving water solubility and promoting dispersion in cell membranes and cells. It preferably contains one or more substituents.
  • the hydrophilic substituent contained in the SC compound is one selected from the group consisting of a tertiary amino group, a quaternary ammonium group and a carbonyl group (excluding an aldehyde group) from the viewpoint of suppressing a reaction with a biomolecule. It is preferable to contain alone or two or more kinds.
  • the SC compound is PC, 1-acetyl-6-piperidylpyrene (PK), Nile Red, POLARIC TM , which is a compound represented by the following chemical formula (II). It is selected from Laurdan, di-4-ANEPPDHQ, Prodan or derivatives thereof.
  • the SC compound is selected from PC, PK, Nile Red and POLARIC, preferably PC or PK, more preferably PC.
  • PK 1-Acetyl-6-piperidylpyrene
  • I 1-Acetyl-6-piperidylpyrene
  • PC is also called (E) -1- (6- (piperidine-1-yl) pyrene-1-yl) hexa-1-en-3-one, and is an SC compound represented by the following chemical formula (II). Is. As shown in the examples, high fluorescence quantum yields are exhibited with various solvents.
  • Nile red is a compound with CAS number 7385-67-3.
  • POLARIC is a compound and a derivative thereof described in Chem. Lett., 2011, Vol.40, pp.989-991, and examples thereof include those sold as the POLARIC series of Goryo Chemical, Inc.
  • Laurdan is a compound with CAS No. 74515-25-6. Details of di-4-ANEPPDHQ are described in, for example, Biophys. J., 2006, Vol. 90, Issue 7, p. 2563-2575.
  • Prodan is a compound of CAS No. 70504-01-7.
  • PC, PK or Nile Red are preferable because they have good photostability and high fluorescence quantum yield. Further, PK and PC are more preferable because they are less adsorbed to non-specific tissues than Nile Red, tend to have a large difference in fluorescence wavelength between tumors and normal tissues, and can suppress background fluorescence.
  • the absorption maximum wavelength of the SC compound is, for example, between 300 and 600 nm in a 20 mM phosphate buffer (pH 7.4) at 25 ° C.
  • the absorption maximum wavelength of the SC compound is, for example, 300 nm, 310 nm, 320 nm, 330 nm, 340 nm, 350 nm, 360 nm, 370 nm, 380 nm, 390 nm, 400 nm, 410 nm, 420 nm, 430 nm, 440 nm, 450 nm, 460 nm, 470 nm, 480 nm, 490 nm.
  • It can be in the range between any two values selected from the group consisting of 500 nm, 510 nm, 520 nm, 530 nm, 540 nm, 550 nm, 560 nm, 570 nm, 580 nm, 590 nm and 600 nm.
  • the maximum absorption wavelength of PK is as shown in Table S1 of Supporting Information of Analytical Chemistry, 2020, Vol.92, Issue 9, p.6512-6520, at room temperature, in 20 mM phosphate buffer (pH 7.4). , 407 nm.
  • the difference between ⁇ Met and ⁇ Hep of the SC compound is 50 nm or more, 60 nm or more, 70 nm or more, 80 nm or more, 90 nm or more, 100 nm or more, or 110 nm or more.
  • the larger the difference between ⁇ Met and ⁇ Hep the easier it is to detect the tumor tissue with high contrast with respect to the healthy tissue, which is preferable.
  • the difference between ⁇ Met and ⁇ Hep of the SC compound can be 300 nm or less, 200 nm or less, or 150 nm or less.
  • the difference between ⁇ DMSO and ⁇ Tol of the SC compound is, for example, 20 nm or more, 30 nm or more, 40 nm or more, 50 nm or more, 60 nm or more, 70 nm or more, 80 nm or more, 90 nm or more, or 100 nm or more.
  • the larger the difference between ⁇ DMSO and ⁇ Tol the easier it is to detect the tumor tissue with high contrast with respect to the healthy tissue, which is preferable.
  • the difference between ⁇ DMSO and ⁇ Tol of the SC compound may be 200 nm or less, 180 nm or less, 160 nm or less, 140 nm or less, or 120 nm or less.
  • the maximum two-photon absorption wavelength of the SC compound is preferably between, for example, 600 to 1200 nm in a 20 mM phosphate buffer (pH 7.4) at 25 ° C. Since such SC compounds can be excited by light having a wavelength that is difficult to be absorbed by biological substances in tissues, they are suitable for use in two-photon microscopy.
  • the fluorescent dye comprises the SC compound alone.
  • the fluorescent dye further comprises any one alone or a combination of two or more, such as a pH buffer, a surfactant, a salt, a solvent, a dye composition different from the SC compound, and the like. May be good.
  • pH buffer examples include tris (hydroxymethyl) aminomethane; good buffer (HEPES, MOPS, etc.); and citric acid, acetic acid, lactic acid, oxalic acid, phthalic acid, imidazole, triethanolamine, diethanolamine, and glycine.
  • HEPES good buffer
  • MOPS MOPS
  • citric acid acetic acid
  • lactic acid lactic acid
  • oxalic acid phthalic acid
  • imidazole triethanolamine
  • diethanolamine diethanolamine
  • glycine glycine
  • a pH buffer containing boric acid, phosphoric acid, or carbonic acid one alone or a combination of two or more selected from the group.
  • the solvent for example, one selected from the group consisting of water, ethanol, methanol, 2-propanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), N, N-dimethylformamide, acetonitrile, acetone, ethyl acetate, tetrahydrofuran, 1,2-dichloroethane. It may be used alone or in combination of two or more.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the dye composition different from the SC compound is not particularly limited as long as it does not interfere with the detection of tumor cells by the SC compound.
  • nuclear dyes such as propidium iodide (PI), ethidium bromide, acridine orange, DAPI, and Hoechst do not interfere with the staining of SC compounds and can be preferably used.
  • a dye composition different from the SC compound for example, hematoxylin eosin (HE) staining, Azan staining, Masson trichrome staining, Elastica Wangison staining, sinter silver staining, Victoria blue staining, PAM staining, PTAH staining.
  • HE hematoxylin eosin
  • Zudan III stain oil red O stain, PAS stain, alcian blue stain, toluidin blue stain, colloidal iron stain, muticalmine stain, congo red stain, Dylon stain, Grimerius stain, Fontana Masson stain, Kossa stain, Berlin blue stain, Dye compositions used for various tissue stains such as Bodian stain, Kluber-Vallera stain, and Gimza stain can be used. These other dye compositions can be used alone or in combination of two or more.
  • the dosage form of the fluorescent dye of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include solids such as powders and liquids.
  • the SC compound When the tissue is stained with the fluorescent dye of the present invention, the SC compound can be distributed in both the tumor cells and the cells of the normal tissue, but the fluorescence wavelength of the SC compound in the tumor cells shifts from the fluorescence wavelength in the cells of the normal tissue. .. Therefore, by appropriately selecting the wavelength of fluorescence to be detected, tumor cells are detected with high contrast with normal tissue.
  • the fluorescent dye of the present invention can be used for examination or diagnosis of tumors, particularly malignant tumors.
  • the fluorescent dye agent of the present invention may be applied to a living body itself or a tissue that is a part of the living body and is not separated from the living body.
  • the fluorescent dye of the present invention When applied to a living body, the fluorescent dye of the present invention can be used for diagnosing tumors, especially malignant tumors. Further, the fluorescent dye agent of the present invention is used as a part of the treatment for removing a tumor in a living body, in particular, in order to identify the removal range of the cancer or to confirm whether or not the tumor is left behind. It may be applied to the living body before, during, or after the treatment.
  • the fluorescent dye of the present invention can be, for example, a reagent used for clinical tests, basic research, etc., as well as a pharmaceutical product or a quasi-drug.
  • kits The fluorescent dye of the present invention can also be made into a kit, for example, in combination with reagents and instruments for staining or preparing a tissue specimen.
  • the kit comprises reagents for preparing a stain.
  • the reagent for preparing a staining solution is, for example, one kind alone or a mixture of two or more kinds selected from the group consisting of the above-mentioned pH buffering agent, surfactant, salt, solvent and another dye composition. May include.
  • the present invention includes a method for detecting tumor cells, which comprises staining a tissue derived from a living body with a fluorescent dye containing a compound exhibiting solvatochromism.
  • Examples of the fluorescent dye containing a compound exhibiting solvatochromism include those described in the above [Fluorescent dye].
  • tissues derived from living organisms include those described in the above [Fluorescent dye] section.
  • the method of the present invention may include the step of preparing those tissues.
  • the method of the invention applies to an organ or the organ itself or a tissue that is a three-dimensional fragment thereof.
  • tissue transparency method include TDE method, LUCID method, CLARITY method, PACT / PARS method, CUBIC method, 3DISCO method, Scale method, ScaleS method, SeeDB method, FocusClear method, Clear method, BABB method, and iDISCO method.
  • the uDISCO method and the like can be mentioned.
  • the method of the present invention is applied to the living body itself or a tissue that is a part of the living body and is not separated from the living body.
  • the method of the present invention is applied to sliced sections.
  • Sliced sections are optionally subjected to treatments such as fixation, dehydration, dealcoholization, paraffin infiltration, paraffin embedding, deparaffinization, water immersion, and staining using the above-mentioned various tissue staining methods, which are usually used in clinical examinations. May be good.
  • Staining is usually performed by contacting the tissue with a staining solution containing an SC compound.
  • concentration of the SC compound in the stain solution is, for example, 0.001 mg / mL or more, 0.01 mg / mL or more, 0.1 mg / mL or more, 0.2 mg / mL or more, 0. 3 mg / mL or more, 0.4 mg / mL or more, 0.5 mg / mL or more, 0.6 mg / mL or more, 0.7 mg / mL or more, 0.8 mg / mL or more, 0.9 mg / mL or more or 1 mg / mL It is adjusted to the above.
  • the concentration of the SC compound in the staining solution is, for example, 500 mg / mL or less, 200 mg / mL or less, 100 mg / mL or less, 50 mg / mL or less, 20 mg / mL or less, 10 mg / mL with respect to the total amount of the staining solution. Hereinafter, it is adjusted to 5 mg / mL or less or 2 mg / mL or less.
  • the temperature at the time of dyeing is not particularly limited, but is, for example, 0 to 80 ° C, 4 to 50 ° C, 20 to 45 ° C, and preferably 35 ° C to 42 ° C.
  • the time for contacting the stain with the tissue is 20 to 40 ° C., for example, 1 minute or more, 10 minutes or more, 20 minutes or more, 1 hour or more, 2 hours or more, 1 day or more or 2 days or more, for example, 14 Less than a day or less than 7 days.
  • the time for contacting the stain with the tissue is 35-40 ° C., for example, 12 hours or less, 6 hours or less, preferably 2 hours or less, more preferably 1 hour or less, still more preferably 30 minutes.
  • it is even more preferably 10 minutes or less, and for example, it may be 1 minute or more, 2 minutes or more, 5 minutes or more, or 10 minutes or more.
  • the tissue stained with the staining solution containing the SC compound can be used as it is for the detection of tumor cells, but may optionally undergo a treatment such as staining with another dye composition before the detection.
  • the method of the present invention may further include a step of detecting tumor cells.
  • Detection of tumor cells is performed, for example, by exciting an SC compound with light of an appropriate wavelength and detecting the emitted fluorescence.
  • a confocal laser scanning microscope can be used, and depending on the thickness of the section, a two-photon microscope or the like capable of multiphoton excitation is used.
  • the compound (PC) of the chemical formula (II) or 1-acetyl-6-piperidylpyrene (PK) is used as the SC compound, it is suitable for measurement by a two-photon microscope as shown in Examples.
  • PC is particularly suitable for detecting deeper tumors because the fluorescence maximum wavelength is even larger than that of PK.
  • tumor cells are detected by selecting fluorescence containing one particular wavelength and measuring its fluorescence intensity such that contrast is obtained between the tumor cells and cells of normal tissue. ..
  • the detection of tumor cells is performed by multi-wavelength measurement. That is, tumor cells are detected by detecting fluorescence containing two or more different specific wavelengths and integrating the respective fluorescence intensities.
  • the detected fluorescence includes one or more wavelengths selected from the range of, for example, 450 to 550 nm, 480 nm to 520 nm or 490 nm to 500 nm. In certain embodiments, the detected fluorescence comprises light at 495 nm.
  • the detection method of the present invention as described in the above-mentioned [Fluorescent dye] section, it is possible to inspect the tumor, specify the removal range of the tumor, diagnose the tumor, or treat the tumor.
  • the present invention includes the following preferred embodiments: ⁇ 1> A fluorescent dye containing a compound exhibiting solvatochromism for detecting tumor cells in a tissue derived from a living body. ⁇ 2> A kit containing the fluorescent dye according to ⁇ 1>. ⁇ 3> A method for detecting tumor cells, which comprises staining a tissue derived from a living body with a fluorescent dye containing a compound exhibiting solvatochromism. ⁇ 4> A method for identifying the extent of tumor removal in a tissue in the living body, which comprises staining the living body with a fluorescent dye containing a compound exhibiting solvatochromism.
  • the compound contains a condensed polycyclic ⁇ -conjugated structure having 2 to 6 rings, and preferably contains a pyrene skeleton.
  • the compound further contains one or more hydrophilic substituents containing one or more atoms selected from the group consisting of boron, nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur and halogen.
  • the molecular weight of the compound is 800 or less, 700 or less, 600 or less, 500 or less or 450 or less, and 200 or more.
  • the compound is a compound represented by the following chemical formula (II), 1-acetyl-6-piperidylpyrene, Nile Red, POLARIC TM , Laurdan, di-4-ANEPPDHQ, Prodan. And their derivatives, preferably the compound represented by the chemical formula (II), 1-acetyl-6-piperidylpyrene, Nile Red and POLARIC, more preferably the compound represented by the chemical formula (II) or It is 1-acetyl-6-piperidylpyrene, more preferably a compound represented by the chemical formula (II).
  • the absorption maximum wavelength of the compound is 300 to 600 nm in a 20 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) at 25 ° C., for example, 300 nm, 310 nm, 320 nm, 330 nm.
  • Hep the maximum fluorescence wavelength in n-heptane at 25 ° C.
  • the SC compounds ⁇ Met and ⁇ The difference in Hep is 50 nm or more, 60 nm or more, 70 nm or more, 80 nm or more, 90 nm or more, 100 nm or more, or 110 nm or more, and 300 nm or less, 200 nm or less or 150 nm or less.
  • ⁇ 16> when the maximum fluorescence wavelength in dimethyl sulfoxide (DMSO) at 25 ° C is ⁇ DMSO and the maximum fluorescence wavelength in toluene at 25 ° C is ⁇ Tol , the SC compound ⁇ DMSO .
  • the difference between ⁇ Tol and ⁇ Tol is 20 nm or more, 30 nm or more, 40 nm or more, 50 nm or more, 60 nm or more, 70 nm or more, 80 nm or more, 90 nm or more or 100 nm or more, and 200 nm or less, 180 nm or less, 160 nm or less 140 nm or less or 120 nm.
  • the living body is a human or a non-human mammal.
  • the tissues in which the tumor or tumor cells are present are skin, brain, spinal cord, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, duodenum, rectum, liver, pancreas, bile sac, bladder, kidney, and heart.
  • the tumor is a malignant tumor.
  • the tissue in which the tumor or the tumor cell is present is the skin.
  • the tumor is selected from sweat gland tumors, malignant melanomas, epidermal / hair follicle tumors, nervous system tumors and mesenchymal tumors, preferably extramammary Paget's disease or malignant melanoma.
  • High resolution mass spectrometry High-resolution mass spectrometry was measured using a high-resolution mass spectrometer (manufactured by JEOL Ltd .: JMS-700). The results obtained with the above compound A are shown below.
  • HRMS ESI +
  • the absorption spectrum and the fluorescence spectrum were measured using an ultraviolet-visible near-infrared spectrophotometer device (manufactured by JASCO Corporation: V-670) and a spectroscopic fluorometer device (manufactured by JASCO Corporation: FP6600), respectively.
  • the fluorescence quantum yield was measured using an absolute PL quantum yield measuring device (Hamamatsu Photonics Co., Ltd .: C9920-02V).
  • the concentration of compound A was 5 ⁇ M for each solvent.
  • Toluene, dichloromethane (DCM), DMSO, and ethanol were used as solvent types.
  • the obtained results are shown in FIG. 1 and Table 1. Further, the absorption maximum wavelength and the fluorescence maximum wavelength of Compound A in the 20 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) at 25 ° C. were 421 nm and the fluorescence maximum wavelength was 621 nm.
  • the absorption maximum wavelength was almost the same value depending on the solvent type, but the fluorescence maximum wavelength was different depending on the solvent type. More specifically, in the polar solvent, the wavelength lengthening of the above-mentioned fluorescence wavelength was observed, and the fluorescence solvatochromism sensitive to the solvent polarity was observed.
  • Test Examples 1 and 2 were prepared by dissolving PK in DMSO at 1 mg / mL.
  • the staining solutions of Test Example 3 and Test Example 4 were both DMSO solutions containing 1 mM SC compound, and were diluted 100-fold at the time of staining before use.
  • the skin healthy tissue, extramammary Paget's disease lesion tissue, and melanoma lesion tissue used in the test example the tissue obtained by excision was completely divided. In advance, a dermatologist has confirmed that it corresponds to each tissue. In addition, the healthy tissue of the rectum and the tumor tissue are also prepared by completely dividing the tissue obtained by excision, and a specialist confirms that the tissue corresponds to each tissue. The collection and use of tumor tissue was carried out under the approval of the Clinical Research Institutional Review Board of Ehime University Hospital (No. 1802009) and according to the study protocol.
  • Test Example 1 Observation of tumor cells by PK staining of sliced sections. Extramammary Paget's disease lesion tissue and healthy tissue were embedded in paraffin and then cut out to prepare tissue sections. The section (thickness 5 ⁇ m) was prepared by the procedure usually used in histopathological examination. For staining with the PK staining solution, after deparaffinizing by a conventional method, the staining was carried out by immersing in the PK staining solution at room temperature for several days to 1 week. Actually, it was possible to sufficiently stain by immersing it in a PK staining solution at room temperature for 2 to 3 days.
  • a two-photon microscope A1R MP + (NIKON) was used for microscopic observation.
  • NIKON a two-photon microscope A1R MP +
  • a 960 nm laser light source and a 495 nm filter were used for PK, and a 561 nm filter was used for PI.
  • the scan was performed to a depth of 100 ⁇ m of the sample.
  • the three-dimensional reconstruction image is obtained by processing the obtained data with the attached software.
  • FIGS. 2A and 2B Images of fragments with a thickness of 10 ⁇ m in the three-dimensional reconstruction image of each tissue are shown in FIGS. 2A and 2B.
  • the fluorescence wavelength is shifted and the signal level is lowered.
  • the cells on the inner side of the tumor cells were transparent, and it seemed that there was an apparent void.
  • the outline of the cell membrane was stained with PK.
  • FIG. 2B there were no regions with low levels of such signals in the healthy tissue.
  • tumor cells can be distinguished from normal cells by staining with PK and appropriately selecting the excitation wavelength and the wavelength of fluorescence to be detected. Furthermore, PK was shown to be inserted into the cell membrane.
  • the clarified tissue was stained with a PK staining solution in the same manner as in Test Example 1.
  • PI staining was performed by the method usually used for tissue staining.
  • the same conditions as in Test Example 1 were used for the detection of the PK signal.
  • FIGS. 3A and 3B Images of a 10 ⁇ m-thick fragment of the extramammary Paget's disease lesion tissue three-dimensional reconstruction image are shown in FIGS. 3A and 3B.
  • a three-dimensional PK-stained image could be obtained without going through thin slices even for a tissue as thick as 500 ⁇ m.
  • Tumor cells (paget cells) could be detected even when one cell was scattered alone. Then, in the region corresponding to the tumor cells where the level of the fluorescence signal at 495 nm was low, only the nucleus was observed with PI staining. Therefore, it was confirmed that cells actually existed in the region.
  • FIG. 3C a three-dimensional reconstruction image of the malignant melanoma lesion tissue is shown in FIG. 3C. Similar to the Paget's disease lesion, no fluorescent signal was observed by PK staining in malignant melanoma cells, and only the nucleus was observed by PI staining. As described above, the fluorescent dye agent of the present invention can specifically detect tumor cells even if the types of tumor cells are different.
  • these observed tissues contained normal cells of the epidermis, dermis and hair follicles, and all of these cells showed a remarkable signal by PK staining. Therefore, it is understood that tumor cells can be detected separately from these various normal cells by PK staining.
  • Test Example 3 Comparison of staining of normal tissue and tumor tissue with various SC compounds.
  • the healthy tissue and extramammary Paget's disease lesion tissue cleared by the LUCID method by the same method as in Test Example 2 were stained with a staining solution containing PK, PC, Nile Red or POLARIC. Stained tissue sections were observed according to the method of two-photon microscopy in Test Example 1. The drawing was performed by coloring the fluorescence wavelength of 492 nm or less with cyan, 500 to 550 nm with green, 560 to 593 nm with yellow, and 593 nm or more with red. In the illustrated image, the brightness and contrast are appropriately corrected.
  • the melanoma lesion tissue of the skin cleared by the same method was stained in the same manner and observed with a two-photon microscope.
  • the tumor cell portion was observed in the form of a void, similar to the Paget's disease lesion.
  • PC had the best drawing power, followed by PK, POLARIC, and Nile Red. Since the shift of the fluorescence wavelength due to Solvatochromism was relatively small in Nile Red and POLARIC, it was found that the degree of the shift of the fluorescence wavelength was related to the drawing power.
  • Test Example 4 Comparison of staining of normal tissue and tumor tissue in the rectum.
  • the healthy rectal tissue and the well-differentiated adenocarcinoma lesion tissue cleared by the LUCID method in the same manner as in Test Example 2 were stained with PK and Hoechst. Stained tissue sections were observed according to the method of two-photon microscopy in Test Example 1.

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Abstract

本発明は、生体に由来する組織中の腫瘍細胞を簡便に検出するための新たな方法を提供することに関する。本発明は、組織中の腫瘍細胞の検出用のソルバトクロミズム（solvatochromism）を呈する化合物を含有する蛍光色素剤を含む。本発明はまた、当該蛍光色素剤を生体に由来する組織の染色、生体に適用して、腫瘍細胞を検出する、又は腫瘍の除去範囲を特定する方法を含む。

Description

蛍光色素剤及び腫瘍細胞の検出方法
　本発明は、腫瘍細胞の検出に用いられる蛍光色素剤、及び腫瘍細胞の検出方法に関する。
　腫瘍細胞の検出には、種々の染色法が用いられている。例えば、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色は、病理診断で最も広く使用され、多くの診断法でゴールドスタンダートとされている。しかし、ＨＥ染色では、腫瘍細胞の他に正常組織も染色されて光透過性が悪くなるため、組織標本の薄切が必要となる。薄切標本は二次元的な情報しか持たないため、腫瘍細胞の分布範囲を確定するためには、多くの切片の作製と観察が必要となる。また、組織標本の作製は、高度なスキルが必要であり、煩雑で長時間を要するものである。
　さらに、ＨＥ染色では、腫瘍細胞と正常組織の境界が低コントラストで不明瞭となるケースもある。
　また、蛍光色素、放射性核種、金属粒子などを結合した抗体で特定組織を染色し、高コントラストな腫瘍細胞像を得る方法も知られている。しかし、抗体部分は細胞膜を通過しないため、膜透過性を上げるための処理が必要であり、操作が煩雑である。また、試薬も高価である。
　一方、染色用の色素を使用せずに光を照射して、異常組織と正常組織のラマン散乱の違いを利用して皮膚疾患を検出する手段も報告されている（例えば、特許文献１）。しかし、ラマン散乱法では、腫瘍の領域を細胞レベルで確定することは困難であると推測される。
　他方で、溶媒等の周囲の分子の極性の変化によって、その吸収極大波長若しくは蛍光波長、又はその両方が変化する現象（ソルバトクロミズム）を呈する化合物がいくつか知られている。ソルバトクロミズムを呈する化合物は、典型的には、光励起されると分子内電荷移動（ＩＣＴ）によって分極する。そして、分極した分子の励起状態の安定性は、溶媒分子の極性の度合いに応じて変化するため、分子の励起状態と基底状態とのエネルギー差が溶媒の極性に基づいて変化することとなる。
　このようなソルバトクロミズムを呈する化合物として、非特許文献１には、１－アセチル－６－ピペリジルピレン（ＰＫ）とそのアルデヒドアナログ（ＰＡ）が記載されている。また、ＰＫを使用して、正常組織又はＨｅＬａ細胞を染色したことが記載されている。
特開２０１８－２０１６７８号公報
Analytical Chemistry, 2020, Vol.92, Issue 9, p.6512-6520
　しかし、非特許文献１には、正常細胞と腫瘍細胞の両方を含む組織を、ソルバトクロミズムを呈する化合物で染色した例は記載されていない。また、当該文献には、ソルバトクロミズムによって生じる蛍光波長の違いから正常細胞と腫瘍細胞が識別できることも記載されていない。
　上記状況に鑑み、本発明は、生体に由来する組織中の腫瘍細胞を簡便に検出するための新たな方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、ソルバトクロミズム（solvatochromism）を呈する化合物を含有する蛍光色素剤を生体に由来する組織の染色に適用することによって組織中の腫瘍細胞が簡便に検出できることを見出し、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は以下の蛍光色素剤を提供する。
　［１］
　生体に由来する組織中の腫瘍細胞の検出用であり、ソルバトクロミズムを呈する化合物を含有する、蛍光色素剤。
　［２］
　前記化合物が、環数が２～６の縮合多環π共役構造を含む、［１］に記載の蛍光色素剤。
　［３］
　前記化合物が、さらにホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄及びハロゲンからなる群より選ばれる原子を１種以上含む親水性置換基を１つ以上含む、［２］に記載の蛍光色素剤。
　［４］
　前記化合物が、下記の化学式（ＩＩ）で表される化合物、１－アセチル－６－ピペリジルピレン、ナイルレッド、ＰＯＬＡＲＩＣＴＭ、Ｌａｕｒｄａｎ、ｄｉ－４－ＡＮＥＰＰＤＨＱ、Ｐｒｏｄａｎ及びそれらの誘導体から選択される、［１］～［３］のいずれか１に記載の蛍光色素剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　［５］
　前記化合物の吸収極大波長が、２５℃の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中において、３００～６００ｎｍである、［１］～［４］のいずれか１に記載の蛍光色素剤。
　［６］
　２５℃のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中での蛍光極大波長をλＤＭＳＯ、２５℃のトルエン中での蛍光極大波長をλＴｏｌとした場合、前記化合物のλＤＭＳＯとλＴｏｌの差が、２０～２００ｎｍである、［１］～［５］のいずれか１に記載の蛍光色素剤。
　［７］
　［１］～［６］のいずれか１に記載の蛍光色素剤を含む、キット。
　さらに、本発明は以下の方法を提供する。
　［８］
　ソルバトクロミズムを呈する化合物を含有する蛍光色素剤を用いて生体に由来する組織を染色することを含む、腫瘍細胞の検出方法。
　［９］
　ソルバトクロミズムを呈する化合物を含有する蛍光色素剤を用いて生体を染色することを含む、前記生体中の組織における腫瘍の除去範囲の特定方法。
　［１０］
　生体に由来する組織中の腫瘍細胞の検出のための、ソルバトクロミズムを呈する化合物の使用。
　［１１］
　腫瘍の除去範囲の特定のための、ソルバトクロミズムを呈する化合物の使用。
　［１２］
　腫瘍の治療用又は診断用組成物の製造のための、ソルバトクロミズムを呈する化合物の使用。
　［１３］
　腫瘍の治療用又は診断用としての、ソルバトクロミズムを呈する化合物。
　本発明の蛍光色素剤によって染色された腫瘍細胞は、正常細胞と容易に区別して検出することができる。そして、本発明の蛍光色素剤は、生体組織を簡便かつ迅速に染色することができる。
図１は、実施例におけるＰＣ（化合物Ａ）の有機溶媒中における（左）吸収スペクトル測定及び（右）蛍光スペクトル測定（ノーマライズ）のチャートである。 図１Ａは、試験例１におけるパジェット病病変部組織の二光子顕微鏡像である。腫瘍細胞（パジェット細胞）１個に対応する領域を矢頭で示す。 図２Ｂは、皮膚健常部組織の二光子顕微鏡像である。 図３Ａは、試験例２におけるパジェット病病変部組織の二光子顕微鏡像である。矢頭は表皮内で増殖したパジェット細胞、矢頭にアスタリスクは毛包内へ浸潤増殖したパジェット細胞、矢印は真皮内で浸潤増殖したパジェット細胞をそれぞれ表す。 図３Ｂは、試験例２におけるパジェット病病変部組織の二光子顕微鏡像である。矢頭は、毛包部周辺に浸潤しているパジェット細胞を表す。 図４Ｃは、試験例２におけるメラノーマ病変部組織の二光子顕微鏡像である。矢印は表皮基底細胞層で増殖したメラノーマ細胞を、矢頭は真皮内で増殖して腫瘍蜂巣を形成したメラノーマ細胞をそれぞれ示す。 図４Ａは、試験例３における皮膚健常部組織の二光子顕微鏡像である。 図４Ｂは、試験例３におけるパジェット病病変部組織の二光子顕微鏡像である。矢頭は表皮内で増殖したパジェット細胞を表す。 図４Ｃは、試験例３におけるメラノーマ病変部組織の二光子顕微鏡像である。矢頭は表皮内で増殖したメラノーマ細胞を表す。 図５は、試験例４における直腸の粘膜上皮組織の二光子顕微鏡像である。パネルＡ及びＢは健常部直腸、パネルＣ及びＤは直腸の高分化型腺癌部分である。
　本明細書において、「ソルバトクロミズム（solvatochromism）を呈する化合物」（本明細書において、「ＳＣ化合物」又は「ソルバトクロミック化合物」と略す）とは、その化合物の周囲の極性（疎水性）の変化によって、その吸収極大波長若しくは蛍光極大波長、又はその両方が変化する化合物を表す。
　特定の作用機序に限定するものではないが、本発明のＳＣ化合物は、正常細胞と腫瘍細胞で異なる細胞膜環境（例えば、膜中の分子の極性、配向性、膜の流動性など）を有する結果、上記と同様に細胞膜内のＳＣ化合物の励起状態の安定性に違いが生じ、腫瘍細胞と正常細胞で異なる波長の蛍光を発するものと推察される。
　［蛍光色素剤］
　本発明は、生体に由来する組織中の腫瘍細胞の検出に用いられ、ＳＣ化合物を含有する蛍光色素剤を含む。
　（検出対象）
　上記生体は、多細胞動物であれば特に限定されず、好ましくは哺乳動物（ヒト、非ヒト哺乳動物を含む）であり、より好ましくはヒトである。
　上記組織は、複数の細胞を有するものであれば特に限定されない。組織は、例えば、皮膚、脳、脊髄、食道、胃、小腸、大腸、十二指腸、直腸、肝臓、膵臓、胆嚢、膀胱、腎臓、心臓、脾臓、胸腺、前立腺、子宮、卵巣、精巣、乳房、肺、気管支、眼球、鼻、副鼻腔、口腔、咽頭、唾液腺、甲状腺、副甲状腺、副腎、筋肉、骨髄、血管、神経、リンパ節、腹膜、横隔膜、血液などが挙げられる。一実施形態では、上記組織は、皮膚であり、例えば、表皮若しくは真皮、又はそれら両方の組み合わせである。別の実施形態では、上記組織は、直腸である。
　また、本発明の蛍光色素剤は、例えば、摘出、切除、穿刺、採血等の外科的処置によって生体から分離された組織、又は便、尿、汗その他の体液等から得られた上記組織に適用することができる。
　一実施形態では、上記組織の形態は、検出方法によって適宜選択され得るが、例えば、臓器若しくは器官そのもの、又はそれらの薄切切片若しくは三次元断片であってもよい。
　上記組織は、その形態によっては、例えば、ホルマリン等による固定処理、パラフィン包埋、脱パラフィン処理、脱水処理、透明化処理等の処理を経ていてもよい。
　本発明の蛍光色素剤によって検出される上記腫瘍は、良性であっても悪性（癌、肉腫の細胞など）であってもよいが、好ましくは悪性の腫瘍である。また、腫瘍細胞の種類も特に限定されず、例えば上記組織に発生する腫瘍が挙げられる。
　一実施形態では、上記腫瘍は、皮膚の腫瘍である。そのような腫瘍としては、例えば、汗腺系腫瘍（乳房外パジェット病、乳房パジェット病、エクリン汗孔癌、微小嚢胞性付属器癌、皮膚粘液癌等）、悪性黒色腫（メラノーマ）、表皮・毛包系腫瘍（基底細胞癌、有棘細胞癌、日光角化症、ボーエン病、白板症、ケラトアカントーマ等）、神経系腫瘍（メルケル細胞癌、悪性末梢神経鞘腫瘍等）、間葉系腫瘍（隆起性皮膚線維肉腫、孤立性線維性腫瘍、筋肉系腫瘍、脂肪肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、紡錘細胞血管内皮腫、異系線維黄色腫、類上皮肉腫、滑膜肉腫、未分化多形細胞肉腫等）が挙げられる。特定の実施形態では、上記腫瘍は、乳房外パジェット病又は悪性黒色腫（メラノーマ）である。
　（ソルバトクロミズムを呈する化合物（ＳＣ化合物））
　本発明の蛍光色素剤において、ＳＣ化合物は、生体由来の組織に適用可能なものであれば特に限定されない。ＳＣ化合物は１種単独であっても、２種以上を組み合わせてもよいが、通常は１種単独の使用で明瞭な染色像を得ることができる。
　上記ＳＣ化合物は、その分子のサイズが小さいほど、細胞膜に移行しやすく染色性が向上するため好ましい。上記ＳＣ化合物の分子量は、例えば、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下又は４５０以下とすることができる。また、上記ＳＣ化合物の分子量は、例えば２００以上であり得る。
　一実施形態では、上記ＳＣ化合物は、細胞膜及び細胞内に分布し得るものであり、さらに特定の実施形態では、上記ＳＣ化合物は、細胞膜に挿入され得るものである。
　一実施形態では、上記ＳＣ化合物は、細胞膜において強い蛍光異方性を示す。
　一実施形態では、上記ＳＣ化合物は、細胞膜及び／又は細胞内に比べて、細胞外で蛍光強度が低くなる性質を有する。特定の実施形態では、上記ＳＣ化合物は、細胞外では実質的に蛍光が観察されない。特に限定されないが、例えば、上記ＳＣ化合物の細胞外の蛍光強度は、細胞内の蛍光強度の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下又は１％以下であり得る。ここで、細胞内外の蛍光強度の比較は、本発明の対象となる組織由来の細胞に上記ＳＣ化合物を励起し得る波長の光を照射したうえで、蛍光極大波長の光を検出できる条件で蛍光顕微鏡画像を取得し、細胞内と細胞外の蛍光の平均シグナル強度を比較することによって行われる。
　一実施形態において、上記ＳＣ化合物は、環数が２、３、４、５又は６の、縮合多環π共役構造を含む。縮合多環π共役構造とは、非局在化したπ電子を含む、２以上の環が縮合した多環構造であり、例えばベンゾフェノキサジン環のように１つ以上のヘテロ原子（窒素、酸素、硫黄等）を含んでいてもよい。特定の実施形態では、縮合多環π共役構造は、縮合多環芳香族炭化水素構造（例えば、ナフタレン、アズレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン等）である。特定の実施形態では、上記ＳＣ化合物は、縮合多環π共役構造としてピレン骨格（環数４）を含む。ピレン骨格を含むＳＣ化合物は、分子サイズを小さくしても蛍光量子収率が高いことから、本発明の用途に特に適する。
　一実施形態において、上記ＳＣ化合物は、２、３、４、５又は６個の共役環が互いに共役した構造を含む。共役環としては、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、フルオレン環、ピリジン環、チオフェン環、ピロール環、フラン環、ベンゾチオフェン環、ベンゾフラン環、ベンゾピロール環、イミダゾール環、キノリン環、イソキノリン環、カルバゾール環、チアゾール環及びジベンゾチオフェン環からなる群より選ばれる１種又は２種以上の組み合わせが挙げられる。
　上記ＳＣ化合物は、水溶性を向上させ、細胞膜及び細胞内への分散を促進する観点から、さらにホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄及びハロゲンからなる群より選ばれる原子を１種以上含む親水性置換基を１つ以上含むことが好ましい。中でも、生体分子との反応を抑える観点から、上記ＳＣ化合物に含まれる親水性置換基は、三級アミノ基、四級アンモニウム基及びカルボニル基（アルデヒド基を除く）からなる群より選ばれる１種単独又は２種以上を含むことが好ましい。
　特定の実施形態では、染色性の観点から、上記ＳＣ化合物は、下記の化学式（ＩＩ）で表される化合物であるＰＣ、１－アセチル－６－ピペリジルピレン（ＰＫ）、ナイルレッド、ＰＯＬＡＲＩＣＴＭ、Ｌａｕｒｄａｎ、ｄｉ－４－ＡＮＥＰＰＤＨＱ、Ｐｒｏｄａｎ又はこれらの誘導体から選択される。さらに特定の実施形態では、ＳＣ化合物は、ＰＣ、ＰＫ、ナイルレッド及びＰＯＬＡＲＩＣから選択され、好ましくはＰＣ又はＰＫであり、より好ましくはＰＣである。
　１－アセチル－６－ピペリジルピレン（ＰＫ）は、以下の化学式（Ｉ）で表されるＳＣ化合物である。Analytical Chemistry, 2020, Vol.92, Issue 9, p.6512-6520のＴａｂｌｅ　Ｓ１に示されるように、ＰＫは種々の溶媒中で高い蛍光量子収率を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　ＰＣは、（Ｅ）－１－（６－（ピペリジン－１－イル）ピレン－１－イル）ヘキサ－１－エン－３－オンとも呼ばれ、以下の化学式（ＩＩ）で表されるＳＣ化合物である。実施例に示すように、種々の溶媒で高い蛍光量子収率を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　ナイルレッドはＣＡＳ番号７３８５－６７－３の化合物である。ＰＯＬＡＲＩＣはChem. Lett., 2011, Vol.40, pp.989-991に記載された化合物及びその誘導体であり、例えば、五稜化薬株式会社のＰＯＬＡＲＩＣシリーズとして販売されているものが挙げられる。ＬａｕｒｄａｎはＣＡＳ番号７４５１５－２５－６の化合物である。ｄｉ－４－ＡＮＥＰＰＤＨＱの詳細は、例えばBiophys. J., 2006, Vol.90, Issue 7, p.2563-2575に記載されている。ＰｒｏｄａｎはＣＡＳ番号７０５０４－０１－７の化合物である。
　上記ＳＣ化合物のうち、ＰＣ、ＰＫ又はナイルレッドは、光安定性が良好であり、また蛍光量子収率が高い点から好ましい。
　さらにＰＫ及びＰＣは、ナイルレッドに比べて非特異的な組織への吸着が少なく、腫瘍と正常組織との蛍光波長の差が大きい傾向にあり、バックグラウンド蛍光を抑えられることから、より好ましい。
　一実施形態において、ＳＣ化合物の吸収極大波長は、例えば、２５℃の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中において、３００～６００ｎｍの間にある。ＳＣ化合物の吸収極大波長は、例えば、３００ｎｍ、３１０ｎｍ、３２０ｎｍ、３３０ｎｍ、３４０ｎｍ、３５０ｎｍ、３６０ｎｍ、３７０ｎｍ、３８０ｎｍ、３９０ｎｍ、４００ｎｍ、４１０ｎｍ、４２０ｎｍ、４３０ｎｍ、４４０ｎｍ、４５０ｎｍ、４６０ｎｍ、４７０ｎｍ、４８０ｎｍ、４９０ｎｍ、５００ｎｍ、５１０ｎｍ、５２０ｎｍ、５３０ｎｍ、５４０ｎｍ、５５０ｎｍ、５６０ｎｍ、５７０ｎｍ、５８０ｎｍ、５９０ｎｍ及び６００ｎｍからなる群より選ばれるいずれか２つの数値の間の範囲内であり得る。
　ＰＫの吸収極大波長は、Analytical Chemistry, 2020, Vol.92, Issue 9, p.6512-6520のSupporting InformationのTable S1に示されるように、室温、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中において、４０７ｎｍである。
　一実施形態において、２５℃のメタノール中での蛍光極大波長をλＭｅｔ、２５℃のｎ－ヘプタン中での蛍光極大波長をλＨｅｐとした場合、ＳＣ化合物のλＭｅｔとλＨｅｐの差は、例えば５０ｎｍ以上、６０ｎｍ以上、７０ｎｍ以上、８０ｎｍ以上、９０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、又は１１０ｎｍ以上である。λＭｅｔとλＨｅｐの差が大きいほど、腫瘍組織を健常部組織に対して高コントラストで検出しやすくなり、好ましい。また、ＳＣ化合物のλＭｅｔとλＨｅｐの差は、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下又は１５０ｎｍ以下であり得る。
　一実施形態において、２５℃のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中での蛍光極大波長をλＤＭＳＯ、２５℃のトルエン中での蛍光極大波長をλＴｏｌとした場合、ＳＣ化合物のλＤＭＳＯとλＴｏｌの差は、例えば、２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、４０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、６０ｎｍ以上、７０ｎｍ以上、８０ｎｍ以上、９０ｎｍ以上又は１００ｎｍ以上である。λＤＭＳＯとλＴｏｌの差が大きいほど、腫瘍組織を健常部組織に対して高コントラストで検出しやすくなり、好ましい。また、ＳＣ化合物のλＤＭＳＯとλＴｏｌの差は、２００ｎｍ以下、１８０ｎｍ以下、１６０ｎｍ以下１４０ｎｍ以下又は１２０ｎｍ以下であり得る。
　ＰＫの蛍光極大波長は、Analytical Chemistry, 2020, Vol.92, Issue 9, p.6512-6520のSupporting InformationのTable S1に示されるように、λＭｅｔ＝５９３ｎｍ、λＨｅｐ＝４７４ｎｍ、λＴｏｌ＝５０３ｎｍ、λＤＭＳＯ＝５５８ｎｍである。
　一実施形態において、ＳＣ化合物の二光子吸収極大波長は、２５℃の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中において、例えば、６００～１２００ｎｍの間にあることが好ましい。このようなＳＣ化合物は、組織中の生体物質によって吸収されにくい波長の光で励起することができるため、二光子顕微鏡観察での使用に適する。
　（その他組成）
　一実施形態では、蛍光色素剤は、ＳＣ化合物単独からなる。
　一実施形態では、蛍光色素剤には、さらにｐＨ緩衝剤、界面活性剤、塩、溶媒、ＳＣ化合物とは別の色素組成物などのいずれか１種単独又は２種以上の組み合わせを含んでいてもよい。
　ｐＨ緩衝剤としては、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；グッド緩衝剤（ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ等）；及び、クエン酸、酢酸、乳酸、シュウ酸、フタル酸、イミダゾール、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、グリシン、ホウ酸、リン酸、又は炭酸を含むｐＨ緩衝剤；からなる群より選ばれる１種単独又は２種以上の組み合わせが挙げられる。
　溶媒としては、例えば水、エタノール、メタノール、２－プロパノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、１，２－ジクロロエタンからなる群より選ばれる１種単独又は２種以上の組み合わせが挙げられる。
　ＳＣ化合物とは別の色素組成物としては、ＳＣ化合物による腫瘍細胞の検出を妨害するものでなければ特に限定されない。例えば、プロピジウムイオダイド（ＰＩ）、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ等の核染色色素は、ＳＣ化合物の染色を妨げにくく、好適に用いることができる。また、ＳＣ化合物とは別の色素組成物として、例えば、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、アザン染色、マッソン・トリクローム染色、エラスチカ・ワンギーソン染色、鍍銀染色、ビクトリア青染色、ＰＡＭ染色、ＰＴＡＨ染色、ズダンＩＩＩ染色、オイル赤Ｏ染色、ＰＡＳ染色、アルシアン青染色、トルイジン青染色、コロイド鉄染色、ムチカルミン染色、コンゴー赤染色、ダイロン染色、グリメリウス染色、フォンタナ・マッソン染色、コッサ染色、ベルリン青染色、ボディアン染色、クリューバー・バレラ染色、ギムザ染色などの各種組織染色に用いられる色素組成物を用いることができる。これらの別の色素組成物は、１種単独又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　（剤形）
　本発明の蛍光色素剤の剤形は特に限定されず、例えば、粉末等の固体、液体などが挙げられる。
　（用途）
　本発明の蛍光色素剤で組織を染色すると、腫瘍細胞及び正常組織の細胞の両方にＳＣ化合物が分布し得るが、腫瘍細胞におけるＳＣ化合物の蛍光波長が、正常組織の細胞における蛍光波長からシフトする。そのため、検出する蛍光の波長を適切に選択することにより、腫瘍細胞が正常組織と高コントラストで検出される。そして、本発明の蛍光色素剤は、腫瘍、特に悪性腫瘍の検査又は診断に使用することができる。
　また、本発明の蛍光色素剤は、生体そのもの、又は、生体の一部であって、生体から分離されていない組織に適用されてもよい。
　本発明の蛍光色素剤は、生体に適用される場合、腫瘍、特に悪性腫瘍の診断に使用することができる。さらに、本発明の蛍光色素剤は、腫瘍の治療において、生体の腫瘍、特に癌の除去範囲を特定するため、又は、腫瘍の取り残しの有無を確認するために、治療の一環として、当該除去処置の前、処置時、又は処置後に生体に適用されてもよい。
　本発明の蛍光色素剤は、例えば、臨床検査、基礎研究等に使用される試薬の他、医薬品、医薬部外品であり得る。
　（キット）
　本発明の蛍光色素剤は、例えば、染色又は組織標本作製のための試薬や器具と組み合わせてキットにすることもできる。特定の実施形態では、キットは、染色液調製用の試薬を含む。さらに特定の実施形態では、染色液調製用試薬は、例えば、上記のｐＨ緩衝剤、界面活性剤、塩、溶媒及び別の色素組成物からなる群より選ばれる１種単独又は２種以上の混合物を含み得る。
　［組織中の腫瘍細胞の検出方法］
　本発明は、ソルバトクロミズムを呈する化合物を含有する蛍光色素剤で、生体に由来する組織を染色することを含む、腫瘍細胞の検出方法を含む。
　ソルバトクロミズムを呈する化合物を含有する蛍光色素剤としては、上記の［蛍光色素剤］に記載したものが挙げられる。
　生体に由来する組織は、上記の［蛍光色素剤］の項に記載したものが挙げられる。本発明の方法には、それらの組織を調製する工程を含んでもよい。
　一実施形態では、本発明の方法は、臓器若しくは器官そのもの又はそれらの三次元断片である組織に適用される。当該実施形態では、染色の前に組織を透明化する工程を含むことが好ましい。組織の透明化法には、例えばＴＤＥ法、ＬＵＣＩＤ法、ＣＬＡＲＩＴＹ法、ＰＡＣＴ/ＰＡＲＳ法、ＣＵＢＩＣ法、３ＤＩＳＣＯ法、Ｓｃａｌｅ法、ＳｃａｌｅＳ法、ＳｅｅＤＢ法、ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ法、Ｃｌｅａｒ法、ＢＡＢＢ法、ｉＤＩＳＣＯ法、ｕＤＩＳＣＯ法等が挙げられる。これらの透明化法は、例えば、Cell Chem. Biol. 2016, Vol.23, 137-157、Laser Photonics Rev. 2019, Vol.13, 1800292に記載されている。
　一実施形態では、本発明の方法は、生体そのもの、又は、生体の一部であって生体から分離されていない組織に適用される。
　一実施形態として、本発明の方法は、薄切切片に適用される。薄切切片は、任意選択で、通常臨床検査で使用される固定、脱水、脱アルコール、パラフィン浸透、パラフィン包埋、脱パラフィン、浸水、上記の各種組織染色法を用いた染色等の処理を経てもよい。
　染色は、通常は組織にＳＣ化合物を含有する染色液を接触させることによって行う。染色液中のＳＣ化合物の濃度は、染色液の全量に対して、例えば、０．００１ｍｇ／ｍＬ以上、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上、０．１ｍｇ／ｍＬ以上、０．２ｍｇ／ｍＬ以上、０．３ｍｇ／ｍＬ以上、０．４ｍｇ／ｍＬ以上、０．５ｍｇ／ｍＬ以上、０．６ｍｇ／ｍＬ以上、０．７ｍｇ／ｍＬ以上、０．８ｍｇ／ｍＬ以上、０．９ｍｇ／ｍＬ以上又は１ｍｇ／ｍＬ以上に調整される。そして、染色液中のＳＣ化合物の濃度は、染色液の全量に対して、例えば、５００ｍｇ／ｍＬ以下、２００ｍｇ／ｍＬ以下、１００ｍｇ／ｍＬ以下、５０ｍｇ／ｍＬ以下、２０ｍｇ／ｍＬ以下、１０ｍｇ／ｍＬ以下、５ｍｇ／ｍＬ以下又は２ｍｇ／ｍＬ以下に調整される。
　染色時の温度は、特に限定されないが、例えば０～８０℃、４～５０℃、２０～４５℃であり、好ましくは３５℃～４２℃である。
　組織に染色液を接触させる時間は、２０～４０℃で、例えば１分以上、１０分以上、２０分以上、１時間以上、２時間以上、１日以上又は２日以上であり、例えば、１４日以下又は７日以下である。
　一実施形態では、組織に染色液を接触させる時間は、３５～４０℃で、例えば１２時間以下、６時間以下であり、好ましくは２時間以下、より好ましくは１時間以下、さらに好ましくは３０分以下、さらにより好ましくは１０分以下であり、そして、例えば、１分以上、２分以上、５分以上又１０分以上であり得る。
　ＳＣ化合物を含有する染色液で染色された組織は、そのまま腫瘍細胞の検出に用いることができるが、任意選択で、検出の前に他の色素組成物による染色等の処理を経てもよい。
　本発明の方法は、さらに腫瘍細胞を検出する工程を含み得る。腫瘍細胞の検出は、例えば、ＳＣ化合物を適切な波長の光で励起し、放出される蛍光を検出することによって行われる。検出には、例えば共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いることができ、切片の厚さによっては二光子顕微鏡等の多光子励起が可能なものが用いられる。例えば、ＳＣ化合物として化学式（ＩＩ）の化合物（ＰＣ）又は１－アセチル－６－ピペリジルピレン（ＰＫ）を用いた場合は、実施例に示されるように二光子顕微鏡による測定に適する。中でもＰＣは、蛍光極大波長がＰＫよりもさらに大きいことから、より深部の腫瘍を検出する場合に特に適する。
　一実施形態では、腫瘍細胞は、当該腫瘍細胞と正常組織の細胞の間でコントラストが得られるような、１つの特定の波長を含む蛍光を選択し、その蛍光強度を測定することによって検出される。
　別の実施形態では、腫瘍細胞の検出は、多波長測定によって行われる。即ち、腫瘍細胞は、２以上の異なる特定の波長を含む蛍光を検出し、各々の蛍光強度を統合することによって検出される。
　一実施形態として、ＳＣ化合物としてＰＣ又はＰＫを用いた場合、検出される蛍光は、例えば４５０～５５０ｎｍ、４８０ｎｍ～５２０ｎｍ又は４９０ｎｍ～５００ｎｍの範囲から選択される１又は２以上の波長を含む。特定の実施形態では、検出される蛍光は、４９５ｎｍの光を含む。
　本発明の検出方法によって、上記の［蛍光色素剤］の項に記載したように、腫瘍の検査、腫瘍の除去範囲の特定、腫瘍の診断又は腫瘍の治療を行うことができる。
　［本発明の好ましい実施形態］
　本発明は、以下の好ましい実施形態を含む。
　＜１＞
　生体に由来する組織中の腫瘍細胞の検出用であり、ソルバトクロミズムを呈する化合物を含有する、蛍光色素剤。
　＜２＞
　＜１＞に記載の蛍光色素剤を含む、キット。
　＜３＞
　ソルバトクロミズムを呈する化合物を含有する蛍光色素剤を用いて生体に由来する組織を染色することを含む、腫瘍細胞の検出方法。
　＜４＞
　ソルバトクロミズムを呈する化合物を含有する蛍光色素剤を用いて生体を染色することを含む、前記生体中の組織における腫瘍の除去範囲の特定方法。
　＜５＞
　ソルバトクロミズムを呈する化合物を含有する蛍光色素剤を用いて生体に由来する組織又は生体を染色すること、及び
　染色像に基づいて腫瘍を検出すること、
を含む、腫瘍の治療又は診断のための方法。
　＜６＞
　生体に由来する組織中の腫瘍細胞の検出のための、ソルバトクロミズムを呈する化合物の使用。
　＜７＞
　腫瘍の除去範囲の特定のための、ソルバトクロミズムを呈する化合物の使用。
　＜８＞
　腫瘍の治療用又は診断用組成物の製造のための、ソルバトクロミズムを呈する化合物の使用。
　＜９＞
　腫瘍の治療用又は診断用としての、ソルバトクロミズムを呈する化合物。
　＜１０＞
　前記＜１＞～＜９＞において、前記化合物は、環数が２～６の縮合多環π共役構造を含み、好ましくはピレン骨格を含む。
　＜１１＞
　前記＜１＞～＜１０＞において、前記化合物は、さらにホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄及びハロゲンからなる群より選ばれる原子を１種以上含む親水性置換基を１つ以上含む。
　＜１２＞
　前記＜１＞～＜１１＞において、前記化合物の分子量は、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下又は４５０以下であり、そして、２００以上である。
　＜１３＞
　前記＜１＞～＜１２＞において、前記化合物は、下記の化学式（ＩＩ）で表される化合物、１－アセチル－６－ピペリジルピレン、ナイルレッド、ＰＯＬＡＲＩＣＴＭ、Ｌａｕｒｄａｎ、ｄｉ－４－ＡＮＥＰＰＤＨＱ、Ｐｒｏｄａｎ及びそれらの誘導体から選択され、好ましくは化学式（ＩＩ）で表される化合物、１－アセチル－６－ピペリジルピレン、ナイルレッド及びＰＯＬＡＲＩＣから選択され、より好ましくは化学式（ＩＩ）で表される化合物又は１－アセチル－６－ピペリジルピレンであり、さらに好ましくは化学式（ＩＩ）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　＜１４＞
　前記＜１＞～＜１３＞において、前記化合物の吸収極大波長が、２５℃の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中において、３００～６００ｎｍであって、例えば、３００ｎｍ、３１０ｎｍ、３２０ｎｍ、３３０ｎｍ、３４０ｎｍ、３５０ｎｍ、３６０ｎｍ、３７０ｎｍ、３８０ｎｍ、３９０ｎｍ、４００ｎｍ、４１０ｎｍ、４２０ｎｍ、４３０ｎｍ、４４０ｎｍ、４５０ｎｍ、４６０ｎｍ、４７０ｎｍ、４８０ｎｍ、４９０ｎｍ、５００ｎｍ、５１０ｎｍ、５２０ｎｍ、５３０ｎｍ、５４０ｎｍ、５５０ｎｍ、５６０ｎｍ、５７０ｎｍ、５８０ｎｍ、５９０ｎｍ及び６００ｎｍからなる群より選ばれるいずれか２つの数値の間の範囲内である。
　＜１５＞
　前記＜１＞～＜１４＞において、２５℃のメタノール中での蛍光極大波長をλＭｅｔ、２５℃のｎ－ヘプタン中での蛍光極大波長をλＨｅｐとした場合、ＳＣ化合物のλＭｅｔとλＨｅｐの差は、５０ｎｍ以上、６０ｎｍ以上、７０ｎｍ以上、８０ｎｍ以上、９０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、又は１１０ｎｍ以上であり、そして、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下又は１５０ｎｍ以下である。
　＜１６＞
　前記＜１＞～＜１５＞において、２５℃のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中での蛍光極大波長をλＤＭＳＯ、２５℃のトルエン中での蛍光極大波長をλＴｏｌとした場合、ＳＣ化合物のλＤＭＳＯとλＴｏｌの差は、２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、４０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、６０ｎｍ以上、７０ｎｍ以上、８０ｎｍ以上、９０ｎｍ以上又は１００ｎｍ以上であり、そして、２００ｎｍ以下、１８０ｎｍ以下、１６０ｎｍ以下１４０ｎｍ以下又は１２０ｎｍ以下である。
　＜１７＞
　前記＜１＞～＜１６＞において、前記生体は、ヒト又は非ヒト哺乳動物である。
　＜１８＞
　前記＜１＞～＜１７＞において、前記腫瘍又は腫瘍細胞が存在する組織は、皮膚、脳、脊髄、食道、胃、小腸、大腸、十二指腸、直腸、肝臓、膵臓、胆嚢、膀胱、腎臓、心臓、脾臓、胸腺、前立腺、子宮、卵巣、精巣、乳房、肺、気管支、眼球、鼻、副鼻腔、口腔、咽頭、唾液腺、甲状腺、副甲状腺、副腎、筋肉、骨髄、血管、神経、リンパ節、腹膜、横隔膜及び血液から選択される。
　＜１９＞
　前記＜１＞～＜１８＞において、前記腫瘍は、悪性腫瘍である。
　＜２０＞
　前記＜１＞～＜１９＞において、前記腫瘍又は腫瘍細胞が存在する組織は皮膚であり、
　前記腫瘍は、汗腺系腫瘍、悪性黒色腫、表皮・毛包系腫瘍、神経系腫瘍及び間葉系腫瘍から選択され、好ましくは乳房外パジェット病又は悪性黒色腫である。
　［１．材料］
　［１－１．ＰＣの合成及び分析］
　ＰＣの合成は、下記のスキームのように行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　既知のピレン誘導体である化合物１（１００ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）、及び２－ペンタノン（４７μＬ，０．４８ｍｍｏｌ）に対して、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１ｍＬ）、及び脱水エタノール（６ｍＬ）を加え、得られた溶液を、アルゴン雰囲気化にて６０℃で４時間加熱攪拌した。
　次いで、上記溶液に水を加え、生じた析出物をろ別して回収した。
　得られた析出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：ヘキサン＝２：１）にて精製し、さらにアセトニトリルで再結晶することで目的物たる化合物Ａ（ＰＣ）を得た。（収量：２０ｍｇ、収率：１６％）
　（１Ｈ－ＮＭＲ分析、及び１３Ｃ－ＮＭＲ分析）
　１Ｈ－ＮＭＲ、及び１３Ｃ－ＮＭＲ分析は、核磁気共鳴装置（日本電子株式会社製：ＪＭＮ－ＬＡ５００）を用いて測定した。上記化合物Ａにおいて得られた結果を下記に示す。
・１Ｈ　ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝８．７１（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），８．４６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２５（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．２２（ｓ，４Ｈ），２．７８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．９３－１．９５（ｍ，４Ｈ），１．７７－１．８５（ｍ，２Ｈ），１．７３（ｓ，２Ｈ），１．０６（ｔ，Ｊ＝７．３３Ｈｚ，１Ｈ）．
・１３Ｃ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）＝１４．１１，１８．１２，２４．６７，２６．８４，４３．４９，５５．２１，１１７．５３，１２０．４９，１２４．２６，１２４．４８，１２４．７１，１２５．０９，１２５．６８，１２６．０２，１２６．３１，１２６．５１，１２６．５７，１２７．６６，１２８．７５，１３０．８０，１３３．２１，１３９．２５，１５０．３３，２００．４９．
　（高分解能質量分析）
　高分解能質量分析は、高分解能質量分析装置（日本電子株式会社製：ＪＭＳ－７００）を用いて測定した。上記化合物Ａにおいて得られた結果を下記に示す。
・ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋），ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２５Ｈ２３ＮＯ［Ｍ＋Ｎａ］＋４０４．１９８５，ｆｏｕｎｄ　４０４．１９８１．
　（ＰＣの有機溶媒中での光物性測定）
　上記ＰＣの各有機溶媒中での吸収スペクトル及び蛍光スペクトル測定を行った。
　吸収スペクトル及び蛍光スペクトル測定は、それぞれ紫外可視近赤外分光光度計装置（日本分光株式会社製：Ｖ－６７０）及び分光蛍光光度計装置（日本分光株式会社製：ＦＰ６６００）を用いて測定した。また、蛍光量子収率は絶対ＰＬ量子収率測定装置（浜松ホトニクス株式会社：Ｃ９９２０－０２Ｖ）を用いて測定した。また、化合物Ａの濃度は、各溶媒それぞれ５μＭであった。溶媒種は、トルエン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ＤＭＳＯ、エタノールを用いた。得られた結果を図１及び表１に示す。また、２５℃の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中における化合物Ａの吸収極大波長は４２１ｎｍ、蛍光極大波長は６２１ｎｍであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　図１及び表１に示されるように、吸収極大波長は上記溶媒種によりほぼ同様の値であったが、蛍光極大波長は上記溶媒種により相違が認められた。より詳細には、極性溶媒では上記蛍光波長の長波長化が認められ、溶媒極性に鋭敏な蛍光ソルバトクロミズムが認められた。
　［１－２．ＰＣ以外のＳＣ化合物の準備］
　ＰＫは、Analytical Chemistry, 2020, Vol.92, Issue 9, p.6512-6520に記載の方法で合成したものを使用した。ナイルレッドは東京化成工業株式会社製のものを使用した。ＰＯＬＡＲＩＣは、ＰＯＬＡＲＩＣＴＭ　５００ＢＣＳ（五稜化薬株式会社製）を使用した。
　［１－３．染色液の調製］
　試験例１及び２の染色液は、ＰＫをＤＭＳＯに１ｍｇ／ｍＬ溶解して調製した。試験例３、試験例４の染色液は、いずれも１ｍＭのＳＣ化合物を含有するＤＭＳＯ溶液であり、染色時に１００倍に希釈して使用した。
　［１－４．使用組織］
　試験例に用いられた皮膚健常部組織、乳房外パジェット病病変部組織及びメラノーマ病変部組織は、切除して得られた組織を全割したものを用いた。予め、皮膚専門医がそれぞれの組織に該当することを確認している。また、直腸の健常部組織及び腫瘍組織も、切除によって得られた組織を全割して調製し、専門医がそれぞれの組織に該当することを確認している。腫瘍組織の採取及び使用は、愛媛大学医学部付属病院臨床研究倫理審査委員会の承認のもと（第１８０２００９号）、その試験プロトコールに従って行われた。
　［２．試験例１：薄切切片のＰＫ染色による腫瘍細胞の観察］
　乳房外パジェット病病変部組織及び健常部組織をパラフィン包埋してから切り出し、組織切片を作製した。切片（厚さ５μｍ）の作製は、病理組織検査において通常行われる手順で行った。ＰＫ染色液による染色は、常法で脱パラフィン処理した後、ＰＫ染色液に室温で数日～１週間浸漬して染色を行った。なお、実際にはＰＫ染色液に室温で２～３日浸漬することによって、十分に染色することができた。
　顕微鏡観察には、二光子顕微鏡Ａ１Ｒ　ＭＰ＋（ＮＩＫＯＮ）を用いた。測定において、ＰＫについては９６０ｎｍのレーザー光源及び４９５ｎｍのフィルターを用い、ＰＩについては５６１ｎｍのフィルターを用いた。スキャンは試料の深さ１００μｍまで行われた。三次元再構成像は、得られたデータを付属のソフトウェアで処理することによって得られる。
　各組織の三次元再構成像のうちの厚さ１０μｍ分の断片の画像を、図２Ａ及び図２Ｂに示した。図２Ａに示されるように、腫瘍細胞（パジェット細胞）の細胞が存在する部分は、蛍光波長がシフトしてシグナルのレベルが低下した。その結果、腫瘍細胞の奥側の細胞が透けて、見かけ上の空隙があるように見えた。一方、周囲の正常細胞は細胞膜の輪郭がＰＫに染色された。一方、図２Ｂに示されるように、健常部組織には、そのようなシグナルのレベルが低い領域は存在しなかった。
　以上から、ＰＫで染色して、励起波長及び検出すべき蛍光の波長を適切に選択することにより、腫瘍細胞を正常細胞と区別可能であることが明らかとなった。さらに、ＰＫは細胞膜に挿入されることが示された。
　［３．試験例２：透明化された三次元組織のＰＫ染色による腫瘍細胞の観察］
　厚さ５００μｍの由来の乳房外パジェット病病変部組織及び厚さ１００μｍの悪性黒色腫病変部組織について、固定、薄切処理を経ずに、透明化処理を行ってからＰＫ及びプロピジウムイオダイド（ＰＩ）による染色を行った。ＬＵＣＩＤ法を用いて、Sawada K, Kawakami R, Shigemoto R, and Nemoto T. Eur. J. Neurosci., 2018, Vol.47, No.9, 1033-1042に記載の手順に従って透明化処理を行った。透明化された組織は、試験例１と同様にＰＫ染色液で染色された。ＰＩ染色は、組織染色で通常行われる方法で行った。また、顕微鏡観察の条件は、ＰＫのシグナルの検出については試験例１と同様の条件を用いた。
　乳房外パジェット病病変部組織の三次元再構成像のうちの厚さ１０μｍ分の断片の画像を、図３Ａ及び図３Ｂに示した。二光子顕微鏡を用いることによって、５００μｍもの厚さの組織でも、薄切を経ることなく三次元のＰＫ染色画像を得ることができた。腫瘍細胞（パジェット細胞）は、１細胞単独で散在している場合でも検出することができた。そして、４９５ｎｍの蛍光のシグナルのレベルが低い腫瘍細胞に相当する領域では、核のみがＰＩ染色されて観察された。よって、当該領域には実際に細胞が存在することが確認された。
　また、悪性黒色腫病変部組織の三次元再構成像を図３Ｃに示した。パジェット病病変部と同様に、悪性黒色腫細胞もＰＫ染色による蛍光シグナルが観察されず、ＰＩ染色によって核のみが観察された。このように、腫瘍細胞の種類が異なっていても、本発明の蛍光色素剤は腫瘍細胞を特異的に検出することができる。
　そして、これらの観察した組織は表皮、真皮及び毛包の正常な細胞を含むが、これらの細胞は、いずれもＰＫ染色によるシグナルが顕著に見られた。従って、ＰＫ染色により、腫瘍細胞をこれら種々の正常細胞と区別して検出可能であることが理解される。
　［４．試験例３：各種ＳＣ化合物による正常組織と腫瘍組織の染色の比較］
　試験例２と同じ方法でＬＵＣＩＤ法により透明化した皮膚の健常部組織及び乳房外パジェット病病変部組織を、ＰＫ、ＰＣ、ナイルレッド又はＰＯＬＡＲＩＣを含有する染色液で染色した。染色した組織切片を、試験例１の二光子顕微鏡観察の方法に従って観察した。描画は、蛍光波長が４９２ｎｍ以下をシアン、５００～５５０ｎｍを緑、５６０～５９３ｎｍを黄色、５９３ｎｍ以上を赤色で着色して行った。なお、図示した画像は、明るさ・コントラストを適宜補正している。
　健常部組織では、図４Ａに示すように、いずれの染色液を使用した場合も、すき間なく細胞で埋められた平面状の構造が観察像として得られた。
　一方、乳房外パジェット病病変部組織では、図４Ｂに示すように、腫瘍細胞に相当する領域の蛍光波長がシフトする結果、試験例１と同様の空隙状の部分が観察された。蛍光観察の際の描画力を比較すると、とりわけＰＣが最も描画力に優れ、次いでＰＫ、ナイルレッド、ＰＯＬＡＲＩＣの順であった。ここで、蛍光強度及び染色のコントラストが高いほど、描画力が高いと判断される。ナイルレッド及びＰＯＬＡＲＩＣは、元の画像の蛍光強度はＰＫ、ＰＣに比べて小さく、腫瘍の識別には、明るさ及びコントラストの調整が必要であった。
　次に、同様の方法で透明化した皮膚のメラノーマ病変部組織を、同様に染色して二光子顕微鏡により観察した。その結果、図４Ｃに示されるように、パジェット病病変部と同様に、腫瘍細胞部分が空隙状に観察された。
　蛍光観察の際の描画力を比較すると、ＰＣが最も描画力に優れ、次いでＰＫ、ＰＯＬＡＲＩＣ、ナイルレッドの順であった。ナイルレッド及びＰＯＬＡＲＩＣはソルバトクロミズムによる蛍光波長のシフトが比較的小さかったことから、蛍光波長のシフトの度合いが描画力に関連することが判明した。
　また、ＰＯＬＡＲＩＣは正常組織に吸着すると、観察した波長領域で強い傾向を発することが判明した。ＰＯＬＡＲＩＣは、腫瘍組織を染色する際にバックグラウンドがなりがちであり、病変部の良好な画像を得るには、レーザーパワーをＰＫ、ＰＣの１／４（２．５％）に下げるなどして観察像全体の蛍光強度を下げる必要があった。一方、他のＳＣ化合物では、特にバックグラウンド強度を調整しなくても描画力の高い画像が得られた。
　［５．試験例４：直腸における正常組織と腫瘍組織の染色の比較］
　試験例２と同じ方法でＬＵＣＩＤ法により透明化した直腸の健常部組織及び高分化型腺癌病変部組織を、ＰＫ及びＨｏｅｃｈｓｔで染色した。染色した組織切片を、試験例１の二光子顕微鏡観察の方法に従って観察した。
　結果を図５に示した。正常な直腸粘膜上皮（円柱上皮）では、細胞膜がＰＫ染色で陽性となり、細胞質は染色性に乏しく、Ｈｏｅｃｈｓｔで染色された核のみが観察された。一方、腫瘍病変部では、ＰＫ染色による細胞質染色性が高くなり、細胞の分布が観察された。即ち、試験例１～３の場合とは逆に、直腸の腫瘍組織の蛍光が観察可能となることで、正常組織と明確に区別可能な染色像が得られた。
 

Claims (7)

  1. 　生体に由来する組織中の腫瘍細胞の検出用であり、ソルバトクロミズムを呈する化合物を含有する、蛍光色素剤。
  2. 　前記化合物が、環数が２～６の縮合多環π共役構造を含む、請求項１に記載の蛍光色素剤。
  3. 　前記化合物が、さらにホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄及びハロゲンからなる群より選ばれる原子を１種以上含む親水性置換基を１つ以上含む、請求項２に記載の蛍光色素剤。
  4. 　前記化合物が、下記の化学式（ＩＩ）で表される化合物、１－アセチル－６－ピペリジルピレン、ナイルレッド、ＰＯＬＡＲＩＣＴＭ、Ｌａｕｒｄａｎ、ｄｉ－４－ＡＮＥＰＰＤＨＱ、Ｐｒｏｄａｎ及びそれらの誘導体から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の蛍光色素剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  5. 　前記化合物の吸収極大波長が、２５℃の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中において、３００～６００ｎｍである、請求項１～４のいずれか一項に記載の蛍光色素剤。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の蛍光色素剤を含む、キット。
  7. 　ソルバトクロミズムを呈する化合物を含有する蛍光色素剤で、生体に由来する組織を染色することを含む、腫瘍細胞の検出方法。
     
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