JPH04273043A - 発光測定法 - Google Patents
発光測定法Info
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- JPH04273043A JPH04273043A JP3421191A JP3421191A JPH04273043A JP H04273043 A JPH04273043 A JP H04273043A JP 3421191 A JP3421191 A JP 3421191A JP 3421191 A JP3421191 A JP 3421191A JP H04273043 A JPH04273043 A JP H04273043A
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Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、液体クロマトグラフや
キャピラリ電気泳動などで分離した試料物質に励起剤を
加え、試料物質を発光させることにより試料物質量を測
定する発光測定法に関する。
キャピラリ電気泳動などで分離した試料物質に励起剤を
加え、試料物質を発光させることにより試料物質量を測
定する発光測定法に関する。
【０００２】
【従来技術】従来の発光測定法は、試料物質に例えば、
シュウ酸エステル／Ｈ２ Ｏ２ などの励起剤を加えて
試料物質を発光させ、その発光量を光電子増倍管で測定
するのが一般的である。
シュウ酸エステル／Ｈ２ Ｏ２ などの励起剤を加えて
試料物質を発光させ、その発光量を光電子増倍管で測定
するのが一般的である。
【０００３】かかる測定法を液体クロマトグラフ系に組
み込んだ系路が図４で、図中１が移動相溶液溜、２が分
離カラム、３が励起剤溜（例えばシュウ酸エステル溶液
）、４が励起剤溜（例えば過酸化水素溶液）、５が反応
コイル、６がガラスセル、７が光電子増倍管、８が増幅
器、９がレコ−ダ、Ｍ１ Ｍ２ がミキサ−、Ｐが送液
ポンプ、Ｉがインジェクタである。
み込んだ系路が図４で、図中１が移動相溶液溜、２が分
離カラム、３が励起剤溜（例えばシュウ酸エステル溶液
）、４が励起剤溜（例えば過酸化水素溶液）、５が反応
コイル、６がガラスセル、７が光電子増倍管、８が増幅
器、９がレコ−ダ、Ｍ１ Ｍ２ がミキサ−、Ｐが送液
ポンプ、Ｉがインジェクタである。
【０００４】試料物質は、インジェクタＩから導入され
、移動相によって分離カラム１２に送られる。シュウ酸
エステルと過酸化水素は、ミキサ−Ｍ１で混合され、反
応（１）の様に高エネルギ中間体を生成する。この高エ
ネルギ−中間体は、ミキサ−Ｍ２ でカラム２で分離溶
出された目的物質を励起し（反応（２））、発光反応を
起こさせる（反応（３））。この時の発光を光電子増倍
管７で測定する。
、移動相によって分離カラム１２に送られる。シュウ酸
エステルと過酸化水素は、ミキサ−Ｍ１で混合され、反
応（１）の様に高エネルギ中間体を生成する。この高エ
ネルギ−中間体は、ミキサ−Ｍ２ でカラム２で分離溶
出された目的物質を励起し（反応（２））、発光反応を
起こさせる（反応（３））。この時の発光を光電子増倍
管７で測定する。
【０００５】
シュウ酸エステル＋過酸化水素→高エ
ネルギ−中間体・・・（１） 目的物質
＋高エネルギ−中間体→目的物質＊ ・
・・（２） 目的物質＊→目的物質＋ｈ
ν ・・
・（３）
ネルギ−中間体・・・（１） 目的物質
＋高エネルギ−中間体→目的物質＊ ・
・・（２） 目的物質＊→目的物質＋ｈ
ν ・・
・（３）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
測定法では、目的物質が分離カラムより溶出していない
状態でも溶媒中の不純物の発光や高エネルギ−中間体そ
のものが発光し、ある程度のバックグランドが観測され
た。このバックグランドは、ポンプの脈流、温度などの
影響を受けてふらつき、測定のＳ／Ｎ比を劣化させてい
た。
測定法では、目的物質が分離カラムより溶出していない
状態でも溶媒中の不純物の発光や高エネルギ−中間体そ
のものが発光し、ある程度のバックグランドが観測され
た。このバックグランドは、ポンプの脈流、温度などの
影響を受けてふらつき、測定のＳ／Ｎ比を劣化させてい
た。
【０００７】したがって、測定にあたっては、バックグ
ランドを出来るだけ低くおさえることが重要であるが、
従来かかる抑止策は特に採られておらず、暗電流を減少
させるため光電子増倍管を冷却することが行われている
に過ぎなかった。しかし、光電子増倍管の暗電流は通常
不純物や中間体そのものの発光に起因するバックグラン
ドより極めて微弱であるからこの方法では、実質上検出
感度をあげることはできなかった。
ランドを出来るだけ低くおさえることが重要であるが、
従来かかる抑止策は特に採られておらず、暗電流を減少
させるため光電子増倍管を冷却することが行われている
に過ぎなかった。しかし、光電子増倍管の暗電流は通常
不純物や中間体そのものの発光に起因するバックグラン
ドより極めて微弱であるからこの方法では、実質上検出
感度をあげることはできなかった。
【０００８】そこで、本発明は、溶媒中の不純物や高エ
ネルギ−中間体そのものの発光を極力抑えることにより
、測定のＳ／Ｎ比の改善を行うことを目的とする。
ネルギ−中間体そのものの発光を極力抑えることにより
、測定のＳ／Ｎ比の改善を行うことを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するため、まず第一の方法として発光反応が起こる場
を室温以下の温度に制御し、バックグランド量を減じさ
せることを特徴とする。
決するため、まず第一の方法として発光反応が起こる場
を室温以下の温度に制御し、バックグランド量を減じさ
せることを特徴とする。
【００１０】発光反応が起こる場とは、上記反応（２）
， （３）が生じる場で、液相、気相を問わない。例え
ば、ルミノ−ルの化学発光では液相で、オゾンと窒素化
合物の発光では、気相となる。
， （３）が生じる場で、液相、気相を問わない。例え
ば、ルミノ−ルの化学発光では液相で、オゾンと窒素化
合物の発光では、気相となる。
【００１１】また、室温以下の温度とは、従来測定され
ていた温度以下という意味で、好ましくは、約２５℃〜
０℃の範囲内の温度である。
ていた温度以下という意味で、好ましくは、約２５℃〜
０℃の範囲内の温度である。
【００１２】温度制御は、例えば、発光反応が起こる場
をアルミブロックに設置しサ−モモジュ−ルで恒温する
もの、エア−バスにつけるもの、冷却水を循環させるも
のを挙げることができるが、これらに限定されない。
をアルミブロックに設置しサ−モモジュ−ルで恒温する
もの、エア−バスにつけるもの、冷却水を循環させるも
のを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１３】発光量の測定は、光電子増倍管、ホトセン
サ−など既存の装置が使える。
サ−など既存の装置が使える。
【００１４】また、本発明の第二の方法は、発光反応が
起こる場にその発光反応を消光させる物質を混入し、目
的物質の発光量とともにバックグランド量を減じさせる
ことを特徴とする。
起こる場にその発光反応を消光させる物質を混入し、目
的物質の発光量とともにバックグランド量を減じさせる
ことを特徴とする。
【００１５】発光反応を消光させる物質とは、目的物質
の発光とともに妨害物質の発光を消光させるもので、例
えば、過シュウ酸エステルの消光物質としてメタノ−ル
、ハロゲン、亜硫酸、亜硝酸、トリメチルエチレン、ア
ルキルアミン、ピリジン、ベンジルアミンなどを挙げる
ことができる。但し、これらに限定されず発光原理の違
いにより様々な物質を使用することができる。
の発光とともに妨害物質の発光を消光させるもので、例
えば、過シュウ酸エステルの消光物質としてメタノ−ル
、ハロゲン、亜硫酸、亜硝酸、トリメチルエチレン、ア
ルキルアミン、ピリジン、ベンジルアミンなどを挙げる
ことができる。但し、これらに限定されず発光原理の違
いにより様々な物質を使用することができる。
【００１６】なお、以上の方法の対象となる発光反応は
、気相、液相のすべての発光反応を含み、例えばルシフ
ェリンとルシフェラ−ゼとの生物発光も対象となる。
、気相、液相のすべての発光反応を含み、例えばルシフ
ェリンとルシフェラ−ゼとの生物発光も対象となる。
【００１７】
【作用】本発明の第一の方法によれば、温度を室温以下
にすることにより、目的物質の発光量が減少するが、そ
れ以上に妨害物質の発光量（バックグランド量）が減少
し結果的にＳ／Ｎ比が向上する。
にすることにより、目的物質の発光量が減少するが、そ
れ以上に妨害物質の発光量（バックグランド量）が減少
し結果的にＳ／Ｎ比が向上する。
【００１８】また、第二の方法によっても、消光物質に
より目的物質の発光量が減少するが、それ以上に妨害物
質の発光量（バックグランド量）が減少し結果的にＳ／
Ｎ比が向上することになる。
より目的物質の発光量が減少するが、それ以上に妨害物
質の発光量（バックグランド量）が減少し結果的にＳ／
Ｎ比が向上することになる。
【００１９】
【実施例】（実験例１）第一の方法を以下の実験例に基
づいて実施した。
づいて実施した。
【００２０】（１）実験例
サンプル：ダンシルアラニン（Ｄｎｓ−Ａｌａ １
ｆＭ ｉｎ ２０ μｌ） カラム ：Ｃ１８カラ
ム（Φ４．６ ×１５ｃｍ） 移動相 ：２ｍＭイ
ミダゾ−ル（ｉｎ ６００ｍＬアセトニトリル＋４００
ｍＬ Ｈ２Ｏ） ｐＨ＝７．１
流量；１ｍＬ／ｍｉｎ 励起剤 ：■トリクロ
ロフェニルシュウ酸エステル（ＴＣＰＯ）１ｍＭ
ｉｎ １０００ｍＬ
アセトニトリル・・流量；０．５ｍＬ／ｍｉｎ
■Ｈ２Ｏ２ １０ｍＭ ｉｎ
１０００ｍＬ アセトニトリル・・流量；０．５ｍＬ／
ｍｉｎ 反応コイル：ＳＵＳ パイプ（Φ０．５
× ２ｍ）なお、装置全体の構成は図４のものと同様で
、図４中の反応コイル、ガラスセル、光電子増倍管、ミ
キサ−Ｍ２ を一つの温調ブロック（アルミブロック）
に入れ、サ−モモジュ−ルで種々の温度に恒温して測定
した。
ｆＭ ｉｎ ２０ μｌ） カラム ：Ｃ１８カラ
ム（Φ４．６ ×１５ｃｍ） 移動相 ：２ｍＭイ
ミダゾ−ル（ｉｎ ６００ｍＬアセトニトリル＋４００
ｍＬ Ｈ２Ｏ） ｐＨ＝７．１
流量；１ｍＬ／ｍｉｎ 励起剤 ：■トリクロ
ロフェニルシュウ酸エステル（ＴＣＰＯ）１ｍＭ
ｉｎ １０００ｍＬ
アセトニトリル・・流量；０．５ｍＬ／ｍｉｎ
■Ｈ２Ｏ２ １０ｍＭ ｉｎ
１０００ｍＬ アセトニトリル・・流量；０．５ｍＬ／
ｍｉｎ 反応コイル：ＳＵＳ パイプ（Φ０．５
× ２ｍ）なお、装置全体の構成は図４のものと同様で
、図４中の反応コイル、ガラスセル、光電子増倍管、ミ
キサ−Ｍ２ を一つの温調ブロック（アルミブロック）
に入れ、サ−モモジュ−ルで種々の温度に恒温して測定
した。
【００２１】（２）実験結果
結果を図１、図２に示す。図１は、Ｄｎｓ−Ａｌａ の
ピ−ク高さとバックグランドレベル（妨害物質の発光高
さ）、ノイズレベルの温度依存性を示す図であり、この
図より温度の低下とともにＤｎｓ−Ａｌａ のピ−ク高
さが減少するが、それ以上の割合でバックグランドレベ
ルが低下することがわかる。
ピ−ク高さとバックグランドレベル（妨害物質の発光高
さ）、ノイズレベルの温度依存性を示す図であり、この
図より温度の低下とともにＤｎｓ−Ａｌａ のピ−ク高
さが減少するが、それ以上の割合でバックグランドレベ
ルが低下することがわかる。
【００２２】また、これらの信号よりＳ／Ｎ比をとり、
温度との関係をプロットすると図３のようになる。この
図より室温（２５℃）と１０℃での測定ではＳ／Ｎ比が
２倍以上向上することがわかった。
温度との関係をプロットすると図３のようになる。この
図より室温（２５℃）と１０℃での測定ではＳ／Ｎ比が
２倍以上向上することがわかった。
【００２３】（実験例２）第二一の方法を以下の実験例
に基づいて実施した。
に基づいて実施した。
【００２４】（１）実験例
サンプル：ダンシルアラニン（Ｄｎｓ−Ａｌａ １
ｆＭ ｉｎ ２０ μｌ） カラム ：Ｓｈｉｍｐ
ａｃｋ ＣＬＣ−ＯＤＳ（Φ４．６ ×１５ｃｍ）
移動相 ：２ｍＭイミダゾ−ル（ｉｎ ４００ｍＬア
セトニトリル＋６００ｍＬ Ｈ２Ｏ）
ｐＨ＝７．０ 流量；１ｍＬ／ｍｉｎ 励
起剤 ：■ビス−トリクロロフェニルシュウ酸エステ
ル ０．２ｇ
ｉｎ １０００ｍＬ アセトニトリル・・流量；０
．５ｍＬ／ｍｉｎ ■３０％
Ｈ２Ｏ２溶液 ｉｎ １０００ｍＬ アセトニトリ
ル
・・流量；０．５ｍＬ／ｍｉｎ 反応
コイル：ＳＵＳ パイプ（Φ０．３ × ２ｍ） 測
定温度 ：室温（２３℃） 消光物質 ：メタノ−ル なお、装置全体の構成は図４のものと同様で、メタノ−
ルはシュウ酸エステル溶液中に添加した。
ｆＭ ｉｎ ２０ μｌ） カラム ：Ｓｈｉｍｐ
ａｃｋ ＣＬＣ−ＯＤＳ（Φ４．６ ×１５ｃｍ）
移動相 ：２ｍＭイミダゾ−ル（ｉｎ ４００ｍＬア
セトニトリル＋６００ｍＬ Ｈ２Ｏ）
ｐＨ＝７．０ 流量；１ｍＬ／ｍｉｎ 励
起剤 ：■ビス−トリクロロフェニルシュウ酸エステ
ル ０．２ｇ
ｉｎ １０００ｍＬ アセトニトリル・・流量；０
．５ｍＬ／ｍｉｎ ■３０％
Ｈ２Ｏ２溶液 ｉｎ １０００ｍＬ アセトニトリ
ル
・・流量；０．５ｍＬ／ｍｉｎ 反応
コイル：ＳＵＳ パイプ（Φ０．３ × ２ｍ） 測
定温度 ：室温（２３℃） 消光物質 ：メタノ−ル なお、装置全体の構成は図４のものと同様で、メタノ−
ルはシュウ酸エステル溶液中に添加した。
【００２５】（２）実験結果
実験結果を図３に示す。図３はメタノ−ル添加量とサン
プルピ−ク高さ、バックグランドレベルの関係を示す図
で、この図に示す様にバックグランドに対する消光量と
目的物質の消光量との間に著しい差があり、その結果測
定のＳ／Ｎ比をメタノ−ルを添加しない場合に比べて１
０倍以上あげることができることが判明した。
プルピ−ク高さ、バックグランドレベルの関係を示す図
で、この図に示す様にバックグランドに対する消光量と
目的物質の消光量との間に著しい差があり、その結果測
定のＳ／Ｎ比をメタノ−ルを添加しない場合に比べて１
０倍以上あげることができることが判明した。
【００２６】
【発明の効果】以上、説明した通り、本発明によれば、
目的物質に比し、溶媒中の不純物や高エネルギ−中間体
そのものの発光がを極力抑えられることになり、測定の
Ｓ／Ｎ比が大幅に向上する。
目的物質に比し、溶媒中の不純物や高エネルギ−中間体
そのものの発光がを極力抑えられることになり、測定の
Ｓ／Ｎ比が大幅に向上する。
【図１】サンプルピ−ク高さとバックグランドレベル、
ノイズレベルの温度依存性を示す図である。
ノイズレベルの温度依存性を示す図である。
【図２】Ｓ／Ｎ比の温度依存性を示す図である。
【図３】メタノ−ル添加量とサンプルピ−ク高さ、バッ
クグランドレベルの関係を示す図である。
クグランドレベルの関係を示す図である。
【図４】発光測定法を液体クロマトグラフ系に組み込ん
だ系路図である。
だ系路図である。
３，４：励起剤溜
５：反応コイル
７：光電子増倍管
Ｍ１ Ｍ２ ：ミキサ−
Claims (2)
- 【請求項１】 試料物質を励起させて発光させ、その
発光量を測定する発光測定法において、発光反応が起こ
る場を室温以下の温度に制御し、バックグランド量を減
じさせることを特徴とする発光測定法。 - 【請求項２】 試料物質を励起させて発光させ、その
発光量を測定する発光測定法において、発光反応が起こ
る場にその発光反応を消光させる物質を混入し、目的物
質の発光量とともにバックグランド量を減じさせること
を特徴とする発光測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3421191A JPH07111400B2 (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | 発光測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3421191A JPH07111400B2 (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | 発光測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04273043A true JPH04273043A (ja) | 1992-09-29 |
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| JP (1) | JPH07111400B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2735688B2 (ja) * | 1993-05-03 | 1998-04-02 | ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー | 電気化学発光アッセイ |
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1991
- 1991-02-28 JP JP3421191A patent/JPH07111400B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2735688B2 (ja) * | 1993-05-03 | 1998-04-02 | ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー | 電気化学発光アッセイ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07111400B2 (ja) | 1995-11-29 |
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