JP2735688B2 - 電気化学発光アッセイ - Google Patents
電気化学発光アッセイInfo
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- G01N21/66—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light electrically excited, e.g. electroluminescence
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、電気化学発光現象を測定するための方法、
当該方法を用いて被検体を検出するための方法、当該方
法において使用することができる試薬溶液、および当該
方法の実施に特に適した装置に関する。
当該方法を用いて被検体を検出するための方法、当該方
法において使用することができる試薬溶液、および当該
方法の実施に特に適した装置に関する。
電気化学発光現象を測定するための方法は、近年知ら
れるようになった。こうした方法は、特殊な金属複合体
が酸化によって励起状態に達することができることを利
用する。ここで金属複合体は励起状態から基底状態に崩
壊して電磁波を放射する。このような方法および好適な
金属複合体は、例えばWO 86/02734に記載されている。
れるようになった。こうした方法は、特殊な金属複合体
が酸化によって励起状態に達することができることを利
用する。ここで金属複合体は励起状態から基底状態に崩
壊して電磁波を放射する。このような方法および好適な
金属複合体は、例えばWO 86/02734に記載されている。
こうした技術は絶えず、さらに高度になっている。WO
90/05296において、酸化されると強力な還元剤となる
アミン、特にトリプロピルアミンが検査組成に添加され
る。電気化学反応は電解液の中で生じるが、ここにおい
て電気化学発光（ECL）部分、すなわち電磁波を放射す
ることができる金属複合体、およびアミンが酸化され
る。水溶液中の好適な電解質として、pH6−９、特に７
−7.5のリン酸バッファーに言及している。電磁波を増
加させるために、WO 90/05302は、界面活性剤Triton X
−100またはTriton N−401の上記検査組成への添加を提
案している。WO 90/05411は、ECLを測定するための改良
型装置を記述する。
90/05296において、酸化されると強力な還元剤となる
アミン、特にトリプロピルアミンが検査組成に添加され
る。電気化学反応は電解液の中で生じるが、ここにおい
て電気化学発光（ECL）部分、すなわち電磁波を放射す
ることができる金属複合体、およびアミンが酸化され
る。水溶液中の好適な電解質として、pH6−９、特に７
−7.5のリン酸バッファーに言及している。電磁波を増
加させるために、WO 90/05302は、界面活性剤Triton X
−100またはTriton N−401の上記検査組成への添加を提
案している。WO 90/05411は、ECLを測定するための改良
型装置を記述する。
さらに、被検体、被検体類似物、または被検体に特異
的な物質に電気化学発光標識を結合させることにより被
検体を検出するための技術を利用することが可能になっ
た。電気化学発光を利用して、存在する被検体の量を定
量した。通常利用される標識を電気化学発光標識に置き
換えたイムノアッセイについて特に言及している。
的な物質に電気化学発光標識を結合させることにより被
検体を検出するための技術を利用することが可能になっ
た。電気化学発光を利用して、存在する被検体の量を定
量した。通常利用される標識を電気化学発光標識に置き
換えたイムノアッセイについて特に言及している。
このような技術のさらなる改良および応用が、WO 87/
06706,WO 80/04392,WO 89/10552,wO 89/10551,WO 90/05
301,およびWO 90/11511に記載されている。こうした刊
行物の開示は、公知であるとみなされる。
06706,WO 80/04392,WO 89/10552,wO 89/10551,WO 90/05
301,およびWO 90/11511に記載されている。こうした刊
行物の開示は、公知であるとみなされる。
したがって、電気化学発光法を組み合わせて、特に被
検体検出の感度に関して上記の公知の方法を改良するこ
とが本発明の目的であった。
検体検出の感度に関して上記の公知の方法を改良するこ
とが本発明の目的であった。
本発明は、溶液中の、または溶液と接する固相におけ
る電気化学発光現象を測定する方法に関するが、ここで
電気化学発光は、一定温度の溶液および／または固相で
測定され、その温度は、溶液の凝固点よりは高いが、25
℃よりは低い。
る電気化学発光現象を測定する方法に関するが、ここで
電気化学発光は、一定温度の溶液および／または固相で
測定され、その温度は、溶液の凝固点よりは高いが、25
℃よりは低い。
さらに本発明は、作用電極に電圧をかけることにより
電気化学発光を生じさせ、そのことによって電気化学発
光現象を測定するための方法に関する。電気化学発光を
発生させる前に、Ag/AgCl参照電極に対して＋400から−
400mVの間の電位を作用電極にかける。
電気化学発光を生じさせ、そのことによって電気化学発
光現象を測定するための方法に関する。電気化学発光を
発生させる前に、Ag/AgCl参照電極に対して＋400から−
400mVの間の電位を作用電極にかける。
また、本発明は、作用電極に電圧をかけることにより
電気化学発光を生じさせ、そのことによって電気化学発
光現象を測定するための方法に関する。電気化学発光シ
ステムの酸化還元電位と＋800mVの間の電圧をかけるこ
とによって、電気化学発光が生じる。
電気化学発光を生じさせ、そのことによって電気化学発
光現象を測定するための方法に関する。電気化学発光シ
ステムの酸化還元電位と＋800mVの間の電圧をかけるこ
とによって、電気化学発光が生じる。
さらに本発明は、溶液中の、または溶液と接する固相
における電気化学発光現象を測定する方法に関するが、
ここで溶液は、Thesit,C14−E09,Genapol,C8−E09,プラ
ンタレン（Plantaren）（商標）およびオクチルグルコ
シド、またはそれらの混合物からなる一群から選択され
る界面活性剤を含む。
における電気化学発光現象を測定する方法に関するが、
ここで溶液は、Thesit,C14−E09,Genapol,C8−E09,プラ
ンタレン（Plantaren）（商標）およびオクチルグルコ
シド、またはそれらの混合物からなる一群から選択され
る界面活性剤を含む。
さらに本発明は、上記方法、適合する試薬、および最
初に述べた方法を実施するための装置によって被検体を
検出するための方法に関する。
初に述べた方法を実施するための装置によって被検体を
検出するための方法に関する。
本発明は上記先行技術に基づく教示に関する。電気化
学発光法の基本原理は、このような先行技術の文書に非
常に詳細に記載されている。電気化学発光を測定するた
めの機器は、試薬溶液の容器のついた測定ユニット、測
定時に試薬溶液と接触する少なくとも二つの電極（作用
電極および対電極）、および電気化学発光過程で発生す
る光を測定するための検出器を含んでなる。通常、最初
に溶液に初期電圧（前分極）をかける。この電圧を、溶
液中に含まれる例えばアミンのような物質の酸化還元電
位を越えて上昇させる。こうして酸化された物質は、例
えば特定のルテニウム複合体のような電気化学発光を生
じることができる物質を励起し、光を放射する。一定時
間内に検出器に受容される光の総量が、電気化学発光物
質の総量の存在に関する尺度となる。電気化学発光物質
が、例えばイムノアッセイにおいて、被検体、被検体類
似物、または被検体に特異的な物質の標識であるなら
ば、受容された光は被検体の存在の尺度となる。
学発光法の基本原理は、このような先行技術の文書に非
常に詳細に記載されている。電気化学発光を測定するた
めの機器は、試薬溶液の容器のついた測定ユニット、測
定時に試薬溶液と接触する少なくとも二つの電極（作用
電極および対電極）、および電気化学発光過程で発生す
る光を測定するための検出器を含んでなる。通常、最初
に溶液に初期電圧（前分極）をかける。この電圧を、溶
液中に含まれる例えばアミンのような物質の酸化還元電
位を越えて上昇させる。こうして酸化された物質は、例
えば特定のルテニウム複合体のような電気化学発光を生
じることができる物質を励起し、光を放射する。一定時
間内に検出器に受容される光の総量が、電気化学発光物
質の総量の存在に関する尺度となる。電気化学発光物質
が、例えばイムノアッセイにおいて、被検体、被検体類
似物、または被検体に特異的な物質の標識であるなら
ば、受容された光は被検体の存在の尺度となる。
現在公知の電気化学発光法は28℃またはそれ以上の温
度で行なわれるが、新しい知見では、温度を低下させて
ランプ波電圧を用いると、一定時間単位ではシグナル強
度が減少するが、驚くべきことに感度が相当に上昇する
ことが明らかになった。この改善は、例えばECL複合体
と電極との非特異的結合がかなり減少した結果と考えら
れる。10℃では非特異的結合の量は、該薬溶液に由来す
るバックグラウンドの総量から区別することはもはやで
きない。望ましい温度範囲は５から20℃の間であり、特
に望ましい温度は９から11℃の間であることが明らかに
なった。試薬溶液を測定ユニットと接触させる前にこの
溶液を冷却すること、および／または試薬溶液を測定ユ
ニット内で全体として冷却することによって、上記のよ
うな温度が達成される。
度で行なわれるが、新しい知見では、温度を低下させて
ランプ波電圧を用いると、一定時間単位ではシグナル強
度が減少するが、驚くべきことに感度が相当に上昇する
ことが明らかになった。この改善は、例えばECL複合体
と電極との非特異的結合がかなり減少した結果と考えら
れる。10℃では非特異的結合の量は、該薬溶液に由来す
るバックグラウンドの総量から区別することはもはやで
きない。望ましい温度範囲は５から20℃の間であり、特
に望ましい温度は９から11℃の間であることが明らかに
なった。試薬溶液を測定ユニットと接触させる前にこの
溶液を冷却すること、および／または試薬溶液を測定ユ
ニット内で全体として冷却することによって、上記のよ
うな温度が達成される。
さらに、作用電極にかける最終電圧（Ag/AgClと比較
して）の限度を、酸化され得る物質の酸化還元電位と2.
0Vとの間の最大値までとすることが有利であることが判
明した。1.2から1.7Vの間の電圧が特に望ましい。さら
に望ましい電圧は1.6Vである。これらの値は白金電極を
使用する場合に適用される。
して）の限度を、酸化され得る物質の酸化還元電位と2.
0Vとの間の最大値までとすることが有利であることが判
明した。1.2から1.7Vの間の電圧が特に望ましい。さら
に望ましい電圧は1.6Vである。これらの値は白金電極を
使用する場合に適用される。
測定ユニットに矩形波電圧をかけることによって、感
度をさらに向上させることができる。これは初期電圧が
ただちに（最大でも0.4秒以内に）最終電圧値に上昇す
ることを意味する。励起時間の間、この電圧はほぼ一定
に保たれる。励起時間後、この電圧は系の酸化還元電位
以下の値にただちに低下する。さらに、このような測定
法は、測定のダイナミックレンジ、すなわち一定のイム
ノアッセイで測定可能な被検体濃度の範囲、も改善す
る。低温を使用する場合には、矩形波電圧が、高温につ
いては延長される励起時間の間、維持されなければなら
ない（矩形波電圧が、励起時間の間、維持されなければ
ならない。この励起時間は高温については延長され
る）。経験により、電圧をかけた後約５秒までに測定さ
れる強度がシグナル発生にかなり寄与することが明らか
になった。
度をさらに向上させることができる。これは初期電圧が
ただちに（最大でも0.4秒以内に）最終電圧値に上昇す
ることを意味する。励起時間の間、この電圧はほぼ一定
に保たれる。励起時間後、この電圧は系の酸化還元電位
以下の値にただちに低下する。さらに、このような測定
法は、測定のダイナミックレンジ、すなわち一定のイム
ノアッセイで測定可能な被検体濃度の範囲、も改善す
る。低温を使用する場合には、矩形波電圧が、高温につ
いては延長される励起時間の間、維持されなければなら
ない（矩形波電圧が、励起時間の間、維持されなければ
ならない。この励起時間は高温については延長され
る）。経験により、電圧をかけた後約５秒までに測定さ
れる強度がシグナル発生にかなり寄与することが明らか
になった。
電気化学発光測定時の測定ユニットに含有される試薬
溶液が、0.1mmo/lから0.5mol/lまでの濃度の塩化アルカ
リを含有するならば、上記の方法を単独で使用する場合
も相互に組み合わせて使用する場合にも、感度または被
検体の検出下限を改善することができる。塩化アルカリ
としては塩化ナトリウムが望ましい。塩化ナトリウムの
特に望ましい濃度は、0.05mol/lから0.45mol/lであり、
0.35mol/lが特に望ましい。さらに、経験により、本発
明にしたがって塩化ナトリウムを使用すると、測定時間
が短縮されること明らかになった。また、セル内の電流
は増加する。
溶液が、0.1mmo/lから0.5mol/lまでの濃度の塩化アルカ
リを含有するならば、上記の方法を単独で使用する場合
も相互に組み合わせて使用する場合にも、感度または被
検体の検出下限を改善することができる。塩化アルカリ
としては塩化ナトリウムが望ましい。塩化ナトリウムの
特に望ましい濃度は、0.05mol/lから0.45mol/lであり、
0.35mol/lが特に望ましい。さらに、経験により、本発
明にしたがって塩化ナトリウムを使用すると、測定時間
が短縮されること明らかになった。また、セル内の電流
は増加する。
驚くべきことに、電気化学発光を開始する前に、Ag/A
gCl電極に対して＋400から−400mVの間の初期電圧を作
用電極にかけることによって、やはりシグナルを増加さ
せることができた。望ましい値の範囲は＋50mVから−50
mVの間の範囲であり、0mVが特に望ましい。これらの値
は白金電極を使用するときに適用される。他の材質の電
極に関する電位は、容易に算出することができる。
gCl電極に対して＋400から−400mVの間の初期電圧を作
用電極にかけることによって、やはりシグナルを増加さ
せることができた。望ましい値の範囲は＋50mVから−50
mVの間の範囲であり、0mVが特に望ましい。これらの値
は白金電極を使用するときに適用される。他の材質の電
極に関する電位は、容易に算出することができる。
さらに、pHを6.8から9.0の間、特に7.0から8.0の間、
さらに望ましくは7.25から7.5の間の値に調整すること
によって、やはりシグナルを増加させることができる。
これは、常法によりこの範囲に適したpHバッファーを使
用することによって達成される。
さらに望ましくは7.25から7.5の間の値に調整すること
によって、やはりシグナルを増加させることができる。
これは、常法によりこの範囲に適したpHバッファーを使
用することによって達成される。
経験により、通常、界面活性剤Tween20と組み合わせ
て使用され、WO 90/05302により公知の、一般に使用さ
れる界面活性剤、Triton X−100が、最良の結果をもた
らさないことが明らかになった。一方では、Tritonn X
−100は難分解性であって、したがって環境にとって有
益でない。他方では、驚くべきことに、Triton X−100
以外の特定の界面活性剤がECL法を改善することが経験
から明らかになった。このような特定の界面活性剤は、
シグナル発生を増加させ、シグナル／ノイズ比を改善
し、それによってより高い検出感度を達成し、検出下限
を低下させ、最終的によりよい精度を達成するために使
用される。
て使用され、WO 90/05302により公知の、一般に使用さ
れる界面活性剤、Triton X−100が、最良の結果をもた
らさないことが明らかになった。一方では、Tritonn X
−100は難分解性であって、したがって環境にとって有
益でない。他方では、驚くべきことに、Triton X−100
以外の特定の界面活性剤がECL法を改善することが経験
から明らかになった。このような特定の界面活性剤は、
シグナル発生を増加させ、シグナル／ノイズ比を改善
し、それによってより高い検出感度を達成し、検出下限
を低下させ、最終的によりよい精度を達成するために使
用される。
好適な界面活性剤は、例えばPolidocanol（ドデシル
ポリ−（エチレングリコールエーテル）ｎ）、C14−E09
（ポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ）、Genapol
（イントリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）
ｎ）、C8−E09（オクチルアルコールポリ（エチレング
リコールエーテル）ｎ）、ならびにplantaren（商標）
（アルキルポリグリコシド）およびオクチルグルコシド
（オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド）またはそ
れらの混合物、を包含する脂肪アルコールエトキシレー
トからなる一群から選択される。界面活性剤は、0.001
から0.1％までの範囲の濃度で用いられる。最適濃度
は、それぞれの界面活性剤について容易に決定すること
ができる。最も適した濃度は、0.1から0.5％までの範囲
の濃度である。
ポリ−（エチレングリコールエーテル）ｎ）、C14−E09
（ポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ）、Genapol
（イントリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）
ｎ）、C8−E09（オクチルアルコールポリ（エチレング
リコールエーテル）ｎ）、ならびにplantaren（商標）
（アルキルポリグリコシド）およびオクチルグルコシド
（オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド）またはそ
れらの混合物、を包含する脂肪アルコールエトキシレー
トからなる一群から選択される。界面活性剤は、0.001
から0.1％までの範囲の濃度で用いられる。最適濃度
は、それぞれの界面活性剤について容易に決定すること
ができる。最も適した濃度は、0.1から0.5％までの範囲
の濃度である。
５−10mM濃度のアジ化ナトリウムがこの試験組成にお
いて防腐剤として通常使用される。この環境に有害な薬
剤を、アジドよりはるかに環境によいbiobanまたはoxab
anによって置き換えることができることが経験から明ら
かになった。驚くべきことに、これらの安定化剤はECL
法に関して別の利点、すなわち測定シグナルの増加、を
示す。Oxabanおよびbiobanは0.01から１％までの濃度で
使用され、0.1から0.5％までが望ましい。
いて防腐剤として通常使用される。この環境に有害な薬
剤を、アジドよりはるかに環境によいbiobanまたはoxab
anによって置き換えることができることが経験から明ら
かになった。驚くべきことに、これらの安定化剤はECL
法に関して別の利点、すなわち測定シグナルの増加、を
示す。Oxabanおよびbiobanは0.01から１％までの濃度で
使用され、0.1から0.5％までが望ましい。
前記の測定はそれ自体、公知の方法を有意に改善す
る。さらに、これらの測定法を組み合わせることによっ
て、被検体検出アッセイの感度および／またはダイナミ
ックレンジをさらに有意に高めることができる。
る。さらに、これらの測定法を組み合わせることによっ
て、被検体検出アッセイの感度および／またはダイナミ
ックレンジをさらに有意に高めることができる。
例えば、減圧下で試薬からガスを抜く（例えば＜50mb
ar、２−４時間、室温）ことによって、酸素を除去する
ことにより、検出限界をさらに減少させることができ
る。
ar、２−４時間、室温）ことによって、酸素を除去する
ことにより、検出限界をさらに減少させることができ
る。
例えばサンドイッチ法または競合法によりイムノアッ
セイにおける被検体の検出感度が向上すれば、用いる方
法または装置をさらに簡略化することができる。例え
ば、検出器としてフォトダイオードを使用すること、検
量システムを簡略化すること、シグナルの増加によって
測定時間が減少するので単位時間当り処理される検査数
を増加させること、または試料の量を減らすことが可能
である。
セイにおける被検体の検出感度が向上すれば、用いる方
法または装置をさらに簡略化することができる。例え
ば、検出器としてフォトダイオードを使用すること、検
量システムを簡略化すること、シグナルの増加によって
測定時間が減少するので単位時間当り処理される検査数
を増加させること、または試料の量を減らすことが可能
である。
本発明はさらに、電気化学現象を測定し、特に被検体
を検出するための試薬溶液に関するが、この試薬溶液は
電気化学的に酸化されうるアミンを含んでなり、これは
酸化されるときに強力な還元剤である。溶液は塩化アル
カリを0.1mmol/lから0.5mol/lまでの濃度で含有し、ま
たは7.0から8.0の間のpHを示す。さらに、この溶液は脂
肪アルコールエトキシレート、プランタレン、およびオ
クチルグルコシドまたはそれらの混合物からなる一群か
ら選択される界面活性剤を含有する。
を検出するための試薬溶液に関するが、この試薬溶液は
電気化学的に酸化されうるアミンを含んでなり、これは
酸化されるときに強力な還元剤である。溶液は塩化アル
カリを0.1mmol/lから0.5mol/lまでの濃度で含有し、ま
たは7.0から8.0の間のpHを示す。さらに、この溶液は脂
肪アルコールエトキシレート、プランタレン、およびオ
クチルグルコシドまたはそれらの混合物からなる一群か
ら選択される界面活性剤を含有する。
試薬溶液のための望ましい防腐剤は、biobanまたはox
abanである。
abanである。
電気化学発光による検出を行なう装置は、例えばWO 9
0/05302の実施例１に非常に詳細に記載される。さら
に、こうした装置は、測定ユニットおよび／または液体
容器を０から25℃までの温度に冷却するための手段を含
んでなる。測定ユニットは、その中で電気化学発光が測
定されるセルであると考えられる。液体容器は保存容器
であるが、フィード装置でもある；例えば、試薬溶液の
チューブは測定中は測定ユニットの中である。
0/05302の実施例１に非常に詳細に記載される。さら
に、こうした装置は、測定ユニットおよび／または液体
容器を０から25℃までの温度に冷却するための手段を含
んでなる。測定ユニットは、その中で電気化学発光が測
定されるセルであると考えられる。液体容器は保存容器
であるが、フィード装置でもある；例えば、試薬溶液の
チューブは測定中は測定ユニットの中である。
本発明は、また、電気化学発光標識を用いて被検体を
検出するための方法に関するが、ここにおいて、電気化
学発光現象を測定するための上記方法のうちの一つが利
用される。
検出するための方法に関するが、ここにおいて、電気化
学発光現象を測定するための上記方法のうちの一つが利
用される。
以下の実施例は、本発明をさらに説明することを意図
するものである。
するものである。
実施例１ 電気化学発光法を応用したTSHの定量 甲状腺刺激ホルモン（TSH）をサンドイッチイムアッ
セイで定量した。使用した装置は、やはり測定セル内に
永久磁石を含有するWO 90/05302の実施例１に記載され
たのと同様の装置とした（IGEN（Rockville,USA）製Ori
gen 1.0またはMagnalyser（商標））。また、同様に、
光電子増倍管、ポテンシオスタット、電気化学フロース
ルーセル、液体移動剤、および50チューブ試料ローター
を含んでなる機器を用いた。検出反応のために以下の物
質を混合した。
セイで定量した。使用した装置は、やはり測定セル内に
永久磁石を含有するWO 90/05302の実施例１に記載され
たのと同様の装置とした（IGEN（Rockville,USA）製Ori
gen 1.0またはMagnalyser（商標））。また、同様に、
光電子増倍管、ポテンシオスタット、電気化学フロース
ルーセル、液体移動剤、および50チューブ試料ローター
を含んでなる機器を用いた。検出反応のために以下の物
質を混合した。
インキュベーションバッファー、50μｌ（6.06g/l Tris
−HCl.1g/1クロロアセトアミド,0.1g/l メチルイソチ
アゾロン、pH8.0,50g/lウシ血清アルブミン、10g/1R−I
gGを含有する）ストレプトアビジン−被覆磁粉（Dynal,
2.8μｍ）／インキュベーションバッファー、600μg/m
l、40μｌ DSS（ジスクシニルスベレート）でビチオン化されたTSH
に対する単クローン性抗体（MAB）／インキュベーショ
ンバッファー、3.0μg/ml、40μｌ TAG:TSHに対するMABにDSSとともに結合した（Tris）
（2,2′−ジピリジル）塩化ルテニウム６水和物／イン
キュベーションバッファー、1.2μg/ml、40μｌ 試料液または標準、50μｌ 再懸濁液（試薬溶液（BMG1）の添加、100μｌ ストレプトアビジン−被覆磁粉は、Deutsche Dynal G
mbHから購入した（Dynabeads M−280 Streptavidin）。
−HCl.1g/1クロロアセトアミド,0.1g/l メチルイソチ
アゾロン、pH8.0,50g/lウシ血清アルブミン、10g/1R−I
gGを含有する）ストレプトアビジン−被覆磁粉（Dynal,
2.8μｍ）／インキュベーションバッファー、600μg/m
l、40μｌ DSS（ジスクシニルスベレート）でビチオン化されたTSH
に対する単クローン性抗体（MAB）／インキュベーショ
ンバッファー、3.0μg/ml、40μｌ TAG:TSHに対するMABにDSSとともに結合した（Tris）
（2,2′−ジピリジル）塩化ルテニウム６水和物／イン
キュベーションバッファー、1.2μg/ml、40μｌ 試料液または標準、50μｌ 再懸濁液（試薬溶液（BMG1）の添加、100μｌ ストレプトアビジン−被覆磁粉は、Deutsche Dynal G
mbHから購入した（Dynabeads M−280 Streptavidin）。
上記混合物を室温（21℃）で16分間インキュベートし
た後、室温においた測定セルに移した。移動した粒子を
試薬溶液BMG1で洗浄し、BMG1において測定した。
た後、室温においた測定セルに移した。移動した粒子を
試薬溶液BMG1で洗浄し、BMG1において測定した。
BMG1は以下の組成を有する： 試薬 PH7.5 g/l KH2PO4 ＊2H2O 27.19 H3PO4 − Polidocanol 1.0 Oxaban A 1.0 TPA（トリプロピルアミン） 14.33 KOH 3.6 この実施例については、ランプ波電圧を用いた場合の
シグナル回収率と標準曲線に関するセル温度の影響を示
すためにTSHイムノアッセイを用いた。
シグナル回収率と標準曲線に関するセル温度の影響を示
すためにTSHイムノアッセイを用いた。
標準曲線へのセル温度の影響を第１図に示す。検出さ
れた化学発光を、μU/mlで与えられる異なる濃度のTSH
を有する５標準ａ−ｅの濃度に対してプロットする。ラ
ンプ波電圧をかけたとき、温度が低いほど光の放射量が
増加することは明白である。
れた化学発光を、μU/mlで与えられる異なる濃度のTSH
を有する５標準ａ−ｅの濃度に対してプロットする。ラ
ンプ波電圧をかけたとき、温度が低いほど光の放射量が
増加することは明白である。
実施例２ 実施例１にしたがって、バッファー（BMGl）において
標準ｅのTSH濃度で、TSH定量への温度の影響を10から42
℃までの様々な温度について測定した。いわゆるランプ
波電圧を用いたが、ここにおいて、565mVの電位（初期
電圧）を１秒間にわたって3Vまで上昇させ、次に同様に
して1Vにまで低下させた。結果を第２図にまとめる。明
らかに、ランプ波電圧をかけると、シグナル強度は42か
ら21℃に向かって増加し、10℃では再び減少する。
標準ｅのTSH濃度で、TSH定量への温度の影響を10から42
℃までの様々な温度について測定した。いわゆるランプ
波電圧を用いたが、ここにおいて、565mVの電位（初期
電圧）を１秒間にわたって3Vまで上昇させ、次に同様に
して1Vにまで低下させた。結果を第２図にまとめる。明
らかに、ランプ波電圧をかけると、シグナル強度は42か
ら21℃に向かって増加し、10℃では再び減少する。
実施例３ 試験特異的なバックグラウンドシグナル、すなわちビ
オチン化抗体が存在しなくてもTAG−被検体複合体だけ
によって生じるシグナルへの影響を、10℃および28℃で
バッファーBMG1において測定した。実施例２で述べたラ
ンプ波電圧をかけた。結果を第３図にまとめる。試験特
異的な、TAG−被検体複合体の非特異的結合を温度の低
下にともなって減少することが明かである。
オチン化抗体が存在しなくてもTAG−被検体複合体だけ
によって生じるシグナルへの影響を、10℃および28℃で
バッファーBMG1において測定した。実施例２で述べたラ
ンプ波電圧をかけた。結果を第３図にまとめる。試験特
異的な、TAG−被検体複合体の非特異的結合を温度の低
下にともなって減少することが明かである。
実施例４ 実施例１にしたがって、標準ｅの濃度およびバッファ
ーBMG1でTSHを定量するために、検出される光の総量の
時間間隔を10℃で565mvで始まる矩形波電圧をかけて測
定した。結果を第４図にまとめる。放射強度の大部分は
時間範囲の比較的遅い時点で測定する必要があることが
明らかである。0.8秒後に測定された強度を測定するこ
とは不可能であった、または研究者がそのことをしない
でおいたと考えられる。
ーBMG1でTSHを定量するために、検出される光の総量の
時間間隔を10℃で565mvで始まる矩形波電圧をかけて測
定した。結果を第４図にまとめる。放射強度の大部分は
時間範囲の比較的遅い時点で測定する必要があることが
明らかである。0.8秒後に測定された強度を測定するこ
とは不可能であった、または研究者がそのことをしない
でおいたと考えられる。
ランプ波電圧の代わりに矩形波電圧を用いた場合、TS
Hの検出限界は0.03mIU/mlから0.006mIU/mlに低下させる
ことができた。ダイナミックレンジは55から104まで改
善された。この率は、最低濃度（ａ）の標準のシグナル
強度に対する最高濃度（ｅ）の標準のシグナル強度に相
当する。
Hの検出限界は0.03mIU/mlから0.006mIU/mlに低下させる
ことができた。ダイナミックレンジは55から104まで改
善された。この率は、最低濃度（ａ）の標準のシグナル
強度に対する最高濃度（ｅ）の標準のシグナル強度に相
当する。
実施例５ 一連の実験において、電気化学発光を生じるために加
える最終電圧の大きさのシグナル強度への影響を調べた
（矩形波電圧）。結果を第5a図に示す。1.6から2.0Vの
間の電圧でよい結果が得られた。最適な電圧は1.6Vであ
った。
える最終電圧の大きさのシグナル強度への影響を調べた
（矩形波電圧）。結果を第5a図に示す。1.6から2.0Vの
間の電圧でよい結果が得られた。最適な電圧は1.6Vであ
った。
第5b図は、第5a図のシグナル曲線として表示された磁
粉（HP）のシグナル振幅を示す。バックグラウンドシグ
ナル（ab）および磁粉のシグナル振幅のバックグラウン
ドに対する比（HP/ab）も示す。使用すべき電圧を選択
するために欠かせないファクターは、シグナル／ノイズ
比、すなわちHP/abである。第５図はその最大値が1.6V
で得られることを示す。
粉（HP）のシグナル振幅を示す。バックグラウンドシグ
ナル（ab）および磁粉のシグナル振幅のバックグラウン
ドに対する比（HP/ab）も示す。使用すべき電圧を選択
するために欠かせないファクターは、シグナル／ノイズ
比、すなわちHP/abである。第５図はその最大値が1.6V
で得られることを示す。
測定は、次のようにして電気化学発光標識をつけた磁
粉の懸濁液で行なわれた。
粉の懸濁液で行なわれた。
ストレプトアビジン被覆磁粉（Dynal,直径2.8μｍ）
を、ルテニウム−ビス−ピリジル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（IGEN,データは製造業者から提供
された）で標識された、T4に対するビオチン化ポリクロ
ーナル抗体複合体とともに、バッファー（50mM HEPES p
H7.4;3％サッカロース;2％ウシ血清アルブミン;0.01％
メチルイソチアゾロン;0.1％ Oxypyrion（商標））中
で、１時間、21℃でローラー撹拌装置内でインキュベー
トした。その磁粉を標識していないDynal磁粉で希釈し
て、ECL測定装置（Magnalyser,IGEN）で50,000ユニット
を示す濃度とした。磁粉は使用するまで凍結乾燥の形で
保存された。使用前に、磁粉を4mlバッファー（BMG1）
に懸濁して、600μg/lの濃度とした。懸濁液の50μｌ分
の磁粉を500μｌバッファー（BMG1）とともにMagnalyse
r試験管にいれ、測定した。
を、ルテニウム−ビス−ピリジル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（IGEN,データは製造業者から提供
された）で標識された、T4に対するビオチン化ポリクロ
ーナル抗体複合体とともに、バッファー（50mM HEPES p
H7.4;3％サッカロース;2％ウシ血清アルブミン;0.01％
メチルイソチアゾロン;0.1％ Oxypyrion（商標））中
で、１時間、21℃でローラー撹拌装置内でインキュベー
トした。その磁粉を標識していないDynal磁粉で希釈し
て、ECL測定装置（Magnalyser,IGEN）で50,000ユニット
を示す濃度とした。磁粉は使用するまで凍結乾燥の形で
保存された。使用前に、磁粉を4mlバッファー（BMG1）
に懸濁して、600μg/lの濃度とした。懸濁液の50μｌ分
の磁粉を500μｌバッファー（BMG1）とともにMagnalyse
r試験管にいれ、測定した。
実施例６ 電気化学発光（ECL）強度へのハロゲン化アルカリ濃度
の影響 一連の実験において、塩化ナトリウム／塩化カリウム
濃度のECLシグナルへの影響を調べるために、実施例１
に従ったTSH試験を利用した。本実験では、TSH標準ｅを
用いた。1.6Vの矩形波電圧をかけた。初期電圧は565mV
であった。用いたバッファーはBMG1である。温度は10℃
に調整した。
の影響 一連の実験において、塩化ナトリウム／塩化カリウム
濃度のECLシグナルへの影響を調べるために、実施例１
に従ったTSH試験を利用した。本実験では、TSH標準ｅを
用いた。1.6Vの矩形波電圧をかけた。初期電圧は565mV
であった。用いたバッファーはBMG1である。温度は10℃
に調整した。
塩化ナトリウム無しでの試験結果は非常に不十分であ
ったが、0.1mol/lおよび0.25mol/l濃度での積算は、明
らかに増加している。これほど明白ではないが同様のシ
グナルの相違が塩化カリウムについても得られた。
ったが、0.1mol/lおよび0.25mol/l濃度での積算は、明
らかに増加している。これほど明白ではないが同様のシ
グナルの相違が塩化カリウムについても得られた。
結果を第６図にまとめる。
実施例７ 一連の実験において、TAG−標識Dynal磁粉についてBM
G1バッファーを用いて10℃で、初期電圧（作用電極の前
分極）の影響を調べた。用いたECL電圧は1.6Vとした
（矩形波）。第７図から、ECL強度は、初期電圧がAg/Ag
Clに対して0mVに近づくとき、最大になる傾向があるこ
とが明かである。
G1バッファーを用いて10℃で、初期電圧（作用電極の前
分極）の影響を調べた。用いたECL電圧は1.6Vとした
（矩形波）。第７図から、ECL強度は、初期電圧がAg/Ag
Clに対して0mVに近づくとき、最大になる傾向があるこ
とが明かである。
実施例８ 試薬溶液のpHの影響を、実施例１の標準ｅでのTSH試
験で調べた。試験には以下のパラメータを用いた： 矩形波電圧 1.6V（最大） 初期電圧 565mV 温度 10℃ pH6.8または先行技術の文書に記載されたバッファー
とは対照的に、pH7.5では測定時のシグナル強度は有意
に増加することが実施例から明らかになった。
験で調べた。試験には以下のパラメータを用いた： 矩形波電圧 1.6V（最大） 初期電圧 565mV 温度 10℃ pH6.8または先行技術の文書に記載されたバッファー
とは対照的に、pH7.5では測定時のシグナル強度は有意
に増加することが実施例から明らかになった。
バッファーBMG2は以下の組成を有する： 試薬 pH6.8 g/l KH2PO4 ＊2H2O − H3PO4 16.4 Polidocanol 1.0 Oxaban A 1.0 TPA（トリプロピルアミン） 22.93 KOH 5.7 結果を第８図にまとめる。積算強度は以下の通りであ
る:pH6.8:112000;pH7.5:399000 実施例９ この実施例の実験は、実施例１のTSH試験に基づいて
行なわれた。この実験から、本発明の測定を組み合わせ
ることによって、比較的初期にECLシグナルを相当増加
させることができることが明らかになった。グラフに示
す５本の曲線は、10℃で、1.6Vの電気化学発光電圧（矩
形波電圧）で測定された。
る:pH6.8:112000;pH7.5:399000 実施例９ この実施例の実験は、実施例１のTSH試験に基づいて
行なわれた。この実験から、本発明の測定を組み合わせ
ることによって、比較的初期にECLシグナルを相当増加
させることができることが明らかになった。グラフに示
す５本の曲線は、10℃で、1.6Vの電気化学発光電圧（矩
形波電圧）で測定された。
曲線1:BMG2,pH6.8,初期電圧565mV 曲線2:BMG1,pH7.5,初期電圧565mV 曲線3:BMG2,pH7.5,初期電圧565mV 曲線4:BMG2,pH7.5,初期電圧0mV 曲線5:BMG2,pH7.5,0.25MNaCl、初期電圧0mV 実験結果を第９図にまとめる。
実施例10 第10図は、実施例１にしたがった10℃でのTSH定量に
関する標準曲線を示す。曲線１はランプ波電圧を用いた
ときの標準曲線を示すが（図２）、曲線２は最適なpH、
イオン強度および前分極条件を組み合わせて矩形波電圧
を用いた場合の標準曲線を示す。このことは、低温を使
用したとき、矩形波電圧を加えることによってシグナル
強度を増加させることができることを示す。
関する標準曲線を示す。曲線１はランプ波電圧を用いた
ときの標準曲線を示すが（図２）、曲線２は最適なpH、
イオン強度および前分極条件を組み合わせて矩形波電圧
を用いた場合の標準曲線を示す。このことは、低温を使
用したとき、矩形波電圧を加えることによってシグナル
強度を増加させることができることを示す。
TSH検出限界は、測定を組み合わせることによって、
約0.0028μIU/mlにまで低下させることができた。ダイ
ナミックレンジは、約280に向上した（標準e/標準
ａ）。
約0.0028μIU/mlにまで低下させることができた。ダイ
ナミックレンジは、約280に向上した（標準e/標準
ａ）。
実施例11 次の実験によって、本発明で得られた効果が他の被検
体についても適用可能であることを確認した。第11図
は、先行技術の条件（ランプ波）下、および本発明の条
件（10℃、矩形波電圧1.6V）での、エストラジオール
（E2）定量のための標準曲線である。感度（検出下限）
を20倍高めることができた（約1.5pg/mlに低下）。
体についても適用可能であることを確認した。第11図
は、先行技術の条件（ランプ波）下、および本発明の条
件（10℃、矩形波電圧1.6V）での、エストラジオール
（E2）定量のための標準曲線である。感度（検出下限）
を20倍高めることができた（約1.5pg/mlに低下）。
E2検出のために以下の成分を合わせてインキュベート
した。
した。
第１段階： 25μｌバッファーBMG1 50μlE2に対するビオチン化（DSS）多クローン性抗体
（FAB′）溶液 50μｌ試料または標準（0.1％、0.3％ウシ血清アルブミ
ン含有） 50mg/mlジヒドロキシテストステロン 次に溶液を15分間インキュベートした。
（FAB′）溶液 50μｌ試料または標準（0.1％、0.3％ウシ血清アルブミ
ン含有） 50mg/mlジヒドロキシテストステロン 次に溶液を15分間インキュベートした。
第２段階： 25μｌバッファーBMG1 50μｌ実施例１の磁粉溶液 50μlTAG溶液： 300mg/ml、IGENによるRu（bpy）3 2+−NHSエステルで
標識されたFABフラグメント を添加した。
標識されたFABフラグメント を添加した。
溶液を15分間インキュベートした。次にこの溶液の10
0μｌをBMG1に添加して、懸濁液をMagnalyserに移し、
固定化された磁粉を1500μlBMG1で洗浄し、以下の標準
についてBMG1中で測定した。
0μｌをBMG1に添加して、懸濁液をMagnalyserに移し、
固定化された磁粉を1500μlBMG1で洗浄し、以下の標準
についてBMG1中で測定した。
ａ 0pg/ml ｂ 72pg/ml ｃ 229pg/ml ｄ 529pg/ml ｅ 1709pg/ml ｆ 5032pg/ml 実施例12 本発明にしたがって使用される界面活性剤の単独の影
響を以下の一連の実験で判定した。個々の試験パラメー
ター、すなわち測定すべき被検体、とは独立にシグナル
発生への界面活性剤の影響を判定するために、ビオチン
化またはルテニル化抗体を結合させたストレプトアビジ
ン被覆磁粉を用いた（HSAP;"ホットストレプトアビジン
粒子）。
響を以下の一連の実験で判定した。個々の試験パラメー
ター、すなわち測定すべき被検体、とは独立にシグナル
発生への界面活性剤の影響を判定するために、ビオチン
化またはルテニル化抗体を結合させたストレプトアビジ
ン被覆磁粉を用いた（HSAP;"ホットストレプトアビジン
粒子）。
以下の物質を試薬チューブ内で混合し分析を行なっ
た： HSAP（凍結乾燥HSAPをTris/polidocanolバッファー（10
0mM;0.1％）pH9.0に溶解し、600μg/mlの作用溶液）、5
0μｌ PBSバッファー（50mMKH2PO4バッファー;100mMNaCl;0.1
％BSA;PH7.0）、200μｌ 試薬溶液（200mMKH2PO4バッファー;100mMTPA;pH7.5;試
験する各試薬について） この混合物をピペットで測定チューブに入れた後、測
定セルに移した。HSAPをバッファー（AB）で洗浄し、シ
グナル放射量を上記バッファー中で測定した。
た： HSAP（凍結乾燥HSAPをTris/polidocanolバッファー（10
0mM;0.1％）pH9.0に溶解し、600μg/mlの作用溶液）、5
0μｌ PBSバッファー（50mMKH2PO4バッファー;100mMNaCl;0.1
％BSA;PH7.0）、200μｌ 試薬溶液（200mMKH2PO4バッファー;100mMTPA;pH7.5;試
験する各試薬について） この混合物をピペットで測定チューブに入れた後、測
定セルに移した。HSAPをバッファー（AB）で洗浄し、シ
グナル放射量を上記バッファー中で測定した。
用いた抗体は、ビオチン−DDS（ビオチニル−アミノ
−3,6−ジオキサオクタノイル−アミノカルボニル−ヘ
プタン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）に
よってビオチン化された。（Tris）（2,2′−ビピリジ
ル）塩化ルテニウム６水和物をDSS（ジスクシニルスベ
レート）を用いて抗体に結合した。
−3,6−ジオキサオクタノイル−アミノカルボニル−ヘ
プタン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）に
よってビオチン化された。（Tris）（2,2′−ビピリジ
ル）塩化ルテニウム６水和物をDSS（ジスクシニルスベ
レート）を用いて抗体に結合した。
Deutsche Dynal GmbH（ドイツ）製のDynabeads M−28
0 Streptavidinを実験に用いた。
0 Streptavidinを実験に用いた。
測定に使用したバッファー（AB）は以下の組成からな
る： KH2PO4 ＊2H2O 0.2M KOH 0.076M NaCl 0.05mM TPA（トリプロピルアミン） 0.1M 界面活性剤 濃度は表中に示す Oxaban/bioban 0.1/0.3％ pH 7.5 使用する対象は、一般によく知られた界面活性剤Twee
n20およびTriton X−100、それぞれの濃度は0.05％とし
た。比較のために、表２で上記界面活性剤について得ら
れたシグナル放射量を100％とみなした。もう一つの測
定値を得るために、バッファー（AB）中の非特異的シグ
ナル放射量を測定して、HSAP/ABシグナル放射量の比の
算出に用いた。HSAP有り、無しでのシグナル放射量のこ
のような比は、アッセイの感度のためのすぐれた指標と
なる。表２に記載された結果から、明らかに本発明の界
面活性剤はもっとも適していると考えることができる。
PolidocanolおよびC8−E09は、HSAP/AB比に関して最良
の効果を示す。Tween/Triton X−100以外の界面活性剤
は、シグナル放射量に悪影響を及ぼす。
る： KH2PO4 ＊2H2O 0.2M KOH 0.076M NaCl 0.05mM TPA（トリプロピルアミン） 0.1M 界面活性剤 濃度は表中に示す Oxaban/bioban 0.1/0.3％ pH 7.5 使用する対象は、一般によく知られた界面活性剤Twee
n20およびTriton X−100、それぞれの濃度は0.05％とし
た。比較のために、表２で上記界面活性剤について得ら
れたシグナル放射量を100％とみなした。もう一つの測
定値を得るために、バッファー（AB）中の非特異的シグ
ナル放射量を測定して、HSAP/ABシグナル放射量の比の
算出に用いた。HSAP有り、無しでのシグナル放射量のこ
のような比は、アッセイの感度のためのすぐれた指標と
なる。表２に記載された結果から、明らかに本発明の界
面活性剤はもっとも適していると考えることができる。
PolidocanolおよびC8−E09は、HSAP/AB比に関して最良
の効果を示す。Tween/Triton X−100以外の界面活性剤
は、シグナル放射量に悪影響を及ぼす。
使用した界面活性剤の名称および略号 C8−E09 オクチルアルコールポリ（エチレングリコー
ルエーテル）ｎ C14−E09 ポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ C16−E09 セチルポリ（エチレングリコールエーテル）
ｎ ドデシルマルトシド ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノ
シル（１→４）α−Ｄ−グルコピラノシド Genapol イソトリデシルポリ（エチレングリコールエ
ーテル）ｎ オクチルグルコシド オクチル−β−Ｄ−グルコピラノ
シド プランタレン アルキルポリグルコシド（C14−Cl6） Ralufon3−14 ｎ−テトラデシル−n,n−ジメチル−３
−アミノ−１−プロパン硫酸 SDS ラウリル硫酸ナトリウム Polidocanol ドデシルポリ（エチレングリコールエー
テル）ｎ Triton X−100 オクチルフェノールポリ（エチレング
リコールエーテール）ｎ Tween ポリ（オキシエチレン）ｎ−ソルビタン−モノ
ラウリン酸
ルエーテル）ｎ C14−E09 ポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ C16−E09 セチルポリ（エチレングリコールエーテル）
ｎ ドデシルマルトシド ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノ
シル（１→４）α−Ｄ−グルコピラノシド Genapol イソトリデシルポリ（エチレングリコールエ
ーテル）ｎ オクチルグルコシド オクチル−β−Ｄ−グルコピラノ
シド プランタレン アルキルポリグルコシド（C14−Cl6） Ralufon3−14 ｎ−テトラデシル−n,n−ジメチル−３
−アミノ−１−プロパン硫酸 SDS ラウリル硫酸ナトリウム Polidocanol ドデシルポリ（エチレングリコールエー
テル）ｎ Triton X−100 オクチルフェノールポリ（エチレング
リコールエーテール）ｎ Tween ポリ（オキシエチレン）ｎ−ソルビタン−モノ
ラウリン酸
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 Ｐ４４０１５７７．１ (32)優先日 1994年１月20日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (72)発明者 クレムト，ヴォルカー ドイツ連邦共和国 ディー―82362 ヴ ァイルハイム，アム フィシャンガー ３番地 (72)発明者 ミュラー，ギュンター ドイツ連邦共和国 ディー―82380 パ イゼンベルグ，ヴイ．―ボーデンシュヴ ィン―ヴェーク ６番地 (72)発明者 ノイマン，ウルリッヒ ドイツ連邦共和国 ディー―82362 ヴ ァイルハイム，エスティー．―アンナー ヴェーク ８番地 (56)参考文献 特開 平４−273043（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−47324（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−27399（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−503451（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−502207（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−502964（ＪＰ，Ａ)
Claims (17)
- 【請求項１】酸化可能なアミンと電気化学発光を生じる
ことができる成分を含有する水溶液中または該水溶液に
接する固相で電気化学発光現象を測定する方法であっ
て、電圧をかけて電気化学発光を生じさせ、発生した光
が電気化学発光を生じることができる成分の存在の尺度
となり、電気化学発光作用が該溶液の凝固点より高いが
25℃よりは低い該溶液および／または該固相の温度で測
定されることを特徴とする方法。 - 【請求項２】温度範囲が５℃から20℃の間であることを
特徴とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】溶液が脂肪アルコールエトキシレート、ア
ルキルポリグルコシド、オクチル−β−Ｄ−グルコピラ
ノシドまたはこれらの混合物からなる群から選択される
界面活性剤を含有することを特徴とする、請求項１記載
の方法。 - 【請求項４】溶液が１または複数のハロゲン化アルカリ
またはアルカリ土類を含有することを特徴とする請求項
１記載の方法。 - 【請求項５】溶液のpHが6.8から9.0の範囲であることを
特徴とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項６】電気化学発光が2.0Vの最大電圧をかけるこ
とによって生じることを特徴とする、請求項１記載の方
法。 - 【請求項７】測定のために矩形波電圧を用いることを特
徴とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項８】電気化学発光を生じることができる成分が
被検体、被検体類似物、または被検体特異的物質の標識
であって、受容された光が被検体の存在の指標となるこ
とを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項９】酸化されるときに強力な還元剤となる電気
化学的に酸化可能なアミンを含有し、さらに0.1mmol/l
から0.5mol/lの濃度の塩化アルカリを含有することを特
徴とする、請求項１記載の方法に使用するための試薬溶
液。 - 【請求項１０】塩化アルカリが塩化ナトリウムであるこ
とを特徴とする、請求項９記載の試薬溶液。 - 【請求項１１】塩化アルカリまたは塩化ナトリウムが0.
05mol/lから0.45mol/lの濃度で存在することを特徴とす
る、請求項９または10記載の試薬溶液。 - 【請求項１２】その溶液のpHが7.0から8.0の間であるこ
とを特徴とする、請求項９から11までの一項に記載の試
薬溶液。 - 【請求項１３】酸化されるときに強力な還元剤となる電
気化学的に酸化可能なアミンを含有し、さらに0.1mmol/
lから0.5mol/lの濃度の塩化アルカリと、脂肪アルコー
ルエトキシレート、アルキルポリグルコシド、オクチル
−β−Ｄ−グルコピラノシドまたはこれらの混合物から
なる群から選択される界面活性剤とを含有することを特
徴とする、電気化学発光現象を測定するための試薬溶
液。 - 【請求項１４】作用電極に電圧をかけることによって電
気化学発光を生じさせることにより水溶液中または水溶
液に接する固相で電気化学発光現象を測定する方法であ
って、該水溶液が酸化可能なアミンおよび電気化学発光
を生じることができる成分を含有し、該成分が粒子に結
合しており、電気化学発光を生じさせる前に、作用電極
にAg/AgCl電極に対して＋400から−400mVの間の電位を
かけることを特徴とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項１５】作用電極に電圧をかけることによって電
気化学発光を生じさせることにより水溶液中または水溶
液に接する固相で電気化学発光現象を測定する方法であ
って、該水溶液が酸化可能なアミンおよび電気化学発光
を生じることができる成分を含有し、この成分が粒子に
結合しており、電気化学発光系の酸化還元電位と＋800m
Vの間で電気化学発光を生じさせることを特徴とする、
請求項１記載の方法。 - 【請求項１６】測定時に試薬溶液とよく接触する少なく
とも２個の電極を有する測定ユニット、電気化学発光に
より生じた光を測定するための検出器、および液体容器
を含んでなる電気化学発光現象を測定するための装置で
あって、該測定ユニットを０から25℃までの温度に冷却
するための手段を有することを特徴とする、前記の装
置。 - 【請求項１７】測定ユニットを冷却するための手段がさ
らに液体容器も冷却する、請求項16記載の装置。
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