KR100241996B1

KR100241996B1 - 전자화학발광 현상의 측정 방법과 상기 측정 방법에 따른 분석물의 검출방법, 및 상기 측정 방법에 사용된 시약 용액

Info

Publication number: KR100241996B1
Application number: KR1019950704915A
Authority: KR
Inventors: 클렘트 볼커; 뮐러 귄터; 노우만 울리히; 기이센 우르줄라; 호알레 니콜라스
Original assignee: 베른트 콜프; 로셰 디아그노스틱스 게엠베하; 랄프 슈바르츠
Priority date: 1993-05-03
Filing date: 1994-04-27
Publication date: 2000-03-02
Also published as: UA44245C2; DE59402311D1; DE4401577A1; DE59404965D1; KR960702608A

Abstract

특정 청정제 및 필요하다면 알칼리 클로라이드 및 이 목적에 적합한 반응물을 사용하여 전기화학발광 현상을 측정하는 방법.

Description

전자화학발광 현상의 측정 방법과 상기 측정 방법에 따른 분석물의 검출 방법, 및 상기 측정 방법에 사용된 시약 용액

본 발명은 전기화학발광 현상(electrochemiluminescent phenomena)을 측정하기 위한 방법, 이 측정 방법을 이용하여 분석물을 검출하는 방법, 이러한 검출 방법에 사용될 수 있는 시약용액 및 전술한 방법을 수행하는데 특히 적합한 장치에 관한 것이다.

전기화학발광 현상을 측정하기 위한 방법은 수년동안 공지되어져 왔다. 이러한 방법은 산화에 의해, 여기된 상태를 이루기 위해 특정 금속 착물의 작용능력을 이용하는데, 여기된 상태로부터, 이러한 금속 착물은 전자기 복사(electromagnetic radiation)를 방출하여 바닥 상태로 붕괴된다. 이러한 종류의 방법 및 적합한 금속 착물이 예를 들어 WO 86/02734에 기술되어 있다.

이러한 방법은 계속해서 점점 더 복잡해져 왔다. WO 90/05296에서, 산화시 강 환원제인 아민 바람직하게는, 트리프로필아민(tripropylamine)이 시험 조성물에 첨가된다. 전기화학 반응은 전기화학발광 (ECL:electrochemiluminescence) 일부분 즉, 전자기 복사를 방출할 수 있는 금속착물 및 아민이 산화될 수 있는 전해질 내에서 일어난다. 이는 수용액 내의 적합한 전해질로서 pH 6 내지 9, 바람직하게는 pH 7 내지 7.5의 인산염 완충액을 의미한다.

전자기 복사를 증가시키기 위해 WO 90/05302에서는 이러한 시험 조성물에 트리톤(Triton) X-100 또는 트리톤 N-401, 세정제의 첨가를 제안하고 있다. WO 90/05411은 ECL을 측정하기 위한 개선된 장치를 기술한다.

또한, 전기화학발광 표지에 분석물, 분석물 유사체 또는 분석물-특이물질을 결합시킴으로써 분석물을 검출하기 위한 방법을 이용해왔다. 전기화학발광은 존재하는 분석물의 양을 결정하는 데에 이용된다. 특히, 종래에 사용되는 표지는 전기화학발광 표지로 대체된 면역학적 검정을 언급하고 있다.

이 방법에 관한 추가적인 개선 및 응용은 WO 87/06706, WO 89/04392, WO 89/10552, WO 90/05301 및 WO 90/11511에 기술되어 있다. 이러한 간행물의 발표는 공지된 것으로 추정된다.

그러므로 본 발명의 목적은 특히 전기화학발광 분석 공정과 함께 분석물 검출의 감도에 대한 공지된 방법을 개선시키는 것이다.

본 발명은 용액 또는 용액에 접촉하고 있는 고체 상에서의 전기화학현상을 측정하는 방법으로써, 전술한 용액은 지방 알코올 에톡실레이트, 플란타렌(Plantaren), 및 옥틸글루코시드 또는 이들의 혼합물로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 세정제이다.

또한, 본 발명은 전술한 방법을 이용하여 분석물을 검출하는 방법 및 이러한 검출 방법을 수행하는데 적합한 시약에 관한 것이다.

본 발명은 전술한 기술에 근거하여 설명되어질 것이다. 전기화학발광 공정의 원리는 이러한 종래의 기술 문헌에 더욱 상세하게 기술되어 있다. 전기화학발광을 측정하기 위한 장치는 시약 용액의 용기를 갖춘 측정 장치, 측정중에 시약 용액과 접촉하는 적어도 두 개의 전극(작동 전극 및 역 전극), 및 전기화학발광 과정에서 방출되는 광을 측정하기 위한 검출기로 구성되어 있다. 먼저, 초기 전압(prepolarization)이 용액에 인가된다. 계속해서, 용액 내에 함유되어 있는 물질, 예를 들어 아민의 산화 환원 전위를 통하여 전압이 증가된다. 이와 같이 산화된 물질은 임의의 루테늄 착물(ruthenium complexes)등의 재료를 여기시켜, 광을 방출하기 위한 전기화학발광의 발생이 가능해진다. 주어진 시간내에 검출기가 받은 광의 양은 전기화학발광 재료의 양의 존재에 대한 측정값이 된다. 분석물, 분석물 유사체 또는 분석물-특이 물질에 대한 표지가 예를 들어, 면역학적 검정 내에서 전기화학발광 재료로 제공된다. 수용된 광은 분석물의 존재를 나타낸다.

WO 제 90/05302호로부터 공지된 세정제 트윈(tween) 20과 결합하여 사용되는 세정제 트리톤 X-100는 최적의 결과를 생성하지 않는다는 것을 보여주고 있다. 한편으로 트리톤 X-100은 분해되기가 어렵고 따라서 환경에 이롭지 않다. 다른 한편으로 트리톤 X-100과 비교하여 임의의 다른 특정 세정제가 ECL 방법을 개선시킴을 나타내고 있다. 이러한 특정 세정제는 신호 수율을 증가시키고, 보다 높은 검출 감도를 얻기 위해 신호/잡음비(signal/noise ratio)를 개선시키고, 그리고 보다 정확성을 얻기 위해 낮은 검출 한계치를 낮추는데 사용된다.

적합한 세정제는 예를 들어 폴리도카놀(도데실폴리-(에틸렌 글리콜 에테르)_n), C14-E09(폴리(에틸렌 글리콜 에테르)_n), 게나폴(이소트리데실폴리(에틸렌 글리콜 에테르)_n)를 포함하는 지방 알코올 에톡실레이트로 구성된 군으로 부터의 것들이다 ; 플란타렌(알킬폴리그루코시드) 및 옥틸글루코시드(옥틸-베타-D-글루코피라노시드) 또는 이것들의 혼합물이 특히 유용하다고 판명되어졌다. 세정제는 0.001 및 1.0%내 범위의 농도로 사용된다. 최적의 농도는 각각의 세정제에 따라 용이하게 결정된다. 가장 적합한 농도는 0.1 및 0.5%내 범위의 것이다.

농도 5 내지 10 mM에서 나트륨 아지드는 정상적으로 이 시험 조성물에서 보존제로 사용된다. 이러한 환경적으로 해로운 시약은 아지드 보다 환경에 훨씬 더 이로운 비오반(bioban) 또는 옥사반(oxaban)에 의해 대체될 수 있다는 것을 보여 주고 있다.

놀랍게도, 이러한 안정제들은 ECL 방법에 또 다른 긍정적 효과 즉, 측정 신호의 증가를 갖는다. 옥사반 및 비오반은 0.01 내지 1% 바람직하게는 0.1 내지 0.5%의 농도로 사용된다.

본 발명에 따른 용액 또는 용액과 접촉되어 있는 고체 상에서의 전기 화학 현상을 측정하기 위한 방법은 용액의 빙점 이상의 온도, 그러나 40℃이하의 온도에서 수행될 수 있다.

측정 장치에 구형파(square-wave) 전압을 인가함으로 해서 감도가 보다 증가될 수 있다. 이것은 초기 전압이 최종 전압까지 직접 증가(최고 0.4초 내에) 됨을 의미한다. 여기 시간 동안 전압은 일정하게 유지된다. 이시간 이후에는 전압은 시스템의 산화 환원 전위 이하로 직접적으로 감소된다. 더욱이, 이 측정은 또한 동력학적 측정 범위 즉, 결정된 면역학적 검정의 분석물 농도가 측정될 수 있는 범위를 개선시킨다. 만일 더 낮은 온도가 사용된다면, 염의 첨가는 바람직한 측정이 된다.

작동 전극(Ag/Agcl과 비교하여)에 인가되는 구형파 최종 전압을 산화 가능한 물질의 산화 환원 전위와 2.2V 사이의 최대치로 제한하는 것이 유리하다고 판명되었다. 특히 바람직한 전압은 1.2 및 2.2V 범위이며, 가장 바람직하게는 1.4V이다. 만약 사용된 전극이 백금 또는 금으로 제조되어졌다면 이러한 수치가 인가된다.

만약 일반적으로 사용되는 램프 전압(ramp voltage), 예를 들어 델타전압이 인가된다면, (Ag/AgCl과 비교하여)최종 전압은 최고 3.0V 으로 제한된다.

놀랍게도, 전기화학발광을 발생하기 전에 Ag/AgCl 전극과 비교하여 +400 및 -400 mM내의 초기 전압을 작동 전극에 인가시킴으로써 신호가 증가될 수 있다. 특히, 바람직한 전압은 0 mM 내지 +200 mM이다. 사용된 전극이 백금 또는 금으로 제조되어 졌다면, 이러한 수치가 또한 적용된다. 전극 재료의 전위는 쉽게 계산될 수 있다.

또한, 신호는 pH 6.8 내지 9.0, 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5, 더욱 바람직하게는 pH 6.8에서 조절됨으로써 증가될 수 있다. 이것은 이러한 범위에 적합한 pH 완충액을 사용함으로써 유리하게 수행될 수 있다. 부가적으로, 용액은 또한 0.05 mmol/l내지 0.5mol/l의 농도에서 하나 이상의 바람직한 재료는 염화나트륨이다.

전술한 측정은 그 자체로 공지된 분석을 이미 상당히 개선시킨다. 더욱이, 이러한 측정을 결합시킴으로써 분석물 검출 분석의 감도 또는 동력학적 측정 범위를 더 현저하게 증가시키는 것이 가능하다.

분석물의 검출 감도가 예를 들어 샌드위치 원리(sandwich principle) 또는 경쟁적 방법에 따른 면역학적 검정에서 증가될 때, 사용된 방법 또는 장치는 훨씬 단순화 될 수 있다. 예를 들어서 검출기로서 광전 다이오우드(photodiode)를 사용하고, 시스템 구경 측정을 단순화하고, 측정 시간이 증가된 신호로 감소된 이후에 시간당 행해진 시험의 횟수를 증가시키거나, 또는 견본 부피를 감소시키는 것이 가능하다.

본 발명은 또한 전기화학 현상을 측정하기 위한 시약 용액, 특히 전기화학적으로 산화될 수 있는 아민, 또는 산화될 때 강 환원제인 분석물을 검출하기 위한 시약용액에 관한 것이다. 용액은 지방 알코올 에톡실레이트, 플란타렌및 옥틸글루코시드 또는 이것의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 세정제를 함유한다. 또한, 이 용액은 0.1 mmol/l 내지 0.5 mol/l에서 알칼리 염화물을 함유하거나 또는 6.8 및 8.0의 pH를 갖는다. 더욱이, 용액은 또한 통상적으로 사용되는 추가적 물질, 예를 들어 완충액 물질, 안정제 및 보존제를 함유할 수 있다.

시약 용액은 바람직하게 비오반 또는 옥사반으로 안정화된다.

전기화학발광에 의한 검출을 수행하기 위한 장치는 예를 들어 WO 90/05302의 실시예 1에 상세하게 기술되어 있다. 더욱이 이러한 장치는 측정 장치를 냉각시키기 위한 수단 또는 0 내지 25℃ 사이의 온도(만일 분석이 이러한 낮은 온도에서 수행되어야 한다면)의 액체 용기로 구성될 수 있다. 측정 장치는 전기화학발광이 측정되는 셀(cell)인 것으로 이해된다. 액체 용기는 저장 용기이며, 또한 예를 들어 측정 중에 측정 단위내에 함유되는 시약용액용 튜브인 공급 장치일 수 있다.

또한 본 발명은 전기화학발광 표지를 이용하여 분석물을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 전술한 방법중 하나는 전기화학발광 현상을 측정하기 위해 사용된다.

하기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것이다.

본 발명에 따라 사용된 세정제의 효과는 일련의 실험으로 결정된다. 개별적 시험 파라미터와는 관계없이 신호의 생성에 대한 세정제의 영향을 결정하기 위해 즉, 비오틴화된 또는 루텐화된 항체가 스트렙타비딘-피복 자기 입자에 부착되는 검출되어질 분석물이 사용된다. (HSAP : “고온의 스트렙타비딘 입자(hot streptavidin particle)”).

측정 셀(Origen 1.0 by IGEN, Rockville, USA or Magnalyser)에 또한 영구 자기를 함유하고 있는, WO 90/05302의 실시예 1에 기술되어 있는 것과 같은 장치는 측정에 사용된다. 이 장치는 또한 광전 증배관, 일정 전위기(potentiostat), 전기화학 병류 전지(electrochemical flow-through cell), 액체 수송제(liquid transfer agents) 및 50-튜브 견본 회전자(sample rotor)를 포함한다.

하기 물질은 분석을 수행하기 위하여 시약튜브에 결합되어 있다:

HSAP(동결 건조된 HSAP를 pH 9.0의 트리스/폴리도카놀 완충액(100mM ; 0.1%)에 용해시켜서 600㎍/㎖의 작용 용액을 얻는다.) 50㎕

PBS 완충액(50mM KH₂PO₄; 100mM NaCl; 0.1% BSA; pH7.0) 200㎕

시약용액(200mM KH₂PO₄완충액 ; 100mM TPA ; pH 7.5 ; 각각의 시험된 반응물)

이 혼합물을 측정 튜브에 피펫팅하고 측정 전지로 옮긴다. HSAP는 완충액(AB)로 씻고 완충액의 신호 수율을 측정한다.

사용된 항체는 비오틴-DDS(비오티닐-아미노-3,6-디옥사옥타노일-아미노카르보닐-헵타노산-N-히드록시숙신이미드 에스테르)로 비오틴화시킨다. (트리스)(2,2′-비피리딜)루테늄 클로라이드 헥사히드헤이트를 DDS(디숙시닐수베레이트)를 사용하여 항체에 결합시킨다.

스트렙타비딘-피복 자기 입자는 독일, 도이체 뒤날 게엠베하로부터 구입할 수 있다 (디나비즈(Dynabeads) M-280 스트렙타비딘).

측정에 사용된 완충액 (AB)는 하기와 같이 구성된다 :

KH₂PO₄ ^*2H₂O 0.2M

KOH 0.076M

NaCl 0.05mM

TPA(트리프로필아민) 0.1M

세정제 표에 기입된 것과 같은 농도

옥사반/비오반 0.1/0.3%

pH 7.5

사용된 대조 표준은 각각 0.05%의 농도의 일반적으로 공지된 세정제 트윈 20 및 트리톤 X-100이다. 참고로 표 1에서 주어진 세정제로 얻은 신호 수율을 100%로 한다. 다른 측정값을 갖기 위해 완충액 (AB)의 특이성이 없는 신호 수율을 결정하고 이것을 이용하여 HSAP/AB 신호 수율의 비율을 계산한다. HSAP의 존재 및 부재하에서 신호 수율 사이의 비율은 분석의 감도에 좋은 지시계이다. 표 1에 주어진 결과로부터 본 발명의 세정제가 가장 적합함을 분명히 이해할 수 있다.

폴리도카놀(polinocanol) 및 C8-E09는 HSAP/AB 비율에 가장 좋은 효과를 나타낸다. 트윈/트리톤 X-100이외의 다른 세정제는 신호 수율에 악영향을 준다.

[표 1a]

[표 1b]

사용된 세정제의 이름 및 약어

[실시예 2]

램프 전압이 NaCl에 따른 측정 셀 내의 28 내지 35℃의 온도에서 사용된다면, 신호 재생 및 동력학에 대한 셀 온도의 결과를 시험하기 위해 파라미터에 독립적인 시험 (HASP)이 이용된다.

실시예 1에 기술된 것과 같이 시험이 수행된다. 완충액(AB)는 하기와 같은 구성을 갖는 완충액 BMG 2로 대체된다.

결과는 표 2에 나와 있다. 온도의 증가 및 염 농도는 또한 완충액(BMG2)만으로, 그리고 HSAP로 얻어진 ECL 신호의 증가를 초래한다.

HSAP/AB, HSAP/FC 및 FC/AB 비율은 온도에는 독립적이나, 염 농도에 의존적이다.

[표 2a]

[표 2b]

만약 온도가 20℃ 이하로 떨어진다면, 용액에 알칼리 클로라이드의 첨가 및 7.25 및 7.75 사이의 바람직한 pH 값으로의 조절이 필요하다.

[실시예 3]

T₃의 검출

종래 시험 구성 (BMG 0)와 본 발명 BMG 1의 시험 구성과 비교하기 위해 트리-요오드 티로닌(T₃)의 검출을 위한 면역 검정을 이용한다 :

시약용액은 하기 구성을 갖는다 :

하기 추가 반응물이 또한 사용된다 :

검출 반응을 수행하기 위해 하기 물질을 연결 시킨다.

혼합물을 28℃에서 16분 동안 배양한 후 28℃의 온도에서 배양한 측정 셀로 옮긴다. 시험 혼합물에 따라 BMG 0 또는 1로 입자를 세척하고 그 후에 측정한다. 그 때, 델타 램프 전압이 인가된다. 측정 전압은 0.565V 및 PMT 720mV이다.

결과는 표 3에 정리되어 있다. BMG 0에서 관찰할 수 있는 헤모글로빈 방해는 더 이상 BMG 1에 존재하지 않음을 보여준다. 이것은 검출 하한에 영향을 주지 않는다.

[표 3]

LDL(2s)=검출 하한

[실시예 4]

HBsAg의 검출

샌드위치 면역 검정에서, HBsAg를 검출하는데 본 발명에 따른 시험 구성 BMG 1을 사용한다. 결과는 BMG 0으로 얻어진 결과와 비교된다. BMG 0 및 1은 실시예 3에서 주어진 구성을 갖는다.

하기 시약이 사용된다.

검출 반응을 위해 하기 물질을 연결시킨다:

혼합물을 28℃에서 16분 동안 배양한 다음 28℃로 상승시킨 측정셀로 전달한다. 입자를 BMG 0 또는 1로 세척하여 측정한다.

결과는 표 4에 요약되어 있다. BMG 1의 사용은 더 낮은 검출 하한을 상당히 개선하였다. 또한 BMG 0와 비교해 볼 때 CV는 감소되었다. 표준 견본 h의 값과 구경 측정 곡선의 비율은 구경 곡선의 향상된 구별을 허용하는 BMG 1에 대하여 증가한다.

[표 4]

LDL: 검출 하한

CV: 변화 계수

[실시예 5]

TSH의 검출

종래의 시험 구성 BMG 0와 비교하여 옥사반이 없는 시험 조성물 BMG 1 및 BMG 1을 TSH(티로이드-자극 호르몬)의 검출을 위해 샌드위치 면역 검정에 사용한다. BMG 0 및 BMG 1은 실시예 3에서 주어진 조성물을 갖는다.

티로이드-자극 호르몬(THS)는 샌드위치 면역 검정에서 결정된다. 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같은 장치의 보조로 수행된다.

검출 반응을 위해 하기 물질을 연결시킨다:

혼합물을 상온(21℃)에서 16분 동안 배양된 후 상온에서 배양된 측정 전지로 옮긴다. 고정화된 입자를 반응 용액 BMG 1으로 세척하고 BMG 1에서 측정한다.

사용된 견본은 하기의 TSH 농도를 갖는 표준 a 내지 e이다:

결과는 표 5에 정리하였다. BMG 0와 비교해 볼 때 BMG 1은 개선된 검출 하한을 나타낸다. 방부제 옥사반의 첨가는 시초의 더 낮은 검출을 훨씬 감소시킨다. 두 경우 모두에서 변화 계수는 또한 현저하게 향상된다(BMG 1±옥사반).

[표 5]

생략한 부분은 실시예 4에서 주어진 것과 같은 의미를 갖는다.

Claims

산화가능한 아민을 함유하는 용액 또는 상기 용액과 접하는 고체상에서 전기화학발광 현상을 측정하기 위한 방법으로서, 전기화학발광을 발생시킬 수 있는 성분과 접촉시키는 단계와, 전기화학발광을 유도하기 위해 전압을 인가 하는 단계와, 그리고 발생된 전자기 복사를 검출하는 단계를 포함하는 전기화학발광 현상을 측정하기 위한 방법에 있어서, 상기 용액은 지방 알코올 에톡실레이트, 플란타렌 및 옥틸글루코시드 또는 그 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 세정제를 함유함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 지방 알코올 에톡실레이트는 폴리도카놀, C14-E09, 게나폴 또는 C8-E09임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 용액은 하나 이상의 알칼리 또는 알칼리토 할로겐화물을 함유함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 용액의 pH가 6.5 내지 9.0임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 전기화학발광은 2.2V의 최대 구형파 전압 또는 3.0V의 최대 램프 전압을 인가함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항중 어느 한 항의 측정 방법에 따라 분석물을 검출하기 위한 방법에 있어서, 전기화학발광을 발생시킬 수 있는 성분은 분석물, 분석물 유사체 또는 분석물 특이 물질의 표지이며, 상기 검출가능한 복사로 상기 분석물의 존재를 측정하는 것을 특징으로 하는 분석물 검출 방법.
산화시 강 환원제로서 전기화학적으로 산화 가능한 아민을 함유하고 있으며, 전기화학 현상을 측정하기 위한 시약 용액에 있어서, 상기 시약 용액은 지방 알코올 에톡실레이트, 플라타렌 및 옥틸글루코시드 또는 이것들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 세정제를 함유함을 특징으로 하는 시약 용액.
제7항에 있어서, 상기 세정제는 0.001 내지 1%의 농도로 함유되어 있음을 특징으로 하는 시약 용액.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 시약 용액에 알칼리 클로라이드가 0.05mmol/l 내지 0.5mol/l의 농도로 추가로 함유되어 있음을 특징으로 하는 시약 용액.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 시약 용액의 pH는 6.5 내지 9.0임을 특징으로 하는 시약 용액.