CN104749108B - 血中丝虫幼虫的检测方法、血液分析装置和信息处理系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种工作人员的工作量比过去更小的血中丝虫幼虫的检测方法、血液分析装置和信息处理系统。血液分析装置1在试样制备部件23中混合溶血剂、染色试剂和血液样本来制备测定试样，由检测部件24测定测定试样，获得特征参数——即荧光强度、前向散射光强度、前向散射光脉冲幅度和侧向散射光强度。根据获得的特征参数分类白细胞，并且将微丝蚴与白细胞区分开，检测出来，计数微丝蚴数量。信息处理单元5输出包括微丝蚴的计数值在内的分析结果界面。

Description

血中丝虫幼虫的检测方法、血液分析装置和信息处理系统
技术领域
本发明涉及一种从狗等动物的血液中检测丝虫幼虫的方法、血液分析装置及信息处理系统。
背景技术
由于丝虫（filaria，下同）这一寄生虫的寄生引起的疾病称为丝虫病。丝虫病是一种多发于狗的疾病，是一种主要通过蚊子感染的传染病。感染后的动物体内存在丝虫的成虫和幼虫。幼虫的一种——微丝蚴（microfilaria，下同）存在于感染的动物血液中，当蚊子吸血时移到蚊子体内，在蚊子体内成为有感染力的感染幼虫。蚊子吸其他动物的血时，感染幼虫移动到该动物的体内，以此感染。感染幼虫随着血流移到心脏，寄生于心脏和肺动脉并发育成成虫。
过去，丝虫病的检查使用的是以下方法：用显微镜肉眼观察血液样本的直接镜检法（参照专利文献1）、以及用免疫检查试剂盒从丝虫感染样本中检测特有抗原的检查法（参照专利文献2）。
专利文献
专利文献1：美国专利第4025306号说明书
专利文献2：特表平（日本专利公报平成）11-503609号公报。
发明内容
发明要解决的技术问题
然而，用上述直接镜检法检查丝虫病时，需要兽医等检查者用肉眼观察血液样本中的微丝蚴，费工又费时，检查者工作量很大。通过免疫检查试剂盒进行检查的话，在试剂中使用抗体，一般试剂较贵，成本很高。
因此，人们急需一种能够减轻工作人员负担、低成本、快速检测血中丝虫幼虫的办法。
解决问题的技术手段
为解决上述课题，本发明一种形态下的血中丝虫幼虫的检测方法具有以下步骤：由采自动物的血液样本制备测定试样的步骤；使制备的所述测定试样流入流动室的步骤；光照流经所述流动室的所述测定试样的步骤；检测光照下的所述测定试样发出的光的步骤；根据检测出的光的特征参数检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤。
由此，无需直接肉眼观察丝虫幼虫，无需使用昂贵的免疫检查试剂盒，能在减轻检查者工作量的同时，低成本、快速检测丝虫幼虫。
在此形态下，可以如下设置：在检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤中，根据所述特征参数将丝虫幼虫与所述测定试样中的血细胞区分开并检测出来。以此就能精确地检测丝虫幼虫。
优选地，在检测所述光的步骤中检测出的光包括光照下的所述测定试样发出的散射光，所述特征参数包括所述散射光的特征参数。
优选地，所述散射光的特征参数是散射光信号幅度。
优选地，在检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤中，将散射光信号幅度大于白细胞的粒子作为丝虫幼虫检测出来。
在上述形态下，可以如下设置：所述特征参数包括至少两种特征参数，在检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤中，根据所述至少两种特征参数将所述测定试样中的粒子分类为血细胞和丝虫幼虫，分别计数所分类的血细胞和丝虫幼虫。以此不仅能检测丝虫幼虫，还能检测血液样本中所含有的血细胞。此外还能定量测定血细胞和丝虫幼虫。
在上述形态下，可以如下设置：所述血细胞为白细胞，在检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤中，根据所述至少两种特征参数将所述测定试样中的白细胞分类为数类，按照种类分别计数所分出的各类白细胞。以此，在血液样本的一次测定中，不仅能够检测丝虫幼虫，还能够进行白细胞分类。
在上述形态下，可以如下设置：还具有输出界面的步骤，该界面包括：有所述至少两种特征参数各自的坐标轴、并显示所述坐标轴规定的坐标空间内丝虫幼虫的分布的分布图、以及丝虫幼虫的计数结果。以此，检查者能够从视觉上确认丝虫幼虫是如何分布的，能够掌握检测出的丝虫幼虫的数量。
优选地，在制备所述测定试样的步骤中，将用于染色血中粒子的染色试剂与所述血液样本混合，制备所述测定试样；在检测所述光的步骤中检测出的光包括光照下的所述测定试样发出的散射光和荧光；所述至少两种特征参数包括与所述散射光相关的特征参数和与所述荧光相关的特征参数。
优选地，与所述散射光相关的特征参数是散射光强度，与所述荧光相关的特征参数是荧光强度。
优选地，在所述检测光的步骤中检测出的光包括光照下的所述测定试样向不同方向发出的第一散射光和第二散射光；所述至少两种特征参数包括与所述第一散射光相关的特征参数和与所述第二散射光相关的特征参数。
优选地，与所述第一散射光相关的特征参数是第一散射光强度，与所述第二散射光相关的特征参数是第二散射光强度。
优选地，在制备所述测定试样的步骤中，将溶血剂与所述血液样本混合，制备所述测定试样。
优选地，所述血液样本采集自狗。
优选地，用自动血细胞分析装置自动进行所述各步骤。
优选地，在制备所述测定试样的步骤中，在不使用免疫学方法的情况下制备所述测定试样。
本发明一种形态下的血液分析装置具有：由采自动物的血液样本制备测定试样的试样制备部件、所述试样制备部件制备的所述测定试样向其中供应的流动室、光照流经所述流动室的所述测定试样的光源、检测所述测定试样在所述光源的光照下发出的光的光检测部件，以及根据所述光检测部件所检测出的光的特征参数检测所述测定试样中的丝虫幼虫的信息处理部件。
本发明一种形态下的信息处理系统是连接着测定单元的信息处理单元，该测定单元使由采自动物的血液样本制备的测定试样流入流动室，用光照射流经所述流动室的测定试样，检测光照下的测定试样发出的光，该信息处理系统具有：数据获取部分，用于获取包括所述测定单元检测出的光的特征参数在内的测定数据；检测部分，根据所述数据获取部分获得的所述测定数据中所包含的所述特征参数，检测测定试样中的丝虫幼虫。
附图说明
图1为实施方式涉及的血液分析装置的结构示意图；
图2为光学检测部件的结构概要图；
图3为示意性说明与前向散射光相关的特征参数的脉冲信号图；
图4为血液分析装置进行白细胞分类及微丝蚴检测测定时的作业步骤流程图；
图5为测定数据中前向散射光脉冲幅度及前向散射光强度的散点图；
图6为测定数据中侧向散射光强度及荧光强度的散点图；
图7为分析结果界面的一例示图；
图8为用XN-1000的WDF通道（channel，下同）分析从丝虫病感染动物采集的样本和正常样本时的结果散点图；
图9为用XN-1000的WNR通道分析从丝虫病感染动物采集的样本和正常样本的结果散点图；
图10为用XN-1000的WDF通道、WNR通道和目测得到的从丝虫病感染动物采集的三个样本的微丝蚴各测定值的比较图；
图11为示意性说明与前向散射光相关的其他特征参数的例子的脉冲信号图。
具体实施方式
下面参照附图就本发明的理想实施方式进行说明。本实施方式的方法是用搭载了流式细胞仪的自动血液分析装置检测采自动物的血液中所含有的丝虫幼虫的一种，即微丝蚴。
[血液分析装置的结构]
图1为本实施方式涉及的血液分析装置的结构示意图。本实施方式涉及的血液分析装置1是一种按照种类检测采自动物的全血样本中所含有的血细胞并计数各血细胞的动物用多项目血细胞分析装置。血液分析装置1是一种多种动物对应型的血液分析装置，它从狗、猫、兔子等各种动物中接受对一种动物的指定，通过与所指定的动物种类相应的测定模式进行作业。如图1所示，血液分析装置1具有测定单元2、以及能够控制测定单元2的信息处理单元5。
从动物（如狗）采集的末梢血——即全血样本装入样本容器（采血管）T。此样本容器T所装有的全血样本由测定单元2测定。本实施方式的血液分析装置以狗、猫、兔等饲养动物和家畜动物为主要检查对象。本说明书中使用“动物”这一用语时也包括人。
<测定单元的结构>
下面就测定单元的结构进行说明。如图1所示，测定单元2具有：将样本容器T取入测定单元2的机壳内的样本容器设置部件21、从样本容器T吸移血液样本的样本吸移部件22、由样本吸移部件22所吸移的血液制备测定用测定试样的试样制备部件23、从试样制备部件23制备的测定试样检测血细胞的检测部件24、由CPU及存储器等构成的控制部件25。
样本容器设置部件21有能够插入样本容器T的孔部21a，将样本容器T插入此孔部21a，以此设置样本容器T。样本容器设置部件21能够在测定单元2的机壳内外移动。设置了样本容器T的样本容器设置部件21从测定单元2外侧向内侧移动，由此样本容器T被取入测定单元2。从测定单元2排出样本容器T时，设置有样本容器T的样本容器设置部件21从测定单元2内侧向外侧移动。
样本容器设置部件21能够向测定单元2内的吸移位置21b移动。样本容器设置部件21移到吸移位置21b后样本吸移部件22会从样本容器T吸移血液样本。
样本吸移部件22有吸管221。样本吸移部件22具有注射泵（无图示）。吸管221能够向垂直方向移动，通过向下移动，吸移运送到吸移位置21b的样本容器T内的血液样本。
试样制备部件23有无图示的混合室。吸管221通过注射泵从样本容器T吸移一定量全血样本，所吸移的样本送到混合室的位置，由所述注射泵向混合室供应一定量全血样本。试样制备部件23具有用于加热混合室的加热器。
试样制备部件23通过管（tube）连接着试剂容器23a。具体而言，装溶血剂的试剂容器、装染色试剂的试剂容器、装鞘液（稀释液）的试剂容器等连接着试样制备部件23。上述溶血剂和染色试剂是后述白细胞分类及微丝蚴的测定中用的试剂。这些溶血剂和染色试剂都是不需要运用免疫学技术即可检测微丝蚴的试剂。所谓“不需要运用免疫学技术”指不使用识别微丝蚴细胞表面抗原并能够进行结合的抗体。由此试剂容器23a向试样制备部件23的混合室供应试剂。
检测部件24拥有能够进行白细胞分类和微丝蚴测定的光学检测部件D。在白细胞分类和微丝蚴测定中，血液样本中的白细胞被分类为LYMPH（淋巴细胞）、EO（嗜酸性粒细胞）、NEUT（嗜中性粒细胞）、BASO（嗜碱性粒细胞）和MONO（单核细胞）五个亚类。此外，在白细胞分类和微丝蚴测定中，除了进行上述白细胞五分类以外，还检测血液样本中的微丝蚴。
在此白细胞分类和微丝蚴测定中，由试样制备部件23制备通过混合全血样本、上述溶血剂和上述染色试剂而得到的测定试样，制备的测定试样供给光学检测部件D，此时，光学检测部件D检测特征参数（荧光强度、前向散射光强度、前向散射光脉冲幅度和侧向散射光强度）。测得的特征参数作为测定数据经由控制部件25传送到信息处理单元5，信息处理单元5对测定数据进行分析，以此对全血样本中的白细胞进行检测和分类，并检测微丝蚴。
图2为光学检测部件D的结构概要图。此光学检测部件D将测定试样和鞘液送入流动室231，使流动室231内产生液流，激光照射通过流动室231的液流中所含有的粒子，进行测定，其具有鞘流系统232、射束点形成系统233、前向散射光受光系统234、侧向散射光受光系统235和荧光受光系统236。
鞘流系统232使测定试样和鞘液流入流动室231内，并使测定试样中的粒子在鞘液包裹下流动。射束点形成系统233使激光光源237照射的光通过准直透镜（collimatorlens）238和聚光透镜（condenser lens）239，照射到流动室231。射束点形成系统233还具有束霖止器（beam stopper）240。
前向散射光受光系统234通过前向集光透镜241将向前的散射光聚集起来，用前向散射光受光部件243接收穿过针孔242的光。前向散射光受光部件243输出与接收的前向散射光强度相应的脉冲信号。图3为前向散射光受光部件243输出的脉冲信号的示意图。如此图所示，超过一定阈值的脉冲波峰高度对应前向散射光信号强度，超过一定阈值的脉冲幅度对应前向散射光脉冲幅度。前向散射光受光部件243使用光电二极管或光电倍增管。
侧向散射光受光系统235用侧向集光透镜244聚集侧向的散射光，并用分色镜245反射一部分光，通过侧向散射光受光部件246接收光。侧向散射光受光部件246输出与接收的侧向散射光的强度相应的脉冲信号。与图3的说明同样地，超过一定阈值的脉冲波峰高度对应侧向散射光强度，超过一定阈值的脉冲幅度对应侧向散射光脉冲幅度。侧向散射光受光部件246使用光电二极管或光电倍增管。
光散射是指粒子作为障碍物存在于光的前进方向上，使光改变其前进方向而产生的现象。检测这种散射光就能够获得有关粒子大小和成分的信息。前向散射光强度反映粒子的表面积和大小。侧向散射光强度反映粒子内部的复杂程度（核的形状、核的大小、密度和颗粒数量）。前向散射光脉冲幅度反映粒子通过射束点所需要的时间、即粒子的全长。
微丝蚴形状呈细长丝状，全长比白细胞及其他血细胞长。因此，微丝蚴从鞘流室231中通过时的前向散射光脉冲幅度比包括白细胞在内的其他血细胞通过鞘流室231时的前向散射光脉冲幅度大。因此，前向散射光脉冲幅度特别适宜用于微丝蚴检测。侧向散射光脉冲幅度也反映与前向散射光脉冲幅度基本相同的粒子性状，因此，也能够用侧向散射光脉冲幅度取代前向散射光脉冲幅度来检测微丝蚴。
荧光受光系统236进一步让透过分色镜245的光通过分光滤光器247，用荧光受光部件248接受该光。荧光受光部件248输出与接收的侧向散射光强度相应的脉冲信号。与图3的说明同样地，超过一定阈值的脉冲波峰高度对应荧光强度，超过一定阈值的脉冲幅度对应荧光脉冲幅度。荧光受光部件248可以使用光电二极管、雪崩光电二极管或光电倍增管。
当全血样本、溶血剂和染色试剂混合在一起时，血细胞的核会被染色试剂中所含有的荧光物质染色，微丝蚴表面会附着荧光物质。一般来说，血细胞核的染色程度比微丝蚴更强。用光照射被荧光物质染色的粒子（血细胞或微丝蚴），会发出波长长于照射光波长的光。染色越充分荧光强度就越强，通过测定这种荧光强度即可获得有关粒子染色程度的信息。因此，荧光强度的差异能够用于白细胞的分类和微丝蚴的检测。
检测部件24将光学检测部件D的各受光部件243、246、248输出的模拟的脉冲信号转换成数字信号，并将其传送到控制部件25。
控制部件25由CPU和存储器等组成，通过执行控制程序来控制测定单元2的各个部分。控制部件25有无图示的通信部件，能够与信息处理单元5传输数据。由检测部件24进行了A/D转换的脉冲信号提供给控制部件25，该控制部件25对其进行波形分析，以此，如参照图3所作出的说明，求出各粒子的特征参数，生成测定数据，将此测定数据发送至信息处理单元5。针对各粒子，特征参数包括荧光强度、荧光脉冲幅度、前向散射光强度、前向散射光脉冲幅度、侧向散射光强度和侧向散射光脉冲幅度。
<信息处理单元的结构>
下面就信息处理单元5的结构进行说明。信息处理单元5由计算机构成。如图1所示，计算机5有CPU51a、ROM51b、RAM51c、硬盘（HDD）51d、读取装置51e、输入输出接口51f、通信接口51g和图像输出接口51h，CPU51a、ROM51b、RAM51c、硬盘51d、读取装置51e、输入输出接口51f、通信接口51g和图像输出接口51h由总线51j连接。
硬盘51d中安装有操作系统和应用程序等供CPU51ａ执行的各种计算机程序及执行该计算机程序时所需要的数据。后述测定数据分析用计算机程序54a也安装在此硬盘51d中。存在硬盘51d的应用程序具有与狗、猫、兔等多种动物相应的多种测定模式。更详细而言，应用程序启动，操作人员从多种动物中选择一种动物，则设定为对应于该动物的测定模式。硬盘51d中存有各测定模式用的基于测定顺序（sequence）和分析算法（algorithm）的程序代码，CPU51ａ读取与所设定的测定模式相应的程序代码，并据此进行测定单元2的控制、对从测定单元2获得的测定数据进行分析。本实施方式涉及的计算机程序54a在存在硬盘51d的操作系统上运行。
读取装置51ｅ由软盘驱动器（flexible disk drive）、CD-ROM驱动器或DVD-ROM驱动器等构成。读取装置51ｅ能够从存有使计算机发挥信息处理单元5的功能的计算机程序54a的CD或DVD等移动存储介质读取所述计算机程序54a，并将该计算机程序54a装入硬盘51d。
输入输出接口51f上连接着由键盘、鼠标、触摸屏等构成的输入部件53，操作人员能够用该输入部件53向计算机5输入数据。操作人员操作输入部件53，上述动物种类由此输入到CPU51a。
通信接口51g通过LAN连接到测定单元2的控制部件25。以此，信息处理单元5能够向测定单元2传送作业指示数据，也能够接收测定数据。
图像输出接口51h连接着由LCD或CRT等构成的显示部件52，其向显示部件52输出与CPU51a提供的图像数据相应的影像信号。显示部件52按照所输入的影像信号显示界面。
[血液分析装置的测定作业]
下面就本实施方式涉及的血液分析装置1的作业进行说明。
图4为血液分析装置1进行白细胞分类及微丝蚴检测测定时的作业步骤流程图。首先，信息处理单元5的CPU51a在显示部件52上显示动物种类的选择界面，接受操作人员对动物种类的输入（步骤S1）。动物种类输入后，CPU51a便设定与所输入的动物种类相应的测定模式（步骤S2）。接着，测定单元2的控制部件25等待测定开始指示（步骤S3）。按下设在测定单元2中的无图示的测定开始按钮，以此下达测定开始指示。当测定开始按钮未按下时（步骤S3为否），控制部件25反复进行步骤S3的处理。
操作人员将装有采自狗等动物的全血样本的样本容器T插入伸出到测定单元2外侧的样本容器设置部件21的孔部21a，按下测定开始按钮（步骤S3为是）。以此开始样本测定作业。
样本测定作业开始后，样本容器设置部件21便退到测定单元2内，样本容器T被取入测定单元2。样本容器设置部件21移到吸移位置21b后，吸管221插入样本容器T内，吸移全血样本（步骤S4）。
接下来，在测定单元2中，在控制部件25的控制下，制备测定试样（步骤S5）。在此处理中，将一定量的样本吸移部件22吸移的全血样本供给试样制备部件23的混合室，再从试剂容器23a供给混合室溶血剂和染色试剂，在混合室内对血液样本、溶血剂和染色试剂进行混合搅拌，制备测定试样。
然后，以制备的测定试样为对象，在光学检测部件D进行光学测定（步骤S6）。在步骤S6的处理中，具体而言，在激光光源237向流动室231照射激光的状态下，测定试样和鞘液同时供应到光学检测部件D的流动室231，此时产生的前向散射光被前向散射光受光部件243接收，侧向散射光被侧向散射光受光部件246接收，荧光被荧光受光部件248接收。这些光学检测部件D的各受光元件输出的输出信号（模拟信号）由检测部件24的A/D转换器转换成数字信号，由检测部件24的信号处理电路进行一定信号处理后，以数字信号提供给控制部件25。控制部件25从此数字信号中提取包括与各粒子相应的前向散射光强度、前向散射光脉冲幅度、侧向散射光强度及荧光强度在内的各类特征参数，生成包含特征参数在内的测定数据。然后，控制部件25向信息处理单元5发送测定数据（步骤S7）。
血液分析装置1的信息处理单元5从测定单元2接收测定数据（步骤S8）。
在步骤S9，CPU51a用测定数据将白细胞分成五个亚类，计数属于各亚类的血细胞的数量。在步骤S9的处理中，微丝蚴与其他血细胞区分开并检测出来，且计数检测出的微丝蚴的数量。
下面详细说明步骤S9的处理。图5为以前向散射光脉冲幅度和前向散射光强度为轴的散点图中簇（cluster）出现区域的示意图。在图5所示散点图中，微丝蚴簇和白细胞簇出现在互不相同的位置。如上所述，微丝蚴比白细胞全长长，故出现在前向散射光脉冲幅度数值比白细胞高的区域。在前向散射光脉冲幅度和前向散射光强度的散点图中，微丝蚴出现的位置是固定的。因此，在本实施方式，预先设定微丝蚴检测用门（gate）（检测区）G。定义微丝蚴检测用门（gate）G的数值范围储存在硬盘51d。步骤S9处理中，CPU51a将前向散射光脉冲幅度和前向散射光强度的值分别在定义为微丝蚴检测用门（gate）G的数值范围内的粒子作为微丝蚴检测出来。在步骤S9的处理中，CPU51a对如此检测出的微丝蚴数量进行计数。
图6为以侧向散射光强度和荧光强度为轴的散点图中簇出现区域的示意图。在图6所示散点图中，出现嗜酸性粒细胞簇、嗜中性粒细胞簇、嗜碱性粒细胞簇、淋巴细胞簇、单核细胞簇和微丝蚴簇。如图6散点图所示，CPU51a将白细胞与微丝蚴区分出来，并分类为嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞。在步骤S9的处理中，如此分类的各亚类的白细胞数由CPU51a计数。微丝蚴簇与白细胞亚类的簇不重复，不会影响白细胞分类。
在步骤S10，CPU51a根据计数的微丝蚴数量判断作为该样本的采集源的被测动物是否疑似患有丝虫病（步骤S10）。在此处理中，判断计数的微丝蚴数量CN是否在一定基准值T以上。微丝蚴数量CN在基准值T以上时，判断疑似患有丝虫病，微丝蚴数量CN低于基准值T时，判断并非疑似患有丝虫病。
在步骤S11，CPU51a将如上获得的分析结果存入硬盘51d（步骤S11）。CPU51a还使显示部件52显示表示存入硬盘51d的分析结果的分析结果界面（步骤S12），结束处理。
分析结果界面上显示上述获得的粒子（血细胞和微丝蚴）数和比例等数值数据以及粒子的分布图。数值数据包括淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞及微丝蚴的各个计数值、以及淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞各自在白细胞总数中所占比例。此外，分布图包括侧向散射光强度和荧光强度的散点图、侧向散射光强度和前向散射光强度的散点图以及前向散射光脉冲幅度和前向散射光强度的散点图。
图7为分析结果界面的一例的示图。如图7所示，分析结果界面R上部设有样本的样本ID和被测动物种类（狗、猫等）的显示区A1。显示区A1下方设有显示数值数据的显示区A2、显示信息（message）的显示区A3和显示分布图的显示区A4。
显示区A2显示白细胞、红细胞、血小板、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等的各计数值（ＷＢＣ、ＲＢＣ、ＰＬＴ、ＮＥＵＴ＃、ＬＹＭＰ＃、ＭＯＮＯ＃、ＥＯＳＩ＃、ＢＡＳＯ＃）、以及嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞各自在白细胞总数中所占比例（ＮＥＵＴ％、ＬＹＭＰ％、ＭＯＮＯ％、ＥＯＳＩ％、ＢＡＳＯ％）等数值数据。微丝蚴的计数值以Ｍ－ＦＩＬＡ这一项目名显示。
关于显示区A3，在上述步骤S10判断被测动物疑似患有丝虫病时，显示表示该内容的信息“丝虫病？”。
显示区A4显示用于检测微丝蚴的散点图，即前向散射光脉冲幅度（FSCW）和前向散射光强度（FSC）的散点图S。
显示如上所述分析结果界面R，如果显示区A3出现“丝虫病？”这一信息，检查者就能够掌握被测动物疑似患有丝虫病。此外，检查者还可通过确认显示区A2的微丝蚴计数值或显示区A4的散点图S来验证上述判断是否正确。
检查者还能够通过确认白细胞亚类的测定结果来判断微丝蚴对白细胞的计数值是否有影响。或者，通过确认白细胞亚类的计数值来验证患有丝虫病这一装置的判断是否正确。感染丝虫病后，嗜酸性粒细胞会呈增加趋势，因此，根据嗜酸性粒细胞的计数值和比例也能够验证分析结果。
上述白细胞分类是所有健康诊断中几乎必需的血液检查项目之一，它是分辨疑似异常样本和正常样本的一部分，即筛选检查的一部分。在本实施方式中，在白细胞分类的同时，能够检查是否患有丝虫病，因此不用另行进行直接镜检，无需使用专用的检查试剂盒进行传统丝虫检查，在一般健康诊断中就能够筛选丝虫病样本。因此，能够趁着健康诊断的机会筛查出疑似患有丝虫病的样本，能够发现过去容易忽略的丝虫感染样本，并进行进一步的精密检查。同时，还有望早期发现丝虫病。在本实施方式中，从测定试样的制备到微丝蚴的检测、丝虫病疑似病例的诊断全部能够由血液分析装置自动进行，与直接镜检法或使用检查试剂盒的传统方法相比，能够减轻检查者的工作量。本实施方式涉及的血液分析装置无需使用免疫学方法就能制备测定试样，因此能够抑制成本，而且本实施方式能够采用流式细胞技术进行速度检查。
本方法在定量性上也优于传统的丝虫检查方法。直接镜检法或使用专用检查试剂盒的传统丝虫检查均是以确认有无感染为目的的半定量或定性检查，至今为止尚无能够定量血中微丝蚴数的检查方法。过去的丝虫病治疗是根据末梢血中的半定量微丝蚴指数或动物症状判断用药量和药剂种类，但如果能对微丝蚴进行定量检查的话，能够恰当决定用药量和药剂种类等治疗方针。本实施方式涉及的丝虫检查方法能够定量全血样本中所含有的微丝蚴数量，与以往丝虫检查相比，能够制定出更恰当的治疗方针。
此外，在使用白细胞分类用试剂的一次样本测定中，除了白细胞分类外，还能检测微丝蚴，因此，不用单独为检测微丝蚴消耗试剂，能够控制试剂的消耗量。这将控制试剂的生产量和废液的处理量，能够控制给环境造成的负担。此外，还能够使过去的直接镜检法消耗的染料或检查试剂盒的使用量减少，因此能够控制给环境造成的负担。此外，本方法不是过去的免疫检查试剂盒一类的免疫学结构，因此也不需要用于获取抗体的实验动物。
在上述实施方式，关于检测微丝蚴的特别合适的特征参数的组合，例示了前向散射光脉冲幅度和前向散射光强度的组合，还例示了用荧光强度和侧向散射光强度的组合进行白细胞分类。如此，用与白细胞分类不同的特征参数组合——尤其是前向散射光脉冲幅度来检测微丝蚴的优点在于：着眼于微丝蚴与其他血细胞最明显的不同在于粒子全长这一点，以此就能检测微丝蚴。即使丝虫病与其他疾病的合并症等导致血液中含有异常血细胞（如幼稚细胞和血小板凝集等），这些异常血细胞的全长也不可能与微丝蚴同日而语，因此，即使样本中含有微丝蚴以外的异常血细胞，也能够非常可信地检测微丝蚴。
因此，最好是用前向散射光脉冲幅度检测微丝蚴，但如图6所示，用前向散射光信号脉冲幅度以外的特征参数也能够将微丝蚴与其他血细胞区分开并检测出来，因此，不一定要如上述实施方式那样使用前向散射光脉冲幅度，也不一定要在微丝蚴检测和白细胞分类中使用互不相同的特征参数。也能够如后述图8的S11那样，用荧光强度和侧向散射光强度的组合检测微丝蚴，还能够如后述图8的S12那样，用前向散射光强度和侧向散射光强度的组合检测微丝蚴。
在上述实施方式中，用为分类白细胞而制备的测定试样检测微丝蚴、进行白细胞分类，但微丝蚴检测不必与白细胞分类同时进行。也可以专门为检测微丝蚴而制备测定试样，也可以如后述图9的S14、S15那样，不进行白细胞分类，根据对用于测定白细胞总数（WBC）的测定试样进行测定所获得的特征参数，检测微丝蚴。
[验证试验]
本发明人为验证本实施方式涉及的血中微丝蚴的检测方法（以下称“本方法”）的功能而进行了试验。下面就验证试验进行说明。
用希森美康公司生产的多项目自动血细胞分析装置XN-1000的改造版（变更软件，使之能测定微丝蚴）分析从患丝虫病的被测动物采集的样本（样本1）和正常样本（样本2）。对这六份样本分别用XN-1000的WDF通道（白细胞分类用通道）和WNR通道（白细胞和网织红细胞测定用通道）两者进行了测定。在WDF通道测定中，使用XN-1000专用的白细胞分类用试剂（溶血剂和染色试剂），在WNR通道测定中，使用XN-1000专用的白细胞和网织红细胞测定用试剂（溶血剂和染色试剂）。
图8为用WDF通道分析上述样本1和2所得到的结果的散点图。在图8中，S11是样本1的侧向散射光强度和荧光强度的散点图，S12是样本1的侧向散射光强度和前向散射光强度的散点图，S13是样本1的前向散射光脉冲幅度和前向散射光强度的散点图。S21是样本2的侧向散射光强度和荧光强度的散点图，S22是样本2的侧向散射光强度和前向散射光强度的散点图，S23是样本2的前向散射光脉冲幅度和前向散射光强度的散点图。
如图8所示，在散点图S11，淋巴细胞簇、单核细胞簇、嗜酸性粒细胞簇、嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞构成的血细胞群的簇、以及微丝蚴簇分别出现在不同位置。而另一方面，在散点图S21，淋巴细胞簇、单核细胞簇、嗜酸性粒细胞簇、以及嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞构成的血细胞群的簇出现了，但微丝蚴簇未出现。由此得知，采用WDF通道，如果使用侧向散射光强度和荧光强度，则能够将微丝蚴与淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞区分开，将其检测出来。
此外，在散点图S12，白细胞（淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞）的簇和微丝蚴的簇分别出现在不同位置。而在散点图S22，白细胞的簇出现了，但微丝蚴的簇并未出现。由此得知，采用WDF通道时，使用侧向散射光强度和前向散射光强度也能将微丝蚴与白细胞区分开，将其检测出来。
在散点图S13，白细胞的簇和微丝蚴的簇分别出现在不同位置。而在散点图S23，白细胞的簇出现了，但微丝蚴的簇并未出现。由此得知，采用WDF通道时，使用前向散射光脉冲幅度和前向散射光强度也能将微丝蚴与白细胞区分开，将其检测出来。
此外，在散点图S13，在前向散射光强度（纵轴）上基本布满白细胞，白细胞出现区域与微丝蚴出现区域重叠。而在前向散射光脉冲幅度（横轴）上，白细胞出现在较低水平的区域，微丝蚴出现在水平高于白细胞的区域，二者的区域未重叠。由此得知，采用WDF通道，只使用前向散射光脉冲幅度就能将微丝蚴与白细胞区分开，将其检测出来。
图9为用WNR通道分析上述样本1和2的所得到的结果的散点图。在图9中，S14是样本1的荧光强度和前向散射光强度的散点图，S15是样本1的侧向散射光强度和前向散射光强度的散点图。S24是样本2的荧光强度和前向散射光强度的散点图，S25是样本2的侧向散射光强度和前向散射光强度的散点图。
如图9所示，在散点图S14中，淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞构成的血细胞群的簇、微丝蚴簇分别出现在不同位置。而另一方面，在散点图S24，淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞构成的血细胞群的簇虽然出现了，但微丝蚴簇未出现。由此得知，采用WNR通道，如果使用荧光强度和前向散射光强度，则能够将微丝蚴与淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞区分开并检测出来。
在散点图S15，白细胞的簇和微丝蚴的簇分别出现在不同位置。而在散点图S25，白细胞的簇出现了，但微丝蚴的簇并未出现。由此得知，采用WNR通道，使用侧向散射光强度和前向散射光强度，也能够将微丝蚴与白细胞区分开，将其检测出来。
此外，本发明人还成功确认了，在WNR通道中也能只使用前向散射光脉冲幅度将微丝蚴与白细胞区分开，将其检测出来。
接着，验证了用同一测定试样检测微丝蚴和白细胞时的白细胞的计数值的精度。在XN-1000的WDF通道中进行测定时，除了计数微丝蚴数量，还对嗜酸性粒细胞数量（EO#）、嗜中性粒细胞数量（NEUT#）、嗜碱性粒细胞数量（BASO#）、淋巴细胞数量（LYMPH#）和单核细胞数量（MONO#）进行计数，并计算出嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞各自在全体白细胞（WBC）中所占的比例（EO%、NEUT%、BASO%、LYMPH%、MONO%）。在XN-1000的WNR通道中进行测定时，除了对微丝蚴数量进行计数，还对白细胞数量（WBC）进行了计数。作为本方法的比较实验，用希森美康公司生产的XT-4000iV和爱德士实验室公司（IDEXX Laboratories Inc）生产的ProCyte Dx测定了样本1、2，获得EO#、NEUT#、BASO#、LYMPH#、MONO#、EO%、NEUT%、BASO%、LYMPH%、MONO%和WBC。在这些比较试验中，分别使用了各种装置的专用试剂。下表为其比较结果。
【表1】
从样本1看，XN-1000对白细胞的计数值与XT-4000iV和ProCyte Dx的计数值均基本相同。由此就能知道，在本方法中，与微丝蚴同时计数的白细胞总数和白细胞亚类均得到了正确测定。
接下来，准备三份丝虫感染样本（上述样本1之外又加了样本3、4），分别比较了用XN-1000得到的分析结果。图10为用XN-1000的WDF通道、WNR通道和目测方式得到的样本1、3、4的微丝蚴的各测定值的比较图。
如图10所示，在通过目测进行检测的方法（以下称“镜检法”）中，关于1μL样本中的微丝蚴数，样本1为51.6，样本3为35.2，样本4为19.4，按照样本1、3、4的顺序逐渐减少。与此相对，采用了WDF通道的本方法的检测结果为：样本1为68.5，样本3为49.4，样本4为31.9。采用了WNR通道的本方法的检测结果为：样本1为64.7，样本3为43.3，样本4为30.9。即，采用本方法，虽然各个数值比镜检法的结果大，但是WDF通道和WNR通道的结果均按照样本1、3、4的顺序逐渐减少，与镜检法的结果具有相关性。由此就能够知道，本方法具有足够的定量精度。
（其他实施方式）
在上述实施方式的示例中，检测出微丝蚴作为血中存在的丝虫幼虫，但只要是血中出现的丝虫幼虫即可，也可以检测包鞘幼虫（广义上的微丝蚴），还可以检测从携载体（carrier）侵入体内的感染幼虫。
在上述实施方式中，用一份测定试样检测微丝蚴并进行白细胞分类，但不限于此。也可以与白细胞分类用测定试样分开制备用于检测微丝蚴的测定试样，分别就各测定试样进行测定。
在上述实施方式中，检测微丝蚴用的测定试样使用了溶血剂，但不限于此。也可以在不用溶血剂的情况下检测微丝蚴。此时，红细胞会出现在荧光强度水平较低的区域，但红细胞出现的区域与微丝蚴出现的区域不同，因此能够检测出微丝蚴。另外，还能够在不使用染色试剂的情况下测定样本，检测微丝蚴。此时，使用前向散射光脉冲幅度或使用侧向散射光强度和前向散射光强度就能够检测微丝蚴。
在上述实施方式中，将前向散射光脉冲幅度、前向散射光强度、侧向散射光强度和荧光强度组合一在起，检测微丝蚴，但不限于此。也可以用侧向散射光脉冲幅度或荧光脉冲幅度取代前向散射光脉冲幅度。还可以用反映粒子全长的其他特征参数取代散射光和荧光的脉冲幅度。图11为示意性说明与前向散射光相关的其他特征参数的例子的脉冲信号图。例如，如图11所示，超过一定阈值的脉冲的曲线下面积也可以用作检测微丝蚴的特征参数。
在上述实施方式中，微丝蚴检测用门（gate）G是固定设定的，检测出此门G内的粒子作为微丝蚴，但不限于此。还可以用美国专利第5555196号说明书中记述的方法聚类（clustering）粒子，以此将微丝蚴与其他粒子区分开并检测出来。美国专利第5555196号说明书作为参考纳入本说明书。
在上述实施方式中，微丝蚴检测用门（gate）G是固定设定的，与动物种类无关，但也可以使用分别与多种动物相对应的微丝蚴检测用门（gate）G。此时，在硬盘51d中，与多种动物相对应地分别事先存入用于定义门的数值范围，读取操作人员指定的动物种类所对应的门，并将其用于微丝蚴的检测分析。另外，在图4的步骤S10使用的丝虫病判断基准值T也可以根据动物种类设定为不同的值。
在上述实施方式中，控制部件25控制测定单元2各部件的作业，CPU51a进行测定数据的分析处理，但不限于此。也可以由一个控制部件（CPU）进行测定单元2各部件的作业控制和测定数据的分析处理。此时，也可以不分别设置测定单元2和信息处理单元5，而将测定单元2和信息处理单元5的功能集中于一台装置。
在上述实施方式中，由一台计算机5执行计算机程序54a的全部处理，但不限于此，也可以采用分散系统，即，将与上述计算机程序54a相同的处理分散开来由几台装置（计算机）分别执行。
【标号说明】
1 血液分析装置
2 测定单元
22 样本吸移部件
23 试样制备部件
23a 试剂容器
24 检测部件
231 流动室
237 激光光源
243 前向散射光受光部件
246 侧向散射光受光部件
248 荧光受光部件
25 控制部件
5 信息处理单元
51a CPU
51d 硬盘
52 显示部件
54a 计算机程序
D 光学检测部件
R 分析结果界面

Claims (18)

1.一种血中丝虫幼虫的检测方法，包括以下步骤：
由采自动物的血液样本制备测定试样的步骤；
使制备的所述测定试样流入流动室的步骤；
光照流经所述流动室的所述测定试样的步骤；
检测光照下的所述测定试样发出的光的步骤；
根据检测出的光的特征参数检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤；
其中，在制备所述测定试样的步骤中，在不使用识别丝虫幼虫细胞表面抗原并进行结合的抗体的情况下通过将用于染色血中粒子的染色试剂与所述血液样本混合来制备所述测定试样。
2.根据权利要求1所述的血中丝虫幼虫的检测方法，其特征在于：
在检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤中，根据所述特征参数将丝虫幼虫与所述测定试样中的血细胞区分开并检测出来。
3.根据权利要求2所述的血中丝虫幼虫的检测方法，其特征在于：
在检测所述光的步骤中检测出的光包括光照下的所述测定试样发出的散射光，所述特征参数包括所述散射光的特征参数。
4.根据权利要求3所述的血中丝虫幼虫的检测方法，其特征在于：
所述散射光的特征参数是散射光信号幅度。
5.一种血中丝虫幼虫的检测方法，包括以下步骤：
由采自动物的血液样本制备测定试样的步骤；
使制备的所述测定试样流入流动室的步骤；
光照流经所述流动室的所述测定试样的步骤；
检测光照下的所述测定试样发出的、包括散射光在内的光的步骤；
根据作为检测出的光的特征参数的散射光信号幅度将丝虫幼虫与所述测定试样中的血细胞区分开并检测出来的步骤；其中，
在检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤中，将散射光信号幅度大于白细胞的粒子作为丝虫幼虫检测出来。
6.根据权利要求1所述的血中丝虫幼虫的检测方法，其特征在于：
所述特征参数包括至少两种特征参数；
在检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤中，根据所述至少两种特征参数将所述测定试样中的粒子分类为血细胞和丝虫幼虫，分别计数所分类的血细胞和丝虫幼虫。
7.一种血中丝虫幼虫的检测方法，包括以下步骤：
由采自动物的血液样本制备测定试样的步骤；
使制备的所述测定试样流入流动室的步骤；
光照流经所述流动室的所述测定试样的步骤；
检测光照下的所述测定试样发出的光的步骤；
根据检测出的光的特征参数将丝虫幼虫与所述测定试样中的血细胞区分开并检测出来的步骤；其中，
所述特征参数包括至少两种特征参数；
在检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤中，根据所述至少两种特征参数将所述测定试样中的粒子分类为血细胞和丝虫幼虫，分别计数所分类的血细胞和丝虫幼虫；
所述血细胞为白细胞；
在检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤中，根据所述至少两种特征参数将所述测定试样中的白细胞分类为数类，按照种类分别计数所分出的各类白细胞。
8.一种血中丝虫幼虫的检测方法，包括以下步骤：
由采自动物的血液样本制备测定试样的步骤；
使制备的所述测定试样流入流动室的步骤；
光照流经所述流动室的所述测定试样的步骤；
检测光照下的所述测定试样发出的光的步骤；
根据检测出的光的特征参数将丝虫幼虫与所述测定试样中的血细胞区分开并检测出来的步骤；其中，
所述特征参数包括至少两种特征参数；
在检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤中，根据所述至少两种特征参数将所述测定试样中的粒子分类为血细胞和丝虫幼虫，分别计数所分类的血细胞和丝虫幼虫；
所述检测方法还具有输出界面的步骤，所述界面包括：有所述至少两种特征参数各自的坐标轴、并显示在所述坐标轴规定的坐标空间内丝虫幼虫的分布的分布图以及丝虫幼虫的计数结果。
9.一种血中丝虫幼虫的检测方法，包括以下步骤：
由采自动物的血液样本制备测定试样的步骤；
使制备的所述测定试样流入流动室的步骤；
光照流经所述流动室的所述测定试样的步骤；
检测光照下的所述测定试样发出的光的步骤；
根据检测出的光的特征参数将丝虫幼虫与所述测定试样中的血细胞区分开并检测出来的步骤；其中，
所述特征参数包括至少两种特征参数；
在检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤中，根据所述至少两种特征参数将所述测定试样中的粒子分类为血细胞和丝虫幼虫，分别计数所分类的血细胞和丝虫幼虫；
在制备所述测定试样的步骤中，将用于染色血中粒子的染色试剂与所述血液样本混合，制备所述测定试样；
在检测所述光的步骤中检测出的光包括光照下的所述测定试样发出的散射光和荧光；
所述至少两种特征参数包括与所述散射光相关的特征参数和与所述荧光相关的特征参数。
10.根据权利要求9所述的血中丝虫幼虫的检测方法，其特征在于：
与所述散射光相关的特征参数是散射光强度，与所述荧光相关的特征参数是荧光强度。
11.根据权利要求7或8所述的血中丝虫幼虫的检测方法，其特征在于：
在所述检测光的步骤中检测出的光包括光照下的所述测定试样向不同方向发出的第一散射光和第二散射光；
所述至少两种特征参数包括与所述第一散射光相关的特征参数和与所述第二散射光相关的特征参数。
12.根据权利要求11所述的血中丝虫幼虫的检测方法，其特征在于：
与所述第一散射光相关的特征参数是第一散射光强度，与所述第二散射光相关的特征参数是第二散射光强度。
13.一种血中丝虫幼虫的检测方法，包括以下步骤：
由采自动物的血液样本制备测定试样的步骤；
使制备的所述测定试样流入流动室的步骤；
光照流经所述流动室的所述测定试样的步骤；
检测光照下的所述测定试样发出的光的步骤；
根据检测出的光的特征参数检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤；其中，
在制备所述测定试样的步骤中，将溶血剂与所述血液样本混合，制备所述测定试样。
14.根据权利要求1、7～9、以及13其中任意一项所述的血中丝虫幼虫的检测方法，其特征在于：
所述血液样本采集自狗。
15.根据权利要求1、7～9、以及13其中任意一项所述的血中丝虫幼虫的检测方法，其特征在于：
用自动血细胞分析装置自动进行制备所述测定试样的步骤、使所述测定试样流入流动室的步骤、光照所述测定试样的步骤、检测所述光的步骤、以及检测所述测定试样中的丝虫幼虫的步骤。
16.根据权利要求7和8其中任意一项所述的血中丝虫幼虫的检测方法，其特征在于：
在制备所述测定试样的步骤中，在不使用识别丝虫幼虫细胞表面抗原并进行结合的抗体的情况下通过将用于染色血中粒子的染色试剂与所述血液样本混合来制备所述测定试样。
17.一种血液分析装置，包括：
在不使用识别丝虫幼虫细胞表面抗原并进行结合的抗体的情况下通过将用于染色血中粒子的染色试剂与采自动物的血液样本混合来制备测定试样的试样制备部件；
所述试样制备部件制备的所述测定试样向其中供应的流动室；
用光照射流经所述流动室的所述测定试样的光源；
检测所述测定试样在所述光源的光照下发出的光的光检测部件；以及
根据所述光检测部件所检测出的光的特征参数将丝虫幼虫与所述测定试样中的血细胞区分开并检测出来的信息处理部件。
18.一种连接着测定单元的信息处理系统，所述测定单元使在不使用识别丝虫幼虫细胞表面抗原并进行结合的抗体的情况下通过将用于染色血中粒子的染色试剂与采自动物的血液样本混合来制备的测定试样流入流动室，用光照射流经所述流动室的所述测定试样，并检测光照下的所述测定试样发出的光；
所述信息处理系统包括：
数据获取部分，用于获取包括所述测定单元检测出的光的特征参数在内的测定数据；
检测部分，根据所述数据获取部分获得的所述测定数据中所包含的所述特征参数，将丝虫幼虫与所述测定试样中的血细胞区分开并检测出来。
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