DK170721B1 - System og metode til celleudvælgelse - Google Patents

Description

i DK 170721 B1

Den foreliggende opfindelse angår et udstyr samt metoder til celleudvælgelse ‘ som angivet i kravene 1 og 12, mere specielt sådant udstyr og sådanne metoder til at opfange individuelle celler på kendte steder, bl.a. til udvælgel-5 se af mindst en underpopulation af celler under anvendelse af definerede parametre, der er fælles for dens medlemmer, fra en mere generel cellepopulation.

Udstyr og metoder til udvælgelse af adskillelse af under-10 populationer af biologiske celler, f.eks. de, der er indeholdt i blodet, er kendte. Adskillige metoder, som betragtes som værende vigtige og indikative for teknikkens stade, beskrives kort og kommenteres i det følgende.

15 Adskillelse baseret på celleadhæsion. Denne metode er ikke særlig effektiv og ikke egnet til adskillelse af forskellige celler, som har samme membranegenskaber, f.eks. celler, der klæber til glas.

20 Immunofluorescensadskillelse. Denne metode er baseret på kendte bindingsegenskaber for underpopulationer af celler til visse antigener og/eller antistoffer. Denne binding til cellerne i et senere stadie kan anvendes til at identificere cellen. Denne metode er imidlertid ret begræn-25 set, fordi den ikke kan anvendes til at adskille celler baseret på måling af deres biologiske egenskaber eller respons til det bundne stof.

Elektroforese. Denne metode er baseret på celleadskillel-30 se efter cellernes elektriske ladning. Den kan således ikke anvendes til at adskille forskellige grupper celler med samme ladning eller masse.

Radioprøve, herunder radioimmunoprøve, radioinkorpore-35 ringsprøve, radioenzymologisk prøve. Ved denne metode kan man ikke adskille grupper af celler fra hinanden eller skelne en undergruppe fra gruppen baseret på dens aktivi- 2 DK 170721 B1 tet eller inaktivitet og respons.

Morfologi. Skelnen mellem celler er baseret på deres fy- i siske fremtoning. Denne metode er hurtig, men den grove-5 ste af alle.

*

Celleadskillelse efter specifik massefylde (gradientteknik) . Ved denne metode flyder celler på en isotonisk opløsning med kendt massefylde, osmolaritet og viskositet.

10 Denne konfiguration underkastes accelerationskræfter ved centrifugering ved en given temperatur og acceleration.

Cellerne, der har en specifik vægt større end opløsningen, synker. De, der har den specifikke massefylde for opløsningen, suspenderes i den, og de med en specifik 15 massefylde mindre end massefylden for opløsningen flyder ovenpå. Hovedproblemet ved denne metode er cellernes opdeling i sektioner uden indbyrdes forbindelse inden for massefyldegradienten, som påvirkes af omgivelsernes betingelser, såsom temperatur, osmolaritet, acceleration, 20 f.eks. grænsefladens afstand mellem blodet og gradienten fra omdrejningsaksen.

Foruden de i det foregående anførte mangler for forskellige til teknikkens hørende metoder er en ulempe fælles 25 for dem alle den kendsgerning, at de fraskilte celler næsten altid indeholder celler hørende til andre grupper end den gruppe eller undergruppe, der er af interesse.

Derfor er enhver diagnose af de celler, der er fraskilt ved en vilkårlig af disse nævnte metoder, nødvendigvis 30 grov, selv hvis alle procedurerne er blevet udført med i den yderste præcision.

F.eks. beskriver L. Cercek et al. en SCM-test * (Structuredness of Cytoplastic Matrix) in Biophys. J., 35 Juli 1978, bind 23, nr. 1, p. 395 ff. I nævnte artikel indrømmer forfatterne, at ved den i det foregående beskrevne gradientmetode indeholdt fraskilte celler ca. 50% 3 DK 170721 B1 uønskede celler på trods af den store omhu, med hvilken forsøget var udført.

Det tilsigtes derfor med den foreliggende opfindelse 5 først og fremmest at tilvejebringe en metode samt udstyr til udvælgelse af en gruppe celler fra andre celler og yderligere at adskille de valgte celler fra hinanden.

Hver af de valgte celler, skilt fra hinanden, er på et præcist kendt sted. Alle de valgte celler kan underkastes 10 almindelige forsøg, og dog er virkningen på hver enkelt celle bestemmelig, hvilket muliggør mere nøjagtig diagnose. Forsøgene og virkningerne på hver celle foretages automatisk for at reducere prøvetiden, et job, der kan udføres af personale med en forholdsvis lille uddannelse.

15

Den manglende evne til totalt at skille en særlig gruppe celler fra alle andre påvirker i høj grad diagnosenøjag-tigheden. Endvidere, og det er yderst vigtigt, foretages celleadskillelsen af de følgende forsøg i de i det fore-20 gående beskrevne metoder på makrobasis eller portionsbasis fremfor på mikrobasis, dvs. en sådan, i hvilken de valgte celler skilles fra hinanden, og hver celle kan afprøves og undersøges separat. Ethvert system og enhver metode til at adskille valgte celler af interesse fra an-25 dre celler og yderligere skille de valgte celler fra hinanden, så at hver enkelt kan afprøves og/eller undersøges separat, ville være af stor betydning ved diagnose af forskellige biologiske tilstande og til andre formål. Afprøvning og undersøgelse af enkelte udvalgte celler ville 30 eliminere fejl, der nu forekommer ved mange diagnoser baseret på unøjagtige statistiske kriterier.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes et udstyr eller system til udvælgelse af specielle biologiske celler fra andre 35 celler og observation og/eller måling af mindst én udvalgt egenskab hos de udvalgte biologiske celler, hvilket system omfatter: » 4 DK 170721 B1 mindst én i det væsentlige plan bærer med en forud valgt tykkelse og som definerer øvre og nedre overflader og omfatter en ordnet gruppering af huller strækkende sig * derigennem, hvilke huller har en forud valgt konfigura-5 tion med forud valgte dimensioner ved top- og bundover- , fladerne, der defineres som henholdsvis top- og bunddimensioner, idet hvert huls topdimension er større end den mindste indre tværsnitsdimension, både bærerens tykkelse og hullernes topdimensioner er af samme størrelses-10 orden som de udvalgte cellers diametre, og hvert huls mindste indre tværsnitsdimension er mindre end tværsnitsdimensionen af de udvalgte celler og større end enhver tværsnitsdimension af de ikke-udvalgte celler, som har en mindre tværsnitsdimension end de udvalgte celler, hvor-15 ved, når biologiske· celler anbringes på den nævnte topoverflade, kun udvalgte celler med en bestemt dimension tilbageholdes med i det væsentlige én celle pr. hul; indretning til understøttelse af ovennævnte bærer, hvorved hvert hul i bæreren er beliggende ved en kendt position, 20 som kan defineres som en adresse, i forhold til nævnte indretning; instrument til observation og/eller måling af mindst én celleegenskab; styreorgan til styring af den relative bevægelse og operation af nævnte instrument i forhold til nævnte bærer.

25

Endvidere angiver opfindelsen en fremgangsmåde til udvælgelse af specielle biologiske celler fra andre celler for at lette observationen og/eller målingen af mindst én egenskab hos de udvalgte biologiske celler, hvor nævnte 30 udvælgelse og enhver efterfølgende observation og/eller måling udføres ved brug af det ovenfor angivne system ifølge opfindelsen, idet ved denne fremgangsmåde (i) den øvre overflade af mindst én i det væsentlige 35 plan bærer i ovennævnte system i det væsentlige dækkes med celler indbefattende de udvalgte celler af interesse, 5 DK 170721 B1 (ii) den nævnte øvre overflade af bæreren eller bærerne vaskes for at fjerne celler, som ikke er understøttet i hullerne, hvorved kun udvalgte celler med forud valgte dimensioner bibeholdes med i det væsentlige én celle pr.

5 hul, og (iii) elektromagnetiske midler og/eller midler til frembringelse af en trykforskel over i det mindste én valgt del af nævnte bærer(e) anvendes til at tiltrække en ak- 10 tuel celle til et hul og for at fremme fastholdelsen af cellen i hullet eller for at udstøde en anden celle fra hullet.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse omfat-15 ter det hidtil ukendte udstyr eller system en cellebærer, som har ordnede celleoptagende huller, hvor stedet i ordenen eller adressen for hvert hul er fastsat og kendt. Hullerne strækker sig fra bæreroversiden til en bundoverside i afstand derfra. Hullerne har forud valgte konfigu-20 rationer, således at når en portion celler passerer over bæreroversiden, går kun forud valgte celler, baseret på deres særlige størrelse, ind i hullerne og bæres af dem. Celler med mindre størrelse end størrelsen for de valgte celler passerer gennem hullerne, mens meget større celler 25 ikke kan komme ind i hullerne. Når bæreren er skyllet, er der kun udvalgte celler i dens huller, en celle pr. hul på en fastsat adresse.

Cellerne i bærerhullerne kan derpå underkastes biologiske 30 forsøg, og særlige egenskaber derfor måles på en celle-til-celle-basis for at bestemme, hvilke af cellerne, der tilhører en særlig undergruppe, baseret på deres særlige egenskaber og deres målte parametre. Når først en undergruppe af celler er blevet identificeret, kendes adres-35 serne for alle undergruppecellerne, da hver celle deri er på en kendt adresse. Man kan således underkaste alle cellerne et eller flere forsøg, men dog undersøge egenska- 6 DK 170721 B1 berne for hver celle alene i undergruppen ved at dirigere de specielle måle- og/eller diagnoseinstrumenter til cellens entydigt bestemte adresse. * 5 Andre formål med den foreliggende opfindelse vil fremgå tydeligere af den efterfølgende beskrivelse af flere udførelsesformer for opfindelsen under henvisning til den medfølgende tegning, hvorpå 10 fig. 1A-1C skematisk viser, delvis i tværsnit, foretrukne cellebærere ifølge opfindelsen, fig. 2A-2D viser en udførelsesform for en flercellebærer-holder til udførelse af målingskredsløb ved flere celle-15 bærere, fig. 3A og 3B er forstørrede tværsnit af holderen i fig.

2A-2D, 20 fig. 4 viser skematisk en optisk analysator til individuel scanning af cellerne i den population, der er indeholdt i en cellebærer, fig. 5 viser skematisk en anden udførelsesform for en op-25 tisk analysator, fig. 6A og 6C viser en modificeret holder af udførelsesformen ifølge fig. 3A-3D, og fig. 6B viser en del af et optisk system, der kan anvendes med den modificerede hol- 30 der ifølge fig. 6A og 6C, fig. 7A og 7B viser en udførelsesform for et strømningskammer for bundsiden af et analysesystem, 35 fig. 8 er en modificeret version af strømningskammeret ifølge fig. 7A og 7B, 4 7 DK 170721 B1 fig. 9 er igen anden udførelsesform af en holder og et strømningskammer for et avanceret analysesystem, fig. 10 er en adskillelsesenhed tilpasset til at modtage 5 holderen fra fig. 6A og 6C til at tilvejebringe cellebærere med celler, fig. 11 er et tværsnit af dele af udførelsesformen vist på fig. 10, 10 fig. 12A og 12B viser en adskillelsesenhed beregnet til at modtage holderen fra fig. 9 til tilvejebringelse af cellebærerne med celler, 15 fig. 13A-13C viser detaljer af et blodtilførselselement tilpasset til anvendelse med adskillelsesenheden fra fig.

12A og 12B, fig. 14 er et tværsnit gennem en anden udførelsesform for 20 et blodtilførselselement tilpasset til anvendelse med adskillelsesenheden fra fig. 12A og 12B, fig. 15A og 15B viser en udførelsesform for et flerbærer-system til klinisk anvendelse, i hvilket adskillelses- og 25 måletrinene er kombineret, fig. 16 er en skematisk totalillustration af et optisk diagnosesystem ifølge opfindelsen, og 30 fig. 17 viser en cellebærer til selektiv tiltrækning eller frigivelse af ønskede celler.

Opfindelsen vil først blive beskrevet under henvisning til udvælgelse og analyse af en særlig population af cel-35 ler af en given type indeholdt i en biologisk væske fra andre cellepopulationer som et eksempel. Desuden kan et yderligere valg af en speciel underpopulation skilles fra 8 DK 170721 B1 den særlige population, der er valgt. Mere specifikt vil opfindelsen først blive beskrevet i forbindelse med udvælgelse og analyse af en særlig underpopulation af lym-focyter, som er til stede i humant blod, ved først at 5 skille lymfocyter fra andre typer celler og derpå afprøve lymfocyterne for at identificere underpopulationen eller undergruppen inden for gruppen af lymfocyter.

L. Cercek og B. Cercek diskuterer i artikler offentlig-10 gjort i European Journal of Cancer, bind 17, 1981, pp.

167 - 171 og bind 13, 1977, pp. 903 - 915; og i

Biophysical Journal, bind 23, 1978, pp. 395 - 405 anslå-ningen og emissionspolarisationsspektre af fluorescin i levende celler (artiklen i Biophysical Journal) med rela-15 tion til anvendelsen af fænomenet af ændringer i

Structuredness of the Cytoplasmic Matrix (SCM) i diagnosen af maligne lidelser. Kort sagt udfører Cercek og Cercek den såkaldte SCM-test efter først at prøve på at adskille en særlig undergruppe af lymfocyter fra andre lym-20 focyter såvel som fra andre celletyper ved massefylde-gradientteknikken.

Denne teknik er som tidligere anført meget utilfredsstillende. For det første er den meget tidskrævende, som det 25 vil være velkendt for dem, der har kendskab til teknikken, og som det klart fremgår af artiklerne af Cercek og Cercek. For det andet tilhører de endeligt adskilte celler ikke, såvidt Cercek og Cercek ved, alene den undergruppe, der er af interesse, men de omfatter også et 30 stort antal, af størrelsesordenen 50%, af andre lymfocy- <* ter. Analysen af deres respons på stimulering af de adskilte celler er således meget begrænset. For det tredje, og dette er det vigtigste, udføres alle de stimuleringer og responsmålinger, som Cercek og Cercek foretager på de 35 adskilte celler, på alle cellerne i en portion fremfor på celle-for-celle-basis. Der er imidlertid klart, at en celle-for-celle-analyse giver en langt bedre information 9 DK 170721 B1 for forståelsen af de biologiske slutninger af de fænomener, der studeres.

Den foreliggende opfindelse gør det muligt at realisere 5 sådanne analyser meget hurtigt og nøjagtigt. I det særlige tilfælde, hvor det drejer sig om betragtning af det eventuelle antal cancerdiagnoseforsøg, som man kan ønske at udføre, er både hastigheden og nøjagtigheden meget vigtig. Lige så vigtig ved den hidtil ukendte opfindelse 10 er det både i henseende til systemet og metoden, at man opnår mulighed for at adskille biologiske celler fra hinanden ved at anbringe hver adskilt celle på en kendt adresse, hvortil man kan vende tilbage for gentagen celleobservation og/eller gentagne stimuleringer efter-15 fulgt af påfølgende analyse.

Kort kan det siges, at ifølge den foreliggende opfindelse skilles først et stort antal celler, f.eks. lymfocyter i blodet, som kan tænkes at repræsentere en gruppe eller 20 population af celler, først fra alle andre celler, dvs. fra forskellige cellegrupper eller -populationer. Ved adskillelsesprocessen ‘skilles de adskilte lymfocyter, foruden i at blive skilt fra de andre celler, også fra hinanden, idet hver er på et kendt sted, der i det føl-25 gende betegnes som en adresse. Alle de adskilte lymfocyter underkastes derpå samtidigt udvalgte forsøg, og derefter undersøges hver celle separat for at bestemme, hvorvidt den udviser en særlig egenskab eller ikke som følge af forsøget eller stimulation. Adressen for hver 30 celle, der udviser denne egenskab optegnes. Således kendes efter undersøgelse af alle de adskilte celler adresserne på alle de celler, som udviste den særlige egenskab. Disse celler repræsenterer en særlig undergruppe af lymfocyter inden for den større samlede lymfocytgruppe.

35 Når først cellerne i undergruppen er blevet identificeret, kan de sammen med resten af lymfocyterne underkastes et eller flere yderligere forsøg. Hvad angår undersøgel- DK 170721 B1 xo sen af egenskaberne for cellerne som følge af dette eller disse yderligere forsøg, kan man imidlertid begrænse sig til kun cellerne i undergruppen. Hver celle i undergruppen undersøges individuelt ved at dirigere undersøgelses-5 instrumentet til cellens kendte plads eller adresse. Når ** således cellerne i undergruppen er blevet identificeret, undersøges kun de yderligere, mens alle andre celler, skønt de hører til samme gruppe, men ikke er en del af undergruppen, ignoreres derved, at de ikke underkastes 10 nogen undersøgelse. Følgelig, når først undergruppen er identificeret, undersøges kun dens celler, hvorved man begrænser undersøgelsestiden til blot at vedrøre de undergruppeceller, som er af interesse. Da også undersøgelsen udføres på celle-for-celle-basis, kan man opnå 15 mere præcise data for forøget diagnosenøjagtighed. Andre fordele ved at være i stand til at identificere celler fra en undergruppe og undersøge hver enkelt individuelt vil blive diskuteret nærmere i det følgende.

20 Som tidligere anført adskilles lymfocyterne i et første trin fra de andre celler, der er indeholdt i blodet. Adskillelsen foretages ved hjælp af en perforeret cellebærer 1, som vist i fig. 1A.

25 Cellebæreren 1 kan have forskellige konfigurationer af huller 2 såvel som forskellige måder, på hvilke de er arrangeret. I fig. 1A antages de at være arrangeret i rækker og kolonner langs henholdsvis akserne X og Y. Hullerne er vist som havende større åbninger foroven end for-30 neden, som vist på fig. IB. I den beskrevne udførelsesform har hullerne en størrelse, så de er egnede til at - optage lymfocyter, blandt hvilke der er to hovedstørrelser på ca. 7 um og ca. 10 - 15 um. Ved den øvre overflade af side lt af bæreren 1 har hullerne en tværsnitsdimen-35 sion på 10 um. Hullerne ved bundoverfladen eller side lb har tværsnitsdimensioner på ca. 6 um. Sidevæggene i hullerne kan konvergere kontinuerligt eller trinvis som vist 11 DK 170721 B1 på fig. 1C mod åbningen ved bundsiden lb af cellebæreren.

I almindelighed skal hullet helst være formet, så tværsnitsdimensionen enten ved dets bundside eller ved et 5 tværsnit mellem siderne lt og lb er mindre end ved oversiden, så at en ønsket celle, der kommer ind i et hul, ikke passerer gennem hullet, men snarere holdes tilbage deri. Det er også vigtigt at lukke bærertykkelsen mellem side lt og lb, så størrelsen af hullet står i forhold til 10 størrelsen af de ønskede celler, således at når en ønsket celle går ind i et hul, er praktisk taget hele cellen inde i hullet, hvorved man undgår, at den vasker ud under et vasketrin, hvilket vil blive beskrevet i det følgende.

15 Formen af hullerne 2 gør det muligt for cellerne effektivt at holdes til bæreren ved at påføre midler, såsom en trykforskel mellem den øvre side og bundsiden af bæreren eller elektromagnetiske kræfter. Kort kan det siges, at til først at skille en særlig gruppe celler fra celler af 20 andre grupper, hvor cellerne i hver gruppe er af kendt størrelse eller størrelser, som på typisk vis afviger fra størrelsen i andre grupper, vælges bæreren 1 med huller af en sådan størrelse, så at når stoffet, f.eks. blod, indeholdende de forskellige cellegrupper anbringes på 25 bæreren 1, optages størstedelen, om end ikke alle hullerne, af celler fra gruppen af interesse med en celle pr. hul.

Som tidligere anført er hullerne 2 i bæreren 1 anbragt 30 regelmæssigt over eller i bæreren, f.eks. i rækker og kolonner, for at muliggøre en klar identificering af stillingen for hvert hul 2, f.eks. ved dets X- og Y-koordi-nater i planet for bæreren. I den beskrevne udførelsesform er hullerne anbragt i rækker og kolonner, der stræk-35 ker sig vinkelret i forhold til hinanden, hvorved der dannes en matrix-lignende struktur. Antallet af huller er valgt afhængigt af antallet af celler, der skal bæres.

12 DK 170721 B1 F.eks. med 100 huller pr. række og kolonne er der i alt 10000 huller til at bære 10000 celler på bæreren i den beskrevne udførelsesform, hvert hul med sin entydige po- * sition i henseende til X og Y. Bæreren 1 kan selv have en 5 cirkulær omkreds, hvilket ses på fig. 6C. Som vist deri har bæreren flere ører 8 for at spore bæreren i en holderstruktur 40, som har et par indskæringer 9, der strækker sig fra en topindskæring, i hvilken bæreren bæres. Et hul strækker aksialt over denne indskæring i holderen 40.

10 Andre sporingsmidler, såsom stifter eller specielt udformede bærere er også omfattet af opfindelsen.

Bæreren 1 er fremstillet af et passende materiale, f.eks. metal såsom kobber, guld, nikkel, sølv eller andet, eller 15 af plast, som kan forsynes med elektrisk ledende dele 101, der strækker sig mellem hullerne 2 som vist i fig.

17. Det elektriske potentiale ved et vilkårligt cellehol-digt hul kan således påvirkes til at give en reaktion med cellens elektriske ladning. Ved at kontrollere poten-20 tialet ved forskellige huller kan celler deri bindes elektrisk til bæreren såvel som frigøres derfra.

For at udføre metoden dryppes nogle få dråber af opløsningen indeholdende lymfocyterne, f.eks. blod, på celle-25 bæreren. Væsken passerer gennem hullerne i bæreren. Cellerne forbliver imidlertid på bæreren. Da størrelsen af hullerne 2 er valgt til kun at huse lymfocyter, går de ind i hullerne. Hvert hul huser kun en celle. Overskud og andre celler vaskes af overfladen af bæreren, såsom cel-30 ler, der er for store til at gå ind i hullet og/eller overskudsceller i forhold til antallet af huller. Derefter kan cellerne fastholdes til hullerne for at undgå, at de forlader hullerne i bæreren, hvilket kan ske på forskellig måde, f.eks. ved at dække bæreren med et adhæ-35 sivt, kolloidalt stof, og ved elektrisk ladning deraf, såvel som ved elektrisk og/eller magnetiske felter. En anden kombineret metode til at isolere populationen og 13 DK 170721 B1 samtidigt påføre den på bæreren vil blive diskuteret i det følgende i forbindelse med fig. 10, 11, 12A og 12B.

Hver bærer forsynet med sin gruppe af celler af interes-5 se, dvs. med lymfocyter, placeres i en bærerholder i et strømningskammer, såsom holder 10 (fig. 2D) for at give det nødvendige miljø til prøven eller målekredsløbene, som vil blive beskrevet senere.

10 I en første udførelsesform, der er vist i fig. 2A-2D, 3A og 3B anbringes en række matricer eller cellebærere 1 på holder 10 (fig. 2D pg 3A). Kun én orientering af bærerne er mulig, så perforationerne (hullerne) i bærerne findes på linie i forhold til definerede akser, såsom X og Y (se 15 fig· 1A). Holderen, som er toppen af strømningskammeret, er bevægeligt anbragt på en central del 11 (fig. 2A) af et strømningskammer. Den centrale del 11 definerer en række kanaler 12, der hver er forbundet ved begge ender til en række rør 13 til tilførsel og fraførsel af en øn-20 sket opløsning. Den centrale del er ved bunden fastgjort ved en lavere del 14 (fig. 2B) af et strømningskammer omfattende en transparent væg 15, som er nødvendig, når man anvender indfaldende og transmitterende lys i forbindelse med teknikken til analyse af cellerne på bæreren.

25

Som det vil ses af fig. 3A, som viser et snit vinkelret på retningen af en kanal 12 (og derfor flyder opløsningen "ind i papiret"), hvor en strømningsleder 16 sikrer, at opløsningen kommer i kontakt med cellebæreren 1. Fig. 3B 30 viser dette arrangement skematisk set fra siden.

På holderen 10 anbringes bærerne 1 for flere forskellige individer (patienter) på en række, der strækker sig langs kanalerne, mens en kolonne af bærere for samme person 35 strækker sig vinkelret på kanalerne. Hver kanal 12 er knyttet til én prøvetype, så antallet af prøver, der skal udføres, bestemmer antallet af kanaler 12 i strømnings- 14 DK 170721 B1 kammeret.

En vilkårlig opløsning, som flyder gennem en af kanalerne, befugter derfor alle cellerne i bærerne over den 5 kanal, hver hørende til en anden patient. Cellebærerne 1 kan være dækket med en glasplade 17 for at muliggøre anvendelsen af immersionsvæske for det optiske scanningsystem, om nødvendigt.

10 I fig. 2A er strømningskammeret vist omfattende syv kanaler 12. I et sådant tilfælde bæres celler fra hver patient på syv bærere, én per kanal, mens der langs hver kanal er understøttede bærere med celler fra forskellige patienter, som vist i fig. 2D. Et sådant arrangement gør 15 det muligt at stimulere celler fra forskellige patienter med forskellige stimuli via hver kanal enten samtidig eller efter hinanden og derpå prøve eller analysere hver celles respons på den særlige stimulus. Andre udførelsesformer, der skal beskrives, omfatter også flere kanaler.

20 I hver multikanal-udførelsesform er antallet af cellebærende bærere fra hver patient typisk lig med antallet af kanaler. Det vil imidlertid ses af følgende beskrivelse, at opfindelsen ikke er begrænset til flerkanal-arran-gementer. Det har vist sig, at celler efter stimulering 25 med visse stimuli og undersøgelse kan renses og således føres tilbage til deres præ-stimulerede tilstand for at kunne stimuleres senere med en anden stimulans. Om ønsket kan der således anvendes kun en celleunderstøttende bærer per patient. Cellerne på denne bærer kan successivt sti-30 muleres, og efter hver stimulering og analyse kan de renses til næste stimulerings- og analysetrin.

Før andre udførelsesformer for strømningskamre beskrives, er det hensigtsmæssigt at beskrive enkeltheder ved en 35 foretrukken metode og et foretrukkent system til individuel analyse af cellerne, som er anbragt på definerede steder på bæreren og indført i strømningskammeret. Til 15 DK 170721 B1 dette formål henvises igen til SCM-testen beskrevet af L. og B. Cercek et al. i de nævnte publikationer. Ifølge L. og B. Cercek er der mindst to karakteristiske egenskaber for en undergruppe af lymfocyter, som er egnede til SCM-5 testen. Kendskab til det specifikke antigen forårsager, at en lymfocyt passerer fra en hviletilstand til en stimuleret tilstand. Når fluorescinmolekyler indlejres i lymfocyterne ved at anvende et velkendt fænomen, der kaldes fluorochromasi, resulterer overføringen fra hvilefa-10 sen til den stimulerede fase i kritiske ændringer i polarisationen af fluorescensen af fluoresceinet i lymfocyterne. Lymfocyterne, hvori stimuleringsprocedurer kan fremkalde sådanne kritiske ændringer, afviger ved i det mindste to egenskaber fra de øvrige lymfocyter. Den spe-15 cifikke massefylde og den kendsgerning, at for disse celler observeres en forholdsvis høj (kontrol) værdi for fluorescenspolarisering kun for et meget snævert bånd af emissionsspektret omkring 510 nm.

20 Denne anden egenskab drager man fordel af til at markere eller identificere de rigtige lymfocyter blandt hele populationen af lymfocyter og således undgå behovet for fysisk adskillelse. Det er således den gruppe af lymfocyter, som udviser denne særlige spektrale opførsel, på 25 hvilken alle yderligere stimulationsvirkninger derefter undersøges, mens alle andre lymfocyter fremover negligeres.

Sagt på en anden måde, ifølge opfindelsen bliver bæreren 30 først anvendt til at adskille lymfocyterne i en persons bloddråbe fra andre celletyper ved hjælp af størrelsen af hullerne i bæreren. Hullerne fyldes i alt væsentligt med lymfocyter, en celle per hul. Mindre celler passerer gennem hullerne, og større celler vaskes af bærerens øvre 35 overflade. Derefter skylles lymfocyterne på bæreren med fluoresceindiacetat· og phosphatpufret saltvandsopløsning (FDA + PBS), som ved fluorochromasi omdannes til fluore- 16 DK 170721 B1 scln inde i cellerne. Derpå måles og optegnes fluorescenspolarisering i et snævert bånd af emissionsspektret rundt om 510 nm fra hver celle. Kun de lymfocytceller, der hver især udviser en forholdsvis høj fluorescens-5 polarisationsværdi, der kan defineres som P, betragtes som hørende til den særlige undergruppe af interesse. Da adressen for hver celle på bærerhularrangementet er kendt, er adressen for hver celle i undergruppen kendt.

Når således cellerne tilhørende undergruppen en gang er 10 kendt, bliver alle følgende målinger og/eller observationer, som udføres, kun udført på cellerne i undergruppen, mens alle de andre lymfocytceller på bæreren, som ikke tilhører undergruppen, kan ignoreres, således at der hverken udføres målinger eller observationer på dem. Be-15 grænsningen af efterfølgende målinger eller observationer til blot at angå cellerne i undergruppen nedsætter i høj grad analysetiden, hvilket er af stor betydning. Endvidere, og muligvis vigtigere, kan cellens enestående respons på hver stimulans optegnes til opnåelse af enestå-20 ende information, da adressen for hver celle er kendt, hvilket hidtil har været uopnåeligt på grund af den kendsgerning, at målinger og observationer blev foretaget på portioner af celler eller ved brug af strømningssystemer. Selv når en særlig celle blev observeret under mi-25 kroskop, kunne man ikke derefter stimulere den med en anden stimulans og observere cellens respons derpå. Dette skyldes den kendsgerning, at hidtil var individuelle celler ikke placeret i en fast orden med adressen for hver celle velkendt, så at måle- og/eller observationsinstru-30 menteringen kunne rettes på den samme adresse igen for at observere den samme celle. ‘

Et egnet kriterium kan bestemmes for minimumforholdet ? mellem polarisationer målt med to fluorescens-emissions-35 bølgelængder, nemlig 510 nm og 515 nm. Derfor identificeres som et første trin cellerne for den kritiske undergruppe af lymfocyter ved at afprøve dette kriterium for 17 DK 170721 B1 hver enkelt celle på bæreren. Efter overføring til et stimuleringsstadium falder polarisationsgraden for de stimulerede medlemmer af nævnte undergruppe til en værdi på ca. 0,14 for emissionsbølgelængden på 510 nm. Denne 5 ændring af polarisationsgraden undersøges kun for de identificerede celler i undergruppen.

Et system til udførelse af disse forsøg for hver celle på bæreren vil nu blive beskrevet i forbindelse med fig. 4.

10 Cellerne på bæreren 1 skylles først typisk med en opløsning af phosphatpufret saltvand (PBS) og fluorescein-diacetat (FDA). Sidstnævnte overføres på grund af fluoro-chromasifænomenet inde i hver lymfocytcelle til fluorescein. Derpå anslås fluoresceinet ved bestråling ved en 15 bølgelængde på 470 nm, hvorpå det udsender sit karakteristiske emissionsspektrum. Bestemmelsen af, hvilke af lymfocytcellerne på bæreren, der fører til undergruppen af interesse, foretages ved trinvis scanning af hver enkelt celle på bæreren ved hjælp af den optiske analysator 20 20, der er vist i fig. 4.

Den omfatter en zirconiumlampe (eller laser) 21, der tjener som lyskilde med top ved 470,1 nm og 468 nm, hvorved man fjerner behovet for et excitationsfilter til filtre-25 ring af lys i området af interesse, dvs. 510 nm og 515 nm. Lyset er planpolariseret vinkelret på planet for fig.

4 ved en polarisator 22, efter passage af en fokuserende linse 21A. Planpolarisationen vises ved de små cirkler. Strålen af planpolariseret lys strejfer et spejl 23, der 30 virker som strålespalter derved, at det transmitterer lys på h > 500 nm og reflekterer lys under denne bølgelængde. Således reflekteres lyset fra kilde 21 til bæreren 1, gennem en linse 24.

35 Den fluorescens, der udsendes af hver celle på bæreren, måles separat og optegnes. Fluorescensen fra en celle passerer gennem et spejl 23 og en linse 24A til en Glenn- 18 DK 170721 B1

Thompson polarisator 25. Grundlæggende deler polarisator 25 fluorescensen 1 to dele: for det første polariserede stråler parallelle med papirets plan (angivet ved stiplede linier på fig. 4), som strækker sig i den oprinde-5 lige indfaldsretning, og for det andet polariserede stråler vinkelret på papirets plan (angivet ved cirklerne i fig. 4), som afbøjes vinkelret på indfaldsretningen.

Hver af de polariserede stråler deles i to ens og på hinanden vinkelrette stråler af en stråleopspalter (26, 10 27). Hver af disse fire nydannede stråler passerer gennem et inteferensfilter ved 510 nm eller 515 nm (28, 29, 28', 29'), og deres intensiteter måles samtidig af lysforstærkerrør (30, 31).

15 Disse fire målte intensiteter opbevares i et computersystem som det på fig. 16 viste, og polarisationsgraden for hver bølgelængde, dvs. λ - 510 nm og λ = 515 nm beregnes. Polarisationsgraden er defineret som 20 P * (I - I )/(1 + I )

Efter beregning af ?51q og beregnes deres forhold, dvs. P5iq/P515' åer repræsenterer kontrolværdien, i virkelig tid. Adressen for hver celle i henseende til X- og 25 Y-koordinater er kendt og opbevares sammen med kontrolværdien. Efter undersøgelse af alle cellerne og bestemmelse af deres kontrolværdi og opbevarede værdier er det enkelt af bestemme de celler, der har en kontrolværdi større end 1,05. Det er disse celler, der hører til un-30 dergruppen af interesse. Når denne bestemmelse er foretaget, bliver alle følgende målinger eller observationer af cellernes respons på forskellige stimulerende midler kun udført på cellerne i undergruppen, og alle andre cel- t ler ignoreres. F.eks. undersøges kun cellerne i under-35 gruppen til bestemmelse af, hvilke af dem der udviser en ændring i polarisationsgraden, som er tilstrækkelig til at identificere dem som aktive og således i stand til at 19 DK 170721 B1 identificere et specielt antigen.

Det vil ses, at til at afprøve hver celle for sig må den optiske analysator 20 (fig. 4) have en optisk opløsning i 5 størrelsesordenen en cellediameter, hvilket er opnåeligt med et mikroskopobjektiv. Bæreren med cellerne forskydes trinvist under mikroskopet fra en perforering til naboperforeringen. Et præcist mekanisk flyttesystem som beskrevet i fig. 16 er således nødvendigt.

10 I en anden udførelsesform for den optiske analysator undgås behovet for trinvis at forskyde cellebæreren ved at anvende en laser som excitations-lyskilde. På fig. 5 er denne udførelsesform vist skematisk. En laserstråle 131 15 med passende bølgelængde passerer gennem et kontrolleret afbøjende optisk element, såsom f.eks. et roterende spejl 130. Laserstrålen 131 har et tværsnit, der i alt væsentligt svarer til størrelsen af en celle. Ved hjælp af det afbøjende element 130 scanner strålen 131 cellerne i hul-20 lerne sekventielt, hvorved hver celle anslås, den ene efter den anden. På et givet tidspunkt rammes kun én celle af laserstrålen, og derfor udsender kun denne celle fluorescenslys i det øjeblik. Den optiske analysator 131X, anbragt på den anden side af bæreren, har et syns-25 felt, der dækker hele overfladen af bæreren 1. I det øjeblik et emissionssignal modtages, korreleres intensiteten af dette signal med positionen af den scannende laserstråle 131, hvorved hvert modtaget og analyseret lyssignal korreleres med beliggenheden af den pågældende celle, 30 hvorfra det er blevet emitteret. Det vil ses af fig. 5, at anslåningen sker fra den store side af hullerne 2 i bæreren 1. Til den optiske analyse derimod anvendes fore-trukkent emissionslys, der forlader hvert hul gennem den snævre ende, hvilket skyldes årsager, der vil blive for-35 klaret i det følgende.

20 DK 170721 B1

Efter forklaring af foretrukne analysesystemer, hvormed opfindelsen anvendes, vil det forstås, at tilsvarende systemer til måling af andre parametre kan anvendes, forudsat at det er muligt at fokusere på hver enkelt celle på 5 bæreren. Eksempler på målelige parametre omfatter lysintensitet, optisk massefylde, refraktionsindeks, elektromagnetiske egenskaber, absorption og spredning. Endvidere er scanningsproceduren ikke begrænset til stråler, såsom synligt lys, ultraviolet eller infrarødt lys og elektron-10 optiske systemer, men kan også omfatte afprøvning via fysisk kontakt ved hver celle. Andre eksempler på målelige eller observerbare egenskaber omfatter kernemagnetisk resonans (NMR), pH-værdi såvel som cellemorfologi og ændringer af denne som respons på forskellige stimuli.

15 F.eks. kan man rette udgangen fra et mikroskop, som er rettet mod en vilkårlig celle, mod en mønsterrecorder til optagelse af et todimensionalt signal af cellens mønster. Celletemperaturmålinger og/eller målinger af temperaturændringer kan foretages og optegnes eller oplagres. Sam-20 menfattende kan en eller flere målelige eller observerbare egenskaber for en celle bestemmes på celle-for-celle-basis. Da adressen for hver celle er kendt, kan man altid vende tilbage til samme celle for yderligere målinger og observationer. Alle målinger og observationer 25 for hver celle kan registreres til opnåelse af unik information for hver enkelt celle. Denne information kan korreleres til opnåelse af indsigt og diagnose, der hidtil ikke har været mulig.

30 En udførelsesform for opfindelsen til praktisk anvendelse vil nu blive forklaret i forbindelse med fig. 6A til 6C, der viser en modificeret holder 40 til flere cellebærere 1. Holderen 40 er bølgeformet for at muliggøre, at dens trug 41 kan neddykkes i de opløsninger, der flyder gennem 35 kanalerne 12 på et højere niveau. De cellebærere, der er monteret på bunden af trugene 41, kan befugtes for at skylle eller på anden måde stimulere cellerne både oppe 21 DK 170721 B1 fra og nede fra. Derfor er der i denne udførelsesform ikke behov for strømningsledere som tidligere forklaret i forbindelse med fig. 2A og 3B. Som det er blevet beskrevet i forbindelse med fig. 2A-2D hører de celle-5 bærere, der er anbragt på samme trug 41, til forskellige patienter. På trods af dette er der ingen fare for nogen blandet lymfocytstimuleringsvirkning, fordi der ikke er nogen fysisk forbindelse mellem bærere. Selv hvis en celle skulle løsrive sig fra en bærer, er sandsynligheden 10 for, at den bliver skyllet væk meget større end for, at den anbringer sig på en anden bærer. I fig. 6A er bærere vist i kun et trug. I praksis forefindes der imidlertid en bærer for hver patient i hvert trug.

15 I fig. 6C er bæreren 1 vist som værende fjernelig fra holder 40. For at definere dens hulordning i henseende til X og Y, har den imidlertid ører 8, der kan anbringes i udskæringer 9.

20 Da cellebærerne 1 i den omhandlede udførelsesform neddyk-kes i opløsningen, som strømmer gennem hver kanal 12, er mikroskopet i det optiske system til cellescanning udstyret med en kvartsmanchet 42 (fig. 6B) på objektivcylinderen. Kanalerne 12 og trugene 41 har dimensioner, som 25 muliggør relativ bevægelse af objektivet og bærerne efter behov til scanning af hele overfladen for hver bærer.

Som indikeret i det foregående forsynes kanalerne først med en PBS + FDA opløsning under kontrolmålingskredsløbet 30 til udvælgelse af undergruppecellerne baseret på ovennævnte kontrolværdi til identificering af de rigtige celler på hver bærer hørende til undergruppen. For derefter at bestemme reaktionen af de valgte celler på forskellige stimuleringsmidler tilføres hver kanal forskellige stimu-35 leringsmidler, f.eks. fytohæmagglutinin (PHA), encepha-litogenisk faktor (EF), cancerbasisprotein (CaBP), tumorekstrakter eller et andet ønsket mitogen eller antigen.

22 DK 170721 B1 »

Derpå undersøges og registreres reaktionerne for kun de valgte celler.

For de i det foregående nævnte stimulatorer har det vist 5 sig, at stimulering af celler med en stimulator ikke påvirker en efterfølgende stimulering, hvis stimulatoren skylles af og/eller neutraliseres før næste stimuleringsforsøg, for at undgå en direkte interaktion eller konkurrerende virkning mellem dem. Endvidere har det vist sig, 10 at binding af cellerne til bæreren ikke har nogen virkning på deres aktivering. Som følge deraf kan stimuleringsprocedurerne gentages på samme celle på samme sted på bæreren, og det med forskellige aktiveringsmidler. Således kan en eksakt profil af hver enkelt undergruppe-15 celles respons på aktivering opnås som en funktion af tid, og det er derfor nu muligt at kende det nøjagtige antal og responset af de aktiverede celler samt deres pladser på matrix, som forbliver den samme under og efter de i det foregående beskrevne måleforløb.

20

De fleste bærerholdersysterner, beskrevet i det foregående, var beregnet til topscanning, dvs. til analysering af det emitterede fluorescerende lys fra den store overside af hullerne i bæreren, hvilket muliggør anvendelsen af 25 samme optiske systemer til optisk undersøgelse og analyse af cellerne. I de alternative udførelsesformer, som beskrives i det følgende, er den optiske analysator anord-net til at modtage emissionslyset, der passerer gennem den snævre side eller bunden af hullerne 2. Således kan 30 man undgå forstyrrende virkninger forårsaget af lysemission fra fluorescein, som trænger ud af cellerne og er til stede i omgivelserne. Det lys, der emitteres af det omgivende fluorescein, repræsenterer en uønsket optisk baggrund. Når man ser på cellerne fra de snævre sider el-35 ler bunden af hullerne, muliggøres reduktionen af denne baggrund væsentligt, da den indsnævrende konus virker som et skjold mod uønsket emissionslys. I tilfælde af, at an- 23 DK 170721 B1 slået lys går ind i hullerne gennem deres store åbninger eller toppen, kan der endvidere forekomme reflektioner ved de koniske vægge, hvorved indfaldende lys såvel som fluorescerende lys reflekteres tilbage. En anden fordel-5 agtig virkning, der forårsages ved at udøve den optiske analyse på den nævnte måde, er, at ved hvert sted på bæreren udtages kun emissionslyset fra den celle, der er indeholdt i det pågældende hul, hvorimod andre celler, som i undtagelsestilfælde kan være til stede på overfla-10 den af bæreren, ikke påvirker måleresultaterne. Endnu en fordel ligger i den kendsgerning, at på grund af den mindre størrelse af åbningerne er det meget lettere at udføre analyse af emissionslys for hver celle separat uden fare for krydsning mellem naboceller, hvis ind-15 stillingsmekanismen for det optiske system i forhold til hullerne ikke er yderst præcis.

Ved hjælp af fig. 7A, 7B, 8 og 9 er forskellige udførelsesformer vist, som gør det muligt at udføre den op-20 tiske analyse som forklaret i det foregående. I en første udførelsesform til anvendelse med en optisk mikroskopanalysator (fig. 7A og 7B) omfatter bundvæggen 110 af strømningskammeret elastiske (gummi) glasholdere 111, der hver bærer en glasplade 112, der er indstillet i forhold til 25 en ovenfor anbragt cellebærer 1. Den elastiske glasholder 111 giver en væsketæt forsegling mellem glaspladen 112 og bundvæggen 110 for strømningskammeret og gør det muligt for objektivet 113 i mikroskopet at kunne bevæges nær nok til cellebæreren 1 til scanning af dens individuelle ste-30 der eller huller nedefra (fig. 7B). Hvis objektivet 113 i mikroskopet er i sin ydre stilling, åbnes kanalen i strømningskammeret til sin begyndelsesbredde. I en modifikation (fig. 8) for denne udførelsesform er bunden og sidevæggene af strømningskammeret lavet ud i et af gummi.

I en anden udførelsesform (fig. 9) foretages den optiske analyse fra oversiden. Holderen 114 til cellebærerne 1 35 24 DK 170721 B1 anbringes imidlertid omvendt på bunddelen 115 af strøm-ningskammeret, efter at det er blevet udstyret med celler i en speciel enhed (som vil blive beskrevet i forbindelse med fig. 12A og 12B), så at de koniske huller i bærerne 1 5 udvider sig nedad. For at holde cellerne på plads og til effektivt at binde dem til bæreren påføres en trykforskel mellem bunddelen 115 (fig. 9) og en øvre del 116 af strømningskammeret, . idet væsken i bunddelen 115 har et lidt højere tryk end i den øvre del 116. Forseglingsfrem-10 spring 117 forhindrer de to dele af strømningskammeret i at lække. Under anvendelse af denne udførelsesform kan den optiske analysator vist på fig. 4 anvendes til scanning af cellerne på bærere 1 uden at give afkald på de ovenfor anførte fordele.

15

Idet der nu vendes tilbage til problemet med at forsyne cellebærerne med celler af en vis ønsket population eller gruppe, hvilket i princippet kunne foretages på i alt væsentligt konventionel måde som beskrevet i det foregåen-20 de, viser fig. 6, 7A og 7B et system til samtidig adskillelse af cellepopulationen fra andre cellegrupper bortset fra ved de konventionelle ufordelagtige metoder til celleadskillelse. Den foreliggende udførelsesform er også beskrevet med hensyn til adskillelse af lymfocyter fra 25 andre blodceller til anvendelse i de i det foregående beskrevne SCM-forsøg.

Som det vil ses på fig. 10 og fig. 11 hviler holderen 50, som kan indsættes i strømningskammeret i fig. 6A, på et 30 arrangement af rør 51, der hver er underopdelt i længden i en øvre del 53 og en nedre del 52. Den nedre del danner en fluidumleder (for luft eller væske) med lavere tryk til dræning af væsker og urene blodceller fra den øvre del 53. Den øvre del omfatter broer 54, hvorunder der er 35 dræningshuller 55, og mellem hvilke der er sugehuller 56 på linie med bærerne 1 på holderen 50. I fig. 10 er der vist bærere til at bære celler fra kun en patient. Den 25 DK 170721 B1 • øvre og den nedre del 53 og 52 tilføres en væske, f.eks. PBS-opløsning. Som det klart fremgår af tværsnittet på fig. 10 passerer fluidet i den øvre del under broerne 54 og gennem passende slidser 57 i holderen 50. Fluidet i 5 den nedre del tvinges af fremspring 58 til at flyde med en højere hastighed i området ved dræningshullerne 55 og sugehullerne 56, hvorved der dannes et lokalt undertryk i disse huller. Derfor trækkes fluidet, der til at begynde med flyder gennem den øvre del 53, delvis til den nedre 10 del gennem hullerne.

Et blodtilførselselement 60, der kan flyttes på holderen 50, anbringes til tilførsel af blod til bærerne 1. Ben 61 i tilførselselementet 60 forhindrer fluidet i at passere 15 fra en række slidser 57 i holderen 50 til en anden.

Som teoretisk basis for forståelse af celleadskillelsen ved hjælp af ovennævnte enhed skal følgende fakta understreges : 20 a) størrelsen af de lymfocyter, der giver respons, er “ 7 u, b) størrelsen af makrophager, granulocyter er ’ 20 μ 25 - 35 n, c) størrelsen af erythrocyter kan nå 3 u - 5 n, d) der er storé lymfocyter - 15 n, 30 e) størrelsen af blodpladerne - negligerbare, f) celler kan briste, når de efterlades i destilleret vand, 35 g) levetiden for et erythrocyt i destilleret vand er meget mindre end for en lymfocyt.

26 DK 170721 B1

Cellebærerholderen 50 anbringes først på rørarrangementet, således at bærerne i første række (vinkelret på kanalerne) anbringes over hullerne. Tilførselselementet 60 anbringes med benene 61 på hver side af cellebærerne.

5 Hele systemet samles som vist på fig. 11. En sprøjte med helblod fra en patient anbringes i en sprøjteholder 62. I fig. 11 er vist to sådanne holdere til to forskellige patienter. Blodstrømmen i hvert af rørene kontrolleres ved at påføre egnet tryk på sprøjten. Blod når frem til 10 alle udgange af rør PI og P2 (fra to forskellige patienter) efter de første få trykslag.

Ved et vist trin vil et trykslag forårsage, at en bloddråbe falder på hver cellebærer. Størrelsen af hullerne i 15 bæreren vil ikke tillade blodet at passere fra en side af cellebæreren til den anden. Til dette formål dannes et undertryk i den nedre del af adskillelsesrøret, som beskrevet i det foregående, ved at lade PBS løbe gennem denne del af røret. ’Blodet suges straks under bæreren.

20

De mindre celler vil passere gennem bæreren og blive skyllet bort med PBS-strømmen. De med en størrelse svarende til toppen af hullerne i bæreren, f.eks. 7 um, vil standse på bæreren, og de største vil hvile over bæreren.

25 For at undgå blokering af bæreren standses blodtilførslen, og PBS strømmer over den øvre del af matrixen for at bortvaske de større celler. De fleste af dem suges ind i dræningshullerne 55 (fig. 11). En mindre del af cellerne når til den næste bærer (i strømningsretningen) og pas-30 serer ud. Som tidligere pointeret er alle cellebærere placeret vinkelret på udstrækningen af kanalerne fyldt med blod fra én donor. Derfor er der intet problem med blanding af blod fra forskellige donorer.

35 I et næste trin standses den øvre strømning, og en anden bloddråbe tildryppes, og kredsløbet gentages så ofte som nødvendigt. Efter nogle få dråber blod udføres en såkaldt 27 DK 170721 B1 "øvre sprængningsvask". Processen fortsættes, indtil bæreren er tilstrækkeligt fyldt. En grovundersøgelse af dette kan foretages ved at afprøve den elektriske resistens for bæreren efter hver dråbe. Destilleret vand 5 strømmer i et ønsket tidsrum og forårsager, at erytrocy-terne sprænges. Det destillerede vand får cellerne til at svulme eller kvælde, og derfor brister erytrocyterne, mens lymfocyterne styrker deres hold i bærerhullerne. Efter det ønskede tidsrum indføres PBS. De stoffer, der 10 frigøres fra de sprængte erytrocyter, kan ikke påvirke lymfocyterne, da der foregår en permanent strømning af opløsning, der vasker disse stoffer væk. Elektrisk ladning eller genladning af matrix eller påføring eller ophævelse af elektromagnetiske felter er analog med vibre-15 ring af matrixen med ultralyd eller anden teknik, som også kan anvendes. Denne procedure kan udvides med og kor-releres med vasketrin. Mindre end 1 ml blod er nødvendig for hver patient P^ P2 etc.

20 Denne adskillelsesproces varer højst ca. 5 minutter. Der er ingen grænse for antallet af blodprøver, fra hvilke celler kan adskilles samtidigt. Holderen 50 fjernes derpå fra adskillelsessystemet og indsættes i strømningskammeret i fig. 4 til optisk scanningsoperation som beskrevet 25 i det foregående.

Et lignende adskillelsessystem, men tilpasset holderen 114 i fig. 9 vil blive forklaret ved hjælp af fig. 12A og 12B. En basisplade 120 er forsynet med kanaler 121 til 30 fluidumstrømning, hvilket forårsager lokalt undertryk i området under bærerne 1 og dræningshullerne 55. Dertil er der dannet fremspring 122 på basis af kanalerne 121. Holderen 114 er bevægeligt anbragt på basispladen 120, så dens bærere 1 bringes på linie med fremspringene 122, som 35 det vil ses på fig. 12B, således at deres koniske huller åbner opad, dvs. mod et overliggende fjerneligt tilførselselement 123, som i funktion svarer til tilførsels- 28 DK 170721 B1 elementet 60 på fig. 10. Tilførselselementet 123 kan tilføre cellebærerne celler blot ved påvirkning af tryk som forklaret i forbindelse med fig. 10. Det er imidlertid muligt at forøge effektiviteten for blodtilførslen ved at 5 tilvejebringe udstrygningselementer, som kan forskydes i forhold til bærerne som vist på fig. 13A, 13B, 13C og 14.

På fig. 13A, 13B og 13C er vist en udførelsesform, der har glideplader 124, der strækker i tilførselselementet på linie med kanalerne 121.

10

Ved hver udgang for en tilførselsledning er der anbragt et elastisk udstrygningselement 125, hvilket kan ses på fig. 13B og 13C. På* fig. 13B er vist et tværsnit af ud-strygningselementet 125, vinkelret på retningen af en 15 glideplade 124, hvorimod fig. 13C viser et tværsnit langs udstrækningen af pladen 124. Bredden af det elastiske udstrygningselement 125 svarer i alt væsentligt til sidelængden af en bærer, og det danner en lille udgang til lineær fejning over bæreroverfladen, når man bevæger 20 glidepladen 124, så at hver bærer overtrækkes med et tyndt lag celler. Derefter foretages de i det foregående beskrevne vasketrin.

På fig. 14 er der vist en anden udførelsesform for ud-25 strygningselementet i tværsnit, vinkelret på en kanal 121. I en drejelig stang 126, der strækker sig langs hver kanal 121 er dannet en blodledning 127, som ved hver bærer 1 er udstyret' med en udgang, der har en fordelerbørste 128. Ved tilførsel af blod til bæreren drejes den 30 drejelige stang 126 flere gange, hvorved cellerne børstes ned på bæreren 1.

Mens der i den ovennævnte udførelsesform foretages blodtilførsel og "grov" adskillelse ved hjælp af en speciel 35 adskillelsesenhed, hvorefter holderne 40, 50 og 114, må placeres på et strømningskammer til optisk scanning, kan det i nogle tilfælde være ønskeligt at undgå dette trin.

29 DK 170721 B1 I en yderligere udførelsesform for opfindelsen, som er vist på fig. 15A og 15B, er celleadskillelsen og den optiske scanningsoperation derfor kombineret i et apparat.

5 Et bærersystem 70 er forsynet med overfladekanaler 71, 72, der strækker sig transversalt i forhold til hinanden, og indre ledninger 73, 74, der også strækker sig transversalt til hinanden. Ved hver samling i bærer 1 er der på en roterbar holder 75, som er vist i snit på fig. 15B.

10 På holderens basis er dannet et tandhjul 76, der arbejder sammen med en tandstang 77, der strækker gennem bærerorganet 70. En tandstang driver alle holderne 75 i den pågældende kolonne. Lineær bevægelse af denne tandstang forårsager rotation af holderne 75. Retningen for indfø-15 ring af blod til grovadskillelse, dvs. til adskillelse af lymfocytgruppen fra andre blodceller, er vinkelret på det plan, i hvilket cellebæreren scannes under mikroskopet. Efter adskillelsen af lymfocyterne fra de andre blodceller roteres holderne 75 således 90° til scanningsopera-20 tionen.

For at muliggøre teknikken "transmitteret lys” (måling af lys som kommer ud fra bundenden af et hul) i ovennævnte udførelsesform er den del af kanalen, som krydser hol-25 deren 75 under cellebærerne, et rør af glas 78, som er delt i længderetningen. Dette rør er anbragt, så dets åbne side er rettet mod bæreren (fig. 15B). På denne måde gøres vandret væskestrømning gennem holderen mulig, mens lys samtidig transmitteres i lodret retning. Undertrykket 30 i systemet opnås ved at fremstille de indre ledninger 73, 74 lukkede og tyndere, mens de øvre kanaler 71, 72 er bredere og åbne. Den samme virkning kan opnås ved andre teknikker, såsom forøgelse af strømningshastigheden i de indre ledninger i forhold til hastigheden i de øvre ka-35 naler.

30 DK 170721 B1

Proceduren kan opsummeres som følger: Ved hjælp af en 0 -90° kontrol bestemtes stillingen af holderne 75. I et første trin, hvor der udføres "grov adskillelse", er kanalerne 71 og ledningerne 73 i drift. Efter fuldendelse 5 af dette trin roteres holderne 75 90°. Således blokeres eller lukkes kanalerne 71 og ledningerne 73, og kanalerne 72 og ledningerne 74 åbnes.

I denne udførelsesform kan et blodtildrypningshoved knyt-10 tes til scannerhovedet, f.eks. et mikroskop. Som respons på kommandosignaler fra en kontrol, f.eks. en computer, foretages adskillelsen af den optiske scanning derefter automatisk og uden behov for udlært personale. Operatøren behøver kun anbringe sprøjterne som vist på fig. 6 og at 15 udskifte holderne 75 efter fuldendelse af forsøgene.

På fig. 16, hvortil der henvises, er vist et totalsystem for celleadskillelse, scanning og analyse (diagnose). Et strømningskammer 81, som beskrevet i det foregående, er 20 anbragt på et bord 82, som kan bevæges i 3 akser X, Y og Z ved hjælp af respektive computerkontrollerede trinmotorer 83, 84, 85. Det optiske system omfatter et mikroskop 86 med en optisk analysator 87 som beskrevet i fig.

4. En anslåningslyskilde 88, f.eks. en zirkoniumlampe, 25 gør brug af samme optiske system i modsat retning. I en opløsningstank 89 opbevares alle de opløsninger, der er nødvendige til celleadskillelse og afprøvning.

Med en opløsningskontrolenhed 90 kontrolleres tilførslen 30 af den respektive opløsning. For at stabilisere fluore-sceinkoncentrationen i cellerne, som kan påvirke de absolutte polarisationsværdier, anvendes en elektro-optisk mekanisk feedback kontrol, hvori intensiteten af fluoro-scensemissionslyset periodisk måles og sammenlignes med 35 en referenceværdi. Enhver afvigelse i den målte værdi fra referenceværdien kan anvendes til at forårsage en ændring i koncentrationen af FDA i PBS-opløsningen. Analysen af 31 DK 170721 B1 den målte værdi kan udføres med ethvert velkendt computersystem. En præcomputer-grænseflade 91 tjener til at transformere de målte værdier til computerlæselig information, som typisk er digital. I en computer 92 udføres 5 de nødvendige beregninger og identifikationstrin, og de opbevares i en hukommelse 93. En postcomputer-kontrol 94 danner kontrolsignalerne for trinmotorerne og opløsningskontrolenheden .

10 Driften af ovennævnte system kan opsummeres som følger: Efter den grove adskillelsesprocedure fastgøres strømningskammeret på bordet 82. Mikroskopet indstilles. Derefter foregår processen automatisk. En PBS + FDA opløsning indføres gennem kanalerne og ledningerne. En del 15 deraf går ind gennem bærerne fra de øvre kanaler til de nedre ledninger, og en del deraf fortsætter med at flyde gennem de øvre kanaler og vasker cellerne bort ovenfra. Efter en valgt pause, f.eks. 20 minutter, begynder scanningen. Polarisationen af hver enkelt celle måles ved de 20 ønskede bølgelængder. Der er ingen fare for, at cellen overeksponeres ved det anslående lys, f.eks. 470 nm, fordi scanning foretages meget hurtigt.

Den optiske information - efter omdannelse til en elek-25 trisk strømimpuls - fødes til computeren, bedømmes og opbevares i hukommelsen. Hver enkelt celle identificeres i hukommelsen efter sine koordinater, dvs. adresse, på bæreren. Fra dette trin vil alt, hvad der kan erfares om hver enkelt celle, *blive opbevaret i computeren knyttet 30 til dens adresse.

Opsamlingen af data kan opsummeres som følger: Kontrolværdierne for celler for alle patienter, hvis bærere er bragt på linie i en kanal, vil først blive bestemt. Derpå 35 vil scanningshovedet blive overført til næste kanal (ved at sænke bordet og bevæge det sidelæns), og det vil blive anvendt til at bestemme kontrolværdierne for alle celler- 32 DK 170721 B1 ne på de bærere, der er bragt på linie i den anden kanal. Samtidig med dataopsamlingen fra den anden kanal vil en stimulerende opløsning blive indført i den første kanal. Efter bestemmelse af datasamlingen fra den anden kanal 5 overføres scanningshovedet til den tredje kanal, og en anden stimulerende opløsning indføres i den anden kanal etc.

Efter dataopsamling fra alle bærerne vil scanningshovedet 10 blive returneret til sin første stilling. Derpå gentages scanningsoperationen på de stimulerede celler. Denne gang vil datasamlingen være selektiv og kun celler, der opfylder det beskrevne optiske kriterium, dvs. de, der tilhører den særlige undergruppe, vil blive genundersøgt. Der-15 for vil den information, der akkumuleres i computeren, være cellebeliggenhed, kontrolværdier, polarisationsværdier efter stimulering med PHA, polarisationsværdier efter stimulering med CaBP, SCM-respons-forhold (se L. Cer-cek et al., i Europ. J. Cancer, bind 17, pp. 167 - 171, 20 1981), polarisationsværdier efter stimulering med speci fikke tumorstimulatorer og lignende.

Skelnen mellem cellebærerne for forskellige patienter kan foretages ved magnetisk eller optisk kodning, som kan 25 fastgøres på holderne under det grove adskillelsestrin.

En magnetisk eller optisk læser kan være knyttet til det optiske scanningshoved, som vil læse patientens kode og overføre den til computeren. Al informationen vedrørende hver patient kan overføres til et forudbestemt sted i 30 computerhukommelsen.

Ved dette system kan det nøjagtige antal aktiverede lymfocyter bestemmes for hvert stimuleringsmiddel. For fagmanden på området muliggør den foreliggende opfindelse * 35 cancerdiagnose på et meget tidligt stadie. Skønt den foreliggende opfindelse primært er blevet beskrevet i forbindelse med cancerdiagnose, er det indlysende, at op- 33 DK 170721 B1 findelsesmetoden og systemet ikke er begrænset dertil. Generelt tilvejebringes en fremgangsmåde og midler til hurtig udførelse af biologiske prøver førende til nye kliniske diagnoser og behandling så vel som nye anvendel-5 ser på området bioteknologi og bioteknik.

Som nævnt i det foregående bliver den nøjagtige position for hver aktiveret celle på en bærer bestemt og lagret.

Det er derfor muligt at isolere en ønsket gruppe eller 10 undergruppe af celler på bæreren ved selektivt at fjerne alle andre celler fra bæreren, så kun undergruppen af celler bliver tilbage derpå, eller ved at frigøre og fjerne kun cellerne fra undergruppen fra bæreren. Dertil kan man gøre brug af det kendte faktum, at celler ikke er 15 elektrisk neutrale, men har elektriske overfladeladninger. Denne kendsgerning kan anvendes i de i det foregående beskrevne udførelsesformer til at binde eller på anden måde fastholde cellerne til bæreren. Den samme virkning kan anvendes til selektiv frigørelse eller fast-20 holdelse af ønskede celler. Dette kan opnås ved en modificeret udførelsesform af cellebæreren ifølge fig. 1A, som nu vil blive forklaret i forbindelse med fig. 17. Den ydre form af bæreren 100 er den samme som vist på fig.

1A. Bæreren 100 er imidlertid udstyret med elektriske le-25 dere 101, der strækker sig mellem hullerne 102 i en netlignende konfiguration og er elektrisk isoleret fra hinanden. Ved periferien af bæreren er lederne forbundet på kendt måde (IC-teknik) til et computerkontrolleret tændarrangement til elektrisk påvirkning af det elek-30 triske potential for hver leder 101. For at fastholde cellerne til bæreren kan alle ledere 101 holdes ved samme potential modsat cellernes ladningspotentiale, hvilket resulterer i en elektrisk tiltrækning af cellerne. Til frigørelse af en vilkårlig celle, f.eks. den i hul A 35 viste på fig. 17, kan nabolederne νχ2, νχ3, Vyl, Vy2 indstilles på et passende potential til at forårsage udsmidning af cellen i hul A fra bæreren.

34 DK 170721 B1

Cellebæreren 100 kan fremstilles ved en multilagsteknik, der er kendt fra IC-produktion. I tilfælde af, at en ionopløsning, såsom PBS, anvendes, skal der iagttages foranstaltninger for at undgå uønskede indflydelser af mulige 5 overfladeladninger på holderen. Til dette formål kan den gives et isolerende overtræk og forsynes med ledende elementer, der ender i kanalen. Dette ville forårsage, at ionerne tiltrækkes og neutraliseres, hvorved man undgår dannelsen af et iondække over holderoverfladen, som kan 10 påvirke bærerens potential. En anden mulighed er at anvende ikke-ioniske organiske opløsninger, såsom et lipid, til påstrygning af bæreren i dette trin af proceduren.

Adskillelsen af særlige celler i overensstemmelse med op-15 findelsen fra alle andre celler er universielt anvendeligt på området klinisk behandling ved produktion af kloner. Kloner kan fremstilles ud fra særlige celler, som blev valgt fra andre celler, i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, baseret på en vilkårligt valgt 20 egenskab. Det er f.eks. velkendt, at legemet af en person, der er angrebet af visse lidelser, f.eks. hudcancer, producerer identificerbare celler, der kan bekæmpe eller dræbe lidelsen. For at opnå et godt resultat må der imidlertid været et stort antal af sådanne celler, i det føl-25 gende betegnet som dræberceller, i legemet. Med den foreliggende opfindelse kan blod, lymfeknuder og forskelligt legemsvæv indeholdende nogle dræberceller anvendes som kilde for sådanne celler. Efter fraskillelse af dem som beskrevet i det foregående fra andre celler kan dræber-30 cellerne mangfoldiggøres ved passende cellevækstteknik og derpå indføres i patienten, hvorfra de oprindelige celler blev modtaget, for at bekæmpe lidelsen. I et sådant tilfælde forventes ingen celleafstødning, da cellerne stam- - mede fra patientens krop. Den foreliggende opfindelse kan 35 således anvendes til at skaffe en persons krop nok celler til at bekæmpe sin egen lidelse.

35 DK 170721 B1

Det skal bemærkes, at hvorimod adskillelsen mellem celler af interesse på bæreren og andre celler hidtil har kunnet udføres ved at frastøde eller fjerne enten cellerne af interesse fra bæreren, så kun de andre celler bliver på 5 den, eller ved at fjerne de celler, der ikke er af interesse, og kun efterlade de udvalgte celler på bæreren, kan man om ønsket bevirke en sådan adskillelse ved f.eks. at dræbe de celler, som ikke er af interesse, mens de er i hullerne i bæreren, så de eneste levende celler, der 10 bliver tilbage på bæreren, er cellerne af interesse. Drab af celler i hullerne, dvs. in situ, kan opnås ved at rette en laserstråle mod hver celle på dens kendte adresse såvel som med tilsvarende eller analoge midler.

En dræbt celle, dvs. en død celle, kan, skønt den er på 15 bæreren, således betragtes som værende adskilt eller fjernet derfra, da den, når først den er dræbt, kan lades ude af betragtning til alle praktiske formål. Som anvendt heri omfatter udtrykket "frastødning" af en celle fjernelse af cellen fra bæreren eller drab deraf in situ.

20

Hvad angår mangfoldiggørelse af celler af interesse, vil det være indlysende; at det kan gøres efter: a) at de celler, der skal mangfoldiggøres, var fjernet 25 fra bæreren bærende levende celler, som ikke var af interesse, b) fjernelse af de celler, som ikke er af interesse, fra bæreren efterfulgt af mangfoldiggørelse af cellerne af 30 interesse til vækstformål og c) drab af de celler, som ikke er af interesse, mens de stadig er i hullerne, og mangfoldiggørelse af cellerne af interesse in situ, dvs. mens de er i hullerne i bæreren.

35

Mens principperne ved opfindelsen er blevet beskrevet i forbindelse med specifikke systemer, anvendelser og meto 36 DK 170721 B1 der, vil det forstås, at beskrivelsen er givet for at forklare og ikke som begrænsning af opfindelsens ramme.

Mange nye anvendelser i biologisk forskningsarbejde, kli-5 nisk behandling og industriel produktion åbnes ved hjælp t af den foreliggende opfindelse. Det er ventet og er fastslået i tilfredsstillende omfang, at der er optiske parametre knyttet til cellernes cycliske fase. Ved hjælp af den foreliggende opfindelse er det muligt at differen-10 tiere en cellepopulation efter cellernes alder, deres cycliske fase og deres iboende funktion og at udføre tilsvarende undersøgelser. En klinisk anvendelse af det ovenfor anførte ligger i tidlig opdagelse af leukæmi, som er karakteriseret ved tilstedeværelsen af et stort antal 15 unge celler af en vis type eller visse typer i blodet og knoglemarven.

En anden klinisk anvendelse er immunoreaktivitetsprøver til udførelse af organtransplantationer. Dertil anvendes 20 et præparat af transplantat som stimulerende middel ved opfindelsen.

Et generelt træk og hovedtræk samt fordel ved opfindelsen er det faktum, at den tid, der kræves til biologiske eks-25 perimenter og forsøg, forkortes væsentligt, da celleidentifikation og afprøvning udføres på en væsentligt kortere tid end ved konventionelle biologiske metoder, hvori naturlige udviklinger ofte må reproduceres under kunstige betingelser, hvilket fører til usikre resultater, der 30 nødvendiggør omfattende statistiske bedømmelser. Opfindelsen reducerer påvirkningerne af omgivelserne, hvilket muliggør numerisk analyse med et minimum af statistik. Tidsbehovet til udførelse af målinger med den foreliggende opfindelse er meget kort absolut set sammenlignet med 35 den kendte teknik, hvorved man reducerer virkningen af ændringer i omgivelsernes betingelser, såsom temperatur, fugtighed etc.

37 DK 170721 B1

Skønt særlige udførelsesformer for opfindelsen er blevet beskrevet og illustreret heri, vil det ses, at modifikationer og variationer let kan forekomme og udføres af fagmanden på området.

5 10 15 « 20 25 30 35 2

Claims (19)

1. System til udvælgelse af særlige biologiske celler fra 5 andre celler og observation og/eller måling af mindst én udvalgt egenskab hos de udvalgte biologiske celler, hvilket system omfatter: mindst én i det væsentlige plan bærer med en forud valgt 10 tykkelse, som definerer øvre og nedre overflader, og som omfatter en ordnet gruppering af huller strækkende sig derigennem, hvilke huller har en forud valgt konfiguration med forud valgte dimensioner ved top- og bundoverfladerne, der defineres som henholdsvis top- og bund-15 dimensioner, kendetegnet ved, at topdimensionen for hvert hul er større end den mindste indre tværsnitsdimension, at bærerens tykkelse og hullernes topdimensioner er af 20 samme størrelsesorden som de udvalgte cellers diametre, og at hvert huls mindste indre tværsnitsdimension er mindre end tværsnitsdimensionen af de udvalgte celler og større end enhver tværsnitsdimension for de ikke-udvalgte celler, som har en mindre tværsnitsdimension end de ud-25 valgte celler, hvorved, når biologiske celler anbringes på den nævnte topoverflade, kun udvalgte celler med en bestemt dimension tilbageholdes med i det væsentlige én celle pr. hul? 30 indretning til understøttelse af ovennævnte bærer, hvorved hvert hul i bæreren er beliggende ved en kendt position, som kan defineres som en adresse, i forhold til nævnte indretning; 35 instrument til observation og/eller måling af mindst én celleegenskab; r DK 170721 B1 styreorgan til styring af den relative bevægelse og operation af nævnte instrument i forhold til nævnte bærer.

2. System ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 5 hullerne er dimensioneret til at tilbageholde lymfocyter, som har en diameter på ca. 7 um, én pr. hul, idet den mindste indre tværsnitsdimension for hvert hul er sådan, at celler med en diameter på 3-5 um kan passere igennem, og idet topdimensionen for hvert hul er sådan, at celler 10 med en diameter større end 10 um i det væsentlige ikke kan komme ind i hullerne.

3. System ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den relative bevægelse og operation af nævnte in- 15 strument i forhold til bæreren kan styres således, at den nøjagtige beliggenhed af hvert hul kan identificeres ved sin position i forhold til koordinater på x- og y-akserne for bæreren (bærerne).

4. System ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at hullerne er anordnet i et gitterlignende mønster ved skæringspunkterne for serier af linjer, som er parallelle med henholdsvis x- og y-aksen for bærerne. 25

5. System ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at instrumentet omfatter en optisk afsøgningsenhed til bestemmelse af optiske egenskaber for enhver af de nævnte celler. 30

6. System ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at indretningen omfatter en anordning til understøttelse af flere bærere.

7. System ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det også omfatter en anden indretning, der selektivt kan placeres i forhold til den første indretning for at mu DK 170721 B1 liggøre, at cellerne på hver af disse i afstand fra hverandre beliggende bærere på samme tid kan stimuleres af et på forhånd valgt stof, såsom ved befugtning gennem enten hullernes top- eller bundende. 5

8. System ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den anden indretning omfatter anordninger til at indeholde forskellige stimulerende stoffer, hvorved cellerne i i det mindste nogle af hullerne i de i afstand fra hver- 10 andre beliggende bærere kan stimuleres samtidigt af de forskellige stimulerende stoffer.

9. System ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at det også omfatter organer 15 til at tiltrække eller frastøde vilkårlige af cellerne til eller fra hullerne, eller til adhæsion eller forøgelse af adhæsionen af celler i hullerne.

10. System ifølge krav 9, kendetegnet ved, at 20 det nævnte organ omfatter elektromagnetiske midler an- ordnet i et forud bestemt mønster i forhold til nævnte huller.

11. System ifølge krav 9 eller 10, kendetegnet 25 ved, at det nævnte organ omfatter midler til frembringelse af en trykforskel over i det mindste en udvalgt del af nævnte bærer(e).

12. Fremgangsmåde til udvælgelse af særlige biologiske 30 celler fra andre celler for at lette observationen og/- eller målingen af mindst én valgt egenskab hos de udvalgte biologiske celler, hvor nævnte udvælgelse og enhver efterfølgende observation og/eller måling udføres ved brug af systemet ifølge et vilkårligt af kravene 1-11, 35 kendetegne.t ved, at DK 170721 B1 (i) den øvre overflade af mindst én i det væsentlige plan bærer i systemet ifølge et vilkårligt af kravene 1-11 i det væsentlige dækkes med celler indbefattende de udvalgte celler af interesse, 5 (ii) den nævnte øvre overflade af bæreren eller bærerne vaskes for at fjerne celler, som ikke er understøttet i hullerne, hvorved kun udvalgte celler med forud valgte dimensioner bibeholdes med i det væsentlige én celle pr. 10 hul, og (iii) elektromagnetiske midler og/eller midler til frembringelse af en trykforskel over i det mindste én valgt del af nævnte bærer(e) anvendes til at tiltrække en ak- 15 tuel celle til et hul og for at fremme fastholdelsen af cellen i hullet eller for at udstøde en anden celle fra hullet.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet 20 ved, at mindst ét stimulerende middel påføres cellerne i hullerne, og resultatet af stimuleringen observeres og/-eller måles, idet det nævnte mindst ét stimulerende middel er valgt blandt fytohæmaglutinin (PHA), concanavalin A (Con A), cancerbasisprotein (CaBP), encefalitogenisk 25 faktor (EF), tumorekstrakter, tumorcellelinjeekstrakter, ekstrakter fra tumorcellelinjesekretion og/eller andre mitogener og antigener.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet 30 ved, at stimulerede celler i hullerne skylles og/eller neutraliseres for at tilbageføre dem til deres oprindelige tilstand.

15. Fremgangsmåde Ifølge krav 14, kendetegnet 35 ved, at der på cellerne, der er ført tilbage til i det væsentlige deres forudgående tilstand, påføres et yderligere og anderledes stimulerende middel valgt blandt DK 170721 B1 gruppen angivet i krav 13, og at resultatet af denne yderligere og anderledes stimulering observeres eller registreres.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 12-15, kendeteg net ved, at der anvendes kendte teknikker på udvalgte celler i hullerne til mangfoldiggørelse af deres antal.

17. Fremgangsmåde til celleformering omfattende udvælgel-10 se af specielle biologiske celler fra andre celler ifølge krav 12, kendetegnet ved, at celler udstødes fra de, der befinder sig i bærerhullerne, og at der derefter anvendes kendte teknikker på disse celler til mangfoldiggørelse af deres antal. 15

18. Fremgangsmåde ifølge krav 12-17, kendetegnet ved, at celler udstødes fra de, som befinder sig i bærerhulrummet, og der derefter anvendes kendte teknikker på disse celler til mangfoldiggørelse af deres antal. 20

19. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at cellemangfoldiggørelsesprocessen observeres i forhold til mindst én celle, som mangfoldiggøres in situ. 25 30 35