CN108699533A

CN108699533A - 新型副溶血弧菌噬菌体Vib-PAP-1及其用于抑制副溶血弧菌增殖的用途

Info

Publication number: CN108699533A
Application number: CN201680075421.8A
Authority: CN
Inventors: 尹圣君; 俊苏云; 权安成; 黄苏星; 康桑贤
Original assignee: Intron Biotechnology Inc
Current assignee: Intron Biotechnology Inc
Priority date: 2015-12-21
Filing date: 2016-11-10
Publication date: 2018-10-23
Anticipated expiration: 2036-11-10
Also published as: US20180369299A1; WO2017111304A1; US10751377B2; KR101727456B1; CN108699533B

Abstract

本发明涉及一种从自然界中分离并且可特异性地杀灭副溶血弧菌细胞的短尾噬菌体Vib‑PAP‑1(登录号：KCTC 12817BP)以及使用包含所述噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗副溶血弧菌感染的方法，所述噬菌体具有由SEQ ID NO:1的核苷酸序列表示的基因组。

Description

新型副溶血弧菌噬菌体Vib-PAP-1及其用于抑制副溶血弧菌增殖的用途

技术领域

本发明涉及一种从自然界中分离的感染并杀灭副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)细胞的噬菌体，以及使用包含该噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗副溶血弧菌感染的方法。更具体地讲，本发明涉及一种从自然界中分离的并且可特异性地杀灭副溶血弧菌细胞的短尾噬菌体Vib-PAP-1(登录号：KCTC12817BP)，以及使用包含所述噬菌体作为活性成分的组合物来预防副溶血弧菌感染和随后对其进行治疗的方法，该噬菌体具有由SEQ ID NO:1的核苷酸序列表示的基因组。

背景技术

副溶血弧菌是一种属于弧菌属的革兰氏阴性杆菌，会引起人类急性食物中毒和肠炎以及鱼类的弧菌病。鱼类的弧菌病存在多种症状。受感染的鱼类可表现出身体颜色变暗和皮肤溃烂，并且有时会显示出吻突变红和皮肤发红。此外，就解剖学病征而言，观察到肝脏出血或充血。

由副溶血弧菌感染引起的弧菌病爆发频繁发生，导致了严重的经济损失。因此，需要开发一种用于预防并进一步治疗副溶血弧菌感染的新方法。

由于野生鱼捕捞不足时通过鱼类养殖很容易获得食物资源，所以鱼类养殖业每年都在持续快速发展。然而，随着水产养殖业日益发展，围绕水产养殖的由饲料引起的环境污染日益严重。具体地讲，饲料中包含的大量抗生素被广泛传播，以致严重危及人类健康。在水产养殖中，过量地利用化学治疗抗生素来实际地根除细菌性疾病。结果，频繁催生出多重耐药性菌株，这导致水产养殖遭受经济损失。此外，这种无任何限制地滥用抗生素会威胁全民健康，并因而在精神上影响各国减少鱼类的食用，从而导致鱼类养殖业整体竞争力减弱。因此，迫切需要开发一种预防细菌感染和随后对其进行有效治疗的新方法。尤其是海产品的安全性已成为主要的社会问题，因此优选的是环境友好的方法。

最近，使用噬菌体作为一种治疗细菌感染的新方法引起了我们的注意。具体地讲，我们对噬菌体高度感兴趣的原因在于基于噬菌体的处理是一种自然友好的方法。噬菌体是一种感染细菌的极其微小的微生物。一旦噬菌体感染细菌，噬菌体就在细菌细胞内增殖。增殖后，后代噬菌体会摧毁细菌的细胞壁以逃离宿主，这表明噬菌体具有杀灭细菌的能力。噬菌体感染的特征在于其高度特异性，使得某种噬菌体仅感染特定的细菌。也就是说，能够被某种噬菌体感染的细菌是有限的，这表明噬菌体只能杀灭某种特定的细菌而不会伤害其他细菌。由于这种细胞特异性，噬菌体对靶细菌产生抗菌作用，而不会影响环境中或鱼类肠道中的共生细菌。同时，常规抗生素一致地作用于各种类型的细菌。但是，噬菌体的使用却不会干扰鱼肠道内的正常微生物群，因为其选择性地杀灭靶细菌。因此，与任何其他抗生素相比，噬菌体可安全地使用并因此降低发生不利作用的概率。

1915年，英国细菌学家Twort首次发现了噬菌体，当时他注意到微球菌菌落溶化并且因某种未知的东西变得透明。1917年，法国细菌学家dHerelle发现痢疾患者粪便滤液中的痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)被某种东西溶化了，并且进一步对这种现象进行了研究。结果，他独立地鉴定出了噬菌体，并将其命名为意指细菌杀手的噬菌体。自那以后，已不断鉴定出特异性作用于此类病原菌(诸如志贺氏菌(Shigella)、伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae))的噬菌体。

由于噬菌体的这种杀灭细菌的独特能力，噬菌体已得到研究并预期作为治疗细菌感染的更好方法。然而，在Fleming发现青霉素之后，由于抗生素的普及，仅东欧一些国家和前苏联在继续研究噬菌体。2000年以后，由于耐抗生素细菌的增加，常规抗生素的优势逐渐消失。因此，噬菌体作为可替代常规抗生素的新型抗菌剂重新受到关注。此外，最近世界各地政府加强了对使用抗生素的规定。人们对噬菌体的兴趣日益增加，并且也越来越多地实现了工业应用。

如上所示，噬菌体往往对细菌具有高度特异性。特异性通常使得噬菌体对一部分细菌有效，尽管这些细菌属于相同的种类。另外，取决于靶细菌菌株，噬菌体的有效性各不相同。因此，有必要收集可用于有效控制特定细菌的多种噬菌体。因此，为了开发用于应对副溶血弧菌的噬菌体的用途，应当获取大量的噬菌体(对副溶血弧菌具有抗菌作用的多种噬菌体)。此外，需要对所得的噬菌体进行筛选以确定在抗菌强度和抗菌谱方面是否优于其他噬菌体。

发明内容

技术问题

因此，本发明人试图通过使用从自然界中分离并且可选择性地杀灭副溶血弧菌细胞的噬菌体来开发一种适用于预防或治疗副溶血弧菌感染的组合物，并且进一步确立使用该组合物预防或治疗副溶血弧菌感染的方法。结果，本发明人分离了适用于该目的的噬菌体，并确定了可区分本发明的噬菌体与其他噬菌体的基因组核苷酸序列。然后，我们开发了包含该分离的噬菌体作为活性成分的组合物，并且证实该组合物可有效地用于预防和治疗副溶血弧菌感染，从而完成了本发明。

本发明的目的是提供一种从自然界中分离并且可特异性地杀灭副溶血弧菌细胞的短尾噬菌体Vib-PAP-1(登录号：KCTC 12817BP)，该噬菌体具有由SEQ ID NO:1的核苷酸序列表示的基因组。

本发明的另一个目的是提供一种适用于预防副溶血弧菌感染的组合物以及使用所述组合物预防副溶血弧菌感染的方法，该组合物包含可感染和杀灭副溶血弧菌细胞的噬菌体Vib-PAP-1作为活性成分。

本发明的另一个目的是提供一种适用于治疗副溶血弧菌感染的组合物以及使用所述组合物治疗副溶血弧菌感染的方法，该组合物包含可感染和杀灭副溶血弧菌细胞的噬菌体Vib-PAP-1作为活性成分。

本发明的另一个目的是提供一种使用所述组合物来预防和治疗副溶血弧菌感染的浸泡剂(药浴剂)。

本发明的另一个目的是提供一种通过使用所述组合物来预防和治疗副溶血弧菌感染而开展农业生产时有效的饲料添加剂。

任务解决方案

为实现上述目的，本发明提供了一种从自然界中分离并且可特异性地杀灭副溶血弧菌细胞的短尾噬菌体Vib-PAP-1(登录号：KCTC12817BP)以及使用包含该噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗副溶血弧菌感染的方法，该噬菌体具有由SEQ ID NO:1的核苷酸序列表示的基因组。

噬菌体Vib-PAP-1已由本发明人分离，然后于2015年5月20日保藏在韩国生物科学与生物技术研究院的韩国典型培养物保藏中心(登录号：KCTC 12817BP)。

此外，本发明还提供了适用于预防或治疗副溶血弧菌感染的包含噬菌体Vib-PAP-1作为活性成分的浸泡剂和饲料添加剂。

由于本发明组合物中包含的噬菌体Vib-PAP-1有效地杀灭副溶血弧菌细胞，因此可认为其能够有效地预防或治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病(感染)。因此，本发明的组合物可用于预防和治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病，但不限于此。

在本说明书中，术语“预防”是指：(i)阻止副溶血弧菌的感染；以及(ii)阻止由副溶血弧菌引起的疾病的发展。

在本说明书中，术语“治疗”或“处理”是指：(i)抑制由副溶血弧菌引起的弧菌病；以及(ii)缓解由副溶血弧菌引起的弧菌病。

在本说明书中，术语“分离”或“分离的”是指通过使用各种实验技术分离噬菌体并且确定可区分这种噬菌体与其他噬菌体的特征的所有行为，并且还包括通过生物工程技术使该噬菌体增殖以使其可用的行为。

包含在本发明组合物中的药学上可接受的载体是通常用于制备药物制剂的载体，其示例为乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟甲基苯甲酸甲酯、羟甲基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不总是限于此。除了上述成分之外，本发明的组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、风味剂、乳化剂、助悬剂和防腐剂。

在本发明的组合物中，噬菌体Vib-PAP-1被包含作为活性成分。此时，所包含的噬菌体Vib-PAP-1的浓度为1×10¹pfu/ml至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至1×10³⁰pfu/g，并且优选地浓度为1×10⁴pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。

本发明的组合物可通过可由本领域的技术人员以单位剂量形式或在多剂量容器中通过使用药学上可接受的载体和/或赋形剂而进行的方法来配制。制剂可以是溶液、油溶性或水溶性介质中的悬浮液或乳液、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式。此时，可另外包含分散剂或稳定剂。

根据使用目的，本发明的组合物可制备成浸泡剂或饲料添加剂，但不总是限于此。

为此目的，本发明的组合物还可包含可对其他细菌种类产生抗菌活性的其他噬菌体以改善其效力。此外，本发明的组合物还可包含对副溶血弧菌具有抗菌活性的其他种类的噬菌体。此外，这些噬菌体可适当组合以最大化抗菌作用，因为它们对副溶血弧菌的抗菌活性在抗菌强度和抗菌谱方面可有所不同。

有益效果

与基于包括常规抗生素的化学物质的常规方法相比，使用这种包含噬菌体Vib-PAP-1作为活性成分的组合物来预防和治疗副溶血弧菌感染的方法具有对副溶血弧菌高度特异性的优点。这意味着，本发明的组合物可特异性地用于预防或治疗副溶血弧菌的感染而不影响正常微生物群，因此具有更少的副作用。一般来讲，当使用诸如抗生素的化学物质时，共生细菌也会受到损害，从而削弱动物的免疫力并产生各种副作用。同时，本发明的组合物使用从自然界中分离的噬菌体作为活性成分，使得它是非常环境友好的。

此外，噬菌体对即使属于同一物种的靶细菌的抗菌活性在抗菌强度和抗菌谱方面也是不同的(在几种副溶血弧菌菌株中，噬菌体的抗菌范围对每种菌株都有贡献。一般来讲，噬菌体通常对一部分细菌菌株有效，即使它们属于同一物种。也就是说，噬菌体的抗菌活性取决于细菌菌株而有所不同，无论它们是否属于同一物种)。然后，本发明的噬菌体可提供针对副溶血弧菌的与其他噬菌体提供的作用于副溶血弧菌不同的抗生素活性。因此，本发明的噬菌体可为鱼类养殖业提供不同的适用性。

附图说明

参照附图可最佳地理解本发明的优选实施方案的应用，在附图中：

图1是示出噬菌体Vib-PAP-1的形态的电子显微照片。

图2是说明噬菌体Vib-PAP-1杀灭副溶血弧菌细胞的能力的照片。培养皿上的透明区域是靶细菌细胞裂解形成的斑块。

具体实施方式

如以下实施例所示，本发明的实际和目前优选的实施方案均是例示性的。

然而，应当理解，考虑到本公开，本领域的技术人员可在本发明的精神和范围内进行修改和改进。

实施例1：能够杀灭副溶血弧菌的噬菌体的分离

从自然界中收集样本以筛选能够杀灭副溶血弧菌的噬菌体。同时，用于本文噬菌体分离的副溶血弧菌菌株从韩国生物科学与生物技术研究院的韩国典型培养物保藏中心(登录号：KCTC 2729)获得。

在下文中详细描述噬菌体的分离过程。将收集到的样本加到以1/1,000的比例接种有副溶血弧菌的LB(Luria-Bertani；胰蛋白胨，10g/L；酵母提取物，5g/L；氯化钠，10g/L)培养液中，随后在37℃下振荡培养3至4小时。培养结束后，以8,000rpm离心20分钟，回收上清液。将回收的上清液以1/1,000的比例接种副溶血弧菌，随后在37℃下振荡培养3至4小时。当样本中含有噬菌体时，总共重复上述过程5次以增加噬菌体的滴度。重复该过程5次后，将培养溶液以8,000rpm离心20分钟，回收所得的上清液。使用0.45μm过滤器对回收的上清液进行过滤。所得的滤液用于进行斑点测定以检查其中是否包含能够杀灭副溶血弧菌的噬菌体。

如下进行斑点测定：将LB培养液以1/1,000的比例接种副溶血弧菌，随后在37℃下振荡培养过夜。将上面制得的3ml(OD₆₀₀为1.5)的副溶血弧菌培养液涂布到LA(Luria-Bertani Agar；蛋白胨，10g/L；酵母提取物，5g/L；氯化钠，10g/L；琼脂，15g/L)平板上。将该平板放入室内约30分钟进行干燥。干燥后，将10μl所得滤液直接点涂在副溶血弧菌菌苔的表面上并干燥约30分钟。干燥后，将平板在37℃下温育一天，然后检查细菌菌苔表面上是否形成透明区域。如果滴入滤液的地方产生了透明区域，则可以判断滤液中应当包含能够杀灭副溶血弧菌的噬菌体。通过上述过程，可获得含有能够杀灭副溶血弧菌的噬菌体的滤液。

之后，从上面确认的滤液中分离噬菌体以获得能够杀灭副溶血弧菌的噬菌体。使用常规噬菌斑测定法进行纯噬菌体的分离。详细地讲，通过使用无菌尖端来挑取在噬菌斑测定过程中形成的噬菌斑，然后将其加到副溶血弧菌的培养溶液中，再在37℃下培养4至5小时。培养结束后，以8,000rpm离心20分钟，得到上清液。将回收的上清液以1/50的比例接种副溶血弧菌培养物，随后在37℃培养4至5小时。为了提高噬菌体的滴度，重复上述过程至少5次。然后，以8,000rpm离心20分钟以得到上清液。使用所得的上清液进行噬菌斑测定。一般来讲，纯噬菌体分离不是通过一次性操作完成的，因此通过使用上面形成的所得噬菌斑重复以上过程。在重复该过程至少5次后，获得含有纯噬菌体的溶液。通常重复分离纯噬菌体的过程直至所产生的噬菌斑在大小和形态上变得相似，并且通过电子显微镜确认最终的纯噬菌体的分离。重复上述过程，直至通过电子显微镜确认分离出纯的噬菌体。通过常规方法进行电子显微镜观察。简而言之，将含有纯噬菌体的溶液加载到铜网上，随后用2％乙酸双氧铀进行负染。干燥后，使用透射电子显微镜观察形态。图1中呈现了本发明中分离的噬菌体的电子显微照片。基于形态学特征，确认上面分离的噬菌体属于短尾噬菌体科。

对含有上面确认的纯噬菌体的溶液进行纯化。将副溶血弧菌培养液加到含有纯噬菌体的溶液中，所添加的体积与噬菌体溶液总体积的比率为1/50，随后再培养4至5小时。培养结束后，以8,000rpm离心20分钟，得到上清液。重复该过程5次以获得含有足够数量的噬菌体的溶液。使用0.45μm过滤器对最后离心得到的上清液进行过滤，随后进行常规的聚乙二醇(PEG)沉淀。具体地讲，向100ml滤液中加入PEG和NaCl直至达到10％PEG 8000/0.5MNaCl，然后在4℃下静置2至3小时。然后，以8,000rpm离心30分钟以获得噬菌体沉淀物。将所得的噬菌体沉淀物悬浮于5ml缓冲液(10mM Tris-HCl，10mM MgSO₄，0.1％明胶，pH 8.0)中。该溶液被称为噬菌体悬浮液或噬菌体溶液。

结果，收集上面纯化的纯噬菌体，命名为噬菌体Vib-PAP-1，然后于2015年5月20日保藏在韩国生物科学与生物技术研究院的韩国典型培养物保藏中心(登录号：KCTC12817BP)。

实施例2：噬菌体Vib-PAP-1基因组的分离和序列分析

如下分离噬菌体Vib-PAP-1的基因组。从实施例1中获得的噬菌体悬浮液中分离基因组。首先，为了清除包含在悬浮液中的副溶血弧菌的DNA和RNA，将各自200U的DNase I和RNase A加到10ml的噬菌体悬浮液中，然后在37℃下温育30分钟。30分钟后，为消除DNase I和RNase A活性，向其中加入500μl的0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)，然后温育10分钟。将悬浮液在65℃下进一步温育10分钟，然后添加100μl蛋白酶K(20mg/ml)以破坏噬菌体的外壁，随后在37℃下温育20分钟。之后，向其中加入500μl的10％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，随后在65℃下温育1小时。向其中加入10ml的比例为25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇的混合物，随后充分混合。将混合物以13,000rpm离心15分钟以分离各层。获得上层，然后向其中加入1.5倍上层体积的异丙醇，随后以13,000rpm离心10分钟以沉淀噬菌体的基因组。收集沉淀物后，将70％乙醇加到沉淀物中，随后以13,000rpm离心10分钟以洗涤沉淀物。回收经洗涤的沉淀物，真空干燥，然后溶解于100μl水中。重复该过程以获得足够量的噬菌体Vib-PAP-1基因组。

使用Roche 454GS Junior仪器通过下一代测序分析来确定上面获得的噬菌体Vib-PAP-1基因组的核苷酸序列。结果，我们发现噬菌体Vib-PAP-1的最终基因组大小为42,808bp，全基因组具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

通过使用BLAST研究了上面获得的噬菌体Vib-PAP-1的基因组序列与先前报道的噬菌体基因组序列的相似性。BLAST的结果证明，噬菌体Vib-PAP-1的基因组序列与弧菌噬菌体VP93的基因组序列(Genbank登录号：FJ896200.1)具有相对较高的同源性(查询范围/相似度：99％/95％)。然而，噬菌体Vib-PAP-1具有环状基因组，而弧菌噬菌体VP93具有线性基因组。因此，确定它们应当是不同种类的噬菌体。另外，通过使用NEBcutter V2.0 Web程序，将噬菌体Vib-PAP-1的基因组序列与弧菌噬菌体VP93的基因组序列进行了比较。结果表明，噬菌体Vib-PAP-1基因组可被15种限制酶(AvaI、AvrII、BmtI、BseRI、BsoBI、BssHII、BstNI、BstZ17I、MscI、NheI、NruI、PspGI、PvuII、SalI、XbaI)单切而消化，而弧菌噬菌体VP93可被10种限制酶(AcuI、AfeI、BmtI、BseRI、BssHII、EarI、MscI、NheI、NsiI、PflMI)单切。因此，再次证明它们应当是不同种类的噬菌体。

基于这个结果，可得出结论，噬菌体Vib-PAP-1应当是先前未报道过的新型噬菌体。或者，可以认为，当噬菌体的种类不同时，它们的抗菌强度和抗菌谱通常会变得不同。因此，证实噬菌体Vib-PAP-1具有比上述任何其他噬菌体更显著的抗菌活性。

实施例3：噬菌体Vib-PAP-1对副溶血弧菌的杀灭能力的研究

研究了经分离的噬菌体Vib-PAP-1对副溶血弧菌的杀灭能力。为此，通过斑点测定法以与实施例1中所述相同的方式观察透明区域的形成。本研究中使用的副溶血弧菌是本发明人先前分离并鉴定为副溶血弧菌的共17种菌株。证实了噬菌体Vib-PAP-1对本实验中使用的15种副溶血弧菌菌株具有杀灭能力。杀灭能力测试的代表性结果示于图2中。同时，还分别研究了噬菌体Vib-PAP-1对爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)、副乳房链球菌(Streptococcus parauberis)、海豚链球菌(Streptococcusiniae)和杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的杀灭活性。结果表明，噬菌体Vib-PAP-1对这些微生物没有杀灭活性。

因此，证实噬菌体Vib-PAP-1具有杀灭副溶血弧菌细胞的特异性能力以及针对副溶血弧菌的广抗菌谱，从而表明本发明的噬菌体Vib-PAP-1可用作用于预防和治疗副溶血弧菌感染的组合物的活性成分。

实施例4：噬菌体Vib-PAP-1对副溶血弧菌感染的预防作用

将100μl 1×10⁸pfu/ml的噬菌体Vib-PAP-1溶液加到含有9ml LB培养液的管中。向含有9ml LB培养液的另一个管中也加入相同量的LB培养液。向每个管中加入副溶血弧菌培养溶液直到OD₆₀₀达到约0.5。然后，将管转移到37℃培养箱中，随后振荡培养，在此期间观察副溶血弧菌的生长。如表1所示，在添加了噬菌体Vib-PAP-1溶液的管中，副溶血弧菌的生长受到抑制，而在未添加噬菌体溶液的管中副溶血弧菌的生长不受抑制。

【表1】

副溶血弧菌的生长抑制

上述结果表明，噬菌体Vib-PAP-1应当不仅抑制了副溶血弧菌的生长，还能杀灭副溶血弧菌。因此，可得出结论，噬菌体Vib-PAP-1可用作组合物的活性成分以防止副溶血弧菌感染。

实施例5：在动物模型中噬菌体Vib-PAP-1对副溶血弧菌感染的预防作用

研究了噬菌体Vib-PAP-1对受到副溶血弧菌影响的海鲈鱼的预防作用。具体地讲，共准备2组幼海鲈鱼(每组50只幼海鲈鱼，体重5至7g，体长8至10cm)，分别在不同的水箱中培养14天。控制水箱周围的环境。同时控制水箱所在实验室的温度和湿度。从实验的第1天开始，实验组(添加噬菌体)的海鲈鱼根据常规饲料供应过程用添加了1×10⁸pfu/g噬菌体Vib-PAP-1的饲料喂食，而对照组(不添加噬菌体)的海鲈鱼根据常规过程用未添加噬菌体的相同饲料喂食。从实验的第7天开始，两组的饲料都用1×10⁸pfu/g副溶血弧菌污染，持续2天并且之后每天分别提供两次，以便引起副溶血弧菌感染。从持续2天的诱导这种感染的下一天(实验的第9天)开始，分别向这两组提供没有受副溶血弧菌污染的饲料。然后，检查所有测试动物是否患有副溶血弧菌感染。由副溶血弧菌引起的感染性疾病的发作通过测量身体变暗指数来检测。通过获得深色着色(DC)评分(0：正常，1：浅着色，2：深着色)的常规方法来测量身体变暗指数。结果示于表2中。

【表2】

深色着色评分(平均值)

从以上结果可以确认，本发明的噬菌体Vib-PAP-1对于预防由副溶血弧菌引起的感染性疾病可能非常有效。

实施例6：噬菌体Vib-PAP-1对副溶血弧菌感染的治疗作用

研究了噬菌体Vib-PAP-1对受到副溶血弧菌感染的海鲈鱼的治疗作用。具体地讲，共准备2组幼海鲈鱼(每组60只幼海鲈鱼，体重5至7g，体长8至10cm)，分别在不同的水箱中培养14天。控制水箱周围的环境。同时控制水箱所在实验室的温度和湿度。从实验的第5天开始，根据常规饲料供应过程，每天提供两次添加了1×10⁸cfu/g副溶血弧菌细胞的饲料，持续3天。在该过程的最后一天，在两个水箱中均观察到受试海鲈鱼表现出由副溶血弧菌引起的感染性疾病的临床症状。从持续3天的提供添加了副溶血弧菌细胞的下一天(实验的第8天)开始，实验组(添加噬菌体)的海鲈鱼根据常规饲料供应过程用添加了1×10⁸pfu/g噬菌体Vib-PAP-1的饲料喂食，而对照组(不添加噬菌体)的海鲈鱼根据常规过程用未添加噬菌体Vib-PAP-1的相同饲料喂食。在实验的第8天后，检查所有测试动物是否患有由副溶血弧菌引起的感染性疾病。由副溶血弧菌引起的感染性疾病的发作通过测量身体变暗指数来检测。通过获得深色着色(DC)评分(0：正常，1：浅着色，2：深着色)的常规方法来测量身体变暗指数。结果示于表3中。

【表3】

深色着色评分(平均值)

从以上结果可以确认，本发明的噬菌体Vib-PAP-1对于治疗由副溶血弧菌引起的感染性疾病非常有效。

实施例7：饲料添加剂和饲料的制备

通过以1×10⁸pfu/g饲料添加剂的浓度添加噬菌体Vib-PAP-1溶液来制备饲料添加剂。其制备方法如下：将麦芽糖糊精(50％，w/v)加到噬菌体溶液中，混合，然后将所得混合物冷冻干燥。最后，将经干燥的混合物研磨成细粉。上述干燥过程可用减压干燥、温热干燥或室温干燥代替。为了制备用于比较的对照，制备了不含噬菌体而仅含缓冲液(10mMTris-HCl，10mM MgSO₄，0.1％明胶，pH8.0)的饲料添加剂。

将上述两种饲料添加剂与250倍添加剂体积的基于生鱼的湿颗粒混合，从而产生两种最终的饲料添加剂。

实施例8：制备浸泡剂(药浴剂)

制备包含1×10⁸pfu/ml的噬菌体Vib-PAP-1的浸泡剂。制备方法如下：将1×10⁸pfu的噬菌体Vib-PAP-1加到1ml缓冲液中，然后充分混合。为了制备对照，制备了与用于噬菌体溶液混合物的缓冲液相同的缓冲液。

将所制备的两种浸泡剂用水以1:1,000的比例稀释，得到用于实验的最终浸泡剂。

实施例9：对海鲈鱼水产养殖的影响

研究了实施例7和实施例8中制备的饲料和浸泡剂对海鲈鱼水产养殖的影响。具体地讲，研究的重点是死亡率。将共500只幼海鲈鱼(体重5至7g，体长8至10cm)分为两组，每组250只海鲈鱼，进行以下实验(A组；喂食饲料，B组；用浸泡剂处理)。将各组再分为两个亚组，每组125只海鲈鱼(亚组①：用噬菌体Vib-PAP-1处理，亚组②：未用噬菌体Vib-PAP-1处理)。各亚组的海鲈鱼都在以一定空间间隔放置的独立水箱中进行水产养殖。各亚组的区分和命名如表4所示。

【表4】

水产养殖实验中海鲈鱼亚组

根据表4中所示的常规饲料供应过程提供饲料，其中饲料如实施例7中所述进行制备。浸泡剂的处理也通过如表4中所示的常规过程进行，其中浸泡剂如实施例8中所述进行制备。结果示于表5中。

【表5】

水产养殖过程中海鲈鱼的死亡率

上述结果表明，本发明制备的饲料和根据本发明制备的浸泡剂有效地降低了养殖海鲈鱼的死亡率。因此，可得出结论，本发明的组合物可有效地用于改善海鲈鱼水产养殖的结果。

本领域技术人员将会理解，在先前说明书中公开的概念和具体实施方案可容易地用作修改或设计用于实现本发明的相同目的的其他实施方案的基础。本领域的技术人员还将认识到，此类等同实施方案并不脱离如所附权利要求中所阐述的本发明的精神和范围。

机构名称:KCTC

保藏号:KCTC 12817BP

保藏日期：20150520

PCT/RO/134表

Claims

1.一种从自然界中分离并且可特异性地杀灭副溶血弧菌细胞的短尾噬菌体Vib-PAP-1(登录号：KCTC 12817BP)，所述噬菌体具有由SEQ ID NO:1的核苷酸序列表示的基因组。

2.一种用于预防和治疗副溶血弧菌感染的组合物，所述组合物包含根据权利要求1所述的噬菌体Vib-PAP-1作为活性成分。

3.根据权利要求2所述的用于预防和治疗副溶血弧菌感染的组合物，其中所述组合物用于制备浸泡剂或饲料添加剂。

4.一种用于预防或治疗副溶血弧菌感染的方法，所述方法包括向受试对象施用根据权利要求2或权利要求3所述的包含噬菌体Vib-PAP-1作为活性成分的组合物的步骤。

5.根据权利要求4所述的用于预防或治疗副溶血弧菌感染的方法，其中所述组合物以浸泡剂或饲料添加剂的形式施用于受试对象。