RU2768152C1 - Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в суправитально окрашенном препарате крови - Google Patents
Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в суправитально окрашенном препарате крови Download PDFInfo
- Publication number
- RU2768152C1 RU2768152C1 RU2021129097A RU2021129097A RU2768152C1 RU 2768152 C1 RU2768152 C1 RU 2768152C1 RU 2021129097 A RU2021129097 A RU 2021129097A RU 2021129097 A RU2021129097 A RU 2021129097A RU 2768152 C1 RU2768152 C1 RU 2768152C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- netosis
- cells
- orange
- red
- morphological
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, патофизиологии и экспериментальной медицине, и может быть использовано для обнаружения морфологических эквивалентов этапов формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ). Выделенную на двойном градиенте плотности раствора фиколла-верографина взвесь нейтрофилов после стимуляции смесью Lactobacillus reutri, L. acidophilius, L. rhamnosis и Bifidumbacterium longum суправитально окрашивают с использованием интеркалирующего красителя йодида пропидия и инкубируют под покровным стеклом в темноте в течение 5 минут при 37°С с моноклональными антителами к специфическому для нейтрофилов антигену CD15, мечеными флуоресцентным красителем FITC. Результаты визуализируют с помощью люминесцентной микроскопии, используя возбуждающий светофильтр с диапазоном длин волн 450-480 нм и эмиссионный - в диапазоне длин волн 515-700 нм. Подсчитывают морфологические эквиваленты клеток, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции: интактные клетки ярко-зеленого цвета без прокрашенного ядра, слабоактивированные клетки с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и слабопрокрашенным ядром, активированные клетки с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и красно-оранжевым ядром, гиперактивированные клетки - поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и увеличенным в размере красно-оранжевым ядром, достигающим границы цитолеммы, гиперактивированные клетки с начальными признаками нетоза - ранний нетоз - с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и увеличенным в размере красно-оранжевым ядром с визуализируемым выходом ядерного вещества хотя бы в одной локации. Одномоментно с клеточными эквивалентами подсчитывают два варианта нетоза: нитевидный нетоз - красно-оранжевые структурированные нитевидные НВЛ, превышающие размер клетки более чем в 2 раза, облаковидный нетоз - неструктурированные гомогенные НВЛ красно-оранжевого цвета, расположенные вокруг клетки-источника, превышающие размер клетки в 1,5-2 раза. Отдельно подсчитывают количество микроорганизмов, находящихся непосредственно в нейтрофильных ловушках в пересчете на одну сеть с последующим расчетом процентного соотношения разных групп морфологических элементов - морфологический профиль нетоза. Способ обеспечивает не только возможность идентификации жизнеспособных (интактных) нейтрофилов, но и определения морфологических эквивалентов клеток, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции, раннего нетоза и возможном выявлении экспрессированных на их поверхности специфических антигенов дифференцировки лейкоцитов с одновременной визуализацией НВЛ за счет двухцветной окраски препарата - структуры ярко-зеленого цвета (CD15-FITC) и прокрашенные йодидом пропидия нити ДНК красно-оранжевого цвета, позволяющей одномоментно определить нейтрофилы путем их иммунофенотипирования с визуализацией экспрессированных на поверхности дифференцировочных антигенов лейкоцитов (CD15), оценить их жизнеспособность и визуализировать нейтрофильные ловушки разного типа. 3 пр., 8 ил.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, патофизиологии и экспериментальной медицине, и может быть использовано для визуализации нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) [Brinkmann, V. Neutrophil extracellulartraps kill bacteria / V.Brinkmann, U.Rechard, C.Goosmann et al. // Sciense. - 2004. - Vol.303. - P.1532-1535], формируемых изолированными нейтрофилами после стимуляции специфическими стимуляторами (культура бактерий или специфический антиген).
Технической задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка метода, позволяющего одномоментно определить нейтрофилы путем их иммунофенотипирования с визуализацией экспрессированных на поверхности дифференцировочных антигенов лейкоцитов (CD15), оценить их жизнеспособность, идентифицировать морфологические эквиваленты клеток, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции и визуализировать нейтрофильные ловушки разного типа (нитевидные и облаковидные) с возможным подсчетом бактерий, захваченных сформировавшимися НВЛ.
Задача, на решение которой направлено изобретение, решается тем, что после стимуляции изолированных нейтрофилов бактериальным антигеном производят суправитальную окраску взвеси клеток с интеркалирующим ДНК-красителем не проникающим через неповрежденную клеточную мембрану (йодид пропидия, синонимы - propidium iodide, PI) с одновременной инкубацией с антителами к антигену CD15, меченными флуоресцентным красителем под покровным стеклом в темноте в строго контролируемых условиях (37°С) в течение 5 минут. В процессе активации нейтрофила йодид пропидия начинает проникать в клетку за счет повышения проницаемости мембраны нейтрофила, причем чем сильнее активация нейтрофила, тем больше йодида пропидия связывается с ДНК ядра гранулоцита.
Способ осуществляется следующим образом.
Нейтрофилы выделяют из 5 мл гепаринизированной периферической венозной крови. После центрифугирования на двойном градиенте плотности фиколла-верографина с плотностью верхнего градиента 1,077 и нижнего градиента 1,105 на границе между градиентами гранулоциты формируют кольцо. Собранные нейтрофилы дважды отмывают физиологическим раствором натрия хлорида. Затем после подсчета в камере Горяева концентрацию нейтрофилов доводят до 5000 клеток на 1 мкл. Следующий этап метода предусматривает стимуляцию нейтрофилов пробиотиком, содержащим смесь Lactobacillus reutri, L. acidophilius, L. rhamnosis и Bifidumbacterium longum. Гранулоциты инкубируют с пробиотиком 30 мин при 37°С. В качестве контроля используют нейтрофилы, инкубируемые в тех же условиях, но без пробиотика. Для окрашивания препарата к 10 мкл взвеси клеток добавляют 5 мкл йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 5 мкл моноклональных антител к CD15 меченые FITC в разведении 1:10. После чего одну каплю взвеси клеток переносят на обезжиренное предметное стекло, накрывают покровным стеклом. Предметное стекло во влажной камере помещают в суховоздушный термостат при 37°С на 5 минут.
Затем с помощью люминесцентной микроскопии, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны 450-480 нм и эмиссию с длиной волны от 515 нм, обнаруживают: жизнеспособные интактные клетки ярко-зеленого цвета (CD15-FITC) без прокрашенного ядра (Фиг. 1. Жизнеспособные нейтрофилы); морфологические эквиваленты клеток, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции: слабоактивированные клетки с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета (CD15-FITC) и слабопрокрашенным красным ядром (окрашено йодидом пропидия) (Фиг. 2. Слабоактивированные клетки), активированные клетки с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и красно-оранжевым ядром, не достигающим границы цитолеммы (Фиг. 3. Активированные клетки), гиперактивированные клетки - поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и увеличенным в размере красно-оранжевым ядром, достигающим границы цитолеммы (Фиг. 4. Гиперактивированные клетки), гиперактивированные клетки с начальными признаками нетоза (ранний нетоз) с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и увеличенным в размере красно-оранжевым ядром с визуализируемым выходом ядерного вещества хотя бы в одной локации, но не окружающее клетку со всех сторон (Фиг. 5. Ранний нетоз), одномоментно с клеточными эквивалентами подсчитываются два варианта нетоза: нитевидный нетоз - красно-оранжевые структурированные нитевидные нейтрофильные внеклеточные ловушки, превышающие размер клетки более чем в 2 раза (Фиг. 6. Нитевидные нейтрофильные ловушки с захваченными бактериями. Фиг. 7. Нитевидные нейтрофильные ловушки с остатками мембраны нейтрофила - клетки-источника нетоза), облаковидный нетоз - неструктурированные гомогенные нейтрофильные внеклеточные ловушки красно-оранжевого цвета, расположенные вокруг клетки-источника нетоза, превышающие размер клетки в 1,5-2 раза (Фиг. 8. Облаковидная нейтрофильная ловушка с остатками мембраны нейтрофила - клетки-источника нетоза).
После подсчета 100 структур разных групп морфологических элементов рассчитывают процентное содержание каждого элемента: интактных клеток, слабоактивированных клеток, активированных клеток, гиперактивированных клеток, раннего нетоза, НВЛ в виде нитей, и облаковидных НВЛ в препарате - морфологический профиль нетоза.
Морфологический профиль нетоза
1. Интактные клетки - (процентное содержание)
2. Активированные клетки:
2.1. Слабоактивированные - (процентное содержание)
2.2 Активированные - (процентное содержание)
2.3. Гиперактивированные - (процентное содержание)
3. Ранний нетоз - (процентное содержание)
4. Нетоз:
4.1. Нитевидный нетоз - (процентное содержание)
4.2. Облаковидный нетоз - (процентное содержание)
В препарате после стимуляции культурой бактерий, подсчитывают количество микроорганизмов, находящихся непосредственно в НВЛ в пересчете на одну сеть.
Из существующих способов визуализации НВЛ известны и запатентованы следующие:
После активации взвеси нейтрофилов in vitro различными активаторами (форболмиристатацетат, интерлейкин-8, культура бактерий) формируемые нейтрофилами НВЛ наблюдают с использованием методов световой и люминесцентной микроскопии.
Ряд авторов используют световую микроскопию с цитологическим окрашиванием мазка крови по Романовскому – Гимзе, с последующим подсчетом процента нейтрофилов, сформировавших НВЛ. При использовании данного метода НВЛ будет визуализироваться в виде нитевидных структур, окрашенных в красный цвет, по размеру превышающих нейтрофильный гранулоцит в 10-15 раз [Возможности люминесцентной и световой микроскопии при определении внеклеточных нейтрофильных ловушек / Дядичкина О.В., Коротина О.Л., Радецкая Л.Е., Генералов И.И. // Вестник Витебского государственного медицинского университета. - 2014. - Т. 13, № 5. - С. 81-86]. Недостатком указанного метода является тот факт, что окрашивание по Романовскому - Гимзе не является специфическим для структур ДНК и выявляет все продукты распада клеток крови независимо от их происхождения.
Другая группа методов заключается в использовании интеркалирующих ДНК-красителей, обладающих способностью к флуоресценции (акридиновый оранжевый, SYTOX, PicoGreen, Hoechst 33342, DAPI) с визуализацией продуктов их окрашивания при помощи люминесцентной микроскопии. В данном случае НВЛ будут представлены тонкими нитями, занимающими пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила и окрашенные в цвет, соответствующий спектру испускания флуоресцентного красителя. [Возможности люминесцентной и световой микроскопии при определении внеклеточных нейтрофильных ловушек /Дядичкина О.В., Коротина О.Л., Радецкая Л.Е., Генералов И.И. // Вестник Витебского государственного медицинского университета. - 2014. - Т. 13, № 5. - С. 81-86]. В частности, описан способ обнаружения нейтрофильных ловушек в клеточной взвеси, отличающийся тем, что фиксированный препарат окрашивают 200 мкл акридинового оранжевого в концентрации 0,2 мг/мл в течение 2 минут, результат учитывают с помощью люминесцентной микроскопии, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм. Обнаруживают ядра нейтрофилов, которые окрашиваются в ярко-зеленый цвет, цитоплазма гранулоцитов не окрашивается, нейтрофильные ловушки, представленные тонкими ярко-зелеными нитями, занимающие пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила, и бактерии-активаторы ярко-оранжевого цвета [Cпособ обнаружения нейтрофильных ловушек; пат. 2384844 Рос. Федерация; МПК G01N 33/48 (2006.01); No 2008112636/15; заявл. 01.04.2008; опубл. 10.10.2009 / Долгушин И.И., Андреева Ю.С.; заявитель и патентообладатель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию". - 5 с.].
Недостаток данного метода - окрашивание ДНК с помощью ДНК-специфичных красителей может быть заблокировано катионными пептидами [De Buhr, N. How Neutrophil Extracellular Traps Become Visible. / N. De Buhr, M. von Köckritz-Blickwede // Journal of Immunology Research. - 2016. - P. 1–13. - URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4884809/ (access date: 25.05.2021)]. Кроме того, во всех биологических жидкостях присутствует свободная внеклеточная ДНК [Козлов, В.А. Свободная внеклеточная ДНК в норме и при патологии. / В.А. Козлов // Медицинская иммунология. - 2013. - Т. 15, №5 - С. 399-412], которая в свою очередь также может окрашиваться интеркалирующими красителями, вызывая аналитическую интерференцию. В подобной ситуации результат оценки наличия ВЛН может быть ложноположительным.
Следующая группа методов обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек предусматривает совместную регистрацию результатов окраски интеркалирующими красителями и иммунофлюоресценции. Визуализация результатов также проводится при помощи люминесцентной микроскопии [NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers / S. Masudaa, D. Nakazawab, H. Shidab, A. Miyoshib, Y. Kusunokib, U. Tomaruc, A. Ishizu // Clinica Chimica Acta. - 2016. - Vol. 459. - P. 89-93]. Для иммунофлуоресценции используются антитела к белкам гранул нейтрофилов, таким как миелопероксидаза, нейтрофильная эластаза, протеиназа-3. По данным некоторых авторов, при одновременном окрашивании и совместной локализации белков нейтрофилов и внеклеточной ДНК предполагается, что наблюдаемая структура является НВЛ, поскольку данные белки оказываются во внеклеточном пространстве в процессе нетоза и остаются связанными с НВЛ [NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers / S. Masudaa, D. Nakazawab, H. Shidab, A. Miyoshib, Y. Kusunokib, U. Tomaruc, A. Ishizu // Clinica Chimica Acta. - 2016. - Vol. 459. - P. 89-93]. Однако, гранулы нейтрофильных ферментов по размеру существенно меньше ДНК-компонента ВЛН, что обеспечивает относительно слабую флуоресценцию этих структур на фоне интеркалирующего красителя и делает подобную комбинацию методов более применимой для проточной цитофлуориметрии, чем для микроскопии [Gavillet, M. Flow cytometric assay for direct quantification of neutrophil extracellular traps inblood samples / K. Martinod, R. Renella, C. Harris, N.I. Shapiro, D.D. Wagner, D.A. Williams // Am. J. Hematol. - 2015. - Vol. 90(12). - P. 1155–1158].
Основным недостатком указанных способов визуализации является потеря клетками жизнеспособности в процессе фиксации препарата и невозможность определить какие из клеток оставались жизнеспособными, а какие клетки подверглись некрозу или апоптозу, поскольку после фиксации препарата все клетки оказываются проницаемыми для интеркалирующего красителя. Другим недостатком данных методов является невозможность идентифицировать клетку-источник внеклеточной ДНК.
Технический результат, обеспечиваемый предложенной нами совокупностью действий, заключается не только в идентификации жизнеспособных (интактных) нейтрофилов, но и определении морфологических эквивалентов клеток, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции, раннего нетоза и возможном выявлении экспрессированных на их поверхности специфических антигенов дифференцировки лейкоцитов с одновременной визуализацией НВЛ. Окраска препарата двухцветная - структуры ярко-зеленого цвета (CD15-FITC) и прокрашенные йодидом пропидия нити ДНК красно-оранжевого цвета.
Клинические примеры
Пример 1
Окрашивали гранулоциты здорового мужчины К. 29 лет, выделенные на двойном градиенте плотности фиколла-верографина. Взвесь нейтрофилов стимулировали пробиотиком, содержащим смесь Lactobacillus reutri, L. acidophilius, L. rhamnosis и Bifidumbacterium longum. в течение 30 мин при 37оС. Контролем являлись клетки, к которым до инкубации вместо пробиотика добавляли физиологический раствор натрия хлорида. После нанесения 10 мкл взвеси инкубированных клеток на предметное стекло в каплю добавляли 5 мкл йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 5 мкл моноклональных антител к CD15 меченых FITC в разведении 1:10. Помещали каплю под покровное стекло с последующей инкубацией полученного препарата в термостате при 37оС в течение 5 мин.
При люминесцентной микроскопии подсчитывали содержание каждой морфологической единицы (интактные клетки, слабоактивированные клетки, активированные клетки, гиперактивированные клетки, ранний нетоз, НВЛ в виде нитей, облаковидные НВЛ) в препарате. После подсчета 100 структур разных групп морфологических элементов рассчитывали процентное содержание каждой морфологической единицы (интактные клетки, слабоактивированные клетки, активированные клетки, гиперактивированные клетки, ранний нетоз, НВЛ в виде нитей, облаковидные НВЛ) в препарате - морфологический профиль нетоза.
Подсчитывали количество микроорганизмов, находящихся непосредственно в НВЛ в пересчете на одну сеть.
Морфологический профиль нетоза
(препарат без стимуляции пробиотиком - контроль с 0,9% NaCl)
1. Интактные клетки - 79%
2. Активированные клетки:
2.1. Слабоактивированные - 5%
2.2 Активированные - 3%
2.3. Гиперактивированные - 3%
3. Ранний нетоз - 4%
4. Нетоз:
4.1. Облаковидный нетоз - 3%
4.2. Нитевидный нетоз - 3%
5. Микроорганизмы в НВЛ (в пересчете на 1 сеть) - 0
Морфологический профиль нетоза
(препарат после стимуляции пробиотиком - стимуляция)
1. Интактные клетки - 55%
2. Активированные клетки:
2.1. Слабоактивированные - 7%
2.2 Активированные - 7%
2.3. Гиперактивированные - 9%
3. Ранний нетоз - 9%
4. Нетоз:
4.1. Облаковидный нетоз - 4%
4.2. Нитевидный нетоз - 9%
5. Микроорганизмы в НВЛ (в пересчете на 1 сеть) - 0,52
Пример 2
Окрашивали гранулоциты здорового мужчины Д. 35 лет, выделенные на двойном градиенте плотности фиколла-верографина. Взвесь нейтрофилов стимулировали пробиотиком, содержащим смесь Lactobacillus reutri, L. acidophilius, L. rhamnosis и Bifidumbacterium longum. в течение 30 мин при 37°С. Контролем являлись клетки, к которым до инкубации вместо пробиотика добавляли физиологический раствор натрия хлорида. После нанесения 10 мкл взвеси инкубированных клеток на предметное стекло в каплю добавляли 5 мкл йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 5 мкл моноклональных антител к CD15 меченых FITC в разведении 1:10. Помещали каплю под покровное стекло с последующей инкубацией полученного препарата в термостате при 37°С в течение 5 мин.
При люминесцентной микроскопии подсчитывали содержание каждой морфологической единицы (интактные клетки, слабоактивированные клетки, активированные клетки, гиперактивированные клетки, ранний нетоз, НВЛ в виде нитей, облаковидные НВЛ) в препарате. После подсчета 100 структур разных групп морфологических элементов рассчитывали процентное содержание каждой морфологической единицы (интактные клетки, слабоактивированные клетки, активированные клетки, гиперактивированные клетки, ранний нетоз, НВЛ в виде нитей, облаковидные НВЛ) в препарате - морфологический профиль нетоза.
Подсчитывали количество микроорганизмов, находящихся непосредственно в НВЛ в пересчете на одну сеть.
Морфологический профиль нетоза
(препарат без стимуляции пробиотиком - контроль с 0,9% NaCl)
1. Интактные клетки - 75%
2. Активированные клетки:
2.1. Слабоактивированные - 8%
2.2 Активированные - 4%
2.3. Гиперактивированные - 3%
3. Ранний нетоз - 4%
4. Нетоз:
4.2. Облаковидный нетоз - 3%
4.1. Нитевидный нетоз - 3%
5. Микроорганизмы в НВЛ (в пересчете на 1 сеть) - 0
Морфологический профиль нетоза
(препарат после стимуляции пробиотиком - стимуляция)
1. Интактные клетки - 50%
2. Активированные клетки:
2.1. Слабоактивированные - 5%
2.2 Активированные - 6%
2.3. Гиперактивированные - 10%
3. Ранний нетоз - 12%
4. Нетоз:
4.2. Облаковидный нетоз - 7%
4.1. Нитевидный нетоз - 10%
5. Микроорганизмы в НВЛ (в пересчете на 1 сеть) - 0,45
Пример 3
Окрашивали гранулоциты здорового мужчины Р. 39 лет, выделенные на двойном градиенте плотности фиколла-верографина. Взвесь нейтрофилов стимулировали пробиотиком, содержащим смесь Lactobacillus reutri, L. acidophilius, L. rhamnosis и Bifidumbacterium longum. в течение 30 мин при 37°С. Контролем являлись клетки, к которым до инкубации вместо пробиотика добавляли физиологический раствор натрия хлорида. После нанесения 10 мкл взвеси инкубированных клеток на предметное стекло в каплю добавляли 5 мкл йодида пропидия в концентрации 0,1 мг/мл и 5 мкл моноклональных антител к CD15 меченых FITC в разведении 1:10. Помещали каплю под покровное стекло с последующей инкубацией полученного препарата в термостате при 37°С в течение 5 мин.
При люминесцентной микроскопии подсчитывали содержание каждой морфологической единицы (интактные клетки, слабоактивированные клетки, активированные клетки, гиперактивированные клетки, ранний нетоз, НВЛ в виде нитей, облаковидные НВЛ) в препарате. После подсчета 100 структур разных групп морфологических элементов рассчитывали процентное содержание каждой морфологической единицы (интактные клетки, слабоактивированные клетки, активированные клетки, гиперактивированные клетки, ранний нетоз, НВЛ в виде нитей, облаковидные НВЛ) в препарате - морфологический профиль нетоза.
Подсчитывали количество микроорганизмов, находящихся непосредственно в НВЛ в пересчете на одну сеть.
Морфологический профиль нетоза
(препарат без стимуляции пробиотиком - контроль с 0,9% NaCl)
1. Интактные клетки - 79%
2. Активированные клетки:
2.1. Слабоактивированные - 5%
2.2. Активированные - 3%
2.3. Гиперактивированные - 3%
3. Ранний нетоз - 4%
4. Нетоз:
4.2. Облаковидный нетоз - 3%
4.1. Нитевидный нетоз - 3%
5. Микроорганизмы в НВЛ (в пересчете на 1 сеть) - 0
Морфологический профиль нетоза
(препарат после стимуляции пробиотиком - стимуляция)
1. Интактные клетки - 62%
2. Активированные клетки:
2.1. Слабоактивированные - 4%
2.2 Активированные - 5%
2.3. Гиперактивированные - 7%
3. Ранний нетоз - 10%
4. Нетоз:
4.2. Облаковидный нетоз - 5%
4.1. Нитевидный нетоз - 7%
5. Микроорганизмы в НВЛ (в пересчете на 1 сеть) - 0,65
Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет идентифицировать интактные нейтрофилы и морфологические эквиваленты клеток, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции, а также визуализировать нейтрофильные ловушки разного типа (нитевидные и облаковидные) с возможным составлением формулы нетоза и одномоментным подсчетом бактерий, захваченных сформировавшимися НВЛ.
Claims (1)
- Способ обнаружения морфологических эквивалентов этапов формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек, отличающийся тем, что выделенную на двойном градиенте плотности раствора фиколла-верографина взвесь нейтрофилов после стимуляции смесью Lactobacillus reutri, L. acidophilius, L. rhamnosis и Bifidumbacterium longum суправитально окрашивают с использованием интеркалирующего красителя йодида пропидия и инкубируют под покровным стеклом в темноте в течение 5 минут при 37°С с моноклональными антителами к специфическому для нейтрофилов антигену CD15, мечеными флуоресцентным красителем FITC, а результаты визуализируют с помощью люминесцентной микроскопии, используя возбуждающий светофильтр с диапазоном длин волн 450-480 нм и эмиссионный - в диапазоне длин волн 515-700 нм, подсчитывая морфологические эквиваленты клеток, находящихся в разной степени активации в процессе нетозформирующей реакции: интактные клетки ярко-зеленого цвета без прокрашенного ядра, слабоактивированные клетки с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и слабопрокрашенным ядром, активированные клетки с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и красно-оранжевым ядром, гиперактивированные клетки - поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и увеличенным в размере красно-оранжевым ядром, достигающим границы цитолеммы, гиперактивированные клетки с начальными признаками нетоза - ранний нетоз - с поверхностными структурами ярко-зеленого цвета и увеличенным в размере красно-оранжевым ядром с визуализируемым выходом ядерного вещества хотя бы в одной локации, одномоментно с клеточными эквивалентами подсчитывают два варианта нетоза: нитевидный нетоз - красно-оранжевые структурированные нитевидные нейтрофильные внеклеточные ловушки, превышающие размер клетки более чем в 2 раза, облаковидный нетоз - неструктурированные гомогенные нейтрофильные внеклеточные ловушки красно-оранжевого цвета, расположенные вокруг клетки-источника, превышающие размер клетки в 1,5-2 раза, отдельно подсчитывают количество микроорганизмов, находящихся непосредственно в нейтрофильных ловушках в пересчете на одну сеть с последующим расчетом процентного соотношения разных групп морфологических элементов - морфологический профиль нетоза.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021129097A RU2768152C1 (ru) | 2021-10-06 | 2021-10-06 | Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в суправитально окрашенном препарате крови |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021129097A RU2768152C1 (ru) | 2021-10-06 | 2021-10-06 | Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в суправитально окрашенном препарате крови |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2768152C1 true RU2768152C1 (ru) | 2022-03-23 |
Family
ID=80819313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021129097A RU2768152C1 (ru) | 2021-10-06 | 2021-10-06 | Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в суправитально окрашенном препарате крови |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2768152C1 (ru) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2384844C2 (ru) * | 2008-04-01 | 2010-03-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Способ обнаружения нейтрофильных ловушек |
| RU2463349C2 (ru) * | 2009-01-26 | 2012-10-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах |
| US20170343537A1 (en) * | 2016-05-26 | 2017-11-30 | Sysmex Corporation | Specimen analyzing method, specimen analyzer, and reagent |
| KR102084688B1 (ko) * | 2018-06-18 | 2020-03-04 | 울산과학기술원 | 다중 프로브 혼성화를 이용한 미생물 검출 방법 |
| WO2021022165A1 (en) * | 2019-07-31 | 2021-02-04 | Montefiore Medical Center | Identifying neutrophil extracellular traps in biological samples |
-
2021
- 2021-10-06 RU RU2021129097A patent/RU2768152C1/ru active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2384844C2 (ru) * | 2008-04-01 | 2010-03-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Способ обнаружения нейтрофильных ловушек |
| RU2463349C2 (ru) * | 2009-01-26 | 2012-10-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах |
| US20170343537A1 (en) * | 2016-05-26 | 2017-11-30 | Sysmex Corporation | Specimen analyzing method, specimen analyzer, and reagent |
| KR102084688B1 (ko) * | 2018-06-18 | 2020-03-04 | 울산과학기술원 | 다중 프로브 혼성화를 이용한 미생물 검출 방법 |
| WO2021022165A1 (en) * | 2019-07-31 | 2021-02-04 | Montefiore Medical Center | Identifying neutrophil extracellular traps in biological samples |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JIANG D. et al. In vitro demonstration and quantification of neutrophil extracellular trap formation. Bio Protoc. 2017, 7(13), e2386, doi:10.21769/BioProtoc.2386. * |
| JIANG D. et al. In vitro demonstration and quantification of neutrophil extracellular trap formation. Bio Protoc. 2017, 7(13), e2386, doi:10.21769/BioProtoc.2386. Ссылка помещена на сайт в Интернет 16 июля 2020 года ; дата размещения подтверждена по адресу Web-архива URL:https://web.archive.org/web/20200716035014/http://www.microscope-plus.ru/fl-filter.html. * |
| Ссылка помещена на сайт в Интернет 16 июля 2020 года ; дата размещения подтверждена по адресу Web-архива URL:https://web.archive.org/web/20200716035014/http://www.microscope-plus.ru/fl-filter.html. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| King | Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry | |
| US20030017514A1 (en) | Method for quantitative detection of vital epithelial tumor cells in a body fluid | |
| CN106198984A (zh) | 非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞pdl1基因的检测方法 | |
| RU2517618C2 (ru) | Способ и система для определения количества культивируемых клеток | |
| US20190128870A1 (en) | Diagnostic Methods For Patient Specific Therapeutic Decision Making In Cancer Care | |
| CN104094116A (zh) | 在哺乳动物个体中检测5t4阳性循环肿瘤细胞的方法和诊断5t4阳性癌症的方法 | |
| JPS58166261A (ja) | 異色染色及び螢光発光による血液の超生体分析方法 | |
| JP2002505441A (ja) | 選択的細胞分析 | |
| CN107860912A (zh) | 一种双功能化核酸适体介导的a549肿瘤细胞检测方法 | |
| CN112301086A (zh) | 一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用 | |
| FREITAS et al. | Hypoxic Tumour Cells | |
| Conteas et al. | Fluorescence techniques for diagnosing intestinal microsporidiosis in stool, enteric fluid, and biopsy specimens from acquired immunodeficiency syndrome patients with chronic diarrhea | |
| US6051395A (en) | Method and compound for detecting low levels of microorganisms | |
| RU2768152C1 (ru) | Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в суправитально окрашенном препарате крови | |
| CN112304851B (zh) | 一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用 | |
| EP2455756A1 (en) | Cell-based screening assay for inhibitors of NET formation | |
| King et al. | Label-free multi parameter optical interrogation of endothelial activation in single cells using a lab on a disc platform | |
| JP4683604B2 (ja) | 内部精度管理法 | |
| RU2384844C2 (ru) | Способ обнаружения нейтрофильных ловушек | |
| WO1997008204A1 (en) | Methods for detection of cryptosporidium oocysts | |
| RU2362997C2 (ru) | Способ выявления нарушения функции фагоцитов при развитии рецидивирующих инфекционных процессов | |
| RU2815709C1 (ru) | Способ детекции внеклеточной днк в цельной периферической крови с использованием проточной цитометрии | |
| Barnea et al. | Analyzing Blood Cells of High-Risk Myelodysplastic Syndrome Patients Using Interferometric Phase Microscopy and Fluorescent Flow Cytometry | |
| JP7368678B1 (ja) | Ｃｄ４＋ｔ細胞集団中の特定の細胞亜集団の相対量の測定方法 | |
| JP2023532780A (ja) | 非癌細胞の代謝活性を評価する方法 |