CN110484503B - 一种贝类血细胞胞外陷阱的诱导方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种贝类血细胞胞外陷阱的诱导方法。采用酵母多糖对贝类血细胞进行诱导，获得发生胞外陷阱的贝类血细胞。有益效果：将蛤仔血细胞用酵母多糖诱导，使得血细胞胞外陷阱的发生。本发明的方法能够有效诱导蛤仔血细胞发生胞外陷阱，并抑制细菌生长。

Description

一种贝类血细胞胞外陷阱的诱导方法及其应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种贝类血细胞胞外陷阱的诱导方法及其应用。

背景技术

胞外陷阱（extracellular traps, ETs）是一种不同于凋亡和坏死的新型细胞死亡方式，是以细胞内核酸为骨架，负载抗菌肽和水解酶组成网状结构，能够包裹并杀伤外来入侵的病原微生物。2004年，Brinkmann等在嗜中性粒细胞中发现了胞外陷阱现象，其主要在细胞吞噬和脱颗粒反应之后发挥作用。随后，国内外学者在高等生物的肥大细胞、酸性粒细胞、巨噬细胞等细胞中，相继发现了胞外陷阱的存在，认为其仅存在于固有免疫细胞中。在固有免疫反应中，胞外陷阱可阻止病原微生物由入侵位置向周边组织扩散，集中多种抗菌肽而使局部抗菌肽浓度升高，加大对病原微生物的杀灭作用，亦可形成不依赖于杀伤作用的防御系统，捕获入侵微生物并阻止其迁移。

不同类型的细胞具有不同的胞外陷阱诱导机制，例如，细菌和真菌均可以诱导巨噬细胞和粒细胞释放胞外陷阱，且体积较大的微生物诱导胞外陷阱释放的能力更强。此外，脂多糖（LPS）、佛波酯（PMA）可诱导中性粒细胞发生胞外陷阱，但它们并不能有效地诱导巨噬细胞发生胞外陷阱。研究发现，胞外陷阱形成过程中通常伴随着多种免疫效应因子的发生，这些免疫蛋白可破坏微生物的细胞壁或细胞膜结构，阻止微生物生长。此类免疫因子主要是一些携带高电荷的肽类和蛋白质类，包括防御素、内源性抗菌肽类、髓过氧化物酶、细菌通透性增强蛋白和阳离子丝氨酸蛋白酶等，它们可协同抗菌，大大提高杀菌效果。作为一种新的杀菌策略，胞外陷阱可以在低耗能的情况下对细菌形成包裹；促进免疫效应因子与微生物充分接触，提高抗菌效率；减小对病灶及周边组织的损伤；调节炎症反应等。虽然胞外陷阱抗菌效果显著，但是如果过度形成或未及时清除，这种富含水解酶和DNA的胶黏网状结构可附着于组织内，引起细胞凋亡，直接导致组织损伤，同时胞外陷阱也可通过释放内源性危险信号，诱导自身免疫的发生。

海洋无脊椎动物通常生活在富含微生物的水环境中，经常面临着多种病原微生物的侵袭。胞外陷阱是固有免疫细胞特有的一种免疫方式，在抵御病原微生物入侵方面作用显著。目前，有关海洋无脊椎动物胞外陷阱的研究仍然以激活途径、杀菌活性等研究内容为主。迄今为止，国内学者对海洋无脊椎动物胞外陷阱的研究较少，而国外学者也仅在长牡蛎、日本对虾、南美白对虾等少数几种海洋无脊椎动物中报道了胞外陷阱的存在。在长牡蛎中，血细胞胞外陷阱的形成过程中往往伴随着组蛋白H1和H5的释放，以应对感染和组织损伤。释放的胞外陷阱可以包被弧菌，阻止其迁移。而在日本对虾中，胞外陷阱可被PMA、LPS、肽聚糖（PGN）和大肠杆菌诱导，释放时往往伴随着溶菌酶的发生。在致病菌较多的情况下，胞外陷阱的抑菌作用优于吞噬作用，经过DNase I处理后，胞外陷阱的抗菌活性受到明显抑制。目前，对于海洋软体动物胞外陷阱的研究较少，对于胞外陷阱形成过程和作用机制缺乏系统而深入的研究，对胞外陷阱的应用潜能尚无开发。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种贝类血细胞胞外陷阱的诱导方法。本发明的方法能够有效诱导蛤仔血细胞发生胞外陷阱。

本发明一种贝类血细胞胞外陷阱的诱导方法，采用酵母多糖对贝类血细胞进行诱导，获得发生胞外陷阱的贝类血细胞。

进一步的，采用100-500ng/ml的酵母多糖对贝类血细胞进行处理0.5-1小时。

进一步的，采用500ng/ml的酵母多糖对贝类血细胞进行处理1小时。

进一步的，所述贝类是菲律宾蛤仔。

本发明还提供一种贝类血细胞胞外陷阱，如上述的诱导方法诱导得到。

本发明还提供一种贝类血细胞胞外陷阱的应用，将发生胞外陷阱的血细胞作为抑菌制剂的应用。进一步的，将发生胞外陷阱的血细胞用于制备抑制灿烂弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌的抑菌制剂。

有益效果：将菲律宾蛤仔血细胞用酵母多糖诱导，使得血细胞胞外陷阱的发生。本发明的方法能够有效诱导蛤仔血细胞发生胞外陷阱，并抑制细菌生长。

附图说明

图1为本发明菲律宾蛤仔血细胞胞外陷阱的透射电镜观察图；其中图1A为对比例1中没有诱导的蛤仔血细胞，图1B为实施例1中经酵母多糖诱导的蛤仔血细胞。

图2为本发明菲律宾蛤仔血细胞胞外陷阱的SytoX荧光显微观察图；其中图2A为对比例1中没有诱导的蛤仔血细胞，图2B为实施例1中经酵母多糖诱导的蛤仔血细胞。

具体实施方式

实施例1

一种贝类血细胞胞外陷阱的诱导方法，具体为一种菲律宾蛤仔血细胞胞外陷阱的诱导方法，步骤包括：取菲律宾蛤仔血细胞（约10⁶个细胞/ml），向其中加入终浓度为100ng/ml细胞松弛素D（抑制细胞吞噬作用）和500ng/ml酵母多糖。立刻将上述经处理后的血细胞滴加至超清洁黏附载玻片上。静置半小时以上，倒掉载玻片上的液体，得到诱导后的菲律宾蛤仔血细胞胞外陷阱。

其中，菲律宾蛤仔血细胞的获取：将菲律宾蛤仔进行开壳处理，取血窦处的血细胞；将细胞用4℃预冷的离心机400g离心5分钟，收集血细胞，再使用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗两次；接着使用细胞计数板进行计数。

对比例1

取菲律宾蛤仔血细胞（约10⁶个细胞/ml），向其中加入终浓度为100ng/ml细胞松弛素D（抑制细胞吞噬作用），得到未经诱导的蛤仔血细胞。

对比例2

取菲律宾蛤仔血细胞（约10⁶个细胞/ml），向其中加入500ng/ml的酵母多糖对血细胞进行处理1小时。此对比例2与实施例1的区别仅在于，不含有100ng/ml细胞松弛素D。与实施例1相比，此对比例2得到诱导后的蛤仔血细胞吞噬酵母多糖的比率较高，即不含有细胞松弛素的血细胞发生胞外陷阱的比例低，具体的，对比例2的血细胞发生胞外陷阱的比例约为30%，实施例1的血细胞发生胞外陷阱的比例约为60-70%。

如图1所示，图1为本发明实施例提供的方法获得的菲律宾蛤仔血细胞胞外陷阱的透射电镜观察图；其中1A图为对比例1中没有诱导的蛤仔血细胞，1B图为实施例1中经酵母多糖诱导的蛤仔血细胞。具体操作为：在载玻片的一侧轻轻滴加2.5%戊二醛溶液进行固定。经过逐级增高浓度乙醇的梯度脱水和金属镀膜后，扫描电镜观察血细胞胞外陷阱现象。

如图2所示，图2为本发明实施例提供的方法获得的菲律宾蛤仔血细胞胞外陷阱的SytoX荧光显微观察图；其中2A图为对比例1中没有诱导的蛤仔血细胞，2B图为实施例1中经酵母多糖诱导的蛤仔血细胞。具体操作为：向载玻片的一侧轻轻滴加含有SytoX荧光染料（染色胞外DNA）的PBS溶液。染色15分钟后，荧光显微镜观察血细胞胞外陷阱现象。

从图1和图2可以看出，500ng/ml的酵母多糖诱导了贝类血细胞产生纤维网状结构的胞外陷阱现象。扫描电镜和荧光显微镜观察的结果均证明，酵母多糖对贝类血细胞进行诱导，获得发生胞外陷阱的贝类血细胞。

应用例1

菲律宾蛤仔血细胞胞外陷阱的抑菌作用

步骤1 制备细菌悬液

在2216E培养基中分别培养灿烂弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌。4℃预冷的离心机5000g转速离心10分钟收集细菌。使用PBS清洗细菌两次后，将细菌浓度稀释至OD₆₀₀=0.8。即得到悬浮于PBS中的灿烂弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌悬液。

步骤2 检测抑菌作用

取实施例1经酵母多糖诱导后的蛤仔血细胞10⁶个于1.5ml离心管中，离心后获得细胞沉淀。向离心管中添加1ml步骤1所得的菌液，20℃孵育1小时。

取对比例1未经诱导的蛤仔血细胞进行孵育。随后，取细胞和细菌的混合液200μl涂布于TCBS琼脂培养基上。28℃培养12小时，使用平板计数法计算病原菌的生长情况。

结果表明，经酵母多糖诱导后的血细胞孵育后，胞外陷阱杀灭灿烂弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌的效果明显，死亡率分别为60.1%、72.7%、92.6%、85.2%。本发明经酵母多糖刺激后的蛤仔血细胞发生的胞外陷阱能够明显抑制灿烂弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌的生长。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。

Claims (1)

1.一种贝类血细胞胞外陷阱的诱导方法，其特征在于，采用酵母多糖对菲律宾蛤仔血细胞进行诱导，获得发生胞外陷阱的贝类血细胞，具体步骤包括：取菲律宾蛤仔血细胞，向其中加入终浓度为100ng/ml细胞松弛素D和500ng/ml酵母多糖；立刻将上述经处理后的血细胞滴加至超清洁黏附载玻片上；静置半小时以上，倒掉载玻片上的液体，得到诱导后的菲律宾蛤仔血细胞胞外陷阱。

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