DE69701446T2

DE69701446T2 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung des hämoglobingehalts von einzelnen roten blutkörperchen

Info

Publication number: DE69701446T2
Application number: DE69701446T
Authority: DE
Inventors: Stewart Frank; Lynn Wyatt
Original assignee: Coulter International Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1996-01-19
Filing date: 1997-01-06
Publication date: 2001-03-08
Anticipated expiration: 2017-01-07
Also published as: JP2000503772A; WO1997026528A1; US5686309A; JP3828155B2; DE69701446D1; EP0874983B1; EP0874983A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Messung der Hämoglobinkonzentration von einzelnen roten Blutkörperchen in einer Vollblutprobe, Genauer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Durchführung einer derartigen Messung und zur Bestimmung von statistischen Charakteristika und zur Identifizierung von Subpopulationen der Probe.

Hintergrund der Erfindung

Die Auswertung bzw. Bewertung der Eigenschaften von einzelnen roten Blutkörperchen eines Individuums bzw. einer Person ist ein Standardschritt bei der Bewertung der Gesundheit des Individuums und wird in der Diagnose von bestimmten Erkrankungen und der Überwachung von Behandlungen verwendet. Eigenschaften von roten Blutkörperchen, welche routinemäßig erfaßt werden, umfassen die Anzahl der roten Blutkörperchen pro Volumseinheit Blut (genannt die "Red Cell Count" oder "RBC" (Erythrozytenzahl)), die Volumsprozent roter Blutkörperchen in Vollblut ("Packed Cell Volume" oder PCV (gepacktes Zellvolumen)), die Menge an Hämoglobin pro Volumseinheit Vollblut ("Hemoglobin Concentration" oder [Hgb] (Hämoglobinkonzentration)), die Durchschnittsgröße der roten Blutkörperchen ("Mean Cell Volume" oder MCV (mittleres Zellvolumen)) und die Größenverteilung von roten Blutkörperchen ("Red Cell Distribution Width" oder RDW (Verteilungsbreite der roten Blutkörperchen)), die durchschnittliche Menge an Hämoglobin in jedem roten Blutkörperchen ("Mean Cell Hemoglobin" oder MCH (mittleres Zellhämoglobin)) und die durchschnittliche Konzentration an Hämoglobin in dem roten Blutkörperchen ("Mean Cell Hemoglobin Concentration" oder MCHC (mittlere Zellhämoglobinkonzentration)). Von diesen aufgezeichneten bzw. erfaßten Parametern messen die meisten Hämatologie-Analysiergeräte direkt nur drei: die Erythrozytenzahl (RBC), die Hämoglobinkonzentration ([Hgb]) und das mittlere Zellvolumen (MCV). Die anderen Parameter werden gemäß den folgenden Beziehungen berechnet:
1. PCV = RBC · MCV
2. MCH = [Hgb]/RBC
3. MCHC = [Hgb]/PCV
4. RDW = Standard-Volumsabweichung/MCV
Die angegebenen bzw. ermittelten Parameter der roten Blutkörperchen werden verwendet, um den Zustand einer Blutprobe eines Patienten zu beschreiben, und stehen in Zusammenhang mit der Klassifikation und Diagnose einer Anämie. Beispielsweise ist durch die Verwendung des MCV eine Subklassifikation von Anämien möglich. Ein verringertes MCV wird bei mikrozytischen Anämien, wie einem Eisenmangel oder Thalassämie, gesehen. Ein erhöhtes MCV tritt bei makrozytischen Anämien von B12/Folat-Mangel oder aplastischer Anämie auf. Normozytische Anämien (normales MCV) umfassen immunhämolytische Anämie oder erbliche Sphärozytose. Eine Einschränkung bzw. Einengung der Klassifikation ist durch die Hinzufügung von anderen Parametern, wie MCHC oder MCH, möglich. Für die mikrozytischen Anämien zeigt ein Eisenmangel eine Verringerung von sowohl dem MCV als auch der MCHC, wohingegen nur das MCV bei Thalassämie verringert ist. Zusätzlich liefert die Werteverteilung in der roten Blutkörperchen-Population weitere Informationen. Beispielsweise ist bei mikrozytischen Anämien RDW bei einem Eisenmangel erhöht, jedoch nicht bei Thalassämie.
Andere analytische Faktoren sind bei der vollständigen Bestimmung bzw. Beurteilung einer Blutprobe eines speziellen Patienten nützlich und erlauben eine frühe Diagnose und Behandlung von Erkrankungen. Eine Analyse der Verteilung der einzelnen Zellhämoglobinkonzentration innerhalb einer Population fügt signifikante Information betreffend die Strömungs- bzw. Flußeigenschaften der roten Blutkörperchen hinzu. Die Verteilung der einzelnen roten Blutkörperchen-Hämoglobinkonzentration ist in etwa äquivalent zu der händischen Bestimmung bzw. Beurteilung der Farbe der roten Blutkörperchen auf einem Mikroskop-Objektträger. Rote Blutkörperchen mit verringerter Hämoglobinkonzentration werden hypochrom genannt, wohingegen rote Blutkörperchen mit erhöhter Hämoglobinkonzentration als hyperchrom bezeichnet werden. Populationen mit einer erhöhten Verteilung der Hämoglobinkonzentration werden als polychromatophil klassifiziert. Hyperchrome rote Blutkörperchen haben veränderte Strömungs- bzw. Flußeigenschaften und dies wurde als der zelluläre Grund für die hämolytische Krise in Erkrankungen, wie einer Sichelzellenanämie, angenommen.
In ihrer vorliegenden Form bestehen zahlreiche Probleme und Beschränkungen im Zusammenhang mit den Messungen des mittleren Zellhämoglobins und der mittleren Zellhämoglobinkonzentration. Erstens werden diese Messungen üblicherweise als eine Durchschnittsmessung für die gesamte Zellpopulation durchgeführt. Es ist daher unmöglich, die Verteilung dieser Messungen in der Population zu erhalten oder Mehrfachpopulationen oder Subpopulationen zu identifizieren. Zweitens, da die Messungen von mittlerem Zellhämoglobin und mittlerer Zellhämoglobinkonzentration nicht direkt bestimmt werden, sondern aus zwei oder mehreren Messungen berechnet werden, wie dies in den obigen Gleichungen beschrieben ist, existiert ein Potential für Fehler aufgrund dieser Mehrfachmessungen.
In dem Referenzverfahren wird MCHC durch Dividieren des Hämoglobingehalts durch das gepackte Zellvolumen bestimmt. In dem Fall von automatisierten Hämatologie-Analysegeräten wird das gepackte Zellvolumen nicht direkt bestimmt, sondern als die Zellzahl mal dem mittleren Zellvolumen bestimmt. Bei zahlreichen automatisierten Systemen besteht eine bekannte Ungenauigkeit in der Volumsmessung für Proben mit abnormaler Hämoglobinkonzentration. Daher setzt sich dieser Fehler im Volumen in die Messung der mittleren Zellhämoglobinkonzentration fort.
Automatisierte Einrichtungen zur Durchführung von elektrischen Widerstands- oder von optischen Messungen an einzelnen Blutkörperchen, wenn im wesentlichen eine Zelle zu einem Zeitpunkt durch eine Öffnung hindurchtritt, sind in der Technik der Zytometrie gut bekannt.
Das Basis- bzw. Entwicklungspatent (Wallace H. Coulter, US- Patent Nr. 2,656,508, Oktober 1953) beschreibt ein Verfahren zum Messen des Gleichstromwiderstands (DC) an einzelnen Zellen, wenn sie durch eine Öffnung hindurchtreten. Das Verhältnis dieser Niederfrequenzmessung zu dem Volumen und der Form der Zelle wurde nachfolgend gut beschrieben. In dem Patent von Coulter und Hogg (US-Patent Nr. 3,502,974, März 1970) wird die Messung des Radiofrequenz- bzw. Hochfrequenz-Widerstands von Zellen während des Durchtritts durch eine Öffnung gelehrt. Es ist auch bekannt, daß die RF-Widerstandsmessung durch die Größe, Form und die innere Leitfähigkeit der Zelle beeinflußt wird. Indem das Verhältnis des RF-Widerstands zu dem DC-Widerstand bestimmt wird, ein Verhältnis, welches als die "Opazität bzw. Trübung" der Zelle bezeichnet wird, kann man den Einfluß der Größe der Zelle eliminieren und eine Messung durchführen, welche nur von der inneren Leitfähigkeit der Zelle und ihrer Form abhängt. Die Opazitätsmessung wurde in verschiedenen Anwendungen verwendet, um Subpopulationen von Blutzellen in einer größeren Population zu unterscheiden, wie beispielsweise für die Identifizierung von spezifischen, weißen Blutkörperchen-Typen oder für die Unterscheidung von Plättchen von roten Blutkörperchen. Diese Unterscheidung basiert auf dem relativen Maß einer Population gegenüber einer anderen und umfaßt nicht die Quantifizierung von spezifischen Zelleigenschaften, die für die beobachtete Messung verantwortlich sind.
Leif et al., "Two-dimensional Impedance Studies of BSA Buoyant Density Separated Human Erythrocytes", Cytometry, 6: 13-21, 1985, beschreibt die Verwendung der Opazitätsmessung, um zwischen roten Blutkörperchen unterschiedlicher Dichte zu unterscheiden. Jedoch erkannten sie die Verwendung der Opazitätsmessung für die Bestimmung der Hämoglobinkonzentration der Zelle nicht. Die Quantifizierung der Hämoglobinkonzentration von einzelnen roten Blutkörperchen unter Verwendung der Opazitätsmessung wurde niemals zuvor beschrieben oder durchgeführt.
In einer anderen Literaturstelle lehren Groves et al., UK-Patentanmeldung GB 2,064,133, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur hydrodynamischen Fokussierung eines Stroms von roten Blutkörperchen, um durch eine Öffnung hindurchzutreten, wobei ein niederfrequenter, elektrischer Strom durch die Öffnung hindurchtritt, um eine erste elektrische Impedanz-Signalmessung zu erzeugen und die Längenmessung von jedem roten Blutkörperchen zu erhalten, während es hydrodynamisch durch optische Signalbildungselemente fokussiert wird, um eine Information über die Form der roten Blutkörperchen zu erhalten. In einer weiteren Ausbildung tritt ein zusätzlicher, hochfrequenter, elektrischer Strom durch die Öffnung hindurch, um eine zweite elektrische Impedanz-Signalmessung zu erzeugen, um einen inneren Widerstand der roten Blutkörperchen von jedem roten Blutkörperchen zu erhalten. Diese Literaturstelle lehrt nicht die Bestimmung der einzelnen roten Blutkörperchen-Hämoglobinkonzentration oder legt diese nicht nahe.
In einer weiteren Literaturstelle lehren Brittenham et al., EP-Patentanmeldung 0 335 001, eine Teilchenanalyse von Blutkörperchen unter Verwendung eines unterscheidenden Parameters, welcher das Verhältnis der Pulshöhe zur Pulsbreite, abgeleitet von individuellen Pulsen, die als Antwort auf die Projektion von jedem Blutkörperchen gebildet werden, ist. Die Verteilung des Unterscheidungsparameters wird auf einer Verteilung der Pulshöhe und der Pulsbreite aufgezeichnet und eine dreidimensionale Darstellung der Pulshöhe, -breite und des unterscheidenden Parameters wird beim Analysieren der roten Blutkörperchen verwendet. Diese Literaturstelle lehrt nicht oder deutet nicht an, wie die einzelne rote Blutkörperchen-Hämoglobinkonzentration erhalten werden kann.
Die Verwendung von elektrischen Einrichtungen, um die Eigenschaften von spezifischen Komponenten von Blut und anderen Zellen zu hinterfragen bzw. zu untersuchen, wurde seit dem Beginn des 20. Jahrhunderts praktiziert. Die Studie der elektrischen Eigenschaften von Blut und anderen biologischen Fluiden durch Durchführen einer Serie von Messungen bei unterschiedlichen Frequenzen wurde als "Wechselstromspektroskopie" bezeichnet. Ein Überblicksartikel über diese Literatur ist von Schwan, "Electrical Properties of Blood and its Constituents: Alternating Current Spectroscopy", Blut, 46 : 185-197, 1983, verfaßt. Zahlreiche Forscher haben die Widerstands- und dielektrischen Eigenschaften von Vollblut über einen Bereich von Frequenzen von Gleichstrom bis zu Mikrowellen studiert. Es wurde in dieser Periode früh erkannt, daß die elektrische Leitfähigkeit von Vollblut für niederfrequente, elektrische Ströme und RF-elektrische Ströme unterschiedlich war und daß der Widerstand der Zellmembran gegenüber niederfrequentem Strom in erster Linie für diesen Unterschied verantwortlich ist. Es ist daher mit dieser Technik der Wechselstromspektroskopie möglich, die durchschnittliche elektrische Leitfähigkeit des Zytoplasmas einer Population von roten Blutkörperchen zu bestimmen. Jedoch erlaubt es diese Technik nicht, die innere Leitfähigkeit von einzelnen Zellen zu messen, noch sind Einrichtungen beschrieben, um die Hämoglobinkonzentration von einzelnen roten Blutkörperchen zu bestimmen.
Pilwat und Zimmermann, "Determination of Intracellular Conductivitiy from Electrical Breakdown Measurements", piochimica et Biophysica Acta, 820: 305-314, 1985, beschreiben die Bestimmung der mittleren, inneren Leitfähigkeit von Zel len in einer Strömungs-Zytometrie-Öffnung unter Verwendung eines sehr starken elektrischen Feldes, welches ein Zerstören bzw. Aufbrechen der Zellmembran bewirkt und so dem Strom erlaubt, durch die Zelle hindurchzutreten. Diese Technik vergleicht dann den elektrischen Widerstand für die zerstörte Zellpopulation mit Messungen, welche bei einer niedrigeren Feldstärke durchgeführt wurden, welche die Zellen nicht zerstört. Mit dieser Technik kann ebenso wie mit der Wechselstromspektroskopie ein durchschnittliches Maß für die innere Leitfähigkeit der Zellpopulation bestimmt werden. Während diese Technik in einer Strömungs-Zytometrie-Öffnung durchgeführt werden kann, kann sie, da sie mehrere Durchgänge einer Population durch die Öffnung erfordert, anstatt daß alle Messungen an einer einzelnen Zelle durchgeführt werden, nur eine Durchschnittsmessung für die gesamte Population liefern. Wiederum kann die Messung der individuellen Zellhämoglobinkonzentration mit dieser elektrischen Technik nicht durchgeführt werden.
Es wurden zwei Einrichtungen zur Durchführung von Messungen der individuellen Zellhämoglobinkonzentration mit einem Strömungs- bzw. Flußzytometer beschrieben. US-Patent Nr. 4,735,504 von Tycko (April 1988) beschreibt das Sammeln von Streulicht über zwei Winkelbereiche für kugelförmige, rote Blutkörperchen in einer Strömungs-Zytometrie-Öffnung, um das Volumen und die Hämoglobinkonzentration dieser Zellen zu bestimmen. Zusätzlich beschreibt das US-Patent Nr. 5,194,909, ebenfalls von Tycko (März 1993), die Messung des Gleichstrom- Widerstands gemeinsam mit einem Winkelbereich einer Lichtstreuung an kugelförmigen bzw. kugelförmig gemachten, roten Blutkörperchen, um gleichzeitig das Zellvolumen und die Hämoglobinkonzentration zu bestimmen. Beide Techniken erfordern die Verwendung von Laserlichtquellen, Flußzellen, die für optische Messungen aus optisch reinen Materialien hergestellt wurden, geeignet sind, und Fotodetektoren und deren zugehörige Elektronik. Die Verwendung dieser optischen Techniken bringt bemerkenswerte Kosten und eine Komplexizität in bezug auf die Meßvorrichtung mit sich. Zusätzlich sind beide Techniken sehr empfindlich in bezug auf die Form der Zelle und genaue Messungen können nur bestimmt werden, wenn die Zelle perfekt kugelförmig ist. Daher sind Messungen mit roten Blutkörperchen in ihrer ursprünglichen Form nicht möglich.
Dementsprechend besteht das Erfordernis für eine Vorrichtung zum Bestimmen der Hämoglobinkonzentration von einzelnen roten Blutkörperchen in einer Strömungs-Zytometrie-Öffnung, welche die Verwendung einer optischen Beleuchtung und Detektion nicht erfordert. Wie hier beschrieben, würden eine derartige Vorrichtung und ein derartiges Verfahren die Fähigkeit besitzen, schnell und genau die Hämoglobinkonzentration einer einzelnen Zelle bei niedrigeren Kosten mit einem einfacheren Instrument, als dies gegenwärtig möglich ist, zu bestimmen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Bestimmen der Hämoglobinkonzentration von einzelnen roten Blutkörperchen gerichtet. Das Verfahren umfaßt die Schritte: Mitreißen bzw. Mitnahme von roten Blutkörperchen einer Blutprobe in einen Strom von in Abstand voneinander befindlichen, einzelnen roten Blutkörperchen in einer Elektrolytflüssigkeit; Messen des elektrischen Niederfrequenz-Widerstands der Elektrolytflüssigkeit in einer Öffnung, umfassend das Messen einer Änderung des elektrischen Widerstands, die durch den Durchgang von jedem roten Blutkörperchen des Stroms durch die Öffnung bewirkt wird, und Ableiten eines entsprechenden ersten Pulssignals, welches eine für die Änderung des elektrischen Widerstands, die durch den Durchgang des roten Blutkörperchens durch die Öffnung bewirkt wird, repräsentative Amplitude aufweist; Messen des Hochfrequenz-(RF-)Widerstands der Elektrolytflüssigkeit in der Öffnung, umfassend das Messen einer Änderung in dem Hochfrequenz-Widerstand, die durch den Durchgang von jedem der roten Blutkörperchen des Stroms durch die Öffnung bewirkt wird, und Ableiten eines entsprechenden zweiten Pulssignals, welches eine für die Änderung in dem Hochfrequenz-Widerstand, die durch den Durchgang von jedem roten Blutkörperchen durch die Öffnung bewirkt wird, repräsentative Amplitude aufweist; Bestimmen einer Form für jedes rote Blutkörperchen; und Berechnen der Hämoglobinkonzentration von jedem der roten Blutkörperchen des Stroms aus den entsprechenden ersten und zweiten Pulssignalen und der Form des roten Blutkörperchens. Zusätzlich ist das Verfahren anwendbar auf Vorrichtungen, welche eine Nichtfokus-Strömungs- bzw. -Flußöffnung aufweisen, und auf Vorrichtungen, welche eine Fokus-Strömungs- bzw. -Flußöffnung anwenden.
Die Bestimmung der Form des roten Blutkörperchens kann mit verschiedenen Verfahren durchgeführt werden, welche ein Kugelförmigmachen der roten Blutkörperchen, eine Direktmessung der roten Blutkörperchen und die Auswahl eines konstanten Werts für die roten Blutkörperchen umfassen.
Die vorliegende Erfindung zielt weiters auf ein Verfahren ab, welches das Bestimmen des Volumens des roten Blutkörperchens, unter Verwendung der gemessenen Änderung in dem niederfrequenten, elektrischen Widerstand, der durch das Hindurchtreten von jedem der roten Blutkörperchen des Stroms durch die Öffnung bewirkt wird, umfaßt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt die Identifizierung von Subpopulationen von roten Blutkörperchen basierend auf der Bestimmung der Hämoglobinkonzentration von roten Blutkörperchen.
Zusätzlich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Vorrichtung zur Messung der Hämoglobinkonzentration von einzelnen roten Blutkörperchen. Die Vorrichtung umfaßt eine Einrichtung zum Mitreißen bzw.. zur Mitnahme von roten Blutkörperchen einer Blutprobe in einen Strom von in Abstand voneinander befindlichen, einzelnen roten Blutkörperchen in einer Elektrolytflüssigkeit; Widerstandsmeßeinrichtungen zum Messen des elektrischen Niederfrequenz-Widerstands der Elektrolytflüssigkeit in einer Öffnung, umfassend die Messung einer Änderung des elektrischen Widerstands, die durch den Durchgang von jedem der roten Blutkörperchen des Stroms durch die Öffnung bewirkt ist, und Ableiten eines entsprechenden ersten Pulssignals für jedes rote Blutkörperchen, welches eine Amplitude aufweist, die für die Änderung des elektrischen Widerstands, die durch den Durchgang von jedem roten Blutkörperchen durch die Öffnung bewirkt ist, repräsentativ ist; Hochfrequenz-Meßeinrichtungen zum Messen eines Hochfrequenz-(RF-)Widerstands der Elektrolytflüssigkeit in der Öffnung, umfassend die Messung einer Änderung in dem Hochfrequenz-Widerstand, die durch den Durchgang von jedem der roten Blutkörperchen des Stroms durch die Öffnung bewirkt ist, und Ableiten eines entsprechenden zweiten Pulssignals, welches eine Amplitude aufweist, die für die Änderung des Hochfrequenz-Widerstands, die durch den Durchgang der roten Blutkörperchen durch die Öffnung bewirkt ist, repräsentativ ist; Einrichtungen zum Bestimmen einer Form für jedes rote Blutkörperchen; und Einrichtungen zum Berechnen der Hämoglobinkonzentration von jedem der roten Blutkörperchen des Stroms aus den entsprechenden ersten und zweiten Pulssignalen und der Form der roten Blutkörperchen.
Zusätzlich ist die Vorrichtung auf ein Instrument gerichtet, welches eine Nichtfokus-Strömungs- bzw. -Flußöffnung umfassen kann. Alternativ kann die Vorrichtung eine Fokus-Strömungsöffnung anwenden.
Weiters ist die Vorrichtung auf das Bereitstellen einer Bestimmung der Form von roten Blutkörperchen gerichtet. In einer Ausbildung der Vorrichtung umfaßt die Vorrichtung ein Gefäß (nicht dargestellt), welches verwendet wird, um die roten Blutkörperchen mit einem Agens zum Kugelförmigmachen zu vermischen, um die roten Blutkörperchen kugelförmig zu machen. In einer zweiten Ausbildung umfaßt die Vorrichtung eine Einrichtung zur Direktmessung der Blutkörperchen. Diese Vorrichtung umfaßt ein Abbildungssystem, um ein Bild des roten Blutkörperchens zu erhalten (nicht dargestellt).
Die Erfindung bezieht sich weiters auf eine Vorrichtung, welche weiters eine Einrichtung zum Bestimmen des Volumens des roten Blutkörperchens, unter Verwendung der gemessenen Änderung in dem elektrischen Widerstand, die durch das Hindurchtreten von jedem der roten Blutkörperchen des Stroms durch die Öffnung bewirkt wird, umfaßt.
Die vorliegende Vorrichtung erlaubt die Identifizierung von Subpopulationen von roten Blutkörperchen basierend auf der Bestimmung des Volumens und der Hämoglobinkonzentration von roten Blutkörperchen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Ansicht einer Vorrichtung zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung.
Fig. 2 ist ein Diagramm des Zusammenhanges zwischen dem Anfangsionengehalt einer gepufferten Salzlösung, der Hämoglobinkonzentration der Lösung und der elektrischen Leitfähigkeit der resultierenden Mischung.
Fig. 3 ist ein Diagramm des Zusammenhanges zwischen der Konzentration an Hämoglobin in einer gepufferten Salzlösung und der elektrischen Leitfähigkeit der Lösung relativ zu der gepufferten Salzlösung ohne Hämoglobin.
Fig. 4 ist ein Diagramm, welches die Abhängigkeit von der Form der Zelle des Zusammenhanges zwischen der Hämoglobinkonzentration eines roten Blutkörperchens und der Opazitätsmessung der Zelle zeigt.
Fig. 5 ist ein Diagramm, welches die Opazitäten von kugelförmigen und deformierbaren, roten Blutkörperchen als eine Funktion der Hämoglobinkonzentrationen zeigt. Die Kurven zeigen die theoretischen Projektionen basierend auf der in dieser Anmeldung entwickelten Analyse.
Fig. 6 ist ein Vergleich der Hämoglobinkonzentration, die mit dem Verfahren dieser Erfindung bestimmt wurde, gegenüber einem Referenzverfahren für 54 Patientenproben.
Fig. 7 ist ein Hämoglobinkonzentration-Histogramm von Blutproben, die durch die vorliegende Erfindung bestimmt sind. Fig. 7(A) zeigt eine normale rote Blutkörperchen-Population, Fig. 7(B) zeigt einen signifikanten Anstieg an roten Blutkörperchen, welche hypochrome roten Blutkörperchen sind. Fig. 7(C) zeigt einen signifikanten Anstieg an roten Blutkörperchen, welche hyperchrome rote Blutkörperchen sind.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausbildungen

Wie schematisch in Fig. 1 gezeigt, besteht die Vorrichtung gemäß dieser Erfindung aus einer Strömungs- bzw. Flußzelle 2, die mit einem Fluidsystem 4 verbunden ist, welches eine verdünnte rote Blutkörperchen-Probe der Flußzelle zuführt bzw. zur Verfügung stellt. Die Flußzelle 2 enthält eine Meßöffnung 6, durch welche rote Blutkörperchen im wesentlichen eines zu einem Zeitpunkt hindurchströmen. Elektroden 8 sind an jeder Seite der Öffnung angeordnet. Die Elektroden sind mit einer elektrischen Schaltung 10 verbunden, die fähig ist, ein Gleichstromfeld und ein elektrisches Hochfrequenz-Wechselstrom-Feld über die Öffnung auszubilden. Die elektrische Schaltung 12 ist ebenfalls an die Elektroden angeschlossen und mißt die Änderung in den DC- und RF-Spannungen, welche auftreten, wenn die roten Blutkörperchen durch die Öffnung hindurchtreten. Der Ausgang dieser Schaltung ist mit einem Computer 14 durch Digitalisierungseinrichtungen 16 verbunden. Der Computer enthält Aufzeichnungseinrichtungen 18, welche die Größe der Änderung in der Gleichspannung bzw. DC-Spannung und der Hochfrequenzspannung bzw. RF-Spannung, die durch jedes rote Blutkörperchen, das durch die Öffnung hindurchtritt, bewirkt wird, aufzeichnet. Der Computer führt dann eine Analyse unter Verwendung von Berechnungseinrichtungen 20 durch, um die Hämoglobinkonzentration des einzelnen roten Blutkörperchens, welches die Öffnung passierte, in Übereinstimmung mit der vorliegenden Offenbarung zu bestimmen. Zusätzlich wird in einer bevorzugten Ausbildung das Volumen von jedem roten Blutkörperchen berechnet. Weiters sammelt der digitale Computer statistische Messungen für die rote Blutkörperchen-Population, umfassend die mittlere Standardabweichung und den Variationskoeffizienten der zellulären Hämoglobinkonzentration und des Volumens.
Um die Hämoglobinkonzentration von einzelnen roten Blutkörperchen zu bestimmen, wird ein Aliquot an roten Blutkörperchen mit einer isotonischen Lösung mit bekannter Leitfähigkeit verdünnt. Die Verdünnung sollte in einem Bereich liegen, um sicherzustellen, daß die Zellen durch die Öffnung im wesentlichen eine zu jedem Zeitpunkt hindurchströmen können. Typische Verdünnungen sind den Fachleuten für den bekannten Zweck bekannt. Üblicherweise sind die Verdünnungen größer als 1 : 1. Für Instrumente bzw. Apparaturen, welche ein Fokus-Flußöffnungssystem verwenden, ist die Verdünnung der roten Blutkörperchen zu dem Elektrolyt etwa 1 : 2500. Für Instrumente bzw. Apparaturen, welche ein Nichtfokus-Flußöffnungssystem verwenden, ist die Verdünnung der roten Blutkörperchen zu dem Elektrolyt etwa 1 : 5000.
Der Bereich der Leitfähigkeit der isotonischen Lösung wurde als nicht signifikant nachgewiesen. Ein weiter Bereich der Leitfähigkeit wurde als in dieser Erfindung verwendbar gezeigt. Die isotonische Lösung ist typischerweise eine gepufferte Salzlösung von Natriumchlorid mit einem neutralen pH- Wert. Ein Beispiel einer geeigneten isotonischen Lösung ist eine isotonische, phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit pH 7,4 und einer Osmolarität von etwa 290 mOsm.
Die Hämoglobinkonzentration der Zelle wird aus dem Analysieren des DC- und RF-Widerstands des roten Blutkörperchens erhalten, welcher gemessen wird, wenn die Zelle durch eine Meßöffnung hindurchtritt. Der elektrische Widerstand, der durch ein Teilchen oder eine Zelle, die in einem elektrisch leitfähigen Fluid suspensiert ist, bewirkt wird, wenn es durch eine Meßöffnung fließt, ist durch das Volumen des Teilchens oder der Zelle, seine Form und Ausrichtung und die elektrische Leitfähigkeit des Teilchens oder der Zelle relativ zu dem Suspendierungsfluid für die spezielle Frequenz des elektrischen Stroms bestimmt. Der Summeneffekt der Form, Ausrichtung bzw. Orientierung und Leitfähigkeit der Zelle oder des Teilchens wird als der "Formfaktor " bezeichnet.
Für Zellen oder Teilchen, welche Rotationsellipsoide sind, wobei ihre lange Achse parallel zu dem elektrischen Feld ausgerichtet ist, ist der Formfaktor fs gleich:
worin σc die Leitfähigkeit der Zelle bei einer speziellen Frequenz ist, σe die Leitfähigkeit der äußeren Lösung bei dieser Frequenz ist, m das Verhältnis der Länge des Ellipsoids (Hauptachse) zu seiner Breite (Nebenachse) ist und z eine Funktion von m ist, die definiert ist als:
z = m - (m² - 1)1/2 / m + (m² - 1)1/2 (2)
Das Verhältnis der Leitfähigkeit der Zelle zu der Leitfähigkeit des externen Mediums σc/σe, wie es in Gleichung (1) aufscheint, wird als die relative Leitfähigkeit bezeichnet.
Für eine Niederfrequenzmessung (umfassend DC) erscheint ein Blutkörperchen als ein Isolator gegenüber dem elektrischen Feld aufgrund der elektrischen Nichtleitfähigkeit seiner Membran bei dieser Frequenz. In dieser Situation ist die Leitfähigkeit der Zelle σc sehr klein relativ zu der Leitfähigkeit der Suspendierungslösung σe und daher ist das Verhältnis σc/σe im wesentlichen 0. Indem diese Vereinfachung auf Gleichung (1) angewandt wird, kann der Formfaktor eines Blutkörperchens für Gleichstrom fs,DC beschrieben werden als:
Wenn die Frequenz des Stroms ansteigt, geht die dielektrische oder Isolationskapazität der Zellmembran verloren. Bei Hochfrequenzen (RF) erscheint die Membran nahezu unsichtbar für das elektrische Feld. Dann wird die Leitfähigkeit der Zelle durch die Leitfähigkeit in ihrem Inneren bestimmt. Für die roten Blutkörperchen enthält das Innere normalerweise eine Lösung aus Hämoglobin und enthält keinen Zellkern oder andere innere Strukturen. Daher ist die Leitfähigkeit der Hämoglobinlösung, welche das Zellzytoplasma ausbildet, vollständig für die Bestimmung der Leitfähigkeit von Zellen bei RF-Strömen verantwortlich. Für rote Blutkörperchen ist die elektrische Leitfähigkeit des Zytoplasmas in derselben Größenordnung wie die Leitfähigkeit der externen, gepufferten Salzlösung, in welcher die Zellen suspendiert sind. Daher kann für die RF-Messung die für Gleichung (1) angewandte Vereinfachung für die Gleichstrommessung nicht angewandt werden und der Formfaktor fs,RF wird durch die vollständige Gleichung (1) beschrieben.
Der elektrische Widerstand (R) eines Teilchens in dem Feld, wie ein DC- oder RF-Widerstand, ist gleich dem Volumen des Teilchens (V) mal dem Formfaktor mal einer Systemkonstanten (k) oder
R = V · fs · k (4)
Wie zuvor beschrieben, ist die Opazität als der RF-Widerstand dividiert durch den DC-Widerstand oder
Opazität = RRF/RDC = VRF · fs,RF · kRF / VDC · fs,DC · kDC (5)
definiert.
Da das Volumen der Zelle dasselbe sowohl für die DC- als auch RF-Messungen ist und indem die Systemkonstanten kRF und kDC durch Einstellen von Verstärkungsregelungen oder anderer Elemente auf den gleichen Wert gesetzt werden können, wird die Opazität nur das Verhältnis der Formfaktoren oder:
Opazität = fs,RF / Es,DC (6)
Wie zuvor ausgeführt, wird fs,DC durch Gleichung (3) beschrieben und fs,RF wird durch Gleichung (1) beschrieben. Daher wird die Opazität einer Zelle beschrieben als:
Wie dies in dieser Gleichung gesehen werden kann, ist die Opazität einer Zelle nur von der Form der Zelle, wie dies durch den Parameter "m" beschrieben ist, und von dem Verhältnis der Leitfähigkeit des Inneren der Zelle zu der Leitfähigkeit des äußeren Mediums (σc/σe) abhängig.
Um die Hämoglobinkonzentration in einem Blutkörperchen durch die Opazität zu bestimmen, muß man den Zusammenhang zwischen der Hämoglobinkonzentration des Zytoplasmas des roten Blutkörperchens und der elektrischen Leitfähigkeit der zytoplasmischen Lösung kennen. Aufgrund der Schwierigkeit des Messens dieses Zusammenhanges in dem kleinen Maßstab eines roten Blutkörperchens selbst wurde ein experimentelles Modell entwickelt, um diesen Zusammenhang zu bestimmen. Eine bekannte Menge eines gepufferten Salzes wurde zu einer bekannten Menge Wasser zugesetzt, um eine Lösung mit bekannter elektrischer Leitfähigkeit auszubilden. Dann wurde eine spezifische Menge an Hämoglobin zu der Salzlösung zugesetzt, was in einer ersten Hämoglobinkonzentration resultiert. Die Leitfähigkeit dieser ersten Hämoglobinlösung wurde gemessen. Dann wurde eine zusätzliche Menge an Hämoglobin zu der ersten Hämoglobinlösung zugesetzt, was in einer zweiten Hämoglobinkonzentration resultierte. Die Leitfähigkeit dieser zweiten Lösung wurde gemessen. Dieses Verfahren wurde über einen weiten Bereich von Hämoglobinkonzentrationen wiederholt. Die Abhängigkeit der Leitfähigkeit der Hämoglobinlösungen zu der Anfangs-Salzkonzentration der gepufferten Salzlösung wurde durch Wiederholen dieses Experiments bei verschiedensten Eingangs- oder Anfangskonzentrationen des gepufferten Salzes gefunden. Die Ergebnisse dieser Serie von Experimenten sind in Fig. 2 gezeigt.
Die Ergebnisse von Fig. 2 können durch Dividieren der Leitfähigkeit von jeder Hämoglobinlösung durch die Leitfähigkeit der Anfangssalzlösung, von welcher die Hämoglobinlösung abgeleitet ist, vereinfacht werden. Diese skalierte Leitfähigkeit kann auch als eine relative Leitfähigkeit bezeichnet werden. Das Ergebnis dieser Skalierung ist in Fig. 3 gezeigt, welche verdeutlicht, daß eine einzige Kurve die relative Leitfähigkeit von Hämoglobinlösungen unabhängig von der Anfangssalzkonzentration beschreibt. Dieses Ergebnis ist mathematisch durch Regression der Daten, die in dieser Figur gezeigt sind, zu einer Gleichung der folgenden, allgemeinen Form beschrieben:
Relative_Leitfähigkeit = (1 - x · Hb)y (8)
Hier bedeutet Hb die Hämoglobinkonzentration. Diese Regression ergibt die folgende, spezifische Gleichung:
Relative_Leitfähigkeit = (1 - ,016 · Hb)1,49 (9)
In dem Verfahren zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration von einzelnen roten Blutkörperchen durch die Messung der Opazität, wie dies in dieser Offenbarung beschrieben ist, werden die Zellen in einem großen Volumen von gepufferter Salzlösung verdünnt. Während die Membran der roten Blutkörperchen sowohl einen Wasserfluß als auch einen Ionentransport durch dieselbe erlaubt, werden die roten Blutkörperchen auf eine Verdünnung in einer äußeren Lösung mit einer spezifischen Ionenkonzentration durch Einstellen ihrer inneren Lösung auf eine Ionenkonzentration ungefähr gleich zur äußeren Lösungsionenkonzentration antworten. Daher ist die relative Leitfähigkeit, wie sie in den oben beschriebenen Experimenten bestimmt und in Gleichung (9) beschrieben ist, gleich der relativen Leitfähigkeit, wie sie durch die Opazität in dem hier beschriebenen Verfahren gemessen ist und in Gleichung (7) beschrieben ist. Daher ist durch Kombinieren der Gleichungen (7) und (9) der Zusammenhang zwischen der Hämoglobinkonzentration und der Opazität bestimmt. Das Ergebnis ist in Gleichung (10) beschrieben als:
Dieser Zusammenhang zwischen der Hämoglobinkonzentration und der Opazität ist in Fig. 4 für einen Bereich des Zellformparameters "m" gezeichnet. Wie in dieser Figur ersichtlich, kann ein wesentlicher Unterschied in der Opazitätsmessung für eine gegebene Hämoglobinkonzentration aufgrund der Änderungen in der Form des roten Blutkörperchens bestehen.
Es ist daher notwendig, die Form der Zelle zu berücksichtigen, um genau die Hämoglobinkonzentration aus der Opazitätsmessung bestimmen zu können. Es bestehen zahlreiche, alternative Einrichtungen bzw. Mittel, um die Zellform zu berücksichtigen.
Eine alternative Möglichkeit würde das isovolumetrische Kugelförmiginachen der roten Blutkörperchen sein. In einer fakultativen Ausbildung können die kugelförmigen Zellen mit einem bekannten Zellfixierungsreagens stabilisiert bzw. fixiert werden. Die Mittel zum isovolumetrischen Kugelförmigmachen der roten Blutkörperchen sind dem Fachmann gut bekannt. Typischerweise kann ein Reagens zum Kugelförmigmachen verwendet werden, um die roten Blutkörperchen von ihrer normalen, bikonkaven Scheibenform in Kugeln durch Reduktion des Oberflächenbereichs der Zellmembran zu dem kleinstmöglichen zu transformieren. Wenn ein Agens zum Kugelförmigmachen verwendet wird, sollte vorzugsweise das Volumen des roten Blutkörperchens nahezu konstant bleiben und sich nicht aufgrund des Agens zum Kugelförmigmachen verändern. Wenn kugelförmige bzw. kugelförmig gemachte, rote Blutkörperchen verwendet werden, würde der Formparameter "m" gleich 1 für alle Zellen sein und die Hämoglobinkonzentration kann durch Gleichung (10) oder Fig. 4 entsprechend bestimmt werden.
Eine zweite alternative Möglichkeit zur Berücksichtigung der Zellform würde die Messung der Form von jeder Zelle sein. Zahlreiche Methoden zur Durchführung desselben sind dem Fachmann in der Technik der Zytometrie bekannt. Methoden zur direkten Messung der Form der Zelle würden ein direktes Ab bildungsverfahren oder ein Schlitzscanverfahren umfassen, welches durch Groves et al. gelehrt ist.
Ein drittes alternatives Mittel zur Berücksichtigung der Zellform würde die Annahme einer Form einer Zelle sein. Dieses Verfahren ist möglich, da eine normale Population von roten Blutkörperchen eine konsistente und bekannte Form und Deformierbarkeit aufweist. Obwohl die Verwendung dieses Verfahrens am einfachsten zu implementieren wäre, weist es die Möglichkeit für Ungenauigkeit auf, insbesondere für Proben von roten Blutkörperchen, welche nicht mit dem normalen Verhalten übereinstimmen.
Eine experimentelle Verifizierung der obigen Analyse wurde sowohl mit einem Modellsystem als auch mit Patientenblutproben durchgeführt. Das Modellsystem verwendet die Technik von Clark et al., "Study on the Dehydrating Effect of the Red Cell Na&spplus;/K&spplus;-Pump in Nystatin-treated Cells with Varying Na&spplus; and Water Contents", Biochimica et Biophysica Acta, 646: 422- 432, 1981, um Populationen von roten Blutkörperchen mit eng definierten Hämoglobinkonzentrationen zu erzeugen. Mit dieser Technik ist es möglich, Populationen mit Hämoglobinkonzentrationen von etwa 20 g/dl bis 50 g/dl herzustellen. Dieser Bereich übersteigt den Bereich der Hämoglobinkonzentrationen, welche sowohl bei normgemäßen als auch nicht-normgemäßen Menschen gesehen werden.
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse mit Zellen, die mit dieser Technik behandelt wurden, um Proben von Zellen mit spezifischen Hämoglobinkonzentrationen auszubilden. Die Zellen werden sowohl nach dem Kugelförmigmachen als auch in ihrem normalen Zustand vermessen. Die durchgezogenen Linien in dieser Figur zeigen die vorhergesagte Messung der Opazität für eine gegebene Hämoglobinkonzentration, wie dies in dieser Offenbarung beschrieben ist, sowohl für Zellen, die in der kugelförmigen Gestalt festgelegt sind, als auch für Zellen, die zu ihre normale Deformierbarkeit beibehalten. Eine enge Über einstimmung wird für beide Populationen von Zellen ersehen. Es sollte festgehalten werden, daß die normale Deformierbarkeit einer Zelle mit der Hämoglobinkonzentration neben anderen Faktoren variiert und daß sich Zellen mit hoher Hämoglobinkonzentration in ähnlicher Weise wie kugelförmig gemachte Zellen verhalten.
Die Ergebnisse der Hämoglobinkonzentrationsmessung mit dem Opazitätsverfahren, welches hier für eine Gruppe von 54 Patientenproben beschrieben ist, die nach dem Fixieren der Zellen als Kugeln gemessen sind, sind in Fig. 6 gezeigt. Die Hämoglobinmessung, wie sie durch das Opazitätsverfahren bestimmt ist, ist mit dem Hämoglobin verglichen, welches durch das kolorimetrische Bezugsverfahren gemessen ist. Die Äquivalenzlinie zwischen diesen zwei Messungen ist ebenfalls eingezeichnet. Für diesen Datensatz ist die Standardabweichung zwischen der Hämoglobinkonzentration, wie sie mit der hier beschriebenen Opazitätstechnik gemessen ist, und der Hämoglobinkonzentration, wie sie durch das kolorimetrische Bezugsverfahren bestimmt ist, 1,09 g/dl.
Die Fähigkeit dieser Erfindung, eine Hämoglobinkonzentrationsverteilung zu detektieren, ist in Fig. 7 gezeigt. Fig. 7(A) zeigt eine normale rote Blutkörperchen-Population mit einer Mehrzahl von Zellen mit einer Hämoglobinkonzentration zwischen 29 g/dl und 41 g/dl. Diese rote Blutkörperchen-Subpopulation ist als normochrom beschrieben. Fig. 7(B) ist eine Hämoglobinverteilung eines Patienten, welcher eine signifikante hypochrome Subpopulation von roten Blutkörperchen zeigte. Fig. 7(C) ist eine Hämoglobinverteilung eines anderen Patienten, welcher eine signifikante hyperchrome Subpopulation an roten Blutkörperchen zeigte. Das Verfahren von Beispiel 3 wurde angewandt, um diese Bestimmungen zu erhalten.
Es sollte festgehalten werden, daß die folgenden Beispiele Verfahren und Formulierungen zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration von einzelnen roten Blutkörperchen zur Verfü gung stellen, welche nur erläuternd sind. Andere Reagentien und/oder Techniken können in Übereinstimmung mit dieser Offenbarung angewandt werden.

Beispiel 1

Eine Probe von 2 ul Vollblut wird in 5 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 140 mM Natriumchlorid, welcher auf 290 mOsm eingestellt ist, verdünnt. Die Probe wird in einen Hämatologie-Analysierer mit einer Flußzelle, die eine hydrodynamische Fokussierung anwendet und eine zylindrische Meßöffnung mit Abmessungen von etwa 50 um Durchmesser und 70 um Länge enthält, angesaugt. Die Flußzelle enthält zwei Elektroden, eine auf jeder Seite der Öffnung, welche mit einer geeigneten elektrischen Schaltung verbunden sind, um die Messung des Gleichstrom-(DC)-Widerstands und des Radio- bzw. Hochfrequenz- (RF)-Widerstands bei einer Frequenz von 23 MHz über die Öffnung zu ermöglichen. Die verdünnte Blutprobe, die typischerweise mehr als 99% rote Blutkörperchen enthält, wird gezwungen, durch die Meßöffnung mit im wesentlichen einer Zelle zu jedem Zeitpunkt zu fließen, wie dies durch das Verdünnungsverhältnis der Blutprobe und das Volumen der Öffnung bestimmt ist. Das hydrodynamische Fokussieren des Fluidstroms, enthaltend die Probe an Zellen, mit einem zweiten Fluidstrom bewirkt eine zusätzliche Verdünnung um einen Faktor von etwa 4. Die Strömungs- bzw. Flußgeschwindigkeit wird auf etwa 5 m/s in der Meßöffnung eingestellt. Die roten Blutkörperchen deformieren sich als Folge der Fluidkräfte, die auf diese während des Flusses ausgeübt werden. Die Messungen des DC- und RF-Widerstands werden für jede der etwa 32.000 Zellen aufgezeichnet. Die Hämoglobinkonzentration von jeder Zelle wird durch die Opazitätsmessung, wie sie hier beschrieben ist, unter der Annahme, daß jede Zelle eine Form mit einem Längen-zu-Breiten-Verhältnis von 4 zu 1 während der Messung annimmt, bestimmt. Der Mittelwert der Hämoglobinkonzentration wird aus den einzelnen Hämoglobin-Konzentrationsbestimmungen berechnet, ebenso wie die statistischen Meßwerte der Standardabweichung und des Variationskoeffizienten der Population. Ein Histogramm der Hämoglobinkonzentration der Population wird ebenfalls hergestellt und hypochrome und hyperchrome Populationen werden identifiziert.

Beispiel 2

Eine Probe von 2 ul Vollblut wird in 5 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 140 mM Natriumchlorid, welcher auf 290 mOsm eingestellt ist, verdünnt. Die Probe wird in einen Hämatologie-Analysierer mit einer Flußzelle angesaugt, welche eine hydrodynamische Fokussierung anwendet und eine rechteckige Meßöffnung mit Abmessungen von etwa 50 um · 50 um im Querschnitt und 70 um Länge enthält. Die Flußzelle enthält zwei Elektroden, eine auf jeder Seite der Öffnung, welche mit einer geeigneten elektrischen Schaltung verbunden sind, um die Messung des Gleichstrom-(DC)-Widerstands und des Radio bzw. Hochfrequenz-(RF)-Widerstands bei einer Frequenz von 23 MHz über die Öffnung zu ermöglichen. Ein Abbildungssystem ist ebenfalls an die Öffnung angepaßt, um zu ermöglichen, daß Bilder von einzelnen Zellen aufgezeichnet werden, wenn sie durch die Öffnung fließen. Die verdünnte Blutprobe, die typischerweise mehr als 99% rote Blutkörperchen enthält, wird durch die Meßöffnung mit im wesentlichen einer Zelle zu jedem Zeitpunkt fließen gelassen, wie dies durch das Verdünnungsverhältnis der Blutprobe und das Volumen der Öffnung bestimmt ist. Das hydrodynamische Fokussieren des Fluidstroms, enthaltend die Probe von Zellen, mit einem zweiten Fluidstrom bewirkt eine zusätzliche Verdünnung um einen Faktor von etwa 4. Die Flußgeschwindigkeit wird auf etwa 5 m/s in der Meßöffnung eingestellt. Die roten Blutkörperchen deformieren sich als Antwort auf die Fluidkräfte, die auf diese während des Flusses ausgeübt werden. Die Messungen des DC- und RF-Widerstands werden für jede der etwa 32.000 Zellen aufgezeichnet. Ein Bild der Form von jeder Zelle in der Meßöffnung wird gemeinsam mit den DC- und RF-Messungen erhalten. Die Form jeder Zelle, wie sie durch das Verhältnis von ihrer Länge zu ihrer Breite be schrieben ist, wird aus dem Bild erhalten. Die Hämoglobinkonzentration von jeder Zelle wird aus der Opazitätsmessung und aus der Formmessung durch die hier beschriebene Analyse bestimmt. Der Mittelwert der Hämoglobinkonzentration wird aus den individuellen Hämoglobinkonzentrationsbestimmungen berechnet, ebenso wie die statistischen Meßwerte der Standardabweichung und des Variationskoeffizienten der Population. Ein Histogramm der Hämoglobinkonzentration der Population wird ebenfalls hergestellt und hypochrome und hyperchrome Populationen werden identifiziert.

Beispiel 3

Eine Probe von 2 ul Vollblut wird in 5 ml 7,0 mM Natriumcitratpuffer, pH 7,4, enthaltend 74 mM KCl, 71 mM NaCl, 100 ug/dl des Detergens n-Dodecyl-n,n-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (DDAPS) und 1% Glutaraldehyd bei 290 mOsm verdünnt. Die Verdünnung der roten Blutkörperchen in der Lösung resultiert in dem isovolumetrischen Kugelförmigmachen von jedem Blutkörperchen und der Fixierung des Blutkörperchens, um eine Deformation während des Flusses zu verhindern. Die Probe wird in einen Hämatologie-Analysierer mit einer Flußzelle angesaugt, die eine hydrodynamische Fokussierung anwendet und eine zylindrische Meßöffnung mit Abmessungen von etwa 50 um Durchmesser und 70 um Länge enthält. Die Flußzelle enthält zwei Elektroden, eine auf jeder Seite der Öffnung, welche an eine geeignete elektronische Schaltung angeschlossen sind, um die Messung des Radio- bzw. Gleichstrom-(DC)-Widerstands und des Hochfrequenz-(RF)-Widerstands bei einer Frequenz von 23 MHz über die Öffnung zu ermöglichen. Die verdünnte Blutprobe, die typischerweise mehr als 99% rote Blutkörperchen enthält, wird durch die Meßöffnung mit, im wesentlichen einer Zelle zu einem Zeitpunkt fließen gelassen, wie dies durch das Verdünnungsverhältnis der Blutprobe und das Volumen der Öffnung bestimmt ist. Die hydrodynamische Fokussierung des Fluidstroms, enthaltend die Probe an Zellen, mit einem zweiten Fluidstrom bewirkt eine zusätzliche Verdünnung um einen Fak tor von etwa 4. Die Messungen des DC- und RF-Widerstands werden für jede der etwa 32.000 Zellen aufgezeichnet. Die Hämoglobinkonzentration von jeder Zelle wird aus der Opazitätsmessung bestimmt, wie dies hier unter Kenntnis, daß jede Zelle während der Messung eine kugelförmige Form aufweist, beschrieben ist. Der Mittelwert der Hämoglobinkonzentration wird aus den einzelnen Hämoglobinkonzentrationsbestimmungen berechnet, ebenso wie die statistischen Meßwerte der Standardabweichung und des Variationskoeffizienten der Population. Ein Histogramm der Hämoglobinkonzentration der Population wird ebenfalls hergestellt und hypochrome und hyperchrome Populationen werden identifiziert.

Beispiel 4

Eine Probe von 1 ul Vollblut wird in 10 ml 7,0 mM Natriumcitratpuffer, pH 7,4, enthaltend 74 mM RC1, 71 mM NaCl, 100 ug/dl Detergens n-Dodecyl-n,n-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (DDAPS) und 1% Glutaraldehyd bei 290 mOsm verdünnt. Die Verdünnung resultiert in einem isovolumetrischen Kugelförmigmachen von jeder Zelle bzw. jedem Blutkörperchen und der Fixierung der Zelle, um eine Deformation während des Flusses zu verhindern. Die Probe wird in einen Hämatologie- Analysierer mit einer Flußzelle angesaugt, welche keine hydrodynamische Fokussierung verwendet und die eine zylindrische Meßöffnung mit Abmessungen von etwa 50 um Durchmesser und 70 um Länge aufweist. Die Flußzelle enthält zwei Elektroden, eine auf jeder Seite der Öffnung, welche an eine geeignete elektronische Schaltung angeschlossen sind, um die Messung des Radio- bzw. Gleichstrom-(DC)-Widerstands und des Hochfrequenz-(RF)- Widerstands bei einer Frequenz von 23 MHz über die Öffnung zu ermöglichen. Die verdünnte Blutprobe, die typischerweise mehr als 99% rote Blutkörperchen enthält, wird durch die Meßöffnung mit im wesentlichen einer Zelle zu jedem Zeitpunkt fließen gelassen, wie dies durch das Verdünnungsverhältnis der Blutprobe und das Volumen der Öffnung bestimmt ist. Die Messungen des DC- und RF-Widerstands werden für jede der etwa 32.000 Zellen aufgezeichnet. Die Hämoglobinkonzentration von jeder Zelle wird aus der Opazitätsmessung bestimmt, wie dies hier unter der Kenntnis, daß jede Zelle während der Messung eine kugelförmige Form aufweist, beschrieben ist. Der Mittelwert der Hämoglobinkonzentration wird aus den einzelnen Hämoglobinkonzentrationsbestimmungen berechnet, ebenso wie die statistischen Meßwerten der Standardabweichung und des Variationskoeffizienten der Population. Ein Histogramm der Hämoglobinkonzentration der Population wird ebenfalls hergestellt und hypochrome und hyperchrome Populationen werden identifiziert.
Obwohl in der vorhergehenden Beschreibung eine detaillierte Beschreibung der Erfindung zu Erläuterungszwecken angegeben wurde, können zahlreiche Änderungen in den hier beschriebenen Details durch den Fachmann durchgeführt werden, ohne den Rahmen der Erfindung, wie er beansprucht ist, zu verlassen.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration von einzelnen roten Blutkörperchen bzw. -zellen, gekennzeichnet durch die Schritte:

a. Mitreißen bzw. Mitnahme von roten Blutkörperchen einer Blutprobe in einen Strom von in Abstand voneinander befindlichen, einzelnen roten Blutkörperchen in einer Elektrolytflüssigkeit;

b. Messen des elektrischen Niederfrequenz-Widerstands der Elektrolytflüssigkeit in einer Öffnung, umfassend das Messen einer Änderung des elektrischen Widerstands, die durch den Durchgang von jedem roten Blutkörperchen des Stroms durch die Öffnung bewirkt wird, und Ableiten eines entsprechenden ersten Pulssignals für jedes rote Blutkörperchen, welches eine für die Änderung des elektrischen Widerstands, die durch den Durchgang des roten Blutkörperchens durch die Öffnung bewirkt wird, repräsentative Amplitude aufweist;

c. Messen des Radio- bzw. Hochfrequenz-(RF-)Widerstands der Elektrolytflüssigkeit in der Öffnung, umfassend das Messen einer Änderung in dem Hochfrequenz-Widerstand, die durch den Durchgang von jedem der roten Blutkörperchen des Stroms durch die Öffnung bewirkt wird, und Ableiten eines entsprechenden zweiten Pulssignals für jedes rote Blutkörperchen, welches eine für die Änderung in dem Hochfrequenz-Widerstand, die durch den Durchgang von jedem roten Blutkörperchen durch die Öffnung bewirkt wird, repräsentative Amplitude aufweist;

d. Bestimmen einer Form für jedes rote Blutkörperchen, und

e. Berechnen der Hämoglobinkonzentration von jedem der roten Blutkörperchen des Stroms aus einem Verhältnis des entsprechenden zweiten Pulssignals zu dem ersten Pulssignal und der Form der roten Blutkörperchen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Bestimmen der Form gekenn zeichnet ist durch Mischen der roten Blutkörperchen mir einem chemischen Reagens, was in kugelförmigen, roten Blutkörperchen resultiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Bestimmen der Form durch eine direkte Messung der roten Blutkörperchen gekennzeichnet ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die direkte Messung der roten Blutkörperchen durch ein optisches Abbilden der roten Blutkörperchen gekennzeichnet ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Bestimmen der Form durch Annehmen einer konstanten Form für die roten Blutkörperchen gekennzeichnet ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Öffnung durch eine Nichtfokus-Strömungs- bzw. -Flußöffnung gekennzeichnet ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Öffnung durch eine Fokus-Flußöffnung gekennzeichnet ist und worin die roten Blutkörperchen von der Elektrolytflüssigkeit umgeben bzw. umhüllt bzw. ummantelt sind.

8. Verfahren nach Anspruch 1, welches weiters durch ein Bestimmen des Volumens von jedem roten Blutkörperchen gekennzeichnet ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, welches weiters durch eine Identifikation von Subpopulationen von roten Blutkörperchen basierend auf der Bestimmung von jeder roten Blutkörperchen-Hämoglobinkonzentration gekennzeichnet ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Subpopulationen der roten Blutkörperchen durch normochrome, hyperchrome und hypochrome rote Blutkörperchen gekennzeichnet sind.

11. Vorrichtung zum Messen der Hämoglobinkonzentration von einzelnen roten Blutkörperchen bzw. -zellen, gekennzeichnet durch:

a. eine Einrichtung zum Mitreißen bzw. zur Mitnahme von roten Blutkörperchen einer Blutprobe in einen Strom von in Abstand voneinander befindlichen, einzelnen roten Blutkörperchen in einer Elektrolytflüssigkeit;

b. Widerstandsmeßeinrichtungen zum Messen des elektrischen Niederfrequenz-Widerstands der Elektrolytflüssigkeit in einer Öffnung, umfassend die Messung einer Änderung des elektrischen Widerstands, die durch den Durchgang von jedem der roten Blutkörperchen des Stroms durch die Öffnung bewirkt ist, und Ableiten eines entsprechenden ersten Pulssignals für jedes rote Blutkörperchen, welches eine für die Änderung des elektrischen Widerstands, die durch den Durchgang von jedem roten Blutkörperchen durch die Öffnung bewirkt ist, repräsentativ ist;

c. Radio- bzw. Hochfrequenz-Meßeinrichtungen zum Messen eines Hochfrequenz-(RF-)Widerstands der Elektrolytflüssigkeit in der Öffnung, umfassend die Messung einer Änderung in dem Hochfrequenz-Widerstand, die durch den Durchgang von jedem der roten Blutkörperchen des Stroms durch die Öffnung bewirkt ist, und Ableiten eines entsprechenden zweiten Pulssignals für jedes rote Blutkörperchen, welches eine für die Änderung des Hochfrequenz-Widerstands, die durch den Durchgang der roten Blutkörperchen durch die Öffnung bewirkt ist, repräsentativ ist;

d. Einrichtungen zum Bestimmen einer Form für jedes rote Blutkörperchen, und

e. Einrichtungen zum Berechnen der Hämoglobinkonzentration von jedem der roten Blutkörperchen des Stroms aus einem Verhältnis des entsprechenden zweiten Pulssignals zu dem ersten Pulssignal und der Form der roten Blutkörperchen.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, worin die Vorrichtung zum Bestimmen der Form gekennzeichnet ist durch Einrichtungen zum Mischen der roten Blutkörperchen mit einem chemischen Reagens, was in kugelförmigen, roten Blutkörperchen resultiert.

13. Vorrichtung nach Anspruch 11, worin die Einrichtungen zum Bestimmen der Form durch Einrichtungen zur Durchführung einer direkten Messung der roten Blutkörperchen gekennzeichnet sind.

14, Vorrichtung nach Anspruch 13, worin die direkte Messung der roten Blutkörperchen durch optisches Abbilden der roten Blutkörperchen gekennzeichnet ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 11, worin die Einrichtungen zum Bestimmen der Form durch Einrichtungen zum Annehmen einer konstanten Form für die roten Blutkörperchen gekennzeichnet ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 11, worin die Öffnung durch eine Nichtfokus-Strömungs- bzw. -Flußöffnung gekennzeichnet ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 11, worin die Öffnung durch eine Fokus-Flußöffnung gekennzeichnet ist und worin die roten Blutkörperchen durch die Elektrolytflüssigkeit umgeben bzw. umhüllt bzw. ummantelt sind.

18. Vorrichtung nach Anspruch 11, welche weiters durch Einrichtungen zum Bestimmen des Volumens von jedem roten Blutkörperchen gekennzeichnet ist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, welche weiters durch Einrichtungen zur Identifizierung von Subpopulationen von roten Blutkörperchen basierend auf der Bestimmung der Hämoglobinkonzentration von jedem roten Blutkörperchen gekennzeichnet ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, worin die Einrichtungen zur Identifizierung von Subpopulationen von roten Blutkörperchen dadurch gekennzeichnet sind, daß die Einrichtungen die Bestimmung von normochromen, hyperchromen und hypochromen roten Blutkörperchen erlauben.