RU2384844C2 - Способ обнаружения нейтрофильных ловушек - Google Patents
Способ обнаружения нейтрофильных ловушек Download PDFInfo
- Publication number
- RU2384844C2 RU2384844C2 RU2008112636/15A RU2008112636A RU2384844C2 RU 2384844 C2 RU2384844 C2 RU 2384844C2 RU 2008112636/15 A RU2008112636/15 A RU 2008112636/15A RU 2008112636 A RU2008112636 A RU 2008112636A RU 2384844 C2 RU2384844 C2 RU 2384844C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- traps
- neutrophilic
- bacteria
- neutrophils
- neutrophil
- Prior art date
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к иммунологии. Предложен способ обнаружения нейтрофильных ловушек. Производят окрашивание акридиновым оранжевым фиксированной на стекле взвеси нейтрофилов, выделенных из периферической венозной крови человека и активированных различными микроорганизмами. Полученный препарат исследуют с помощью люминесцентного микроскопа, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм. Способ позволяет ускорить и упростить выявление нейтрофильных ловушек и дать количественную характеристику их образования. 2 табл.
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и предназначено для обнаружения нейтрофильных ловушек экспресс-методом с количественной оценкой данного явления.
Известен способ обнаружения сетеподобных внеклеточных структур нейтрофилов с использованием метода сканирующей электронной микроскопии [5]. Авторы использовали для визуализации образовавшихся структур. Однако данный способ обнаружения нейтрофильных ловушек требует наличия специального оборудования, набор реактивов для приготовления препарата и очень аккуратного выполнения исследования, так как образующиеся структуры очень хрупкие и быстро разрушаются при механическом воздействии [5].
Для определения нейтрофильных ловушек, которые являются по своей сути волокнами ДНК, можно использовать метод выявления нуклеиновых кислот по способу Фельгена [4]. Данная реакция требует фиксации клеток на стекле по методу Лилли в 10%-ном забуференном формалине, для приготовления реактивов используются агрессивные среды (соляная кислота, фуксинсернистая кислота, сернистая вода), готовые реагенты нуждаются в специальных условиях хранения. Кроме того, реакция проходит в 2 этапа, которые занимают около 2-2,5 часов. При соблюдении всех условий ядерное вещество окрашивается в красно-фиолетовый цвет. Учет реакции проводят с помощью иммерсионной микроскопии при увеличении ×1000. Однако даже при соблюдении всех требований выполнения данной реакции учет представляет определенные сложности: при световой микроскопии не всегда удается рассмотреть тонкие, внеклеточно расположенные волокна ДНК активированных нейтрофилов, а бактерии-активаторы не определяются.
Предлагаемый способ значительно упрощает подготовку препарата, окраску и визуализацию хроматина.
Целью заявляемого способа является оптимизация выявления нейтрофильных ловушек и их количественная оценка.
Сущность предлагаемого способа заключается в использовании раствора акридинового оранжевого для окраски ядерного вещества фиксированных нейтрофилов, выделенных из периферической венозной крови человека и активированных различными микроорганизмами.
Предлагаемый способ диагностики соответствует критерию «новизна», так как в отличие от имеющихся способов обнаружения ловушек обладает следующими существенными отличительными признаками:
- исследуемый материал фиксируется 96%-ным этиловым спиртом;
- для окраски используется один реактив (акридиновый оранжевый);
- учет проводят с помощью люминесцентной микроскопии, позволяющей четко различать окрашиваемые структуры (ядра нейтрофилов окрашивается в ярко-зеленый цвет, цитоплазма клеток, сохранивших морфологию, не окрашивается, нейтрофильные ловушки представлены тонкими ярко-зелеными нитями, занимающие пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила, а бактерии-активаторы имеют ярко-оранжевый цвет);
- позволяет количественно охарактеризовать данное явление.
Благодаря наличию указанных отличительных признаков в данном способе, а также использованию их в совокупности и в определенной последовательности действий, можно сделать вывод о соответствии заявляемого способа изобретательскому уровню.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
1. Взвесь нейтрофилов получают, используя 15,0 мл гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина) периферической венозной крови, которую с целью осаждения эритроцитов отстаивают в стерильной пробирке при температуре +37°С в течение 30 минут. Нейтрофилы выделяют из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095. Объем каждого градиента равняется 1,5 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 оборотах в минуту на границе между градиентами появляется кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%. Кольцо нейтрофилов аккуратно собирают, переносят в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывают от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 оборотах в минуту в течение 10 минут и доводят до концентрации 5·106 клеток/мл [1, 3].
2) Полученную взвесь клеток инкубируют при температуре +37°С в течение 30 минут в присутствии 0,1 мл взвеси суточной культуры контрольных штаммов (S. aureus (штамм 209), E. coli (штамм М-17) (препарат "Колибактерин"), Lactobacterium spp.(препарат “Лактобактерин сухой”), доведенной до концентрации 1 млрд. микробных тел в 1 мл (по стандартному мутности БАК-10) и разведенной в 10 раз, или смеси бактерий, содержащей 108 Lactobacterium spp., 106 Bifidobacterium spp., 103S. aureus, 103E. coli в 1 мл на 1 мл взвеси нейтрофилов. Для контроля используют взвесь нейтрофилов, инкубируемых в тех же условиях, но без активаторов [1].
3) После инкубации клеточную взвесь наносят на стекло и высушивают.
4) Для фиксации используют 96%-ный этиловый спирт, который наносят на мазок в количестве 100 мкл, после испарения спирта мазок считают фиксированным.
5) Для окрашивания нейтрофильных ловушек на фиксированный препарат наносят 200 мкл рабочего раствора акридинового оранжевого и выдерживают при комнатной температуре в течение 2 минут в темноте. Раствор акридинового оранжевого готовят предварительно по следующей схеме: 5 мг сухого красителя растворяют в 5 мл физиологического раствора, полученный таким образом маточный раствор (1 мг/мл) хранят при Т=4°С. Перед использованием 0,2 мл раствора смешивают с 4,8 мл физиологического раствора, получая рабочий раствор
6) Учет проводят с помощью люминесцентного микроскопа, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм, и эмиссию с длиной волны 520 нм. Ядра нейтрофилов окрашиваются в ярко-зеленый цвет, цитоплазма гранулоцитов не окрашивается, нейтрофильные ловушки представлены тонкими ярко-зелеными нитями, занимающие пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила, а бактерии-активаторы имеют ярко-оранжевый цвет.
При этом можно провести количественную оценку образования ловушек, так как при таком способе окраски хорошо различима морфология нейтрофилов: 1 группа объединяет клетки с сегментированным ядром, 2 группа включает клетки с недифференцированным ядром, и к 3 группе относят свободнолежащие ярко-зеленые волокна, представляющие собой нити ДНК нейтрофила (нейтрофильные ловушки). Проводят подсчет 100 структур разных групп и определяют процентное содержание каждой морфологической единицы.
При предлагаемом способе окраски можно оценить как активность и интенсивность поглощения микроорганизмов неизмененными нейтрофилами, так и показатели попадания бактерий-активаторов в нейтрофильные ловушки, так как имеется хороший контраст между нейтрофилами, их ловушками, окрашиваемыми в зеленый цвет, и бактериями, окрашиваемыми в оранжевый. Для этого рассчитывают следующие показатели:
1) активность фагоцитоза (%) - число нейтрофилов с сегментированным ядром, содержащих бактериальные клетки в цитоплазме из 100 подсчитанных клеток с сегментированным ядром;
2) интенсивность фагоцитоза (усл.ед.) - число бактерий в 100 подсчитанных клетках с сегментированным ядром в пересчете на 1 клетку;
3) число нейтрофильных ловушек (%) - количество нейтрофильных ловушек, содержащих бактериальные клетки, из 100 подсчитанных сетеподобных структур;
4) индекс нейтрофильной ловушки (усл.ед.) - число бактерий в 100 подсчитанных ловушках в пересчете на 1 структуру.
Предлагаемым способом окрашено 50 фиксированных препаратов, из которых 10 содержали взвесь нейтрофилов без активаторов (контроль) и 4 группы по 10 мазков были приготовлены из взвеси нейтрофилов, активированных E. coli, S. aureus, Lactobacterium spp.или смесью бактерий соответственно (таблица 1, 2).
Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с использованием пакетов статистических программ БИОСТАТ и Statistica for Windows 6.0. О достоверности различий показателей судили с помощью непараметрических критериев Крускала-Уоллиса и Манна-Уитни. При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони [2].
Приводим примеры использования предлагаемого способа обнаружения нейтрофильных ловушек.
Пример 1
Окраске подвергались нейтрофилы, выделенные из периферической крови здоровой женщины Е., 31 год и активированные E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и смесью бактерий. В мазках хорошо визуализировались ярко-зеленые ядерные структуры нейтрофилов, внеклеточно расположенные сети ДНК и бактерии разных морфологических форм (кокки и палочки), что позволило провести количественную оценку образования ловушек (содержание ловушек после взаимодействия с E. coli составило 44%, с S. aureus - 20%, с Lactobacterium spp.- 49% и со смесью бактерий - 26%) и оценить индекс нейтрофильной ловушки (после взаимодействия с E. coli индекс попадания бактерий в нейтрофильную ловушку составил 8,72, с S. aureus - 9,12, с Lactobacterium spp. - 2,02 и со смесью бактерий - 1,07).
Пример 2
Окраске подвергались нейтрофилы, выделенные из периферической крови здоровой женщины К., 19 лет и активированные E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и смесью бактерий. В мазках хорошо визуализировались ярко-зеленые ядерные структуры нейтрофилов, внеклеточно расположенные сети ДНК и бактерии разных морфологических форм (кокки и палочки), что позволило провести количественную оценку образования ловушек (содержание ловушек после взаимодействия с E. coli составило 30%, с S. aureus - 45%, с Lactobacterium spp. - 20% и со смесью бактерий - 32%) и оценить индекс нейтрофильной ловушки (после взаимодействия с E. coli индекс попадания бактерий в нейтрофильную ловушку составил 4,5, с S. aureus - 5,11, с Lactobacterium spp. - 5,75 и со смесью бактерий - 1,0).
Пример 3
Окраске подвергались нейтрофилы, выделенные из периферической крови здоровой женщины Г., 23 года и активированные E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и смесью бактерий. В мазках хорошо визуализировались ярко-зеленые ядерные структуры нейтрофилов, внеклеточно расположенные сети ДНК и бактерии разных морфологических форм (кокки и палочки), что позволило провести количественную оценку образования ловушек (содержание ловушек после взаимодействия с E. coli составило 32%, с S. aureus - 30%, с Lactobacterium spp. - 19% и со смесью бактерий - 13%) и оценить индекс нейтрофильной ловушки (после взаимодействия с E. coli индекс попадания бактерий в нейтрофильную ловушку составил 4,56, с S. aureus - 11,8, с Lactobacterium spp. - 0,78 и со смесью бактерий - 0,69).
Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет оптимизировать выявление нейтрофильных ловушек и количественно охарактеризовать данное явление.
| Таблица 1 | |||||||||
| Содержание различных морфологических форм нейтрофилов периферической крови здоровых женщин после взаимодействия E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и смесью бактерий (n=10), % | |||||||||
| Показатели | Нейтрофилы | ||||||||
| НН | AHE | AHS | AHL | АН смесью бактерий | |||||
| Содержание нейтрофилов с сегментированным ядром, % | 59,89±6,19 | 32,40±5,38* | 40,70±2,21* | 28,40±4,81* | 56,33±6,59 | ||||
| Содержание нейтрофилов с недифференцированным ядром, % | 24,11±3,47 | 31,30±2,31* | 32,9±4,72 | 37,10±3,83* | 15,33±1,63 | ||||
| Содержание ловушек, % | 16,0±4,22 | 36,30±3,89* | 30,00±2,73* | 34,50±4,50* | 28,33±5,15* | ||||
| Примечание к таблице 1: * - достоверность различий показателей по отношению к НН; | |||||||||
| НН - неактивированных нейтрофилов; | |||||||||
| АНЕ - нейтрофилы, активированные E. coli (штамм М-17); | |||||||||
| AHS - нейтрофилы, активированные S. aureus (штамм 209); | |||||||||
| AHL - нейтрофилы, активированные Lactobacterium spp.; | |||||||||
| АН смесью бактерий - нейтрофилы, активированные смесью бактерий. | |||||||||
| Таблица 2 | |||||||||
| Показатели фагоцитоза и содержание E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp.в нейтрофильных ловушках (n=10) | |||||||||
| Показатели | Активирующие агенты | ||||||||
| E. coli | S. aureus | Lactobacterium spp. | смесь бактерий | ||||||
| Активность фагоцитоза, % | 76,00±6,49* | 84,00±3,39* | 34,5±4,5* | 21,22±2,85 | |||||
| Интенсивность фагоцитоза на 1 клетку, усл. ед | 2,59±0,56* | 8,49±1,08* | 1,22±0,40 | 0,36±0,05 | |||||
| Индекс нейтрофильной ловушки, усл. ед | 5,91±0,50* | 11,52±1,18* | 2,56±0,56* | 0,93±0,21 | |||||
| Примечание к таблице 2: * - достоверность различий показателей по отношению к показателям нейтрофилов, активированных смесью бактерий | |||||||||
Литература
1. Андреева Ю.С. Роль нейтрофилов в регуляции микробиоценоза влагалища женщин: дис.… канд. мед. наук / Ю.С.Андреева. - Челябинск, 2005. - 150 с.
2. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С.Гланц. - М.: Практика, 1999. - 450 с.
3. Долгушин, И.И. Нейтрофилы и гомеостаз / И.И.Долгушин, О.В.Бухарин. - Екатеринбург: Изд-во УрОРАН, 2001. - 288 с.
4. Меркулов, Г.А. Курс патогистологической техники / Г.А.Меркулов. - МЕДГИЗ. Ленинградское отделение, 1956. - 263 с.
5. Brinkmann, V. Neutrophil extracellulartraps kill bacteria / V.Brinkmann, U.Rechard, C.Goosmann et al. // Sciense. - 2004. - Vol.303. - P.1532-1535.
Claims (1)
- Способ обнаружения нейтрофильных ловушек в клеточной взвеси, отличающийся тем, что фиксированный препарат окрашивают 200 мкл акридинового оранжевого в концентрации 0,2 мг/мл в течение 2 мин, учитывают с помощью люминесцентной микроскопии, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм, обнаруживают ядра нейтрофилов, которые окрашиваются в ярко-зеленый цвет, цитоплазма гранулоцитов не окрашивается, нейтрофильные ловушки, представленные тонкими ярко-зелеными нитями, занимающие пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила, и бактерии-активаторы ярко-оранжевого цвета, проводят подсчет 100 структур разных групп и рассчитывают процентное содержание каждой морфологической единицы, при наличии в мазках нейтрофилов с сегментированным ядром оценивают активность фагоцитоза (%) - число нейтрофилов с сегментированным ядром, содержащих бактериальные клетки в цитоплазме из 100 подсчитанных клеток с сегментированным ядром и интенсивность фагоцитоза (усл. ед.) - число бактерий в 100 подсчитанных клетках с сегментированным ядром в пересчете на 1 клетку, при обнаружении сетеподобных структур оценивают число нейтрофильных ловушек (%) - количество нейтрофильных ловушек, содержащих бактериальные клетки, из 100 подсчитанных сетеподобных структур и индекс нейтрофильной ловушки (усл. ед.) - число бактерий в 100 подсчитанных ловушках в пересчете на 1 структуру.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008112636/15A RU2384844C2 (ru) | 2008-04-01 | 2008-04-01 | Способ обнаружения нейтрофильных ловушек |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008112636/15A RU2384844C2 (ru) | 2008-04-01 | 2008-04-01 | Способ обнаружения нейтрофильных ловушек |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008112636A RU2008112636A (ru) | 2009-10-10 |
| RU2384844C2 true RU2384844C2 (ru) | 2010-03-20 |
Family
ID=41260388
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008112636/15A RU2384844C2 (ru) | 2008-04-01 | 2008-04-01 | Способ обнаружения нейтрофильных ловушек |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2384844C2 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2539384C1 (ru) * | 2013-10-03 | 2015-01-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" | Способ диагностики асептической нестабильности эндопротеза крупных суставов |
| RU2688178C2 (ru) * | 2016-04-12 | 2019-05-21 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия (ФГБОУ ВО НГСХА) | Способ регистрации изменения поверхностного заряда эритроцитов |
| RU2768152C1 (ru) * | 2021-10-06 | 2022-03-23 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Омский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России) | Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в суправитально окрашенном препарате крови |
-
2008
- 2008-04-01 RU RU2008112636/15A patent/RU2384844C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BRINKMANN V. at al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 2004 Mar 5; 303(5663):1532-5. КАРНАУХОВ В.Н. Люминесцентный анализ клеток: Учебное пособие. - Пущино: Электронное издательство "Аналитическая микроскопия", 2004. - 131 с. найдено 03.10.09 on-line, http://window.edu.ru/window/library?p_rid=37905. FUCHS T.A. at al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 2007 Jan 15; 176(2):231-41. Epub 2007 Jan 8. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2539384C1 (ru) * | 2013-10-03 | 2015-01-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" | Способ диагностики асептической нестабильности эндопротеза крупных суставов |
| RU2688178C2 (ru) * | 2016-04-12 | 2019-05-21 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия (ФГБОУ ВО НГСХА) | Способ регистрации изменения поверхностного заряда эритроцитов |
| RU2768152C1 (ru) * | 2021-10-06 | 2022-03-23 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Омский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России) | Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в суправитально окрашенном препарате крови |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2008112636A (ru) | 2009-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tan et al. | Predominance of amoeboid forms of Blastocystis hominis in isolates from symptomatic patients | |
| Radonjic et al. | Diagnosis of Trichomonas vaginalis infection: The sensitivities and specificities of microscopy, culture and PCR assay | |
| Harrington et al. | Use of a fluorescent brightener to demonstrate cellulose in the cellular slime molds | |
| CN105388288B (zh) | 人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒、方法和细胞固定液 | |
| CN110055300A (zh) | 一种真菌感染检测试剂盒及其应用 | |
| RU2384844C2 (ru) | Способ обнаружения нейтрофильных ловушек | |
| CN109374384A (zh) | 一种荧光染色试剂 | |
| CN103266163B (zh) | 一种检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒 | |
| von Bertalanffy | Acridine orange fluorescence in cell physiology, cytochemistry and medicine | |
| Pappas | Structural and cytochemical studies of the cytoplasm in the family Amoebidae | |
| Sköld et al. | Autofluorescence in human alveolar macrophages from smokers: relation to cell surface markers and phagocytosis | |
| Cárdenas et al. | A flow cytometric approach to the study of crustacean cellular immunity | |
| RU2332460C1 (ru) | Способ выявления эпидемически значимых холерных вибрионов vibrio eltor и vibrio cholerae o139 по их адгезивной способности | |
| RU2549989C2 (ru) | Способ микроскопического исследования нативного соскоба корня языка | |
| McCrone et al. | Fluorescent staining for leukocyte chemotaxis: Eosinophil-specific fluorescence with aniline blue | |
| CN113943572A (zh) | 一种用于真菌检测的荧光素碳点染色试剂、染色方法和应用 | |
| Sutphin et al. | Improved detection of oculomycoses using induced fluorescence with cellufluor | |
| Chammas et al. | Evaluation of neutrophilic function (chemotaxis, phagocytosis and microbicidal activity) in healthy dogs and in dogs suffering from recurrent deep pyoderma | |
| DK2689236T3 (en) | Cytological PROCESS WITH USE OF white cell autofluorescence FOR EARLY DIAGNOSIS AND MONITORING OF INFECTIONS | |
| JP2553606B2 (ja) | 密度特異血球の分離及び使用方法 | |
| RU2463349C2 (ru) | Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах | |
| SU1749834A1 (ru) | Способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов | |
| RU2768152C1 (ru) | Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в суправитально окрашенном препарате крови | |
| Cowdry | The supravital staining of vaccine bodies | |
| Mabey et al. | The detection of Chlamydia trachomatis by direct immunofluorescence in conjunctival smears from patients with trachoma and patients with ophthalmia neonatorum using a conjugated monoclonal antibody |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20120313 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150402 |