WO2006062131A1

WO2006062131A1 - 細胞計測方法

Info

Publication number: WO2006062131A1
Application number: PCT/JP2005/022465
Authority: WO
Inventors: Nao Nitta
Original assignee: Effector Cell Institute, Inc.
Priority date: 2004-12-07
Filing date: 2005-12-07
Publication date: 2006-06-15
Also published as: EP1821094A1; CN101036043B; JP4402118B2; US20080075350A1; KR20070083616A; CN101036043A; KR100920532B1; CA2581122A1; JPWO2006062131A1

Abstract

　細胞に関する反応を計測する際に、幅広い濃度範囲での計測を一度に行うことができる技術を提供する。液体１２０を満たした細胞収容空間１１０に細胞群２００を配置する。細胞収容空間１１０の液体に特定の物質を供給して、当該細胞収容空間１１０の一端１１１から他端１１２に向かって液体中１２０に特定物質１３０の濃度勾配１３１を形成させる。細胞収容空間１１０内の細胞群を撮像装置３２０により撮像して、情報処理装置に取り込み、情報処理装置により、得られた画像について、前記濃度勾配に沿って複数の領域に区画し、各領域における画像から特徴量を抽出し、抽出された特徴量と濃度勾配との対応関係を示す情報を生成する。

Description

明細書

細胞計測方法

技術分野

[0001] 本発明は、細胞計測方法に関するものである。

背景技術

[0002] 医薬の開発、検査技術の開発等のために、細胞について顕微鏡等を用いて観察し、種々の計測を行って、例えば、医薬の細胞への影響に関する情報等の各種情報を収集することが行われている。この種の観察、測定等を行う場合、効率を上げるため、細胞を収容して観察等を行うための微小区画である観察サイト（以下単にサイトという）が、複数、二次元的に配置された観察支援機器が用いられる。

[0003] この種の観察支援機器を用いて細胞の観察、測定等を行う場合には、観察支援機器を顕微鏡の XYZステージ上に載せ、ステージを対物レンズ系に対して二次元 (XY

)方向に相対移動させて、複数のサイトを、順次、顕微鏡の視野内に位置させ、一定時間間隔で同じ対象を撮影する経時的撮影 (タイムラブス撮影)が行われる。このため、この種の顕微鏡を用いた光学測定器では、各サイトを顕微鏡の視野内に正確に位置させるように、ステージの相対移動を精密に制御している。このようなタイムラブス観察については、例えば、非特許文献としては、 "Shiro Kanegasaki et al. , A novel optical assay system for the quantitative measurement of chemotaxis. Journal of Im munological Methods 282 (2003) 1 11"に記載されている。また、特許文献としては、 " 特開 2002— 277754号公報"に記載されて!、る。

[0004] ところで、化合物に対する細胞の反応、応答性等を観察する場合においては、細胞の種類ごとの、反応性の差異を測定したり、細胞の条件を変えた場合での応答性の変異を測定したりすることが求められる。

[0005] このような場合には、適切な濃度で実験をすることによって良好な測定結果を得ることができる。例えば、ある刺激に対する細胞の応答性を細胞の種類ごとに比較したい場合、細胞の条件を変えた際の細胞応答性の変化を比較したい場合、設定した濃度が高すぎたり低すぎたりすると細胞の種類ごとでの差異が分力りづらぐ良好な実験結果が得られない。

[0006] そのため、化合物に対する細胞の応答性を試験するにあたっては、化合物刺激の適切な濃度を設定する必要がある。その適切な濃度条件を設定するにあたり、濃度条件を複数設定して各々の濃度について個別に細胞反応の計測を行う必要がある。しかし、従来の技術では、そこまで配慮されていな力つた。

発明の開示

[0007] 本発明は、細胞に関する反応を計測する際に、幅広い濃度範囲での計測を一度に行うことができる技術を提供することを目的とする。

[0008] 本発明の第 1の態様によれば、

撮像装置により細胞群の画像を撮像して画像を情報処理装置に取り込み、情報処理装置にお!、て、得られた画像に基づ!、て細胞にっ、ての計測を行う細胞計測方法において、

細胞群を収容する細胞収容空間に液体を満たして、

前記細胞収容空間に細胞群を配置し、

前記細胞収容空間の液体に特定の物質を供給して、当該細胞収容空間の一端から他端に向力つて液体中に特定物質の濃度勾配を形成させ、

前記細胞収容空間内の細胞群を撮像装置により撮像して、情報処理装置に取り込み、

得られた画像から細胞特徴量と特定物質の濃度との対応関係を示す情報を生成すること

を特徴とする細胞計測方法が提供される。

[0009] 本発明の第 2の態様によれば、

細胞群を収容する細胞収容空間に液体を満たして、

前記細胞収容空間に細胞群を配置し、

前記細胞収容空間の液体に特定の物質を供給して、当該細胞収容空間の一端から他端に向力つて液体中に特定物質の濃度勾配を形成させ、前記細胞収容空間内の細胞群を撮像装置により撮像して、情報処理装置に取り込み、

情報処理装置において、

得られた画像について、前記濃度勾配に沿って複数の領域に区画し、各領域における画像から特徴量を抽出し、

前記抽出された特徴量と濃度勾配との対応関係を示す情報を生成することを特徴とする細胞計測方法が提供される。

本発明の第 3の態様によれば、

細胞計測方法において、

観察時に、観察すべき細胞群を収容する細胞収容領域と、前記細胞収容領域を挟んで連通し、使用時に、それぞれに液体が入れられ、前記細胞収容領域を液体で満たす、第 1液溜空間および第 2液溜空間と、を有する細胞観察支援装置と、使用時に、前記細胞収容領域に収容されている細胞群の画像を取得し、取得した画像に基づいて、細胞に関する情報を収集する情報処理装置と、を用い、

前記観察すべき細胞群を配置し、

第 1液溜空間および第 2液溜空間と、前記細胞収容領域とに液体を満たし、かつ、前記第 1液溜空間の液体中に、前記細胞を刺激する細胞刺激物を添加した後、前記撮像装置により、異なるタイミングで複数回、細胞群の画像を取得する処理と、各回に取得した前記画像について、前記画像に表れる細胞収容領域を、前記第 1 の液溜空間側力前記第 2の液溜空間側に沿って複数の区画に分け、それぞれの区画に含まれる細胞の総個数を計数すると共に、予め定めた特徴量が表れている特定の細胞を識別して、その個数を計数する処理と、

前記計数結果に基づいて、それぞれの区画について、それぞれの区画内で計数された総個数に対する、特徴量が表れている特定の細胞個数の割合を算出する処理と、

前記特徴量が表れている特定の細胞個数の割合に関する経時的変化を示す情報を生成する処理と、指示に応じて、前記経時的変化を示す情報を出力する処理と、を行うことを特徴とする細胞計測方法が提供される。

図面の簡単な説明

[0011] [図 1]図 1は、本発明の一実施形態に係る細胞計測システムの原理を示す説明図である。

[0012] [図 2]図 2は、本発明の細胞計測を行う際に用いることができる細胞計測システムの構成の一例を示すブロック図である。

[0013] [図 3]図 3は、本発明の実施に用いることができる観察部材の第 1の例を示す断面図である。

[0014] [図 4]図 4は、本発明の実施に用いることができる観察部材の第 2の例を示す断面図である。

[0015] [図 5]図 5は、本発明の実施に用いることができる観察部材の第 3の例を示す断面図である。

[0016] [図 6]図 6は、本発明の実施に用いることができる観察部材の第 4の例を示す断面図である。

[0017] [図 7]図 7は、本発明の実施に用いることができる観察部材の第 5の例を示す断面図である。

[0018] [図 8]図 8は、添加後における FITC分子の拡散のようすを、蛍光観察により測定した結果を示すグラフである。

[0019] [図 9]図 9は、刺激物質により細胞が脱顆粒して、コントラストが変化するという特徴を捉える場合にっヽて示す説明図である。

[0020] [図 10]図 10は、得られた画像について、濃度勾配に沿って、画面を複数の領域に区画して、特徴量を抽出する方法を示す説明図である。

[0021] [図 11]図 11は、各地点（区画)で脱顆粒細胞の割合を計算したグラフである。

[0022] [図 12]図 12は、走化活性強度の指標として細胞運動の濃度勾配方向の速度を採用し、その値をチャネル上の各位置にぉ、て計測した結果を示すグラフである。

[0023] [図 13]図 13は細胞の刺激に対する何らかの応答性を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態 [0024] 以下、発明を実施するための最良の形態について、図面を参照して説明する。先ず、本発明の原理について説明し、ついで、具体的な適用について説明する。

[0025] 本発明は、細胞が多数存在する平面上に濃度勾配を再現性よく形成させ、その濃度勾配上の各位置での細胞の応答を計測することにより、幅広、濃度範囲での計測を一度に行うことを可能とする。その結果、本発明により、最適な細胞刺激濃度を探索することに必要となる実験を削減することができて、実験の効率を高める。また、細胞を刺激する化学物質の濃度が位置によって連続的に設定されるため、最適な濃度での評価が可能となる。

[0026] データの解析方法としては、次のような考え方が可能である。すなわち、後述するように、撮像された画面を短冊状に領域を区切り、各々の領域に含まれる細胞集団の特徴量を得た後、解析する。

(a)最適な濃度条件における細胞の薬剤応答性評価方法 (最適条件の選定方法）細胞の薬剤に対する反応性を測定する場合、その細胞及び薬剤に対して、適当な薬剤処理濃度を選定する必要がある。従来このような場合においては適当な濃度をいくつか選択して、その各々の濃度における細胞性質を独立に測定することにより、適当な濃度を選定していた。この場合、より適当な濃度を選択するためには、多数の濃度において実験を繰り返し、あるいは並行して行う必要があった。本技術では、細胞に対する薬剤の処理濃度が連続的に変化した際の、細胞性質の変化についての連続的なデータを取得することができる。

[0027] 例えば二種類以上の細胞群がある場合において、その各細胞群の薬剤に対する反応性の差異を検討する場合、濃度勾配を用いる本技術により各々の細胞群につ V、て連続的な薬剤濃度での反応性データを一括して取得することができる。その一連の濃度条件の中から、各細胞群の性質の差異を評価する最もふさわしい濃度を選択し、その濃度において各細胞郡の薬剤応答性の比較を行うことができる。この手法により、多数の薬剤濃度で細胞応答性を評価する一連の検討実験が不要となり、簡便かつ確実に質の高いデータを取得することが可能となる。

(b)細胞の薬剤応答性の特性を表す、関数もしくは値の取得

本手法により、細胞の薬剤に対する応答性を連続的に評価することができる。ここで取得される"一連の濃度-応答性関係デーダ 'をもとに、細胞の薬剤応答性の特性を示す関数もしくは値を取得することが可能である。例えば、ある試験において、細胞の薬剤に対する反応性が、その薬剤濃度に対する特定の関数の形でよく表される場合、本試験で得られたデータをその関数に対して適宜フィッティングことにより、試験した細胞群における薬剤応答の濃度依存性を近似する関数を得ることができる。ここでいう特定の関数としては、シグモイド関数などが想定されるが、これに限らない。また、その関数から、極大点、極小点、変極点などの特徴的な点に対応する濃度を取得して、その値を当該細胞群の当該薬剤に対する反応性の特徴量として採用することちでさる。

[0028] 次に、本発明の実施形態について図 1を参照して説明する。図 1に示すように、本実施形態では、複数の細胞が配置された空間に、細胞の反応を見るための特定の物質についての濃度勾配を形成する。そのため、観察部材 100により、細胞を収容する空間として細胞収容空間 110が形成される。図 1に示す細胞収容空間 110は、原理の説明をするため、その構造を模式的に示す。具体的な構成については後述する。

[0029] この細胞収容空間 110に、細胞に無害な液体 120を満たし、この中に、観察したい細胞 200を、複数個（細胞群）、分散させて配置する。この状態で、細胞の反応を見るための物質 (以下、刺激物質という） 130を、細胞収容空間 110の一方から注入して、細胞収容空間 110内に濃度勾配 131を形成させる。この例では、化合物等の刺激物質 130を溶解した溶液を注入し、細胞収容空間 110に特定の刺激物質 130の濃度勾配 131が形成された状況において、各細胞 200の状態を、顕微鏡 310を介して、ディジタルカメラ（例えば、 CCDカメラ） 320により撮像する。なお、本実施形態では、細胞収容空間 110をシリコンウェハ上にフォトリソグラフ技術を用いて複数個（例えば、 12個）形成する。そして、それぞれの細胞収容空間 110における濃度勾配の各位置における細胞の応答性を計測する。この方法により、化合物の細胞に対する作用の比較を容易に行うことが可能となる。

[0030] 刺激物質に対する細胞の応答性は、濃度に応じて異なる。細胞が示す応答として、例えば、遺伝子発現、形態変化、生理活性物質の放出など、様々な細胞現象が考えられる。こられの応答として、細胞は、外部から観察できる何らかの特徴量を示す場合がある。本発明では、この性質を利用して、細胞群が示す特徴量を細胞群の画像を解析することにより抽出して、刺激物質に関する細胞の応答に関する情報を、取得する。本発明の場合、同じ画面内に、濃度勾配が形成される。このため、濃度を変えては、実験を繰り返すといった試行錯誤による手間を要しない。 1回の実験で濃度の違、による応答を観察することができる。

[0031] 細胞収容空間 110は、具体的には、図 3から図 7に示すような、様々な形態の観察部材 100により実現することができる。この細胞収容空間 110は、細胞群を平面上に、分散配置させて、外部力顕微鏡等を介して観察することができるようにするためのものである。そのため、扁平な構造となっている。厚さは、例えば、細胞の大きさ程度である。

[0032] 図 3に示すものは、シリコンウェハ 115に、フォトリソグラフ技術を用いて、細胞収容空間 110となる扁平な彫り込みと、その一端側に位置し、細胞収容空間 110に刺激物質を流入させるソース領域 111、および、細胞収容空間 110の他端側に位置し、細胞収容空間 110から刺激物質を排出させるドレイン空間 112となる彫り込みとが形成される。シリコンウェア 115は、ガラス基盤 117上に載せられる。これにより、シリコンウェハ 115とガラス基盤 117に挟まれる、彫り込まれた空間が、細胞収容空間 110、ソース領域 111およびドレイン領域 112を構成する。細胞収容空間 110は、細胞が重ならない程度の深さの扁平な空間（チャネル）となるように形成される。なお、ソース領域 111およびドレイン領域 112は、あくまでも、刺激物質の注入側と排出側とを便宜上名付けているにすぎない。対称的な観察部材の場合、ソース領域とドレイン領域とカ^、ずれの佃 Jになっても差し支えな!/、。

[0033] シリコンウェハ 115の上面側には、液溜を構成する液溜構成部材 116が設けられる。液溜構成部材 116は、例えば、ステンレススチール等の金属で構成される。この液溜構成部材 116により、第 1液溜空間 113aおよび第 3液溜空間 113bと、第 2液溜空間 114aおよび第 4液溜空間 114bとが形成される。第 1液溜空間 113aおよび第 3液溜空間 113bは、ソース領域 111に連通している。一方、第 2液溜空間 112および第 4液溜空間 114は、ドレイン領域 112に連通している。このような構造であることにより、液体 120は、細胞収容空間 110を通じて、第 1液溜空間 113aおよび第 3液溜空間 113bと、第 2液溜空間 114aおよび第 4液溜空間 114bとの間で行き来することができる。ただし、液体自体は、本実施形態では、流れを作らない方が観察には都合がよいため、液溜構成部材 116の上方において、第 1液溜空間 113aおよび第 3液溜空間 113bと、第 2液溜空間 114aおよび第 4液溜空間 114bとを連通させる連通部 118 が設けてある。液体 120を連通部 118まで達するように入れることによって、液体 120 に圧力差による流れができることを抑制することができる。

[0034] 細胞、刺激物質等は、注射器などを用いて注入する。この際、注射針を、ソース領域 111に達する状態とすることによって、細胞収容空間 110に確実に注入することができる。

[0035] 図 4に、図 3に示す構成とほぼ同等の構成を有する観察部材 100を示す。この観察部材 100は、シリコンウェハ 115において形成される彫り込み構造に相違がある他は、前述した図 3に示すものと同様の構造を有し、同様に機能する。

[0036] 図 5に示す観察部材は、前述した図 3および図 4に示す観察部材において設けられて、る第 3液溜空間 113bおよび第 4液溜空間 114bを持たな、構造となって、る。すなわち、第 1液溜空間 113と、第 2液溜空間 114と、ソース領域 111と、細胞収容空間 110と、ドレイン領域 112と、を有する構造となっている。

[0037] なお、図 3および図 4の観察部材 100において、第 3液溜空間 113bおよび第 4液溜空間 114bを設けて、る理由は、注入されて、る液体の揺れを吸収するためである。特に、ソース領域 111から離れた位置で、刺激物質を、注射器などを用いて注入する場合に、刺激物質を押し出す際に生じる圧力の一部を逃がす働きを果たすためと考えられる。

[0038] 図 6および図 7に示す観察部材は、前述した図 3から図 5に示すものと異なるタイプのものである。すなわち、図 6に示す観察部材と図 7に示す観察部材とは、液溜空間の構成と、細胞収容空間 110の構成の仕方において相違がある。第 1液溜空間 113 は、開放されていて、液体の注入、細胞の注入、刺激物質の注入等を行う。一方、第 2液溜空間 114は、開放されていない。また、細胞収容空間 110を構成する部材 11 9として、シリコンではなぐステンレススチールを直接用いている。このようにすることによって、観察部材の生産を簡単化して、製造原価を低下する効果がある。

[0039] 図 6は、横置き型、すなわち、水平に置くタイプの例である。一方、図 7に示す例は、縦置き型である。図 7に示す例では、粘着性のある細胞の場合、ガラス基盤 117〖こ付着してしまうため、細胞が落下することはない。

[0040] ここで、濃度勾配の形成方法につ!、て、説明する。

[0041] 前述した図 5に示す観察部材の場合には、細胞収容空間（チャネル） 110と、これによって連通する第 1液溜空間 113と、第 2液溜空間 114とによって構成される連通管構造について、内部に適当な液体を満たす。また、第 1液溜空間 113および第 2 液溜空間 114のいずれかの管中に、濃度勾配を形成させる目的の物質を含む溶液を注入する。これにより、ソース領域 111からドレイン領域 112に向かって物質がチヤネル 110中に拡散する。なお、上部の連通部 118間で液体 120を満たすことによつて、振動や傾きなどの影響でチャネル 110内を液体が激しく移動することによる濃度勾配の乱れを大幅に軽減することができる。これによつて安定的な濃度勾配を維持することが可能となる。

[0042] 図 3および図 4に示すように、第 1液溜空間 113aに分岐路として第 3液溜空間 113 bを設け、また、第 2液溜空間 114aに分岐路として第 4液溜空間 114bを設けた観察部材を用いることもできる。これらの場合には、それぞれ、第 1液溜空間 113aまたは第 2液溜空間 114aから、目的の刺激物質 130を含む液体を投入する。なお、第 1液溜空間 113a側力刺激物質 130の液体を注入した場合、ソース領域 111からチヤネル 110を経てドレイン領域に向けて刺激物質が拡散する。一方、第 2液溜空間 114a 側から刺激物質の液体を投入した場合、図に示すドレイン領域 112が、実質的にソース領域となり、反対側のソース領域 111が実質的にドレイン領域となる。従って、ソース領域とドレイン領域とは、図 3、図 4および図 5に示す観察部材の場合には、便宜上の名称である。

[0043] なお、図 6および図 7に示す観察部材を用いて濃度勾配を形成することもできる。この場合には、開放されている第 1液溜空間 113から刺激物質 130を含む液体を投入して、ソース領域 111からチャネル 110を経てドレインに向けて、刺激物質 130の濃度勾配を形成される。 [0044] 濃度勾配がどのように形成されるかについて、図 8を参照して説明する。図 4に示す観察部材に液体を満たし、これに、特定の刺激物質 130を投入した場合の、拡散がどのように起きているかについて、図 8に示す。この実験では、第 1液溜空間 113aに、蛍光物質である FITCを添カ卩した。図 8に示すものは、添加後における FITC分子の拡散のようすを、蛍光観察により測定した結果である。グラフ横軸はチャネル上の位置を表し、縦軸は蛍光強度を示す。ここでは FITC分子投入後、 1分、 3分、 6分、 9分および 15分後の FITC分子の濃度勾配を表している。 3分後から、ほぼ直線的な濃度勾配が形成され、維持されていることがわかる。

[0045] 図 2に、本細胞計測システムの構成の一例を示す。図 2に示す細胞計測システムは、細胞収容空間 110に収容されている細胞の撮像を行うための撮像装置と、撮像された画像について処理し、目的とする情報を得るための画像処理を行う情報処理装置とを備える。

[0046] 撮像装置は、本実施形態では、顕微鏡 310、 CCDカメラ 320、ステージ 316、ステージ駆動装置 315、および、情報処理装置 350により構成される。一方、情報処理装置は、入力装置 330および表示装置 340と、コンピュータ 350とを有する。

[0047] コンピュータ 350は、中央演算ユニット（CPU) 351と、メモリ 352と、補助記憶装置 353とを有する。補助記憶装置 353には、当該 CPU351の動作プログラム 360と、データ 370とが格納される。プログラム 360としては、図示していない OSの他、細胞計測システムにおける計測動作を制御する撮像シーケンス 361と、ステージを制御するステージ制御 352と、撮像を制御する撮像制御 363と、得られた画像データの解析を行うデータ解析 364とが含まれる。これらのプログラムは、記憶媒体、ネットワークなど力も補助記憶装置 353にインストールされたものである。データとしては、画像データ 371が代表的なものである。

[0048] 細胞についての撮像は、前述した観察部材により観察用細胞群を用意しておき、コンピュータ 350の制御により、測定を行う。測定は、予め定めた撮像シーケンス 361 に従って行う。すなわち、コンピュータ 350は、ステージ制御プログラム 362により、ステージ駆動装置 315を駆動制御して、観察部材の複数箇所、例えば、 12箇所を、 1 分おき等の一定のタイミングで、撮像するように位置決めを行う。撮像シーケンス 361 は、 XYステージ 316による位置決めと共に、撮像制御プログラム 363により、一定タイミングで、細胞収容空間 110における細胞群の撮像を行うよう CCDカメラ 320に指示する。そして、予め定めたタイミングで、 CCDカメラ 320が撮像した画像をメモリ 35 2に取り込む。

[0049] 取り込んだ画像データについて、データ解析プログラム 64により解析処理を行う。

まず、撮像データを、撮像条件と共に、補助記憶装置 353に格納する。

[0050] この後、得られた画像につ!、て、指定された処理を行う。撮像された画像から特徴量を抽出するには、種々の方法が可能である。例えば、得られた画像について、濃度勾配に沿って、画面を複数の領域に区画し、区画毎に、それらに含まれる細胞群が示す特徴量の抽出を行う。区画は、例えば、図 10に示すように、長方形状に定められる。この区画の大きさは、適宜定めることができる。例えば、表示装置 340条に表示されている画面上に、入力装置を用いて、枠指定を行うことにより、コンピュータ 35 0に区画を認識させる方法がある。また、区画数を指示することによって、画面を指示された区画数に均等割して、区画を定める構成とすることも可能である。いずれの場合でも、コンピュータ 350が認識している区画を人に示すため、長方形の枠を表示画面上に表示することができる。図 10は、表示を行っている例である。

[0051] なお、図 10においては、説明の便宜上、区画を示す枠の左側に 1から 4の数字を付記してある。図 10では、画面上方をソース側とし、下方側をドレイン側として表示している。従って、図 10に示す例の場合、上力も順に降られている数値は、濃度の濃い順を表しているともいえる。

[0052] ここで、細胞群が示す特徴量としては、例えば、次のようなものが挙げられる。もちろん、これらに限定されるものではない。

(a)各領域に存在する細胞全体の個数に対する、当該領域において特定の性質を有する細胞の個数の割合

(al)特定の性質が、細胞の脱顆粒である場合

(a2) alで、さらに細胞がマスト細胞である場合

(b)細胞のある特徴量の平均値、中央値、分散、標準偏差など

(bl)細胞のある特徴量力細胞の運動速度である場合 (b2)細胞のある特徴量力細胞の運動方向特異性である場合

特徴量の抽出は、図 10に示すように、区画に含まれる細胞の画像のコントラストを用いて、細胞が膨張ないし破裂したかを調べることにより行う。この他に、大きさ、例えば、平均直径、面積等について、予め定めた閾値と比較して、閾値を超えたかを調ベることにより、判断する構成とすることもできる。ここでは、図 9に示すように、刺激物質により細胞が脱顆粒して、コントラストが変化するという特徴を捉える場合について説明する。

[0053] まず、細胞群の個数の計数を行う。すなわち、コントラストが大きいもの（例えば、図 9に示す細胞 212)と、小さいもの（図 9に示す細胞 211)とに分けて、それぞれ識別を行って、その個数を計数する。識別は、種々の手法があるが、例えば、輪郭を求めて、閉形状のものを 1個として計数する。この際、例えば、輪郭線と周囲との明度差に基づいて、コントラストを調べる。または、画像について、コントラストの大小を、フィルタを使って分離し、分離された画像のそれぞれについて、輪郭線を求めて、細胞の個数を計数する。いずれによっても、コントラストの高い細胞の個数と、低い細胞の個数とを計数する。

[0054] また、細胞個数の計数の代替として、細胞の領域が占める画面上の面積を計測することも可能である。例えば、コントラストを指標として細胞を識別する場合では、特定のコントラスト範囲に含まれる画面上の領域について面積を計数することにより、細胞個数の計数と同等な効果を得ることができる。例えば、特定のコントラストを有する細胞の割合を評価する場合、画面上を占める細胞の総面積に対する当該性質を有する細胞の面積の割合をもってして、細胞の総数に対する当該性質を有する細胞の割合として用いることができる。

[0055] 計数結果は、各区画について、全体の細胞個数に対する低コントラストの細胞の個数についての割合を求めることによって、例えば、刺激物質に対する脱顆粒率として把握することができる。さらに、異なるタイミングで複数回、撮像が行われる場合には、時間の経過と共に、濃度勾配の各濃度において、刺激物質に対する細胞の応答性を示す情報を生成することができる。図 10は、このようにして生成された情報に基づいて、細胞群が示す特徴量 (ここでは脱顆粒した細胞の割合、すなわち、刺激物質の活性強度）を、各濃度について、その時間変化として表したものである。図 10に示す情報によれば、濃度に応じて活性度が異なること、および、応答性が時間の経過とともに変わることが読みとれる。

<実施例 >

次に、実施例に基づいて、より具体的に説明する。

[0056] マスト細胞は、ある化合物刺激に対応して、細胞内に保有する顆粒を細胞外に放出する脱顆粒と呼ばれる反応を起こす。脱顆粒に際しては細胞の形態やコントラストが変化するため、光学的装置により脱顆粒した細胞を区別することが可能である。ここではマスト細胞が分散した環境中に、マスト細胞刺激物質の濃度勾配を形成させ、各位置で脱顆粒を弓 Iき起こした細胞の割合を計算した。

[0057] 実験にあたっては細胞走ィ匕性測定用の器具である TAXIScan (KK chamber)を用いた (参照： Kanegasaki S et al, (2003)J. Immunol. Methods 282, 1-11)。シリコンウエノ、で形成されたマイクロチャネルとガラス基盤との間隙 (細胞収容空間 110)に、ラット腹腔より採取したマスト細胞を導入し、マイクロチャネルの一方の端につながるソース領域 111より、刺激物質としてマスト細胞刺激剤を投入した。ここで刺激剤としては、 100 μ Μの lysoPSと、 2000,1000,200,80 μ g/mlのコンカナパリン Αとを含む緩衝液を 1マイクロリットル導入した。マスト細胞の脱顆粒は、チャネル中の細胞を顕微鏡で直接観察することによりモニターした。マスト細胞の脱顆粒は、図 9に示すように形態の変化やコントラストの変化などを指標とすることによってモニターすることが可能である。また、コントラスト変化などを指標とすることにより、画像解析で自動的に脱顆粒の検出を行うことも可能である。

[0058] 刺激剤は、拡散により濃度勾配を形成するため、画面上の位置によって濃度が異なる。その各々の地点において個別に脱顆粒活性の強度を測定することにより、各地点の濃度での活性強度が分かる（図 10)。図 10の右に示した 4つのグラフは、写真中の 4つのエリアにおいて、脱顆粒した細胞の割合を、時間を追って計測したものである (横軸は時間 (min)、縦軸は割合 )。濃度勾配は拡散により形成され、ある程度時間を置くと脱顆粒細胞の割合が安定する。前述したように、図 10に示す例では、区画（1)が最も濃度が高ぐ区画 (2)、区画 (3)、区画 (4)の順に、濃度が低くなるような濃度勾配を有する。

[0059] 図 10において、細胞収容空間 110にマスト細胞を配置し、画面上方向より刺激剤を導入した写真 (左:刺激前、右:刺激後)。画面上方の細胞が脱顆粒してコントラストが下がり、白くなつていることが確認される。なお、 211が脱顆粒した細胞、 212脱顆粒しなかった細胞を示す。

[0060] 各地点（区画)で脱顆粒細胞の割合を計算したグラフを図 11に示す。縦軸は脱顆粒した細胞の割合、横軸は横軸は刺激剤の濃度 ( g/ml)である。横軸における数字は、濃度勾配を形成したチャネル (細胞収容空間）上の区画を表す。 1が最も濃度の高、点で、 1から 4の順で濃度が薄くなつて、くように濃度勾配は形成されて!、る。ここで、 1から 4の番号は、図 10において付した区画の番号（1)から（4)に対応している。なお、刺激剤に用いたコンカナノリン A濃度は、黒四角： 2000 g/ml、白四角： 10 00 μ g/ml, X印： 200 /ζ _§/πι1、白丸：80 g/mlである。グラフより、地点 2や 3において、刺激剤の濃度によって脱顆粒細胞の割合に差異がみられ、かつその値は刺激剤の濃度と相関している。

[0061] 図 11に示すグラフにおいて、区画（1)および (4)では刺激剤の濃度差がほとんどないが、区画（2)および（3)では濃度によって反応の違いが明瞭である。例えば、この細胞の、刺激強度に対する活性のばらつきを調べたり、試薬が細胞活性に与える阻害 Z促進活性を確認したりする実験にあたっては、区画 (2)および (3)の領域に該当する刺激物濃度を採用することによって適切なデータを取ることができる。このように、濃度勾配を利用することにより、一度の試験において連続的に変化した濃度での細胞応答が観察できるため、最適な条件での比較が可能である。

[0062] 次に、他の実施例について説明する。ここでは、細胞の走ィ匕活性の濃度変化について述べる。

[0063] 細胞の走化活性の濃度変化についても、濃度勾配上の細胞位置を考慮することにより検討が可能である。細胞の走ィ匕性は細胞が特定の因子の濃度勾配を感知して、濃度の濃い方向へと移動する機能のことである。この走ィ匕活性は、特定の濃度で活性が最大となり、高い濃度や低い濃度域では活性が減少していぐベルシェイブ型の活性を示すことが知られている。従来の方法では、濃度に対して活性がベルシェイブ型であることは、多数の濃度において実験を行うことにより確認することができる。濃度勾配環境中の各位置で濃度が異なることを利用すれば、容易に活性の濃度特性を知ることができる。このことを実験で示すにあたっては、細胞走ィ匕性測定用の器具である TAXIScan (KK chamber)を用いた (方法と材料などについては Kanegasaki S et al, (2003)J. Immunol. Methods 282, 1-11を参照)。

[0064] ここでは、 Jurkat細胞を、細胞収容空間 110中に導入し、そこに SDF-laの濃度勾配を形成した際の細胞の運動を測定した。濃度勾配を作成する際に用いた SDF-laの濃度は 10及び 1 nMの 3種類で、各々にっき 1マイクロリットルを注入した。 Jurkat細胞は SDF-laの濃度勾配方向に走ィ匕性を示したので、走ィ匕活性強度の指標として細胞運動の濃度勾配方向の速度を採用し、その値をチャネル (細胞収容空間 110)上の各位置において計測した。その結果を図 12に示す。グラフ横軸はチャネル上の位置、縦軸は走化活性 (細胞移動速度の濃度勾配方向成分)を表す。濃度勾配はグラフ右方向より形成したため、右に行くほど濃度が高いことになる。縦軸は細胞運動の濃度勾配方向の速度 m/sec)を表す。加えた SDF-laの濃度が 1 nMの際には、図 12 (b)に示すように、濃度が高いほど走ィ匕活性も高くなつている。 ΙΟηΜとした場合の結果をみると、図 12 (a)チャネル上の途中地点に活性のピークがあり、そこより濃度が濃くなると走ィ匕活性は減少していくことが分かる。これにより確かに走ィ匕活性はべルシイプであることが分かる。

[0065] 細胞の運動の計測は、例えば、図 10に示す画面を複数のメッシュに区画し、それぞれのメッシュ内での細胞の輪郭線の一部に注目し、その輪郭線の位置力時間共に、どのように変位するかについて計測し、それらの変位の X成分、 y成分を平均することにより、平均的な変位方向と、撮像タイミングとから、平均的な速度を求めることができる。

[0066] 以上に述べたように、本発明では、細胞収容空間に細胞群を投入すると共に、細胞群について刺激物質を注入して、その刺激物質の濃度勾配を形成して、撮像し、得られた画像について、濃度勾配に沿った区画を設けて、画像処理に基づいて、各区画における細胞群が示す特徴量を抽出するものである。これまでのように、濃度毎に、時間経過毎に、何度も試行する必要があった計測を、一回の処理で行うことが可能となる。

[0067] すなわち、細胞の種類ごとでの反応性の差異を測定したり、細胞の条件を変えた場合での応答性の変異を測定したりする場合には、適切な濃度で実験をすることによつて良好な測定結果を得ることができる。例えば、ある刺激に対する細胞の応答性を細胞の種類ごとに比較したり、細胞の条件を変えた際の細胞応答性の変化を比較したりした、場合、設定した濃度が高すぎたり低すぎたりすると細胞の種類ごとでの差異が分力りづらぐ良好な実験結果が得られない。

[0068] ここで、細胞の刺激に対する何らかの応答性が、図 13(a)のように表されるとする (横軸:濃度、縦軸:活性)。細胞が適当に分散した環境中に図 13(b)(横軸:位置、縦軸:濃度)に示すような濃度勾配を形成した場合、濃度勾配中の各位置における細胞応答性は図 13(c)(横軸:位置、縦軸:活性)のようになる。通常の実験では、多数の濃度を試験する場合、濃度を段階的にふって、各々の濃度における反応をみるため、試験される濃度が断続的となる。さらに、多数の濃度での反応を確認するためには、その数だけの試験を独立に行なう必要がある。濃度勾配を利用すると、連続的な濃度範囲の各濃度における細胞応答を、一つの独立な試験で確認することが可能となる。これにより独立な試験の個数が削減されて実験が簡便となる。

[0069] なお、細胞の活性評価につ!、ては、細胞の形態変化や運動性、ある!、は蛍光プローブなどを用いた細胞内分子の局在変化、遺伝子発現など、顕微鏡上で評価可能なあらゆる生命現象が対象となる。

Claims

請求の範囲

[1] 撮像装置により細胞群の画像を撮像して画像を情報処理装置に取り込み、情報処理装置にお!、て、得られた画像に基づ!/、て細胞にっ、ての計測を行う細胞計測方法において、

細胞群を収容する細胞収容空間に液体を満たして、

前記細胞収容空間に細胞群を配置し、

を特徴とする細胞計測方法。

[2] 請求項 1に記載の細胞計測方法であって、

濃度勾配は、蛍光物質が形成する濃度勾配を蛍光観察によって測定することを特徴とする細胞計測方法。

[3] 請求項 1および 2の、ずれか一項に記載の細胞計測方法であって、

細胞特徴量が、細胞の脱顆粒、運動速度、運動方向特異性、大きさ、平均直径、面積、コントラスト、形態変化、細胞内分子の局在変化、および、遺伝子発現のいずれかであることを特徴とする細胞計測方法。

[4] 請求項 3に記載の細胞計測方法であって、

細胞特徴量は、画像より輪郭を求めて、閉形状のものを 1個の細胞として識別することによって、その識別された細胞力も得られる特徴量であることを特徴とする細胞計測方法。

[5] 撮像装置により細胞群の画像を撮像して画像を情報処理装置に取り込み、情報処理装置にお!、て、得られた画像に基づ!、て細胞にっ、ての計測を行う細胞計測方法において、

細胞群を収容する細胞収容空間に液体を満たして、前記細胞収容空間に細胞群を配置し、

情報処理装置において、

前記抽出された特徴量と濃度勾配との対応関係を示す情報を生成することを特徴とする細胞計測方法。

[6] 請求項 5に記載の細胞計測方法お!/、て、

前記特徴量は、細胞の画像が示すコントラストの違いによって抽出されるものであること、を特徴とする細胞計測方法。

[7] 請求項 6に記載の細胞計測方法にお、て、

前記各領域における画像から、各領域に存在する細胞全体の個数に対する、当該領域にお 1、て特定の性質を有する細胞の個数の割合を、特徴量として抽出すること、を特徴とする細胞計測方法。

[8] 請求項 7に記載の細胞計測方法にお、て、

前記特定の性質が、細胞の脱顆粒である細胞計測方法。

[9] 請求項 8に記載の細胞計測方法にお、て、

前記細胞がマスト細胞である細胞計測方法。

[10] 請求項 6に記載の細胞計測方法にお、て、

前記各領域における画像から、各領域に存在する細胞全体の運動についての、平均値、中央値、分散および標準偏差のいずれかの指標を、特徴量として抽出すること、を特徴とする細胞計測方法。

[11] 請求項 10に記載の細胞計測方法において、

前記特徴量として抽出されるものが細胞の運動速度についての指標である細胞計測方法。

[12] 請求項 10に記載の細胞計測方法におヽて、

前記特徴量として抽出されるものが細胞の運動方向特異性についての指標である細胞計測方法。

[13] 細胞計測方法において、

前記観察すべき細胞群を配置し、

前記特徴量が表れている特定の細胞個数の割合に関する経時的変化を示す情報を生成する処理と、

指示に応じて、前記経時的変化を示す情報を出力する処理と、を行うことを特徴とする細胞計測方法。