JP2007222100A

JP2007222100A - 細胞又は組織内部染色剤組成物及びこれを用いた染色方法

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Publication number: JP2007222100A
Application number: JP2006048590A
Authority: JP
Inventors: Akira Yamamoto; 晃山本; Yusuke Iimori; 祐介飯森; Masae Koyama; 真恵小山
Original assignee: Pentax Corp
Current assignee: Pentax Corp
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2007-09-06

Abstract

【課題】より高感度に細胞又は組織の内部を染色できる組成物及びそれを用いた染色方法を提供する。
【解決手段】色素分子がアミノ基を介して２個以上結合してなる細胞内浸透性高分子を含有する細胞又は組織内部染色剤組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は、顕微鏡や内視鏡で細胞又は組織を観察する際に使用する細胞又は組織内部染色剤組成物に関する。

細胞や組織の観察は生物学・医学分野で広く一般に行われており、形態学、病理学、微生物学、細菌学、寄生虫学など多岐にわたる分野で行われている。中でも、病理診断や細胞診断などの診断には欠くことのできない手技である。

細胞の研究で最も一般的に用いられる方法は顕微鏡観察である。光学顕微鏡下において、細胞や組織の構造物は本来無色に近く、これらの構造を顕微鏡で観察しやすくするために色素を用いて着色することを染色という。病理検査を目的とした顕微鏡観察のための試料は、通常多くの手順を経て、調製される。具体的には、採取、固定、脱水、包埋、薄切、染色という作業を要する。或いは採取した後、急速凍結、薄切、固定、染色という手順をとる。光学顕微鏡によるこのような病理検査は、通常採取した組織片を実験室内で処理後、観察、診断される。すなわち顕微鏡観察による病理組織の診断は生体組織のわずかな一部に関する情報を与えるものであり、それは採取された組織に限定される。顕微鏡による病理診断は過去の実績とその信頼性において極めて優れている。

このような実験室内診断に対して、生体組織を生きた状態で観察、診断する手法が多く考案、実用化されている。これらは例えばMRI、PET、内視鏡観察等である。特に内視鏡による、消化器官内及び気管支内部の検鏡、診断は近年ますます重要になってきている。内視鏡検査の主な目的は、内視鏡で観察し、場合によっては組織を採取し、これらの所見から疾患を診断することである。つまり、内視鏡検査には視診が基本であり、組織の状態をより明瞭に観察するためには色素内視鏡検査法が用いられる。色素内視鏡検査法は各種色素を消化器管に直接噴霧又は静脈注射などにより、細胞や組織を染色し、色素の特性を利用して内視鏡的に観察する方法であり、現在では消化器疾患の病態生理の解明や微細診断に欠かせぬ方法となっている。

組織染色法の技術は古くからほぼ確立されており、観察目的によって多様の染色剤が使用されている。染色剤の色素としては、目視で判別可能な可視色素や励起波長のレーザーを照射したときの蛍光を検出する蛍光色素などがあり、用いる顕微鏡や内視鏡により、両者を単独で又は、併せて使用されている。

しかしながら、従来の細胞や組織の染色に用いられている色素では、感度が十分でない場合が多い。これに対して、色素を多量に用いることにより感度を高めようとすると、不必要な部分まで染色され、コントラストが低下する等の問題があった。
従って、本発明の目的は、より高感度に細胞又は組織の内部を染色できる組成物及びそれを用いた染色方法を提供することにある。

そこで本発明者は、上記課題を解決すべく種々検討した結果、細胞内浸透性高分子にアミノ基を介して２個以上の色素分子を結合させた色素修飾高分子を用いれば、細胞や組織内部に容易に浸透し、かつ色素が高分子中のアミノ基により細胞や組織内に付着し、高感度に、細胞又は組織内部を染色できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、色素分子がアミノ基を介して２個以上結合してなる細胞内浸透性高分子を含有する細胞又は組織内部染色剤組成物を提供するものである。
また、本発明は上記組成物を用いることを特徴とする細胞又は組織内部の染色方法を提供するものである。

本発明組成物を用いれば、細胞又は組織内部が高感度で染色される。また、本発明組成物は、細胞及び組織内部への付着性が高いので顕微鏡や内視鏡による観察が容易である。従って、本発明組成物を用いて細胞又は組織染色による診断法によれば、より高精度な診断が可能になる。

本発明の細胞又は組織内部染色剤組成物は、色素分子がアミノ基を介して２個以上結合してなる細胞内浸透性高分子を含有する。細胞内浸透性高分子としては、細胞内浸透性であれば、合成高分子であると、天然高分子であるを問わない。合成高分子としては、アミノ基含有合成高分子、さらにアミノ基を１０個以上有する合成高分子が好ましい。

合成高分子の例としては、ポリアルキレンポリアミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルエステル、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルアミド、ポリアミジン、ポリビニルピリジン、ポリビニルイミダゾール等が挙げられる。これらの高分子の具体例としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン等のポリアルキレンイミン等のポリアルキレンポリアミン；ポリアリルアミン、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド等のポリアリルアミン；ポリアクリルアミドのホフマン分解物、ポリビニルアセトアミド加水分解物、ポリビニルフタルイミドの加水分解物、Ｎ−ビニルホルムアミドポリマーの加水分解物等のポリビニルアミン；ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド（共）重合体等のジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド（共）重合体；ポリメタアクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド等のジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレート（共）重合体；ポリアミジン、ポリビニルピリジン、ポリビニルイミダゾール、ジシアンジアミド系縮合物、エピクロロヒドリン・ジメチルアミン縮合物等のエピクロロヒドリン・ジアルキルアミン縮合物；ジメチルアミン・エチレンジクロライド縮合物等のジアルキルアミン・アルキルジハライド縮合物；ポリビニルイミダゾリン等が挙げられる。

天然高分子の例としては、オリゴ糖及び分子量の小さいタンパク質等が挙げられる。

また、高分子には２個以上のアミノ基を有するのが１分子あたりに結合する色素分子の数が多くなり、染色性（感度）が向上するので好ましい。高分子１分子あたりのアミノ基の数は、２個以上、さらに１０個以上、さらに５０個以上が好ましい。

また、高分子の分子量は、細胞内浸透性を考慮すると、５００〜１０万、特に１０００〜１万が好ましい。

本発明に用いられる色素分子としては、可視色素及び蛍光色素のいずれでもよく、例えばトルイジンブルー、クリスタルバイオレット、ルゴール、インジゴカルミン、コンゴーレッド、フェノールレッド、アクリジンオレンジ、フルオレセインなどが挙げられる。また、１種の高分子に、可視色素及び蛍光色素の２種を結合させることもできる。

細胞内浸透性高分子に色素分子をアミノ基を介して結合させるには、例えばアミノ基を有する高分子と色素分子とを反応させる方法、色素分子にアミノ基を導入して高分子と反応させる方法、高分子とアミノ基を有する化合物とを反応させ、次いで色素分子を反応させる方法等が挙げられる。細胞内浸透性高分子への色素分子の結合率は、細胞内浸透性高分子上のアミノ基に対して２０〜８０％、さらに３０〜８０％、特に３０〜５０％であるのが、染色性及び染色像の鮮明さの点から好ましい。

本発明の染色剤組成物中の色素の含有量は、染色性及び染色像の鮮明さの点から、色素分子として、０．００１〜７０質量％、さらに０．０１〜５０質量％、特に０．０１〜４０質量％が好ましい。

本発明の染色剤組成物は、液体、顆粒、錠剤等の形態も使用することができる。消化管内で撒布する場合又は粘膜下投与する場合は液体が好ましく、経口投与する場合は液体、顆粒、錠剤等が好ましい。

本発明の染色剤組成物には、その形態（剤型）に応じて種々の成分を配合できる。例えば、粘稠剤、増粘剤、界面活性剤、甘味剤、防腐剤、香料、pH調整剤、水等を配合できる。

pH調整剤としては、pHを５〜９にするもの、例えば、塩酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、酢酸及びこれらの塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、酸化カルシウム、酸化マグネシウム、ピロリン酸四ナトリウムなどが挙げられる。

また溶剤としてエタノール、水などを配合し得る。錠剤の場合は、結合剤、崩壊剤などの公知の錠剤用成分を用いることができる。

本発明の染色剤組成物は、細胞又は組織内部を非特異的に染色することができるので、顕微鏡又は通常の可視光内視鏡観察時における細胞又は組織内部染色剤として有用である。

また、色素として蛍光色素を用いた場合には、蛍光顕微鏡、蛍光内視鏡及び共焦点内視鏡観察用の細胞又は組織内部染色剤組成物として有用である。

本発明の染色剤組成物を用いて細胞又は組織内部を染色するには、インビトロの場合には通常の組織切片を作成後に本発明染色剤組成物を適用すればよい。また、インビボの場合には、本発明染色剤組成物を局所撒布又は経口投与した後に内視鏡で観察すればよい。

また、本発明の細胞又は組織内部染色剤組成物と、これとは異なる細胞内に浸透しない染色剤を併用することにより、細胞表面と細胞内部をそれぞれ染色することが可能となる。これにより、細胞表面と内部の染め分けにより、より鮮明な像を得ることが可能となる。これは共焦点顕微鏡や共焦点内視鏡といった、表面から内部へと３次元的な断層像を観察するような用途において、一見すると組織の境界を識別しにくいような像を観察する際に特に有用である。

また、本発明におけるさらなる特徴としては、異なる２種類以上の色素を修飾できることである。現在開発が進められている共焦点内視鏡は、まず通常のCCDにより低倍率の可視観察を行い、その視診において病変と思われる疑わしい箇所について共焦点による組織内部の断層方向の蛍光観察及び診断を行うというものである。従って、観察にはCCD観察用の可視色素と共焦点観察用の蛍光色素の２種類が必要となる。このような用途に、例えば、本発明における可視色素と蛍光色素の両方を修飾した染色剤組成物を用いると、一度の投与により細胞又は組織内部の可視・蛍光の両方の観察が可能となり、投与回数、投与量ともに少なくすることが可能となる。また、pH応答性の色素、可視色素や蛍光色素などを組み合わせることにより、それぞれの特徴を兼ね備えた染色剤が実現可能となり、様々な観察部位・観察目的に応じて使用することが可能となる。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。

実施例１
PEI-FITC作製方法
蒸留水１００μｌに溶解したFITC５．４mgとポリエチレンイミン（PEI）（和光純薬社製P-70；平均分子量70000）１００mgとを混合し、さらに１．７５mg／mLのポリエチレンイミン濃度となるように蒸留水で希釈し、FITC修飾ポリエチレンイミン溶液を調製した。調製したFITC修飾ポリエチレンイミン溶液はゲルろ過クロマト（カラム：PD-10アマシャムバイオサイエンス株式会社製）により分画を行い、過剰なFITCを除去した。

実施例２
PEI-Rhodamine作製方法
蒸留水１００μｌに溶解したローダミン（RhodamineB isothiocyanate）７．５mgとPEI（和光純薬社製P-70；平均分子量70000）１００mgとを混合し、さらに１．７５mg／mLのポリエチレンイミン濃度となるように蒸留水で希釈し、ローダミン修飾ポリエチレンイミン溶液を調製した。調製したローダミン修飾ポリエチレンイミン溶液はゲルろ過クロマトにより分画を行い、過剰なローダミンを除去した。

実施例３
PEI-FITC-Rhodamine作製方法
蒸留水１mLに溶解したローダミン（RhodamineB isothiocyanate）２．７mgとFITC３．９mgとPEI（和光純薬社製P-70；平均分子量70000）１００mgとを混合し、さらに１．７５mg／mLのポリエチレンイミン濃度となるように蒸留水で希釈し、FITC、ローダミン修飾ポリエチレンイミン溶液を調製した。調製したFITC、ローダミン修飾ポリエチレンイミン溶液はゲルろ過クロマトにより分画を行い、過剰なローダミンを除去した。

実施例４
PEI-FITC溶液、FITC-I溶液、フルオレセインナトリウム溶液にホルマリン固定済み大腸切片を一分間浸漬し、１００mMNaPで洗った。共焦点顕微鏡（ライカマイクロシステムズ製、TCS-SP2）で励起波長４８８nmにて観察を行った。用いた各溶液は、蛍光プレートリーダー（日立ハイテク社製コロナマイクロプレートリーダーMTP-800AFC）を用いて同一蛍光強度となるように調製した。

図１〜３は、同一撮影条件写真（検出感度732）である。
フルオレセインナトリウム溶液（図１）、
PEI-FITC溶液（図２）、
FITC-I溶液（図３）。
図１〜３から、組織内が染色され、かつ、PEI-FITC、FITC-I、フルオレセインナトリウムの順で蛍光強度が高いのがわかる。

図４及び５は、各溶液毎に撮影条件変更した結果である。PEI-FITC溶液（図４）（検出感度432）、FITC-I溶液（図５）（検出感度627）。図４及び５より、PEI-FITCがFITC-Iに比べて蛍光濃度が高いことがわかる。

実施例５
PEI-FITC-Rhodamine溶液にホルマリン固定済み大腸切片を一分間浸漬し、１００mMNaPで洗った。共焦点顕微鏡で励起波長４８８nm、５４３nmにて観察を行った。
その結果、図６に示すように、FITCとRhodamineの二つともPEIに結合しており、異なる二つの色素で同じ領域が検出されていることが確認される。

実施例６
PEI-1800(和光純薬製,平均分子量1800, 100mg/mL)にインジゴカルミン溶液を加え、１０mg/mLとなるように調整した。同様にPEI-P70（和光純薬製,平均分子量70000,100mg/mL)をインジゴカルミンと混合し１０mg/mLになるように調整した。二つの調整溶液をホルマリンで固定したウサギの小腸の組織片に塗布し、室温２５℃において３分放置した後、その染色性及び浸透性を観察した。

PEI-1800とインジゴカルミンの混合物(以下、インジゴ−P1800)はPEI-P70とインジゴカルミンの混合物(以下、インジゴ−P70000)はいずれも組織表面が染色されていた。また、インジゴ−P1800はインジゴ−P70000に比べ組織への浸透性が良かった。

PEIのアミノ基とインジゴカルミンのSO₃ ^-が静電結合している状態のまま組織内部に浸透してゆき、組織を染色する。しかしPEIの分子量の差によって組織内部への浸透性は変化する。アルデヒド基はアミノ基とすぐに反応してシッフ塩基を形成する。そのため、共有結合的に結合し、組織は不可逆的に染色される。このとき組織への浸透性の低い大きな分子はホルマリンとの反応により組織表面で凝集してしまう。

インジゴカルミンは組織への吸着性の低い色素である。(非特許文献：J Pharmac Exp Ther,154,384-9,1966)水とインジゴカルミンを１０mg/mLとなるように調整したものを同様にウサギの小腸の組織片に塗布し、観察を行った。浸透性は良くなかったが、平均的に微弱に染色された。ホルマリン固定してある試料では、摘出直後の試料より染色されていた。

以上の実験で、PEIとインジゴカルミンを混合して得た染色剤はPEIの分子量が組織に浸透可能な大きさであるならば、インジゴカルミン単体よりも組織に浸透し且つ組織を強く染色することを示せた。

実施例７
フルオレセインイソチオシアネートをPEI-1800（和光純薬製、平均分子量1,800）、PEI-P70（和光純薬製、平均分子量70,000）とそれぞれ結合させた染色剤を作製した。作成方法は実施例１の方法によった。
マウスより摘出した小腸組織片の内腔側に、それぞれの染色剤を撒布して、２５℃下３分放置したのち、局方生理食塩水で過剰な色素を洗浄除去した。組織の染色の状態はライカ社製共焦点顕微鏡により観察した。

PEI-1800にフルオレセインを結合させた染色剤は、小腸上皮細胞の細胞膜及び核膜や核小体をよく染色していた。
PEI-P70と色素を結合させて調整した染色剤はPEI-1800の場合と比較すると、核の染色性は低く、組織内部の蛍光強度も弱かった。
小腸粘膜表面の上皮細胞の核は基底膜側に局在していて、粘膜表面より遠いところに位置している。PEI-1800に色素を結合させて得た染色剤が、PEI-P70よりも核の染色性に優れると言うことは、PEI-1800がより組織浸透性に優れていることを意味する。

フルオレセインナトリウムによるラット大腸の染色結果を示す図である。 PEI-FITCによるラット大腸の染色結果を示す図である。 FITC-Iによるラット大腸の染色結果を示す図である。 PEI-FITC（検出感度432）によるラット大腸の染色結果を示す図である。 FITC-I（検出感度627）によるラット大腸の染色結果を示す図である。 PEI-FITCとRhodamineによる共焦点顕微鏡による観察結果を示す図である。

Claims

色素分子がアミノ基を介して２個以上結合してなる細胞内浸透性高分子を含有する細胞又は組織内部染色剤組成物。
細胞内浸透性高分子が、アミノ基含有合成高分子である請求項１記載の細胞又は組織内部染色剤組成物。
色素分子が、可視色素及び蛍光色素から選ばれるものである請求項１又は２記載の細胞又は組織内部染色剤組成物。
色素分子が細胞内浸透性高分子に１０個以上結合しているものである請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞又は組織内部染色剤組成物。
請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物を用いることを特徴とする細胞又は組織内部の染色方法。