SU1749834A1

SU1749834A1 - Способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов

Info

Publication number: SU1749834A1
Application number: SU894634160A
Authority: SU
Inventors: Светлана Николаевна Теплова; Людмила Ивановна Крюкова; Василий Александрович Чернов
Original assignee: Челябинский государственный медицинский институт
Priority date: 1989-01-09
Filing date: 1989-01-09
Publication date: 1992-07-23

Abstract

Использование: в клинической практике и в научных цел х дл определени фагоцитарной активности нейтрофилов. Цель: повышение точности способа. Сущность изобретени : из венозной гепаринизиро- ванной крови выдел ют нейтрофилы. Получают монослой адгезированных клеток, в который внос т взвесь убитой культуры золотистого стафилококка. После инкубации провод т окраску препарата акридиновым оранжевым в конечной концентрации 1:4000 - 1:5000. Затем провод т микрофлу- ориметрическое измерение интенсивности свечени отдельных нейтрофилов. При среднем значении интенсивности флуоресценции клетки свыше 3,03 констатируют повышение фагоцитарной активности, при значении меньше 2,67 - снижение Положительный эффект: сокращение времени исследовани до 5-10 мин и снижение трудоемкости, точность определени повышаетс за счет количественен оценки результатов .

Description

со С

Изобретение относитс к медицине, точнее к иммунологии, и предназначено дл определени нарушений фагоцитарной функции нейтрофилов.

Известен способ оценки фагоцитарной активности лейкоцитов I I I, включающий забор крови из пальца в 2%-ный раствор цитрата натри с последующим внесением живой культуры золотистого стафилококка, инкубирование взвеси в течение 30 мин при 37°С, приготовление мазка, его фиксацию и окраску по Романовскому-Гимза, микроскопический учет, при котором определ ют процент клеток, участвующих в фагоцитозе, и Количестве микробных клеток , фагоцитированных каждым лейкоцитом (оценивают не менее 100 лейкоцитов).

К недостаткам известного способа следует отнести субъективность оценки и св занную с ней низкую точность результатов, особенно в тех случа х, когда захват микробов велик и микробные клетки трудно различимы глазом в цитоплазме лейкоцитов, высокую трудоемкость способа: 20 мин рабочего времени уходит на подсчет 1 мазка. Следует отметить также утомл емость исследовател при подсчете в каждом мазке сосчитываетс 100 лейкоцитов, а также число микробов, захваченных отдельными клетками. Кроме того, необходимость соблюдать правила работы с живыми микробными культурами также увеличивает трудоемкость исследовани .

Целью изобретени вл етс повышение точности способа.

Поставленна цель достигаетс тем, что в способе оценки фагоцитарной активности нейтрофилов, включающем забор крови с

§

00 СЈ

4

последующим введением в нее культуры золотистого стафилококка, приготовление препарата и его окраску с дальнейшим определением поглотительной способности клеток, согласно изобретению из венозной гепариниэированной крови готов т монослой адгезированных лейкоцитов, к которому добавл ют убитую культуру золотистого стафилококка, окраску препарата осуществл ют акридиновым оранжевым, а оценку поглотительной способности провод т путем микрофлуориметрического измерени интенсивности красного свечени нейтро- филов и при значении интенсивности свечени одной клетки свыше 3,03, определ ют повышение фагоцитарной активности, а при значении этого показател меньше 2,67 - снижение фагоцитарной активности кле ток.

Способ оценки фагоцитарной активности нейтрофи ов осуществл ют следующим образом.

Из венозной гепаринизированной крови выдел ют путем центрифугировани слой лейкоцитов (содержащий до 60% ней- трофилов). Полученную обогащенную взвесь (концентраци «леток 2x10 кл/мл) внос т по 1 мл на среде 199 в пробирки типа сапожок с помещенными в них покровными стеклами и инкубируют в течение 1 ч при 37°С дл получени моносло адгеэирован- ных нейтрофилоа. Монослой адгезированных на покровных стеклах нейтрофилов после инкубации трижды отмывают средой 199, добавл ют 0,1 мл взвеси суточной культуры золотистого стафилококка убитой нагреванием и инкубируют в течение 1 ч при 37°С.

После инкубации покровные стекла трижды отмывают средой 199 и провод т окраску моносло раствором акридинового оранжевого в разведении 1:5000 в течение 30 с. Окрашенное таким образом покровное стекло с монослоем помещают на предметное стекло клетками вниз, удал ют фильтром избыток жидкости, на препарат нанос т каплю нейфлуорисцирующей иммерсионной жидкости (димети фталат). Затем провод т микрофлуориметрическое измерение интенсивности красного свечени отдельных нейтрофилов под лименес- центным микроскопом ЯЮМ-АМ-ИЗ со светофильтрами СС-1 и БС-8 (регистрируемое возбуждаемое свечение в пределах 600-700 нм). при этом осуществл ют флуо- риметрию свечени 50 нейтрофилов, поглотивших и непоглотивших стафилококк, провод запись результатов с помощью самописца Н-3010-1.

Определ ют средний показатель свечени одного фагоцитирующего лейкоцита и при значени х его, меньших 2,67 определ ют снижение фагоцитарной активности, при

значени х этого показател превышающих 3,03 - усиление ее.

Пример 1. Донор А. Готов т монослой лейкоцитов на покровном стекле путем инкубации лейковзвеси при 37°С в течение 1

ч. К монослою добавили 0,1 мл убитой суточной культуры золотистого стафилококка в концентрации 2 млрд в 1 мл и инкубировали в термостате еще в течение 1 ч. Стекло трижды отмывали средой 199 и прокрашивали

раствором акридинового оранжевого (в разведении 1:5000) в течение 30 с. Монослой клеток вновь отмывали средой 199, поместили на предметное стекло клетками вниз, удал избыток влаги фильтровальной бумагой .

Затем осуществл ли микроскопирова- ние, провод флуориметрию свечени фагоцитирующих и нефагоцитирующих фоновых лейкоцитов в количестве 50 штук и записыаа результат с помощью самописца Н- 3010-1. Графическую запись результата оценивали путем измерени высоты зубцов в 50 клетках, определили среднюю интенсивность свечени 1 лейкоцита.

Значение фагоцитарной активности у обследуемого донора А составило 2,9 в. В соответствии с предлагаемым способом это свидетельствует о нормальной фагоцитарной активности лейкоцитов у донора А.

П р и м е р 2. Больной Н. Диагноз: стафилококкова инфекци , эмпиема легких . При оценке фагоцитарной активности с помощью способа-прототипа у больного обнаружено , что стади захвата объектов фагоцитоза настолько велика, что сосчитать глазом количество захваченных стафилококков не представл етс возможным.

Фагоцитарную активность в предлагаемом способе оценивали в соответствии с

предложенной схемой: сн ли показатель свечени в с 50 профагоцитировавших и не- профагоцитировавших клеток нашли среднее значение свечени 1 клетки - оно составило 4,0 в. В соответствии с предлагаемым способом (так как показатель нормального свечени составл ет 2,85 i 0,18) сделан вывод о резком повышении фагоцитарной активности лейкоцитов у данного больного.

Проведенные испытани способа подтвердили такие преимущества перед известным способом как повышение объективности, что достигнуто благодар переходу от полуколичественной еизуальной оценки к количественной микрофлуори- метрической.

Сокращение времени исследовани : в известном способе на подсчет 1 мазка уходит 20 мин рабочего времени, в предлагав- мом способе - в среднем от 5 до 10 мин, что св зано, в частности, с возможностью проведени оценки реакции в меньшем количестве лейкоцитов: не в 100 клетках (как в известном способе), а в 50.

Важным преимуществом вл етс улучшение условий труда исследовател , использование убитой культуры золотистого стафилококка обеспечило его безопасность, снизилась трудоемкость способа за счет ис- ключени необходимости соблюдени правил работы с живыми микробными культурами, уменьшилась утомл емость исследовател за счет перехода от визуальной оценки к автоматизированной (утомл е- мость известного способа обусловлена, в частности, тем, что в соответствии с ним необходим подсчет числа объектов фагоцитоза в каждой из 100 клеток).

Предлагаемый способ может быть ис- пользован с целью оценки фагоцитарной активности лейкоцитов дл научных целей, а также в клинической практике. В св зи с тем. что при гнойно-воспалительных и инфекционных заболевани х в подавл ющем

большинстве случаев наблюдаетс повышение фагоцитарной реакции лейкоцитов, необходимо отметить особую значимость предлагаемого способа при повышении активности фагоцитоза. Способ необходим в клинической иммунологии как дл постановки диагноза, так и дл назначени имму- нокорригирующей терапии.

Формул а изобретен и Способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов при гнойно-септических состо ни х, включающий забор крови, введение в нее культуры золотистого стафилококка , приготовление препарата и его окраску с последующим определением поглотительной способности нейтрофилов , отличающийс тем. что. с целью повышени точности способа, провод т забор венозной крови и убитую культуру золотистого стафилококка ввод т в монослой адгезированных нейтрофилов, окраску препарата осуществл ют акридиновым оранжевым в конечной концентрации 1:4000 - 5000 и оценку поглотительной способности провод т микрофлуориметрически, при этом при среднем значении интенсивности флуоресценции одной клетки свыше 3,03 констатируют повышение фагоцитарной активности , при значении меньше 2.67 - снижение .

Claims

Формула изобретения .

10 Способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов при гнойно-септических состояниях, включающий забор крови, введение в нее культуры золотистого стафилококка. приготовление препарата и его 15 окраску с последующим определением поглотительной способности нейтрофилов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что. с целью повышения точности способа, проводят забор венозной крови и убитую культуру золо20 тистого стафилококка вводят в монослой адгезированных нейтрофилов, окраску препарата осуществляют акридиновым оранжевым в конечной концентрации 1:4000 5000 и оценку поглотительной способности 25 проводят микрофлуориметрически, при этом при среднем значений интенсивности флуоресценции одной клетки свыше 3,03 констатируют повышение фагоцитарной активности, при значении меньше 2.67 - сни30 жение.