CN104280537A - 用于分析血液样品的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

公开了用于分析血液样品的方法、系统、以及计算机程序产品。一个实施方式是对血液样品中难以血影化细胞进行检测并计数的方法。另一个实施方式是分析血液样品中网织红细胞的方法。还提供了使用血细胞计数参数的方法。

Description

用于分析血液样品的方法和系统
本申请是申请日为2010年3月25日、申请号为201080065796.9(国际申请号为PCT/US2010/028683)、名称为用于分析血液样品的方法和系统的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明一般涉及通过使用颗粒分析仪来分析血液样品的方法和系统，更多具体地讲，涉及确定网织红细胞和难以血影化(hard-to-ghost)细胞的方法和系统。
背景技术
每年，有几百万的美国人会受到血液病的影响。血液病理学的例子包括：多种血液学恶性肿瘤，比如白血病和淋巴瘤；血红蛋白病，其包括许多种源于遗传的贫血症，比如地中海贫血、库利(Cooley)病、以及镰刀形红细胞性贫血(HbS病)；以及多种凝血和出血病症。血液异常还可以是与其他疾病比如HIV/AIDS、恶性肿瘤、以及自身免疫紊乱有关的次级后果。这些疾病中的大部分具有显著的病态和死亡率，并且通常会引起受影响的病人中严重的疼痛。这些紊乱的早期诊断很关键，以使得罹患该疾病的病人能够接受适当的处理和疾病治疗。
血液是特殊的体液，其可向身体中的细胞输送必需的物质比如营养和氧气，并且从这些相同的细胞中运出废物。血液中这种主要细胞是红细胞，即红血细胞或者红细胞。在外周血涂片中，红细胞由蛋白质血红蛋白衍生了它们的微红色，并且通常呈现具有染色暗淡的中心区域的球形或者椭圆形。它们的两面凹的形态增加了细胞的表面积，并且有助于氧和二氧化碳从细胞中的扩散。典型的红细胞的寿命为约120天。
红细胞由在骨髓中具核的前体细胞发展而来。未成熟的红细胞，即，网织红细胞，具有细胞器，这些细胞器对于提高血红蛋白含量和气体携载能力有贡献。当特殊的染色被用于染色网织红细胞的多聚核糖体或者核糖核酸(RNA)时，能够在外周血涂片中识别出网织红细胞。在典型的状况下，网织红细胞在样品中占红血细胞的大约1-2％。然而，在身体需要的特定周期期间，网织红细胞计数可以上升。
血液测试能够被用于确定生理学和生物化学状态比如疾病、矿物质含量、药物效力、以及器官功能。在证实或者帮助证实疾病比如各种形式贫血症或者急性内出血的诊断中，网织红细胞的确定可能是至关重要的。
自动网织红细胞分析能够通过使用颗粒分析仪比如流式细胞仪或者血液分析仪而进行。颗粒分析仪的例子包括，购自贝克曼考尔特公司的DxH800系统和购自Sysmex公司的XT-2000。用于流式细胞计数或者血液学分析的血液样品的制备通常涉及到下述步骤：获取全血样品，进行用活体染料比如新亚甲基蓝(NMB)孵育血液样品的步骤和用可去除血红蛋白的低渗性酸稀释血液样品的步骤中的一个步骤或者两个步骤。所述染色可沉淀出红细胞内部的RNA。用低渗性酸染色可去除使血红蛋白，留下细胞内被染色的RNA。除去血红蛋白的该方法通常被称作“血影(化)(ghosting)”。然后使该血液样品或其部分经受在颗粒分析仪的流式池中的分析。典型地，鞘液体(sheath fluid)中的细胞一个接一个地经过流式池中的点，它们在该点处被一种以上光束探询。对于每个经过的细胞产生几个测量值。单个细胞的探询(interrogation)被称为细胞事件(cell event)。每个细胞事件通常所记录的测量值包括正向光散射、轴向光损失、以及荧光。一些颗粒分析仪还收集直流阻抗(DC)测量值，其是细胞施加多少阻抗的测量。该DC测量值是通过施加使得细胞膜不被渗透、并且没有电流穿过细胞时的最大电流而得到的，也被称为Coulter体积或容积。
发明内容
本申请针对的是颗粒分析仪数据的分析。在一种实施方式中，对血细胞样品中的难以血影化细胞进行计数的自动方法可能包括：将血细胞样品与核酸染色剂和血影化试剂相混合，以便从红血细胞中除去血红蛋白，借此产生经血影化处理的血细胞样品；使经血影化处理的血细胞样品穿过细胞计数流动池(cytometric flow cell)；通过使用两种不同的光学测量法，分析细胞计数流动池中的经血影化处理的血细胞样品；通过检测两种不同的光学测量值，区分难以血影化细胞；以及对难以血影化细胞进行计数。
在另一个实施方式中，分析血液样品的方法可能包括：通过包含轴向光损失测量的检测，测量流动池中的血液样品，从而产生事件数据；以轴向光损失测量为基础，利用事件数据，识别难以血影化细胞种群；从所述事件数据中滤出(filter-out)难以血影化细胞种群；以及分析事件数据，以便识别血细胞分布模式。在滤出难以血影化细胞之后，能够进行包含网织红细胞分析的分析。
在一些实施方式中，分析血液样品的方法可能包括如下步骤：利用通过轴向光损失测量法产生的事件数据，对难以血影化细胞的种群进行计数。在一种实施方式的实例中，能够以难以血影化细胞占全体红血细胞种群的％进行报告。所述数值可以用作仅供研究使用(RUO)的参数、或者可以被拓展成体外诊断的(IVD)参数。
在另一种实施方式中，对血细胞样品中的难以血影化细胞进行计数的自动方法可能包括：将血细胞样品与核酸染色荧光染料和血影化试剂相混合，其中所述核酸染色荧光染料用于对含有核酸的血细胞进行染色，所述血影化试剂用于从血细胞样品的红血细胞中除去血红蛋白，借此产生经血影化处理的血细胞样品；使经血影化处理的血细胞样品穿过细胞计数流动池；通过使用光散射测量法和荧光测量法，分析细胞计数流动池中的经血影化处理的血细胞样品；通过检测荧光测量值和光散射测量值，将难以血影化细胞与荧光染色后的含有核酸的细胞和血影细胞区分开来；以及对难以血影化细胞进行计数。
以下参考附图，对本发明的其他特征和优点、以及其各种实施方式的结构与操作进行详细的描述。应注意，本发明不局限于在此描述的特定实施方式。在此描述的这些实施方式仅用于示例性目的。以在此包含的教导为基础，附加的实施方式对于本领域技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1是使用流式细胞仪对血液样品进行分析所得到的事件数据视图，是两维的。
图2显示了根据本发明的实施方式分析血液样品中未成熟网织红细胞中的步骤。
图3显示了根据本发明的一种实施方式的图2中所示预处理步骤的更多细节。
图4显示了根据本发明的一种实施方式的图2中所示测量步骤的更多细节。
图5(A)和5(B)是来自血液样品分析的事件数据的二维视图。图5(B)是除去了难以血影化细胞种群的图5(A)所示事件数据的视图。
图6显示了与图5(A)所示相同的事件种群，但是其使用轴向光损失(ALL)和UMALS来代替常规的DC和UMALS。
图7(A-C)显示了几个显示事件数据的二维视图，它们具有识别难以血影化细胞种群的变化能力。
图8显示了根据本发明的另一种实施方式的图2中所示测量步骤的更多细节。
图9是根据本发明的一种实施方式的一个用于评估未成熟网织红细胞的系统。
图10(A)显示了通过对来自健康个体的血液样品进行分析所得到的事件数据的三维视图。在视图中可以清楚地区分难以血影化细胞1010、成熟红血细胞1020、以及网织红细胞1030。
图10(B)显示了通过对来自诊断有镰刀形红细胞贫血病的病人的血液样品进行分析所得到的事件数据的三维视图。在视图中可以清楚地区分难以血影化细胞1010、成熟红血细胞1020、以及网织红细胞1030。
图10(C)显示了通过对来自诊断有地中海贫血的病人的血液样品进行分析所得到的事件数据的三维视图。在视图中可以清楚地区分难以血影化细胞1010、成熟红血细胞1020、以及网织红细胞1030。
图11显示了从健康个体中抽取的血液样品中的“难以血影化”细胞的平均百分比。
图12显示了从罹患各种疾病的病人中抽取的血液样品中的“难以血影化”细胞的平均百分比。
基于下文阐述的具体实施方式，结合附图，本发明的特征和优点将变得更加显而易见。在附图中，比如附图标记通常表示相同的、功能类似的、和/或结构类似的组成部分。一般来讲，其中组成部分首先出现的附图的编号被表示为对应的附图标记中最左边的数字。
具体实施方式
本发明涉及颗粒分析数据处理。虽然在此参考用于特殊应用的示例性实施方式对本发明进行了描述，但应理解本发明并不限于这些实施方式。本领域的技术人员根据此处的教导，将认识到在本发明的保护范围内有附加的变型、应用、以及实施方式，并且认识到本发明在其他领域也有重要的应用。
概要
如上文背景技术描述的那样，确定血液样品中红血细胞的分布的自动化能力对于数种应用而言是重要的能力。在此公开的方法和系统可产生一种改善的测量血液样品中细胞群的自动化测量方法。在一种实施方式中，使用在此提供的方法，可区分难以血影化细胞，并且进行计数。
可以实施本发明的示例性环境包括颗粒分析仪，比如贝克曼考尔特公司的DxH800系统。该DxH800系统，例如使用考尔特公司的专利Volume(容积)、Conductivity(电导率)、以及LightScatter(光散射)(VCS)技术来评估在流动池内部被水动力集中的细胞。VCS采用下述三个独立的彼此和协地工作的能源，用于细胞测量：低频直流电源，用于测量容积；高频电源，用于测量电导率；激光源，用于测量散射。利用考尔特(Coulter)的电阻抗原理，进行体积测量，用于物理地测量等渗稀释剂中的全部细胞替代物(displace)体积。该方法可精确地根据大小划分所有的细胞类型，不管它们在光程中如何定向。射频(RF)范围内的交流电使细胞膜的双极性脂质层发生短路，允许能量穿透细胞。这种强力的方法被用于收集有关细胞大小和内部结构的信息，包括化学成分和细胞核体积。激光和多角度光散射检测器可提供有关细胞内部结构、颗粒性、以及表面形态的信息。另外，VCS装置采用高精确度的体积DC测量法以便得到其它测量值，所述测量值由电导率和散射值被调整用于细胞大小。然而，应注意，在本公开中的教导并不局限于使用VCS技术的装置。
图1显示了以事件数据为基础的血液样品的二维散布图，所述事件数据是由使用颗粒分析仪进行血液测量而产生的。在散布图中出现的每一个数据点都是以选出的由一个细胞事件获得的测量值为基础，其中细胞事件是单个细胞被流动池中的电流和激光光束探询(interrogation)。通常在血液样品中发现的不同细胞类型的事件数据种群被显示在散布图中。一般来讲，充分的分离存在于作为整体的红细胞种群(即，红细胞102和网织红细胞104)、血小板108种群、以及白细胞106种群之间，已知的技术允许将红细胞种群作为整体进行门控(gating)，例如，基于被直线122和直线124限定的区域进行门控。门控指的是从多参数数据中过滤选择的测量值的过程，例如，如上所述，通过相对于已知的阈值，对每个细胞事件所产生的测量值进行检验来分离红细胞(红血球和网织红细胞)、血小板和白细胞。例如，线124可能是阈值体积数值而线122可能是阈值光散射数值，其中使用高于线124的体积测量值和小于线122的光散射数值(经常以Log光散射值的形式使用)的细胞事件要么对应于红细胞、要么对应于网织红细胞。在现有的系统中，网织红细胞种群例如还可以通过细胞系比如线130进行门控。在线130右边的事件是网织红细胞，反之，在线130左边的事件是成熟红细胞。
分析网织红细胞
在一个方面，提供了用于分析血液样品中网织红细胞的方法。图2是在根据本发明的一种实施方式评估网织红细胞中的步骤流程图。在步骤202中，制备血液样品，用于在颗粒分析仪中进行分析。该制备可能包括血影化血液样品并且/或者用合适的染料或染色剂对样品进行染色。图3进一步详细地显示了根据一个实施方式的制备步骤202。在步骤302中，血液样品能够与活体染料结合以便进一步描绘网织红细胞。例如，能够使用可沉淀出网织红细胞的胞内核糖核酸(RNA)的非荧光性染料。合适的染色剂的例子包括，但不限于，新亚甲基蓝(被称为Coulter Retic PakTM的试剂A)、噁嗪750、以及亮甲酚蓝。已经被沉淀的RNA将会具有高密度，这将增强对于每个细胞中RNA含量的描绘。使用非荧光染料来测量网织红细胞具有附加的优点，允许血液样品必要时可通过利用荧光染料而被进一步分析其他的组分。合适的荧光染料的例子包括，但不限于，噻唑橙(thiazole orange)和聚甲川(polymethine)。附加的准备性步骤在本发明中可以呈各种实施方式。例如，在一些实施方式中，荧光染料能够与血液样品结合，以便通过使用荧光测量法来测量样品的附加性能。
为了进一步实施血液样品的成分的检查，能够将血液样品与试剂相结合，该试剂比如是含有硫氰酸钾和硫酸的网织红细胞血影化溶液(步骤304)。可以得到作为商品的该类型的血影化试剂，该商品是被称为Coulter Retic PakTM的试剂B。也可以使用已为本领域技术人员所熟知的其他血影化试剂。该血影化过程可释放红血细胞中的血红蛋白，得到血影细胞。在此使用的术语“血影细胞”指的是已除去了其大约70％的血红蛋白含量的红血细胞。优选该细胞中超过90％、更优选超过95％的血红蛋白已被除去。换句话说，血影细胞仅保留了少于其30％的初始血红蛋白。血红蛋白含量的下降可增强网状组织的限定，从而允许进行网织红细胞的细胞计数流式测定。更具体地讲，红血细胞中血红蛋白含量的下降使得当通过包含光散射和DC的非荧光性方法进行测量时能够进行网织红细胞与成熟RBC的区分。
除了有利于血红蛋白的释放之外，血影化过程还可以球形化红血细胞从而使所述细胞具有更规则的形状，并且因此允许进行更可预测的光散射测量。天然的网织红细胞具有不规则的形状，当经受光束时，可产生不可预知的光散射信息。红血细胞的球形化可提供可再现的光散射信息，该信息可形成用于确定样品中网织红细胞的基础。在一些实施方式中，使血液样品与球形化试剂相结合或许是有利的。使用的球形化试剂的量有效地引起网状红细胞和红血细胞定容地球形化，以便除去在网织红细胞分析中的定向性人为因素。在一些实施方式中，球形化试剂是两性离子表面活性剂，其可定容地球形化红血细胞。适合本发明的球形化试剂的例子包括，但不限于：月桂酸酰胺丙基甜菜碱(lauroamidopropylbetaine)、椰油酸酰胺丙基甜菜碱(cocoamidopropylbetaine)和椰油酸酰胺硫代甜菜碱(cocoamidosulfobetaine)。
此前已经发现，血影化过程受温度的影响。低于55°F的温度会出现血影化过程延迟，并且需要比较长的时间周期以便允许血影化过程发生。在一些实施方式中，在至少55°的温度下将血液样品与血影化溶液混合大约30秒钟。在一种实施方式中，在106°F(41℃)下进行血液样品的血影化。
在一些实施方式中，血影化溶液的pH应该不高于3.0。在一种实施方式中，血影化的溶液pH是大约1.0至2.0。另外，似乎是酸性的血影化溶液可增溶血红蛋白并且促进其从血细胞中的去除。已经注意到，当利用硫氰酸钾时，硫酸是优选的在组合物中使用的酸。硫氰酸钾的优选浓度是大约1.0至6.0克每升，并且硫酸的优选浓度是大约0.7至3.0克每升。
应该控制血影化溶液的渗透压以便使血细胞可进行快速的、但受控制的溶胀。血影化溶液的渗透压应该是至少大约75毫渗透压克分子。该渗透压可引起血细胞在与血影化溶液混合三十(30)秒钟内溶胀并释放血红蛋白。如果渗透压小于大约75毫渗透压克分子，那么血细胞将不能保留完整的细胞膜，并且将会溶解。更具体地讲，较低的渗透压会导致红细胞受损害，以致于网织红细胞计数不可靠。如果渗透压不足，则血细胞将会保留血红蛋白，这将会使网织红细胞的区分变得模糊。在一些实施方式中，血影化溶液的渗透压的范围是大约75至大约110毫渗透压克分子。在其他实施方式中，血影化溶液的渗透压在大约82至大约105毫渗透压克分子的范围内。
返回到图2，在步骤204中，使用颗粒分析仪来分析血液样品。在一种实施方式中，颗粒分析仪是血液分析仪。例如，将血液样品、或其一部分导入颗粒分析仪中。在流体动压力下，血液样品流动，细胞逐个地经过流动细胞。在流动池内，测量单个细胞的数个参数。例如，采用VCS技术的颗粒分析仪能够同时地对每个细胞进行细胞的体积大小、细胞的电导率、以及光散射的测定。图4是根据本发明的一种实施方式中步骤204进一步详细描述的流程图。
在步骤402中，将步骤202中制备的血液样品导入流动池中用于分析。在步骤404中，在一种实施方式中，当样品流动时，细胞逐个地通过流动池中的探询点，样品被来自三个独立源的能量所探询。在步骤406中，对于每个细胞事件，记录光散射测量值。当RNA含量随着网织红细胞的成熟而降低时，据预期光散射测量值会下降。数种光散射测量法可能是可利用的，例如，但不限于，包括正向光散射测量法。正向散射可测量经过被探询的细胞、并且偏离光束轴的光。正向光散射的实例包括，但不限于，低中值角度(lowermedian angle)光散射(LMALS)、上中值角度(upper median angle)光散射(UMALS)、以及低角度(low angle)光散射(LALS)。LMALS指的是在相对于光束轴9°-19°角度处的光散射值，UMALS指的是在相对于光束轴20°-43°角度处的光散射，LALS指的是在相对于光束轴大约5.1°角度处的光散射。另一种光散射测量值--侧角光散射(SALS)，能够测量在90°角度处的光散射。在一些实施方式中，血液样品的分析将包括轴向光损失(ALL)的测量。ALL是在相对于光束轴大约0°至0.5°角度处的光损失的量。
在步骤408中，收集作为网织红细胞成熟的另一种测量值。例如，在本发明的一种实施方式中，能够测量细胞的尺寸。细胞的大小已知随着网织红细胞的成熟而减小，一般来讲，由于RNA含量下降。作为一个实例，细胞的尺寸、或细胞体积，能够通过使用DC测量法而被测量。DC波的峰值振幅是细胞体积的函数。在该步骤中能够使用指示网织红细胞成熟的其他测量法，包括测量细胞体积的直接方式或者间接方式。例如，能够使用用于指示细胞中RNA含量的荧光测量法、或者测量细胞体积的其他方式。作为另一个实例，还可以将正向散射用于指示细胞大小。
返回到图2，在步骤206中，从全部的细胞事件种群中识别出网织红细胞种群。使用不同轴的事件数据的散射图可帮助识别血细胞分布模式。作为一个实例，在散布图中能够目测事件数据，比如图1，其中光散射是在X轴上，而体积(DC)是在Y轴上。如同较早地指示的那样，就图1而言，能够将网织红细胞种群104与红细胞102、血小板108、白细胞106相分离地识别开来。网织红细胞种群的精度尤其取决于如何明确地确定将网织红细胞与红细胞分开的线130。例如，在一种实施方式中，虽然能够以阈值光散射和凭经验由在前收集的测量值衍生的体积测定值为基础，将线130叠加在散布图100上，但线130可能无法正确地将红细胞102与网织红细胞(104)分离开来，特别是就在散布图100中处于非常近似于线130的细胞事件而言。
再一次返回图2，在步骤207中，能够报道一种以上网织红细胞测量值。在一种实施方式中，网织红细胞部分被报告为在映射函数上限定的预定编号的区域相对于全部红血细胞种群的比率。在另一个实施方式中，网织红细胞能够被报告为百分率或者绝对数。报告涉及将一种以上测量值输出到显示器或者其他输出装置比如计算机文件上。
检测难以血影化细胞
在一个方面，本发明的方法允许报告的网织红细胞检测精度得到改善，具有更精确的样本数据，以此为基础来计算网织红细胞信息。在一些血液样品中已经观察到，在初始血影化过程之后，一些细胞依然是或者未被血影化；或者仅被部分地血影化，即“难以血影化”细胞。为本发明的目的，术语“难以血影化细胞”指的是这样的细胞：其仍然保留了至少大约超过30％的初始血红蛋白含量。换句话说，难以血影化细胞中已除去小于70％的初始血红蛋白。优选该细胞具有超过50％、更优选超过70％的初始血红蛋白含量。血影化过程，例如，通过将低渗性的酸性溶液与血液样品相结合，是用来清除来自该细胞的血红蛋白。未经血影化或者无效血影化(即，当时细胞失去的血红蛋白含量少于大约30％)，可能无法清楚地将红细胞与网织红细胞区别开来。血影细胞与难以血影化细胞相比的差异的另一个视图能够在图6中看出，图6显示了位于轴向光损失对UMALS的散布图上部的难以血影化细胞种群610。当难以血影化细胞存在于血液样品中、并且使用光散射和轴向光损失来分析血液样品时，网织红细胞与成熟红细胞的区分可能会失败，因为难以血影化细胞种群是稠密的、并且通常位于网织红细胞区域内部。本发明的一些实施方式涉及到检测全体血细胞种群中的难以血影化细胞。
图5(A)和5(B)显示了在有和没有难以血影化细胞事件的情况下相同事件数据的散布图中存在的对比情况，该对比使用常规的光散射或者上中值角度光散射(UMALS)、以及DC轴。在图5(A)中，散布图包含难以血影化细胞事件。边界510显示了难以血影化细胞事件种群的位置。图5(B)显示了在难以血影化细胞事件被除去之后的相同事件种群，包含边界510限定的种群。在图5(A)和5(B)中，低于边界530的事件对应于血小板，并且在边界520右边的事件对应于白细胞。如同能够通过边界510的定位所看到的那样，难以血影化细胞事件种群跨越成熟红血细胞种群和网织红细胞种群的分离，因此使得难以清楚地区分成熟红血细胞和网织红细胞。相反，当难以血影化细胞事件种群被除去时，如图5(B)所示，在成熟红血细胞和网织红细胞之间能够限定出清楚的边界511。图5(A)和5(B)的视图比较显示了当难以血影化细胞存在时，难以将成熟红细胞与网织红细胞相识别并且分离。
在本实施方式中，轴向光损失测量法使得能够将难以血影化种群与样品中其他种群区别开来。本发明的发明人出乎意料地发现，基于惯常使用的光散射测量法所不能识别难以血影化种群的相同事件种群现在可以通过使用轴向光损失测量法来区分出种群。例如，图6显示了与图5(A)所示相同的事件种群，但是其使用轴向光损失(ALL)和UMALS来代替常规的DC和UMALS。通过使用ALL，难以血影化细胞事件能够被清楚地识别，如边界610内部区域所显示的那样。
图7(A-C)显示了在本发明的一种实施方式中，使用ALL来除去另一个血液样品中的难以血影化细胞事件。散布图710显示了通常使用的UMALS和DC。在散布图710中，存在难以血影化细胞(如边界711内部所示)，但是不能清楚地与其他红血细胞区别开来。然而，当相同的数据被显示在散布图720中时，检测难以血影化细胞的能力被极大地改善。散布图720具有轴向光损失(ALL)和UMALS作为数轴。基于ALL，难以血影化种群721可被清楚地与其他的事件种群相区别。
在本发明的一种实施方式中，对应于难以血影化种群的细胞事件能够被滤出，并且剩余的细胞事件能够被显示在使用UMALS轴和DC轴的散布图比如730中。能够要么自动地基于例如凭经验确定的阈值ALL和UMALS数值、要么使用人工操作辅助手段而通过门控难以血影化种群，来完成对应于难以血影化种群的细胞事件的滤出。散布图730和710的视觉比较显示了在边界731左边的成熟红血细胞种群与边界731右边的网织红细胞种群之间更清楚的区别。
如图6(具体地说，在边界610内部的区域)和图7(A-C)(具体地说，在边界721内部的区域)所示，当使用ALL时，能够将难以血影化细胞作为与其他种群比如成熟红血细胞、网织红细胞、血小板和白细胞不同的种群而识别出来。难以血影化细胞通常展示出与其他血细胞类型(除白细胞之外)相比更高的ALL。由于白细胞相对于其他血细胞类型的高光散射测量值，白细胞能够被区分。难以血影化细胞种群的高ALL可能是归因于相对较高的血红蛋白光吸收。在488nm的激光波长(在产生图5(A)、5(B)、图6和图7(A-C)所示结果的颗粒分析仪中使用的波长)下，血红蛋白显示出非常高的导致高水平ALL的光吸收。一般来讲，当光是在400-500nm之间的波长时，血红蛋白显示出提高的光吸收。
被分析的血液样品中难以血影化细胞的检测能够通过本发明图8中所示的实施方式来完成。在图8中，进一步剖析图2中的步骤202，以便包括用于检测难以血影化细胞的步骤。在步骤802中，能够将制备的血液样品，即，已经被血影化和染色的样品引入流动池中用于分析。在步骤804中，通过使用包含就上述图2所说明的光束的测量法，样品被逐个细胞地探询。在步骤806中，收集ALL测量值，同时收集一种以上步骤810中的光散射测量值。光散射测量法的描述能够参考上述对于图2的描述。
在一种实施方式中，一旦难以血影化细胞被检测，这个事件数据就能够被用于更精确地分析网织红细胞。例如，通过使用网织红细胞事件的ALL数值，能够滤出难以血影化细胞种群，如同步骤812中所述。在本实施方式中，该事件数据将可被用于进一步分析来确定网织红细胞信息或者任何其他的红细胞信息，如步骤814中所述。一般来讲，难以血影化细胞事件种群的去除将会提高大多数有关红血细胞和/或网织红细胞的报告参数的精确度。网织红细胞信息的计算和报告在上述对于图2中进行了描述。
对难以血影化细胞进行计数
本发明的一个方面涉及对血液样品中的难以血影化细胞进行计数。本发明的发明人出乎意料地发现，在血液样品中难以血影化细胞种群与血液病理学之间存在相关性。具体地讲，研究发现，在被分析的从罹患不同疾病的病人中收集的血液样品中，难以血影化细胞数量会提高，所述疾病的实例包括，但不限于：疾病比如血红蛋白病(例如，镰刀形红细胞贫血病和地中海贫血)，血液学恶性肿瘤(例如，白血病和淋巴瘤)，凝血和出血病症，以及HIV/AIDS，恶性肿瘤，以及自身免疫紊乱。另外，当将与难以血影化细胞在散布图中的位置与正常样本相比较时，可以得到关于这些疾病的其他信息。返回到图8，在检测后，能够对难以血影化细胞进行计数，如步骤813中所述。细胞的计数或数数是用于明确定义的细胞群比如目前限定的难以血影化细胞的公认技术。在一种实施方式中，难以血影化细胞部分被报告为难以血影化细胞相对于全部红血细胞种群的比率。在另一个实施方式中，难以血影化细胞能够被报告为百分率或者绝对数。所述数值可以用作仅供研究使用(RUO)的参数、或者可以被拓展成体外诊断的(IVD)参数。图10(A-C)显示了来自健康个体的血液样品中难以血影化细胞种群1010(图10(A))与来自罹患镰刀形红细胞贫血病(图10(B))和地中海贫血(图10(C))的病人的血液样品中难以血影化细胞种群的尺寸差异。如图10(A)和图11所示，在健康个体捐赠的血液样品中难以血影化细胞占全体RBC种群的百分率可以被忽略，即，小于大约0.01％。还可以确定，来自罹患许多特定病理学的病人的血液样品含有增加的难以血影化细胞种群(如图12所示)。这些病理学包括肾衰竭、肝癌、HIV、镰刀形红细胞贫血病、以及地中海贫血。与来自健康个体的难以血影化细胞群体的大小相比，在具有特定诊断疾病状态的病人的血液样品中，难以血影化细胞占全体RBC种群的百分率提高了至少10倍。在一些血液样品中，罹患疾病或紊乱的病人的难以血影化细胞种群比健康个体的难以血影化细胞种群大至少100倍。本发明的发明人对于该趋势的发现可能在确定难以血影化细胞的异常种群的存在方面是有用的，这可以进一步涉及到特定病理的存在。
可以使用备用的方法来对难以血影化细胞进行计数。更具体地说，通过血影化血液样品，并且通过使用已为本领域技术人员所熟知的光散射测量法逐个细胞地测量血细胞样品中的血红蛋白，本领域的技术人员能够分析该血液样品。具有大于30％的初始血红蛋白的那些细胞被认为是难以血影化细胞。换句话说，在散布图中难以血影化细胞将会比血影细胞具有更大的光散射。在该备用方法中，本领域的技术人员还可以使用荧光染料来区分网织红细胞和难以血影化细胞。
本领域的技术人员将会理解，能够实践本发明的环境比如流式细胞仪和血液分析仪，能够被编程以便报告难以血影化细胞种群的数值。该数值可能与个体的生物化学状态和/或生理状态相关连。例如，能够设定血液样品中难以血影化细胞占全体红血细胞的百分率的阈值，对应于健康个体中存在的难以血影化细胞数量。当来源于病人的血液样品中难以血影化细胞的数量超过这样的阈值时，能够怀疑为疾病状态，并且能够报告该血液样品，据此进一步进行病人的诊断评估。评估该血细胞计数结果的医生将会基于病人的症状、一般的健康状态、疾病或紊乱、性别、以及年龄来确定适当的进一步检查。在一种实施方式中，如果血液样品中难以血影化细胞的百分率超过阈值至少10倍，就能够报告该血液样品用于进一步评估。在另一个实施方式中，如果血液样品中难以血影化细胞的百分率超过阈值至少100倍，就能够报告该血液样品用于进一步评估。
确定血细胞信息的系统
图9显示了用于分析血液样品的根据本发明的一种实施方式的系统。使用连线940将颗粒分析仪910偶联于计算机901。任选地使用连接950将计算机901偶联于显示器920、和/或外部存储器装置921。计算机901能够包括处理器902、内存903、内部存储器904、输入模块905、输出模块906、以及网织红细胞模块(reticulocyte module)907。网织红细胞模块907能够包括检测器模块961、分析仪模块963、区分器模块965、以及报告模块(reporter module)967。
颗粒分析仪910可能包括血液分析仪、流式细胞仪、或能够借助于光束探询血液样品的类似装置。制备血液样品，输入颗粒分析仪910中用于分析。通过颗粒分析仪910产生的事件数据通过连线940被传递给计算机901。连线940可能是一种内部连接装置--比如外围部件互连(peripheral component interconnect，PCI)总线、或网络接线。通过在颗粒分析仪910中的血液样品分析产生的事件能够实时地或者呈分批方式地被传递至计算机901。
在计算机901内部经任何加工之后，事件数据然后在显示器920上被传递给用户、或者被储存在外部存储器装置921中。例如，通过计算机901内部的加工产生的散布图能够通过使用显示器920而被传递给用户。加工的事件数据还可以被储存，用于后面的分析和显示。外部存储装置921可能包括硬盘、或者其他类型的便携式存储器。
处理器902能够执行可使模块905、906和907能进行加工的指令。内存903提供这些加工所要求的暂时储存，并且内部存储器904能够提供与这些加工有关的数据和结果的暂时储存或者中间储存。内部存储器904还可以基于模块的指令和/或程序代码，以包含可计算机读取的程序代码的形式来储存控制逻辑，所述模块包括网织红细胞模块907的部件模块。
输入模块905可接受由颗粒分析仪910产生的事件数据。输入模块905能够包括将来自颗粒分析仪910的输入事件数据转化成被网织红细胞模块907理解的格式所要求的任何加工。输出模块906收集被网织红细胞模块907加工的事件数据，进行任何必要的转化，并且通过使用连线950而输出到显示器920或存储器920。连线950可能是一种装置--内部连接器比如PCI、或网络接线。显示器920可能是为观察颗粒分析仪数据而定做的显示设备、一般的显示器、或者任何能够输出颗粒分析结果的其他手段。
检测器模块961能够包括指令，用于将细胞事件的测量值或者参数确定为属于侧向散射，包括UMALS、正向散射、轴向光损失、以及DC。应注意，本发明的每一种实施方式都可能不能取得所有的上述测量值。可以存在一些在颗粒分析仪910上需要的构造，以便能够收集所有上述测量值。
分析仪模块963包含用于识别网织红细胞种群和/或难以血影化细胞种群、并且从其他类型的血细胞中分离这些种群的指令。在另一个实施方式中，分析仪模块963能够包含用于按如上所述过滤出对应于难以血影化细胞的细胞事件的指令。在又一个实施方式中，分析仪模块963能够包含对难以血影化细胞种群进行计数的指令。
区分器模块965能够包含可引起计算机确定待分析样品中未成熟网织红细胞信息的指令。例如，现在通过同时使用光散射测量值和第二种网织红细胞成熟测量值比如体积，可以研究使用模块963识别出的网织红细胞事件种群，以便区分成熟的网织红细胞和未成熟的网织红细胞。
报告模块967包含使得计算机901能将散布图显示给显示器920、并且还报告有用的血液样品中网织红细胞定量值的指令。网织红细胞部分或者网织红细胞百分率是一些能够被报告模块967所报告的定量值。报告模块967还可以包含用于报告有关难以血影化细胞种群的信息的指令。
在本公开中，被公开的方法通过测量值比如网织红细胞部分和难以血影化细胞能够提高血液样品分析的精确度。所公开的方法相对于现有的方法产生了实质的改进，并且能够在许多血液病理学检测和治疗方面导致显著的改进。本领域的技术人员将应理解，在此公开的技术能够适用于除在此描述的红细胞之外的其他细胞类型。
上述对本发明的描述是为了说明和描述目的。并非穷尽本发明或者用于将本发明限定为上述公开的形式，在上述教导下，可以有其他的变型和变化。选择和描述的实施方式是为了解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的技术人员能够更好地以各种实施方式利用本发明，可预期采用不同的变型。应当理解，除在现有技术领域限制的范围之外，附后的权利要求包含本发明的具体实施方式的其它选择。

Claims (20)

1.一种对血细胞样品中的难以血影化细胞进行计数的自动化方法，其包括：
(a)将血细胞样品与核酸染色剂和血影化试剂相混合，其中所述核酸染色剂用于对核酸进行染色，所述血影化试剂用于从血细胞样品的红血细胞中除去血红蛋白，借此产生经血影化处理的血细胞样品；
(b)使经血影化处理的血细胞样品经过细胞计数流动池；
(c)通过使用两种不同的光学测量，分析细胞计数流动池中的经血影化处理的血细胞样品；
(d)通过使用所述两种不同的光学测量进行分析，将经血影化处理的血细胞样品中的难以血影化细胞与其他细胞区分开来；以及
(e)对难以血影化细胞进行计数，
其中所述难以血影化细胞指的是这样的细胞：和血影化试剂相混合后，仍然保留了全部或部分的初始血红蛋白含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，血液样品与核酸染色染料的混合和与血影化试剂的混合是分别进行的。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色剂是荧光性的或者非荧光性的。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光学测量包含轴向光损失、荧光、或者光散射。
5.一种检测血液样品中难以血影化细胞的方法，其包括：
(a)将血液样品与血影化试剂相混合，以便从红血细胞中除去血红蛋白，借此产生经血影化处理的血液样品；
(b)在细胞计数流动池中，通过包括轴向光损失测量值在内的检测，来评估经血影化处理的血液样品，借此产生事件数据；以及
(c)采用事件数据的轴向光损失测量，来识别难以血影化细胞，
其中所述难以血影化细胞指的是这样的细胞：和血影化试剂相混合后，仍然保留了全部或部分的初始血红蛋白含量。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，采用轴向光损失测量来识别难以血影化细胞包括：将轴向光损失测量值与第一阈值比较、将光散射测量值与第二阈值比较，其中将轴向光损失测量值大于第一阈值、光散射测量值低于第二阈值识别为难以血影化细胞。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，光散射测量包括，但不限于：上中值角度光散射(UMALS)、低中值角度光散射(LMALS)、以及低角度光散射(LALS)。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，光散射测量是UMALS。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括收集直流阻抗测量。
10.一种对血液样品中难以血影化细胞进行计数的方法，其包括：
(a)将血液样品与血影化试剂相混合，以便从红血细胞中除去血红蛋白，借此产生经血影化处理的血液样品；
(b)在细胞计数流动池中，通过包括轴向光损失测量值在内的检测，评估经血影化处理的血液样品，借此产生事件数据；
(c)采用事件数据的轴向光损失测量，来识别难以血影化细胞；
(d)采用轴向光损失测量，对难以血影化细胞种群进行计数；以及
(e)报告血液样品中的难以血影化细胞种群，
其中所述难以血影化细胞指的是这样的细胞：和血影化试剂相混合后，仍然保留了全部或部分的初始血红蛋白含量。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，报告难以血影化细胞种群包括报告难以血影化细胞种群占全体红血细胞的比率。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，报告难以血影化细胞种群包括报告难以血影化细胞占全体红血细胞种群的百分率。
13.一种分析血液样品的方法，其包括：
(a)将血液样品与血影化试剂相混合，以便从红血细胞中除去血红蛋白，借此产生经血影化处理的血液样品；
(b)在细胞计数流动池中，通过包括轴向光损失测量值在内的检测，测量经血影化处理的血液样品，从而产生事件数据；
(c)基于所述轴向光损失测量值，使用事件数据来识别难以血影化细胞种群；
(d)从所述事件数据中过滤出难以血影化细胞种群；以及
(e)分析不含难以血影化细胞种群的事件数据，从而识别血细胞分布模式，
其中所述难以血影化细胞指的是这样的细胞：和血影化试剂相混合后，仍然保留了全部或部分的初始血红蛋白含量。
14.一种用于分析血液样品的系统，其包括：
至少一个处理器；
颗粒分析仪，其偶联于至少一个处理器并包含细胞计数流动池；
检测器模块，其偶联于至少一个处理器、并构造为可以基于包括对流动池中经血影化处理的血液样品的轴向光损失测量值在内的检测来产生事件数据；以及
分析仪模块，其偶联于至少一个处理器，并构造为可以基于所述轴向光损失测量值、使用事件数据来识别难以血影化细胞种群，
其中所述难以血影化细胞指的是这样的细胞：和血影化试剂相混合后，仍然保留了全部或部分的初始血红蛋白含量。
15.如权利要求14所述的系统，其特征在于，所述难以血影化细胞仍然保留了至少30％的初始血红蛋白含量，优选具有至少50％的初始血红蛋白含量，更优选具有至少70％的初始血红蛋白含量。
16.如权利要求14所述的系统，其特征在于，所述分析仪模块进一步构造为可以使用轴向光损失测量来对难以血影化细胞进行计数。
17.如权利要求14所述的系统，其特征在于，所述分析仪模块进一步构造为：
从所述事件数据中过滤出难以血影化细胞种群；以及
分析不含难以血影化细胞种群的事件数据，从而识别血细胞分布模式。
18.一种对血细胞样品中的难以血影化细胞进行计数的自动化方法，其包括：
(a)将血细胞样品与核酸染色荧光染料和血影化试剂相混合，其中所述核酸染色荧光染料用于对含有核酸的血细胞进行染色，所述血影化试剂用于从血细胞样品的红血细胞中除去血红蛋白，借此产生经血影化处理的血细胞样品；
(b)使经血影化处理的血细胞样品经过细胞计数流动池；
(c)通过使用光散射测量和荧光测量，分析细胞计数流动池中的经血影化处理的血细胞样品；
(d)通过使用荧光测量和光散射测量进行分析，将难以血影化细胞与含有核酸的荧光染色细胞和血影细胞区分开来；以及
(e)对难以血影化细胞进行计数，
其中所述难以血影化细胞指的是这样的细胞：和血影化试剂相混合后，仍然保留了全部或部分的初始血红蛋白含量。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，血液样品与核酸染色荧光染料的混合和与血影化试剂的混合是分别进行的。
20.如权利要求1、5、10、13和18任一项所述的方法，其特征在于，所述难以血影化细胞仍然保留了至少30％的初始血红蛋白含量，优选具有至少50％的初始血红蛋白含量，更优选具有至少70％的初始血红蛋白含量。
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