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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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1. Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Vorrichtungen
zur Bestimmung der Empfindlichkeit bzw. Sensitivität eines
Mikroorganismus gegenüber
einem Antibiotikum im Allgemeinen, und auf Verfahren und Vorrichtungen
zur Bestimmung der minimalen hemmenden Konzentration eines Antibiotikums
bezogen auf einen bestimmten Mikroorganismus.
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2. Hintergrundinformation
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Die
Bestimmung der minimalen hemmenden Konzentration (minimum inhibitory
concentration; MIC) eines Antibiotikums ist ein wesentlicher Labortest
zur Bestimmung der Empfindlichkeit eines Mikroorganismus, gewöhnlich eines
Bakteriums, gegenüber
spezifischen Antibiotika. Die MIC bezieht sich auf die minimale
Konzentration eines Antibiotikums, die notwendig ist, um den Mikroorganismus
am Wachstum zu hindern. Die Art und die Dosierung der Antibiotika
wird oftmals auf der Grundlage dieser Art von Test festgelegt, wodurch
sich schnelle und genaue Ergebnisse ergeben, die sowohl für das Patientenwohl
als auch kosteneffektive Behandlung wichtig sind. Ein Antibiotikaempfindlichkeitstest
wird am häufigsten
unter Verwendung des qualitativen Kirby-Bauer-Plattenverfahrens durchgeführt, für eine quantitative
MIC-Analyse wird hingegen die Röhrchenverdünnung am
häufigsten
verwendet.
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Der
Kirby-Bauer-Test nutzt eine Platte, die mit einer gleichmäßigen Schicht
eines mikrobiologischen Wachstumsmediums bedeckt ist, das bei Bedarf
speziell für den
Test formuliert wird. Eine Anzahl von Scheiben werden auf die Schicht
des Wachstumsmediums gegeben, welche jeweils eine spezifische Konzentration
eines zu überprüfenden Antibiotikas
enthalten. Bakterien, die auf dem Medium wachsen, bilden eine sichtbare Beschichtung
außer
in der Fläche
um die Platten allgemein als die "klare Zone" bezeichnet), die eine ausreichende
Konzentration eines Antibiotikuns haben, um das Bakteriumswachstum
zu hemmen. Die Größe der klaren
Zone, die eine Scheibe umgibt, ist ein Anzeichen für die Empfindlichkeit
des Mikroorganismus gegenüber
dem in der speziellen Scheibe enthaltendem Antibiotikum; d. h. je
größer die
klare Zone ist, desto größer ist
die Empfindlichkeit des Mikroorganismus gegenüber dem in der Scheibe enthaltenden
Antibiotikum. Der Kirby-Bauer-Test ist aufgrund seiner Einfachheit
und seiner Fähigkeit,
mehrere Antibiotika auf einmal zu überprüfen, beliebt. Ein Nachteil
des Kirby-Bauer-Tests ist, dass es eine Anzahl von Variablen gibt,
die die Antibiotikakonzentration an jeden gegebenen Punkt in dem
Wachstumsmedium beeinträchtigt,
und folglich nicht die Berechnung einer MIC erlauben. Es wurden
Formeln für
die Berechnung der ungefähren
MIC auf der Grundlage der Größe der klaren
Zone veröffentlicht,
aber diese Formeln werden selten verwendet und werden bestenfalls
als Annäherungen
angesehen.
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Das
Röhrchenverdünnungsverfahren
umfasst die Anordnung einer gleichen Menge eines Ziel-Mikroorganismus
in einer Mehrzahl von Vertiefungen (als "Röhrchen" bezeichnet), angeordnet
in einer Plattenvorrichtung, und die Zugabe von verschiedenen Konzentrationen
eines Antibiotikums zu jedem Röhrchen.
Die geringste Konzentration des Antibiotikums, in welchem der Ziel-Mikroorganismus nicht
wachsen wird, bestimmt die MIC für
den speziellen Mikroorganismus. Ein Nachteil des Röhrchenverdünnungsverfahrens
ist, dass seine Genauigkeit von der Schrittgröße in der Konzentrationsänderung
zwischen den Röhrchen
abhängt.
Eine geringe Schrittgröße ergibt
eine größere Genauigkeit
aber kann eine unpraktische Anzahl von Röhrchen und einen hohen Aufwand
erfordern. Zusätzlich
ist die Zubereitung genauer Verdünnungen
ein teures Verfahren, das die Kosten mit der Anzahl der Röhrchen steigen
lässt.
Folglich kann die Erhöhung
der Genauigkeit dieses Verfahrens ebenfalls die Kosten und die erforderliche
Zeit erhöhen.
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Eine
alternative Einrichtung für
die Durchführung
einer MIC-Bestimmung wird im US-Patent Nr. 4,778,758 und anderen
beschrieben, welche die Verwendung eines "E-Streifens" umfasst, welcher ein Streifen ist,
der einen genau gebildeten Gradienten eines einzelnen Antibiotikums
enthält.
Eichmarken sind entlang einer Seite des Streifens angeordnet, entsprechend
der exakten Konzentration des Antibiotikums an diesem Punkt. Der
Streifen wird auf eine beimpfte Kirby-Bauer-Platte gegeben und nach
Bebrüten
wird eine klare Fläche
angrenzend an eine Fläche
mit Mikroorganismen-Wachstums gebildet, vorausgesetzt, dass eine
Antibiotikumkonzentration innerhalb des Gradienten die MIC übersteigt.
Die Eichmarkierungen, die den Grenzen zwischen den klaren Flächen und
den Wachstumsflächen
entsprechen, ergeben den MIC-Wert für das zu überprüfende Antibiotikum. Verschiedene
Nachteile sind mit diesem Verfahren für die Bestimmung einer MIC
eines Antibiotikums verbunden, einschließlich aber nicht beschränkt auf:
1) der Streifen ist schwer herzustellen und folglich teuer; 2) die
Größe des Streifens
macht ihn unpraktisch für
mehrere gleichzeitige Antibiotikatests in einer einzelnen Vorrichtung;
und 3) die Zubereitung muss nach einem genauen Bebrütungszeitraum
abgelesen werden, um eine optimale Genauigkeit zu erzielen.
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Das
US-Patent Nr. 5,702,684 offenbart ein Verfahren für die Überwachung
von Antibiotikaspiegeln für die
Bestimmung, wann die Antibiotika in einem industriellen Rohrsystem
wieder aufgefüllt
werden sollten, unter Verwendung einer fluoreszierenden Markersubstanz.
Das Verfahren erlaubt jedoch nicht die Bestimmung einer MIC oder
einer Art von Antibiotikaempfindlichkeitsmessung.
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Was
erforderlich ist, ist ein Verfahren für die Bestimmung der MIC eines
Antibiotikums für
einen Ziel-Mikroorganismus,
ein Verfahren, das die MIC in einer minimalen Zeitdauer bestimmen
kann, ein Verfahren, das eine genaue MIC bereitstellt, ein Verfahren,
das gleichzeitig die MIC verschiedener Antibiotika für einen
Ziel-Mikroorganismus bestimmten kann, und ein Verfahren, das kostengünstig ist.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Es
ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
für die
Bestimmung der MIC eines Antibiotikums für einen Ziel-Mikroorganismus
bereitzustellen, das ein genaues Ergebnis in einem minimalen Zeitraum
zur Verfügung
stellt.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zur Bestimmung der MIC von verschiedenen Antibiotika für einen
Ziel-Mikroorganismus zur Verfügung
zu stellen.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein kostengünstiges
Verfahren zur Bestimmung der MIC eines Antibiotikums für einen
Ziel-Mikroorganismus
zur Verfügung
zu stellen.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine kostengünstige Vorrichtung
zur Bestimmung der MIC eines Antibiotikums für einen Ziel-Mikroorganismus zur
Verfügung
zu stellen, die ein genaues Ergebnis in einem minimalen Zeitraum
bereitstellt.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zur Bestimmung der MIC eines Antibiotikums für einen Ziel-Mikroorganismus
zur Verfügung
zu stellen, das in der Veterinärmedizin
genutzt werden kann.
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Erfindungsgemäß wird ein
Verfahren zur Bestimmung der MIC eines Antibiotikums für einen
Ziel-Mikroorganismus
zur Verfügung
gestellt, wie es in Anspruch 1 definiert wird.
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Ein
Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass ein Verfahren für die Bestimmung
der MIC eines Antibiotikums für
einen Ziel-Mikroorganismus bereit gestellt wird, das genaue Ergebnisse
in einer minimalen Zeitspanne ergibt. Die vorliegende Erfindung
verwendet ein empfindliches Reagenz, welches eine Markersubstanz
enthält,
die ein Signal in einer Stärke
hat, welche proportional zu der Konzentration der Markersubstanz ist.
Die Konzentration der Markersubstanz innerhalb des Reagenz' ist proportional
zu der Konzentration des Antibiotikums. Die MIC des Antibiotikums
an der Wachstumsgrenze kann daher durch den Nachweis des Signals
der Markersubstanz an der Wachstumsgrenze gemessen werden. Demgemäß kann die
genaue MIC des Antibiotikums bestimmt statt nur geschätzt werden,
und kann ohne ein Vielzahl von Zeit konsumierenden Verdünnungsschritten
bestimmt werden.
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Ein
weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die MIC verschiedene
Antibiotika für
einen Zielmikroorganismus gleichzeitig unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
bestimmt werden können.
Zum Beispiel kann eine Anzahl von unabhängigen Wachstumsmediumsbereichen,
die mit einem Ziel-Mikroorganismus
beimpft sind, in einem einzelnen Gefäß angeordnet werden, und unterschiedliche
Antibiotika in jedem unabhängigen
Bereich eingebracht werden. Die verbleibenden Schritte der vorliegenden
Erfindung können dann
durchgeführt
werden, um den MIC des in jedem Wachstumsmediumsbereich eingebrachten
Antibiotikums zu bestimmen.
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Ein
weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass es ein kostengünstiges
Verfahren zur Bestimmung der MIC eines Antibiotikums für einen
Ziel-Mikroorganismus bereitstellt wird. Die Fähigkeit der vorliegenden Erfindung
genaue MIC-Informationen zur Verfügung zu stellen, überwindet
die Notwendigkeit von mehreren teuren Antibiotikaverdünnungen,
wie sie in dem Röhrchenverdünnungsverfahren
erforderlich sind. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Minimierung
der teuren medizinischen Laborzeit und der Laborkosten die vorliegende
Erfindung beträchtlich
preiswerter als die bisher erhältlichen
Verfahren macht.
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Ein
weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass ein Verfahren
zur Bestimmung der MIC eines Antibiotikums für einen Ziel-Mikroorganismus
bereit gestellt wird, das einen Nutzen in der Veterinärmedizin
hat.
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Ein
weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die Wirksamkeit
einer Vielzahl von Antibiotika in verschiedenen Konzentrationen
für einen
speziellen Ziel-Mikroorganismus
einfach bestimmt werden kann. Im Ergebnis kann ein Behandler, der
eine Antibiotikagabe in Betracht zieht, eine Entscheidung auf der
Grundlage besserer Informationen hinsichtlich der Art und der effektiven
Dosis eines Antibiotikums treffen, was folglich dem Antibiotika-Empfänger nützt.
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Diese
und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung
werden im Lichte der ausführlichen
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon offensichtlich,
wie sie in den beigefügten
Zeichnungen veranschaulicht werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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Die 1 zeigt
einen diagrammartigen Querschnitt einer Vorrichtung in Kirby-Bauer-Plattenbauart, um
das Verfahren der vorliegenden Erfindung darzustellen.
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Die 2 ist
eine grafische Darstellung, die die Markersignalstärke als
eine Funktion des linearen Abstands darstellt, verbunden mit der
in der 1 gezeigten Vorrichtung in Kirby-Bauer-Bauart.
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Die 3 zeigt
einen diagrammartigen Querschnitt einer Wanne, die ein Mikroorganismus-Wachstumsmedium
enthält,
um das Verfahren der vorliegenden Erfindung darzustellen.
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Die 4 ist
eine grafische Darstellung, die die Markersignalstärke als
eine Funktion des linearen Abstands verbunden mit der in 3 gezeigten
Vorrichtung trägt.
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Die 5 zeigt
den in der 3 gezeigten diagrammartigen
Querschnitt, der außerdem
ein auf ein Substrat aufgebrachtes empfindliches Reagenz enthält.
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BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung der minimalen
hemmenden Konzentration (MIC) eines Antibiotikums für einen
Ziel-Mikroorganismus enthält
die Schritte des Bereitstellens eines Mikroorganismen-Wachstumsmediums,
einer wirksamen Menge des Ziel-Mikroorganismus und eines empfindlichen Reagenz'. Das Wachstumsmedium
muss in der Lage sein, den Mikroorganismus zu tragen und ist ein
Medium vom Geltyp oder ein durchlässiges festes Wachstumsmedium.
Entwässerte
Wachstumsmedien, die während der
Verwendung rehydriert werden, sind besonders bevorzugt, weil sie
einfach über
lange Zeiträume
gelagert werden können.
Der Ziel-Mikroorganismus kann entweder aus der ersten Generation
der genommenen Mikroorganismen, z. B. aus einer Urinprobe, oder
einer Suspension der genommenen Mikroorganismen, z. B. aus einer
auf einem anderen Wachstumsmedium gewachsenen Kolonie bestehen.
Der Ziel-Mikroorganismus
ist typischerweise ein Bestandteil innerhalb einer flüssigen Lösung, obwohl
ein diffusionsfähiges
Gel, das den Ziel-Mikroorganismus trägt, alternativ verwendet werden
kann. Die flüssige
Lösung,
die den Ziel-Mikroorganismus trägt,
erleichtert den Schritt der Beimpfung des Wachstumsmediums mit dem
Ziel-Mikroorganismus, insbesondere wenn ein entwässertes Wachstumsmedium verwendet
wird.
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Das
empfindliche Reagenz enthält
das zu bewertende Antibiotikum und eine Markersubstanz. In einer ersten
Ausführungsform
enthält
das empfindliche Reagenz eine angemessene Menge des zu überprüfenden Antibiotikums
gemischt mit einer verwendbaren aber ungenau gemessenen Menge der
Markersubstanz. In einer zweiten Ausführungsform werden das zu überprüfende Antibiotikum
und die Markersubstanz des Reagenz' in bekannten genauen Verhältnissen
gemischt, und die Gesamtmenge des Reagenz' kann variieren, um der Anwendung angepasst
zu sein. Diese Reagenz-Ausführungsformen
erfordern nur einen Parameter (Antibiotikamenge oder Verhältnis des
Antibiotikums zum Marker), der genau bekannt sein muss, und minimieren
auf diese Weise die Kosten für
die Herstellung des empfindlichen Reagenz' und in der Folge des gesamten Verfahrens.
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Die
Markersubstanz kann jedes Material sein, das: 1) ein identifizierbares
Signal mit einer Stärke
proportional zu der Konzentration der Markersubstanz hat; 2) ein
Signal hat, das unterscheidbar von anderen Elementen innerhalb der
Testprobe ist; 3) ein Signal und eine Signalstärke hat, die nicht nachteilig
durch das Wachstum des Mikroorganismus' beeinträchtigt wird; 4) im Wesentlichen
das Wachstum des Ziel-Mikroorganismus' nicht nachteilig beeinträchtigt;
5) nicht unvorhersehbar oder nachteilig die Wirkung des zu überprüfenden Antibiotikas
beeinträchtigt;
und 6) eines, welches, falls notwendig, mit dem Antibiotikum in
das Wachstumsmedium während
dem Impfungszeitraum in einer vorhersehbaren Art und Weise zusammen
diffundiert, so dass die örtliche
Markersubstanzkonzentration proportional zu der örtlichen Antibiotikumkonzentration
ist. Zum Beispiel kann eine fluoreszierende Markersubstanz mit Anregungs-
oder Emissionswellenlängen
außerhalb
des Bereichs der Anregungs- oder Emissionswellenlängen des
Wachstumsmediums verwendet werden, und eines, das nicht an das Wachstumsmedium
oder den Zielmikroorganismus bindet, kann verwendet werden. Die
Markersubstanz und das Antibiotikum diffundieren bevorzugt in das
Wachstumsmedium mit derselben Geschwindigkeit, obwohl eine gleiche
Diffusionsgeschwindigkeit nicht erforderlich ist. Eine Markersubstanz
und ein Antibiotikum mit unterschiedlichen, aber bekannten, Diffusionsgeschwindigkeiten
können
alternativ verwendet werden. In einem weiteren Beispiel kann ein
identifizierbarer Farbstoff, der durch das Antibiotikum absorbiert
wird, verwendet werden. Die Stärke
des von dem Farbstoff emittierten Markersignals ist proportional
zu der Konzentration des Antibiotikums, da es das Antibiotikum ist,
das den Farbstoff "trägt". Die Begriffe "Verhältnis" und "verhältnismäßig", wie sie in der
vorliegenden Beschreibung verwendet werden, umfassen jede Beziehung,
die mathematisch beschrieben werden kann; z. B. x:y, x:y2, x:1/y, usw.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung enthält weiterhin die Schritte von:
a) Einbringen des empfindlichen Reagenz' in das Wachstumsmedium; b) Beimpfen
des Wachstumsmediums mit dem Ziel-Mikroorganismus, c) Bebrüten des
beimpften Wachstumsmediums; d) Bestimmen einer Wachstumsgrenze des Wachstums
des Ziel-Mikroorganismus; e) Messen der Stärke des Signals der Markersubstanz
an der Wachstumsgrenze; und f) Bestimmen der MIC des Antibiotikums
zur Verwendung der gemessenen Stärke
des Signals der Markersubstanz.
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Das
empfindliche Reagenz wird in das Wachstumsmedium in einer derartigen
Art und Weise eingebracht, dass wenigstens ein Gradient der Reagenz-Konzentration
sich innerhalb des Wachstumsmediums ausbildet. An einem Ende des
Gradienten sind die Antibiotika- und Markersubstanzkonzentrationen
größer als die
für die
MIC des Antibiotikums möglichen.
An dem anderen Ende des Gradienten sind die Antibiotikum- und Markersubstanzkonzentrationen
geringer als die für
den MIC des Antibiotikums möglichen.
Das Einbringen kann durch direktes Einfügen des Reagenz' in das Wachstumsmedium
oder durch Aufbringen des Reagenz' auf eine Oberfläche des Wachstumsmediums erfolgen.
Das Einbringen kann ebenfalls indirekt durch Aufbringen des Reagenz' auf ein Substrat
und Anordnen des Substrats in Kontakt mit dem Wachstumsmedium erfolgen.
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Das
Wachstumsmedium kann durch jedes bekannte Verfahren beimpft werden,
das für
die Verwendung mit dem Wachstumsmedium und dem Ziel-Mikroorganismus
akzeptabel ist. Die Anzahl der Keime des Ziel-Mikroorganismus', die in das Wachstumsmedium
beimpft werden, sollte ausreichend sein, um eine angemessene Bedeckung über die
gesamte Fläche
des Wachstumsmediums mit dem eingebrachten Reagenz zur Verfügung zu
stellen. Die Hinlänglichkeit
der Beimpfungskonzentration wird von den Parametern des bevorstehenden
MIC-Tests abhängen,
einschließlich
der Art des Wachstumsmediums, des Ziel-Mikroorganismus, des Antibiotikums
usw. In den meisten Fällen
wird jedoch eine angemessene Impfungskonzentration des Ziel-Mikroorganismus zwischen
1000 Keime pro ml des Inoculums (103 Keime/ml)
und einhundert Millionen Keime pro Millimeter des Inoculums (108 Keime/ml) fallen; höhere Inoculumkonzentrationen
erfordern im Allgemeinen geringere Volumina des Inoculums. Wie vorher
angegeben ist der Ziel-Mikroorganismus bevorzugt ein Bestandteil
innerhalb einer Flüssigkeit
oder Gellösung.
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Das
Wachstumsmedium mit dem eingebrachten Reagenz und beimpft mit dem
Ziel-Mikroorganismus kann unter jeden Bedingungen bebrütet werden,
die für
das Wachstumsmedium und den Ziel-Mikroorganismus akzeptabel sind.
Das Wachstumsmedium wird typischerweise solange bebrütet, bis
ein Abschnitt des Wachstumsmediums ein nachweisbares Wachstum des
Ziel-Mikroorganismus aufweist. Der Bereich des Wachstumsmediums
mit nachweisbarem Wachstum des Ziel-Mikroorganismus wird an einem Bereich
des Wachstumsmediums angrenzen, der im Wesentlichen kein nachweisbares
Wachstum des Ziel-Mikroorganismus hat. In einigen Fällen kann
der Bereich des Wachstumsmediums mit "im Wesentlichen keinem" nachweisbaren Wachstum
des Ziel-Mikroorganismus
eine vernachlässigbare
Menge von vorhandenem Ziel-Mikroorganismus haben. Die Grenze zwischen
den zwei Bereichen wird als die Wachstumsgrenze bezeichnet. Der
Bereich des Wachstumsmediums mit nachweisbarem Wachstum des Ziel-Mikroorganismus
ist der, in welchem das Wachstum des Ziel-Mikroorganismus im Wesentlichen
nicht durch das Antibiotikum gehemmt wird. Im Gegensatz dazu, ist
der Bereich ohne nachweisbares Wachstum der, in welchem das Wachstum
des Ziel-Mikroorganismus
im Wesentlichen durch das Antibiotikum gehemmt wird. Die Wachstumsgrenze
fällt mit
der MIC des Antibiotikums für
den zu überprüfenden Ziel-Mikroorganismus zusammen.
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Die
Position der Wachstumsgrenze wird gewöhnlich durch optische Einrichtungen
bestimmt. Ein zweites Verfahren für die Bestimmung der Position
der Wachstumsgrenze verwendet eine Markersubstanz (welche die gleiche
oder unabhängig
von der in dem Reagenz enthaltenden Markersubstanz sein kann), die
mit dem im wachsenden Ziel-Mikroorganismus interagiert, einschließlich, aber
nicht begrenzt auf, deren Metabolisierung dadurch, um ein empfindliches
Produkt zu erzeugen. Das empfindliche Produkt, welches mit dem Wachstum
des Ziel-Mikroorganismus vorhanden ist, wird gemessen, um die Wachstumsgrenze
festzulegen. Ein drittes Verfahren zur Bestimmung der Position der
Wachstumsgrenze enthält
die Bewertung der Lichtstreuungseigenschaften in den Bereichen,
die das Wachstum des Mikroorganismus aufweisen, gegenüber den
Lichtstreuungseigenschaften in den Bereichen, die im Wesentlichen
kein Wachstum des Ziel-Mikroorganismus aufweisen. In allen drei
Verfahren kann, wenn einmal die Wachstumsgrenze bestimmt ist, das
Signal von der Markersubstanz innerhalb des Reagenz' nachgewiesen und
seine Stärke
gemessen werden.
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Die
mit dem Antibiotikum in dem empfindlichen Reagenz gemischte Markersubstanz
stellt quantitative Information an der Wachstumsgrenze zur Verfügung, die
die Berechnung der MIC des Antibiotikums ermöglicht. Insbesondere ist die
Stärke
des Signals der Markersubstanz an der Wachstumsgrenze proportional
zur Konzentration der Markersubstanz, und die Konzentration des
Antibiotikums kann unter Verwendung des bekannten proportionalen
Verhältnisses
zwischen den Konzentrationen von Markersubstanz und Antibiotikum berechnet
werden. Das exakte Verfahren zur Bestimmung der Antibiotikumkonzentration
wird von den physikalischen Ausführungsformen
des Wachstumsmediums, wie das empfindliche Reagenz verteilt ist,
dem proportionalen Verhältnis
zwischen der Markersubstanz und dem Antibiotikum in dem Reagenz,
usw., abhängen. Die
folgenden Beispiele stellen dar, wie die Antibiotikumkonzentration
unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung berechnet
werden kann.
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Beispiel I:
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Unter
Bezugnahme auf die 1 wird in einem ersten Beispiel
des erfindungsgemäßen Verfahrens eine
Vorrichtung in Kirby-Bauer-Bauart 10 (gezeigt in einem
diagrammartigen Querschnitt) verwendet, welche eine Platte 12,
eine Schicht eines Mikroorganismen-Wachstumsmedium 14 mit gleichmäßiger Dicke "T", die mit einem Ziel-Mikroorganismus
beimpft ist, und eine Scheibe 16 enthält. Das empfindliche Reagenz 17 (mit einer
genau bekannten Menge eines Antibiotikums gemischt mit einer ungenau
gemessenen Menge einer fluoreszierenden Markersubstanz) wird auf
die Scheibe 16 gegeben, und die Scheibe 16 wird
in Kontakt mit dem Wachstumsmedium 14 angeordnet. Das empfindliche
Reagenz 17 diffundiert in das Wachstumsmedium 14, und
bildet bei seiner kreisförmigen
Wanderung einen Konzentrationsgradienten 18 aus (diagrammartig
in der 1 gezeigt). Das beimpfte Wachstumsmedium 14 wird
bebrütet
und ein Bereich 20 mit einem nachweisbaren Bereich des
Wachstums des Ziel-Mikroorganismus 22 entwickelt
sich benachbart zu einem Bereich 24 mit keinem nachweisbaren
Wachstum des Ziel-Mikroorganismus.
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Unter
Bezugnahme auf die 1 und 2, wird
die Platte 12 in einem kommerziell erhältlichen abtastenden Fluorometer
(nicht gezeigt) angeordnet, das eingestellt ist, um die Fluoreszenzsignaleigenschaften der
Markersubstanz abzuweisen. Das Fluorometer erzeugt eine Kurve 26 (2),
die eine Signalstärke
als eine Funktion des radialen Abstands über die Platte 12 darstellt.
Die Stärke
des Signals der Markersubstanz ist eine Funktion der Markersubstanzkonzentration
in einem gegebenen Volumen (V) und wird durch Abtasten einer Fläche (A)
des Wachstumsmediums 14, welches eine gleichmäßige Dicke
hat (T; V = A·T)
bestimmt. Die Signalstärke
der Markersubstanz an der Wachstumsgrenze 28 zwischen den
Bereichen 20, 24 z. B. wird als die Signalstärke gemessen
in einem Volumen (V) eines Wachstumsmediums 14, das ein
der Wachstumsgrenze 28 angeordnet ist, angegeben. Wie vorher
angegeben, kann die Position der Wachstumsgrerze 28 zwischen
den Bereichen 20, 24 optisch oder durch andere
Mittel bestimmt werden. In dem Wachstumsmedium 14 kann
unterhalb der Scheibe 16 und in dem Bereich 20 des
Wachstumsmediums 14 mit nachweisbarem Wachstum des Ziel-Mikroorganismus 22,
das Signal der Markersubstanz durch Interferenz überdeckt werden. Die Gesamtsignalstärke von
der Markersubstanz kann durch Abschätzen der Signalstärke der
Markersubstanz in den verdunkelten Bereichen mit einer an eine mathematische
Analyse angepassten Kurve bestimmt werden. Zum Zweck der Veranschaulichung
zeigt die 2 ein Beispiel einer mathematischen
angepassten Kurve 30 in den verdunkelten Bereichen. Die
gesamte Signalstärke
aus der Markersubstanz wird nachfolgend durch Integration der Fläche unter
der Kurve 26, 30 bestimmt. Wie vorher beschrieben,
wird das Signal der Markersubstanz in einer linearen Art und Weise über die
Mitte der Testfläche
abgetastet. Da das empfindliche Reagenz 17 tatsächlich in
einer radialen Art und Weise diffundiert, kann es notwendig sein,
die Signalintegration einzustellen, um die radiale Diffusion des
Reagenz' widerzuspiegeln.
Die Einstellung der Signalintegration kann jedoch durch Abtasten
der gesamten Fläche
mit der radialen Diffusion des Reagenz' vermieden werden.
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Die
Konzentration des Markers in dem gegebenen Volumen (V) an der Wachstumsgrenze
28 kann
als das Verhältnis
der Stärke
des Signals der Markersubstanz an der Wachstumsgrenze
28 (bestimmt
aus dem Volumen V) zu der Gesamtstärke des Signals der Markersubstanz
gemessen in dem Gesamtvolumen des Wachstumsmediums
14 bestimmt
werden. Die Konzentration der Markersubstanz an der Wachstumsgrenze
28 steht
wiederum mit der Konzentration des Antibiotikums an der Wachstumsgrenze
28 (in
dem gleichen Volumen V) in Beziehung, durch das Verhältnis der
Diffusionsgeschwindigkeiten der Markersubstanz und des Antibiotikums.
Wenn die Diffusionsgeschwindigkeiten gleich sind, kann die Antibiotikumkonzentration
an der Wachstumsgrenze
28 (d. h. die MIC des Antibiotikums
für den
Ziel-Mikroorganismus) wie folgt bestimmt werden:
, welche umgestellt werden
kann, um für
ein Ergebnis für
die bekannte Antibiotikumkonzentration eine Wachstumsgrenze
28 zu
lösen:
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Wenn
die Diffusionsgeschwindigkeit des Antibiotikums und der Markersubstanz
sich unterscheiden, wird ein Korrekturfaktor verwendet, der die
mathematische Beziehung zwischen den zwei Diffusionsgeschwindigkeiten
darstellt, um den Unterschied zu korrigieren. Außerdem erfordern die vorhergehenden
Gleichungen, dass die Menge des Antibiotikums in dem Gesamtvolumen
des Wachstumsmediums genau bekannt ist. Wenn das gesamte empfindliche
Reagenz 17 (das eine genau bekannte Menge des Antibiotikums,
gemischt mit einer ungenau gemessenen Menge einer fluoreszierenden
Markersubstanz enthält)
in das Wachstumsmedium eingebracht wird, ist die Menge des Antibiotikums
bestimmbar aus dem Reagenz. Andere Verfahren zur genauen Bestimmung
der Menge des Antibiotikums in dem Gesamtvolumen des Wachstumsmediums
können alternativ
verwendet werden.
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Beispiel II:
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Unter
Bezugnahme auf die 3–5, enthält eine
Wanne 32 eine Schicht eines Mikroorganismen-Wachstumsmediums 34 mit
bekannter gleichmäßiger Dicke "T", das mit einem Ziel-Mikroorganismus beimpft
ist.
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Die 3 veranschaulicht
eine Ausführungsform,
in der eine Menge eines empfindlichen Reagenz' 36, die ein bekanntes genaues
Konzentrationsverhältnis
von Antibiotikum und Markern enthält, auf eine Oberfläche des
Wachstumsmediums 34 an einem Ende der Wanne 32 aufgebracht
wird. Die 5 veranschaulicht eine alternative
Ausführungsform,
in der eine Menge des sensiblen Reagenz', die ein bekanntes genaues Konzentrationsverhältnis des
Antibiotikums und der Markersubstanz enthält, auf ein Substrat 33 aufgebracht
wird, das in Kontakt mit einer Oberfläche des Wachstumsmediums 34 an
einem Ende der Wanne 32 angeordnet ist. In beiden Ausführungsformen
wird das Verhältnis
der anfänglichen
Konzentrationen des Antibiotikums zur Markersubstanz ausgewählt um sicherzustellen,
dass das Antibiotikum und die Markersubstanz in das Wachstumsmedium
ausreichend genug diffundieren, um eine leicht nachweisbare Menge
von Marker an dem möglichen
MIC-Punkt bereitzustellen. Das Verhältnis der anfänglichen
Konzentrationen wird durch die konstante "k1" ausgedrückt:
k1 = (Antibiotikumkonzentration)anfänglich/Markerkonzentration)anfänglich
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Ein
genauer Wert, der das Verhältnis
der anfänglichen
Konzentrationen des Antibiotikums zur Markersubstanz darstellt,
wird zu dem Zeitpunkt bestimmt, an dem das empfindliche Reagenz 36 hergestellt
wird. Ein Bezugstupfer 38 wird unabhängig von der Schicht des Wachstumsmediums 34 vorgesehen,
das eine bekannte Menge der Markersubstanz enthält, welche eine bekannte Stärke des
Fluoreszenzsignals emittiert. Die in dem Bezugstupfer 38 enthaltende
Markersubstanz kann unterschiedlich von der in dem Reagenz 36 verwendeten sein.
Wenn jedoch die Markersubstanzen unterschiedlich sind, oder wenn
die Antwort der Markersubstanz in dem Bezugstupfer 38 sich
von der Antwort der Markersubstanz in dem Wachstumsmedium 34 unterscheidet, muss
das Verhältnis
der Konzentration zu Signalstärke
von jeder Markersubstanz bekannt sein.
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Das
empfindliche Reagenz 36 diffundiert in das Wachstumsmedium 34,
wobei es einen Gradienten 40 mit abnehmender Konzentration
ausbildet, da es seitlich wandert (diagrammartig in der 3 gezeigt).
Das beimpfte Wachstumsmedium 34 wird bebrütet und
ein Abschnitt 42 mit nachweisbarem Wachstum des Ziel-Mikroorganismus 44 entwickelt
sich benachbart zu einem Bereich 46 mit keinem nachweisbaren
Wachstum des Ziel-Mikroorganismus.
Ein kommerziell erhältliches
abtastendes Fluorometer (nicht gezeigt), eingestellt zur Bestimmung
der Fluoreszenzsignalcharakteristika der Markersubstanz, wird verwendet,
um die Stärke
des Signals der Markersubstanz emittiert an einem gegebenen Volumen
(V) lokalisiert an der Wachstumsgrenze 48 zwischen den
Bereichen 42, 46 zu messen, wobei das Volumen
(V) als eine Fläche
(A) eines beimpften Wachstumsmediums 34 mit einer gleichmäßigen Dicke
(T; V = A × T)
definiert ist, das abgetastet wird. Wie vorher angegeben, kann die
Position der Wachstumsgrenze 28 zwischen den Bereichen 42, 46 optisch
durch andere Mittel bestimmt werden. Das Fluorometer erzeugt eine
Kurve 50 (4), die eine Signalstärke als
eine Funktion der seitlichen Strecke über die Wanne 32 darstellt.
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Die
Konzentration des Antibiotikums an der Wachstumsgrenze
48 (d.
h. die MIC des Antibiotikums für das
Ziel-Mikroorganismus) kann durch die erste Bestimmung der Konzentration
der Markersubstanz in einem gegebenen Volumen (V) an der Wachstumsgrenze
48 unter
Verwendung der folgenden Beziehung berechnet werden:
welche umgestellt werden
kann, um für
eine Ergebnis für
die unbekannte Konzentration der Markersubstanz zu lösen, da
das Signal der Markersubstanz an der Wachstumsgrenze
48 bekannt
ist:
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Wenn
einmal die Konzentration der Markersubstanz an der Wachstumsgrenze 48 bestimmt
ist, kann die Antibiotikumkonzentration an der Wachstumsgrenze 48 durch
Multiplikation des Verhältnisses
(k1) der anfänglichen Konzentrationen des
Antibiotikums und der Markersubstanz mal der Konzentration der Markersubstanz
an der Wachstumsgrenze 48 bestimmt werden, vorausgesetzt,
dass das Antibiotikum und die Markersubstanz innerhalb des empfindlichen
Reagenz' 36 gleiche
Diffusionsgeschwindigkeiten haben:
k1·[(Menge
des Markers)/(V)]gb = Antibiotikakonzentration
an der Wachstumsgrenze
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Wenn
die Diffusionsgeschwindigkeiten des Antibiotikums und der Markersubstanz
sich unterscheiden, wird ein Korrekturfaktor verwendet, der die
mathematische Beziehung zwischen den zwei Diffusionsgeschwindigkeiten
darstellt, um die Differenz zu korrigieren.
