JPS5931685A - 細胞を選別するための装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 少なくともひとつの細胞のサブーボビュレーシロン（ｓ
ｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を該細胞のサブーボピュ
レーシ日ンを構成する細胞に共通な限定されたバラメー
ターを用いて選別する際に、判別可能な位置にある個々
の細胞を捕えるための装置および方法に関する。

生物細胞のサブーボビュレーシ日ンを選別分離するため
の装置および方法、たとえば血液細胞に閑するものは公
知である。当該技術に関して、重要と考えられる方法を
要約して以下に述べる。

細胞の接着性に基づく分離方法：該方法は、膜の性質が
同等である異なる細胞、たとえばガラスに接着性を有す
る種々の細胞を分離するには充分とはいえず、また適当
でない。

免疫螢光　（　ｒ１画皿ｏｆｌｕｏｒｏｓｏｅｎｏｅ）
分離法；該方法抗体に対して結合するという公知の性質
に基づくものである。抗原および（または）抗体が後期
に細胞に結合するということは細胞の確認に使用しうる
。しかしながら、該方法は細胞の生物活性の測定または
結合した物質に対する反応に基づいて細胞を分離する手
段が利用できないので非常に限定された方法である。

電気泳動法：該方法は細胞の電荷によって細胞を分離す
る方法である。したがって、同一の電荷または質量を有
する異なる細胞群を分離することができない。

ラジオイムノアッセイ（ｒａｄｉｏ　ｉｍｍｕｎｏａｓ
ｓａｙ）を含むラジオアッセイ（ｒａｄｉｏ　ａａａ＆
３ｒ）　、ラジオインコーボレーシ日ンアツセイ（ｒａ
ｄｉｏ　１ｎｏｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ａｓａａｙ）　
、ラジオエンザイモロジカルアツセイ（ｒａｄｉｏ　ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｉｏａｌ　ａｓｓａｙ）；該方法にお
いては、細胞のグループをお互いに分離したり、ある細
胞グループ内におけるその活性または歪活性、反応に基
づいてサブグループを区別したりすることができない。

形態学的方法：該方法は細胞の物質的形状に基づいて細
胞を区別する方法であり、時間的には速いが、非常に粗
い方法である。

固有密度（グラジェント手段）による細胞分離法Ｉにに
方法においては、細胞が既知の密度、浸透圧および粘度
の等張溶液上を流れる。該空間は一定のｉｌ！！度およ
び加速度で遠心して加速度を、＃ｊλられる。それによ
って溶液よりも重い特ｚ訂の重さ４−有する細胞が沈み
、溶液の固有密度を有−′る細胞は溶液中に懸濁され、
また溶液よりも小さい固有密度を有する細胞は溶液の上
を流れる。該方法の主たる問題点は密度勾配（ｄｅｎｓ
ｌ、ｔｙ　ｇｒａｄｉｅηｔ）中に細胞が区分けされる
ことであり、周囲の条件、たとえば温度、浸透圧、加速
度１（どによって影響され、血液とグラジェントの界面
の回転軸からの距離によっても影響をうける。

値上のごとき種々の先行技術の欠点に加えて、値上のす
べての方法に共通した欠点として、分離された細胞がほ
とんど常に元の細胞グループまたはサブグループ以外に
属する細胞を含んでいるという事実がある。それゆえ、
すべての行程を最大の慎重さをもって行なったとしても
、該方法によって分離された細胞を用いて行なう診断は
必然的に粗雑なものとなってしまう。

たとえばエル・ケルセック（Ｌ−Ｏｅｒｏａｋ）らはＢ
ｉｏｐｈｙａ、、Ｔ、、２６巻１号、３９５頁（１９７
Ｂ）の中でＳＯＭ−テスト（細胞質基質の構造（Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅｈｅｓｓ　ｏｆ　０ｙｔｏｐｌａｓｔｉｃ
　１ｌｌａｔｒｉｘ）について述べている。該文献にお
いて、著者らは値上のグラジェント法によると非常に注
意して操作を行なったとしても分離された細胞が目的と
しない細胞を約５０％含んでしまうことを認ら選別し、
さらに選別された細胞を互いに分離するための装置およ
び方法を提供することにある。選別され、分離された各
々の細胞は正確な判別可能な位置に存在する。選別され
た細胞はすべて一般的なテストニ供すことができ、個々
の細胞に対する影響も定量可能であり、そのためより精
密な診断を行なうことが可能である。

各々の細胞に関してのテストおよび影響はテスト時間を
短縮し、比較的熟練していない者によって行なわれるば
あいの危険を減少させるために自動で行なわれる。

ある特電の細胞グループを他の細胞から完全に分離する
ことが不可能なげあい診断の精度に重大な影−が及ぶ。

さらに非常に重要なこととしては、叙」−の先行技術の
方法においては、細胞の分１Ｉ１１および引ぎ続いて行
なわれる細胞についての種々のテストがミクロの基準、
たとえば選別された細胞を互いに分離し、えられた個々
の細胞を削屑にテストする方法よりもマクロもしくはバ
ッチの基準で行なわれるということがある。選別したい
細胞を他の細胞から選別し、さらに選別された細胞を互
いに分離し、それによって個々の細胞を別々にテストお
よび（または）検査するための装置および方法は、種々
の生物学的症状の診断あるいは他の目的にとって非常に
重要なものとなる。選別された個々の細胞をテストし検
査することで、不正確な統ｉｔ的基準に基づいている現
状の多くの診断でみられる誤りをなくすことができるの
である。

本発明によれば、値上の目的はつぎに示す行程を含む方
法によって達成されつる。すなわち、多くの細胞グルー
プから予め選ばれた性質を有する多数の細胞を分離する
行程および限走された位置に存在する多数の分離された
細胞の個々の細胞を維持する行程からなる。

本発明の方法はさらにつぎに示すひとつまたはそれ以上
の行程を含むものであってもよい。

すなわち、 選別されたすべての細胞を特別なテストに供し、その結
果どの細胞が特有の性質を示すかを決定する、たとえば
選別されたサブグループを代表する細胞を決定する行程
、 サブグループにおける個々の細胞の位置を記録する行程
、 すべての細胞を１または２以上のテストに供し、各テス
トの終わりに記録された位置に存在する各細胞の性質を
検査する行程、 サブグループに属さない細胞を分離する行程などがあげ
られる。

本発明によれば、本発明の新規な装置は細胞を受けとる
孔の配列（ａｒｒａｙ）を有する細胞担体（０θ１１．
　ｏａｒｒｌｅｒ）を含み、該担体において各々の孔の
配列中の位置またはアドレスは固定されており判別可能
である。また孔は担体の上表部から間隔をあげた下表部
へのびており、細胞のバツチカ月１１体の上表部を通り
過ぎる際に予め選ばれた細胞のみがその細胞に特有の大
きさに基づいて孔の中に入りこんで孔の中に保持される
ように予め選ばれた形状（ｏｏｎｎｇｕｒａｔｌｏｎ）
を有している。

したがって選ばれた細胞よりも小さい細胞は相体の孔を
通り抜けるが、選ばれた細胞よりもはるかに大きい細胞
は孔に入りこめない。ひとたび相体が洗浄されると、選
ばれた細胞のみが孔にとどまり、固定されたアドレスの
ひとつの孔にひとつの細胞が存在することになる。

相体の孔の中の細胞はついで生物学的テストに供され、
その特有の性質を細胞１個ずつに基づいて測定し、その
特有の性質および測定されたパラメーターに基づいてど
の細胞が特定のサブグループに属しているのかを決定す
る。細胞のサブグループがｗＡ詔されたら、個々の細胞
は判別可能なアドレスに存在するのだからサブグループ
のすべての細胞のアドレスがわかる。したがって、すべ
ての細胞を１または２以上のテストに供すことができる
が、特別な測定および（または）診断装置を細胞の個有
のアドレスに用いるばあいはサブグループ中の個々の細
胞の性質しか検査できない。

つぎに図面によって本発明をさらに詳しく説明する。

第１Ａ〜１０図は本発明の細胞担体の一部施態様の概略
見取図および一部切裂断面図；第２Ａ〜２Ｄ図は細胞担
体が複数個あるばあいにサイクルを測定するためのマル
チプル細胞相体ホルダーの一部篇態様の概略見取図；第
３人および６Ｂ図は第２Ａ〜２Ｄ図のホルダーの概略拡
大断面図；第４図は細胞ｉ１Ｊ体に含まれる細胞集団を
個々にスキャニング（ａｏａｒ＋ｎｉｎｇ）するための
光学分析器の一部施態様の概略図；第５図は光学分析器
のいまひとつの一部施態様の概略図：第６Ａ〜６０図は
第６図のホルダーの改造型のホルダーの概略見取図お略
断面図：第８し１ｃ１第１図の７０−チャンバーの改造
型の一部ｍ態様の概略断面図；第９図は分析Ｍ　Ｉｆの
ホルダーおよびフルーチャンバーの一部施態様の概略図
１第１０図は細胞担体に細胞を供給するために第６図の
ホルダーを受けとめるように適応された分１１１６ユニ
ツトの概略図：第１１図は第１０図の分離ユニットの概
略断面図；第１２Ａ図および第１２Ｂ図は細胞担体に細
胞を供給するために第９図のホルダーを受けとめるよう
に適応された分離ユニットの概略図；第１３Ａ〜１３０
図は第１２図の分離ユニットとともに使用できるように
適応された血液供給単位の概略図および概略断面図１１
１４図は＠１２図の分離ユニットとともに使用できるよ
うに適応された血液供給単位のいまひとつの実施態様の
概略断面図；第１５Ａ図および第１５Ｂ図は分離および
測定行程が組合されてなる臨床用のマルチ−担体装置の
一部施態様の概略図および概略断面図；第１６図は本発
明による光学的診断装置の全体の概略図；第１７図は目
的とする細胞を選択的にとり入れまた目放出する細胞担
体の戦略図である。

体液中に含まれる一定の型の細胞の特定のポピユレーシ
ョンを他の細胞のポピユレーションから選別し分析する
ことに関して、本発明は最初の記載であり、さらに本発
明によれば特異的なサブ−ポピユレーションを選別され
た特定のポピユレーションから分離しうる。さらに詳し
くは、本発明はヒト血液中に存在するリンパ球をまず他
の型の細胞から分離し、リンパ球のグループ中のサブ−
ポピユレーションまたはサブグループを同定するために
リンパ球をテストすることによってリンパ球の特定のサ
ブ−ポピユレーションを選別しかつ分析することに閃す
る最ｖＪのｌ５載である。

エル・ケルセック（ＴＪ−０ｅｒｏｅｋ）およびビー・
ケルセック（Ｂ　、０ａｒｏｓｋ）はＩＤｕｒｏｐｅａ
ｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　０ａｎｃｅｒ　、　１７巻
、１６７〜１７１貞（（１９８１）　ｉ回、１６巻、９
０６〜９１５頁（１９７７）およびＥｉｏｐｎｙｅｉｏ
ａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　、　２３巻、６９５〜４ｏ５頁
（１９７Ｂ）で悪性腫瘍の診断において生細胞中におｉ
−＋る螢光の励起および発光−偏光スペクトルと細胞質
基質の構造（１′Ｊ下、ＳＯＭという）との関係につい
て述べている。要約すれば、ケルセックらし１、密度勾
配法によって他の型の細胞がら分離するのと同様にして
他のリンパ球からある特定のリンパ球のサブグループを
分離することを初めて試みたのち、いわゆる８０Ｍテス
トを行なったのである。

ＢＯＭ　フス）は前記に指摘したように非常に不満足な
ものである。まず第１に非常に時間ががかり、当該技術
に慣れた者によれば満足できるが、ケルセックによる技
術から明確である。第２に、ケルセックらが關めている
ように最終的に分離された細胞が目的とするサブグルー
プにのみ属しているのでなく、多くの５０％程度の他の
リンパ球を含んでいる。したがって、分離された細胞の
刺激に対する応答の分析は非常に限定されてしまう。第
６に、分離された細胞に関してケルセックらが行なった
刺激および応答の測定のほとんどすべてがバッチの中の
すべての細胞を対象にして行なわれるものであり、細胞
１個ずつに関するものではない。しかしながら、細胞１
個ずつで分析する方が生物学的意味の理解のための情報
量がはるかに多くえられる。

本発明は値上のごとき分析を非常に迅速にかつ正確に行
なうことを可能にするものである。

ある特定のばあいにおいて、たとえば癌の診断テストの
潜在的な数を考慮すると速度と正確さの両方が非常に重
要である。同等に重要なことには、本発明は装置と方法
の両方に関するものであり、分離された各々の細胞を判
別可能なアドレスに置くことによって生物細胞を互いに
分離し、また引き続き行なう分析によってくり返し細胞
を観察および（または）くり返し細胞を刺激する能力を
提供するものである。

要約すると、本発明によれば細胞のグループまたはポピ
ユレーションを代表するものとして考えつる多数の細胞
、たとえば血中のリンパ球をまず他のあらゆる細胞から
分離する、すなわち異なる細胞のグループまたはポピユ
レーションから分離する。分離過程において、他の細胞
から分離することに加えて、判別可能な位置（１以下、
アドレスという）に存在する分離された細胞をお互いに
分離する。分離されたすべてのリンパ球はついで同時に
選別テストに供され、ついで個々の細胞を別々に検討し
、テストまたは刺激の結果どの細胞が特定の特性を示す
かを決定し、かかる特性を示すそれぞれの細胞のアドレ
スを記録する。したがって、分離されたすべての細胞を
検討ずれば、特定の特性を示すすべての細胞のアドレス
がわかる。かかる細胞はリンパ球のより大きい完全なグ
ループの中である特定のサブグループを代表するもので
ある。

サブグループ中の細胞が同定されれば、同定された細胞
は残りのリンパ球と共に１または２以上のさらに別のテ
ストに供してもよい。しかしながら、追加試験の結果と
して細胞の特性を検討することに関してはザブグループ
中の細胞のみに限定される。サブグループ中の個々の細
胞はそれぞれ細胞に特有の判別可能な位置またはアドレ
スに検査器械を向けて別々に検査される。

したがって、Ｏ・とたびサブグループ中の細胞が同定さ
れたら、それらを引き続き検査し、一方同じグループに
属するがサブグループの一部ではない他のすべての細胞
は無視され、それらはいかなる検査にも供されない。し
たがって、サブグループが同定されれば、該サブグルー
プの細胞のみを検査し、それによって目的とするサブグ
ループの細胞に限って検査時間を限定できる。また、細
胞ひとつひとつに基づいて検査を行なうのでより正確な
データかえられ、診断の精度が上がる。サブグループの
細胞を同定し、各々の細胞を個々に検査しつる他の利点
について以下に述べる。

値上のごとく指摘したように、第１行程で血中に含まれ
る他の細胞からリンパ球が分離される。かかる分離は第
１Ａ図に示される貫通した細胞相体（１）　（ａｅｌｌ
、　ｏａｒｒｉｉｉｒ）を用いて行なう。

細胞（１Ｌ体（１）には孔（２）が種々の形態で配置さ
れ、該孔（２）は種々の形状をとってもよい。第１Ａ図
において、孔（２）はそれぞれＸ軸およびＹ軸にそって
列およびｔｒのｔｒ＜で配列される。第１Ｂ図に示すよ
うに孔←１１ｔ部と下表部に開口を有しており上表部の
開口の方が下表部よりも大きい。本発明の一部圃ｙｉＩ
４様の記載において孔の大きさはリンパ球に適合する大
きさになっており、リンパ球の大きさには約７ｐｍと約
１０〜１５μｍの２つの主たる大きさがある。ＩＦ５体
（１）の上表面また上表部の（１Ｌ）には断面の大きさ
約１０ｐｍの開口があり、下表１ｆ１１または下表部の
（１ｂ）には断面の大きさ約６μｍの開［１がある。ま
た孔の側壁は一直線状でもよいしあるいは第１０図に示
すように階段状になっていてもよい。

一般に孔の形状は、孔に入りこんだ目的とする細胞が孔
を通り抜けずに孔の中に保持されるようにその下表部（
１ｂ）における開口の断面の大きさまたは孔の中間の断
面の大きさの方が上表部（１ｔ）における開口の断面の
大きさよりも小さくなければならない。また孔のサイズ
を目的とする細胞のサイズに関連させるため相体（１）
の上表部（１ｔ）と下表部（１ｂ）の間の厚さを接近さ
せることが重要であり、それによって目的とする細胞が
孔に入りこんだとき無傷の細胞が孔内に保持され、洗浄
によって細胞が洗い流されることを防げる。

孔（２）の形状は、適用手段、たとえば相体の上表部と
下表部の間の圧力差または電磁力によって細胞を効果的
に担体に保持せしめるものである。要約すれば、まず最
初にある特定の細胞グループを他の細胞グループから分
離する際に各細胞グループの大きさがわかっていて、他
のグループの細胞の大きさとは典型的に異なっているば
あい、担体（１）は、種々の細胞グループを含む物質、
たとえば血液が担体（１）におかれるとき、担体の孔の
すべてとはいわないまでもほとんどの孔が効果的に目的
とする細胞グループによって占められ、ひとつの孔に細
胞１個が保持されるような大きさの孔を有する。

叙」二に指摘したように、相体（１）の孔（２）は担体
上または（１１体中に規則正しく、たとえば行と列に配
列され、各孔の位置が明白に同定できる、たとえば相体
面においてＸおよびＹ座標によって同シ；！されるよう
になっている。−実ＷＭＦｉ１様において、孔は互いに
垂直方向にのびる行と列に配置され、それによってマト
リックス様の構造を形成する。孔の数は保持する細胞の
数によって選ばれる。たとえば、行および列に１００個
の孔があれば、合計１ｏｏｏｏ個の孔が存在し、１００
００個の細胞を保持することができ、担体上で各々の細
胞＆Ｊ個有のＸおよび￥の座標を有する。担体（１）自
身は第６０図かられかるように円周を有していてもよく
、複数個の取っ手（θａｒ）を有しており、１１１体が
支えられている上表の凹所から広がる一対の切れ込みを
有するホルダー構造ＯＱにおいて担体を一列に並べる。

ホルダー（４Ｑの前記凹所に関して孔は軸方向にのびる
。他の担体を一列に並べる手段、たとえばピンまたは特
別な形状にした担体も本発明に含まれる。

相体（１）は適当な物質で作られている、たとえば金属
、たとえば銅、金、ニッケル、銀などまたはプラスチッ
クがあげられ、第１７図に示すように孔（２）の間に広
がる電導性の部分が備えられていてもよい。したがって
、細胞を含む孔における電位は細胞の電荷と相互作用す
るように影響をうけうる。種々の孔において電位を制御
することによって孔中の細胞を電気的に担体に結合しま
た同様に孔から放出しつる。

本発明の方法を行なうには、リンパ球を含む溶液、ノに
とえば血液の数滴を細胞担体」二に落とす。液体は１１
体の孔を通り抜けるが、細胞は担体上に保持される。孔
（２）の大きさをリンパ球のみをＩＩＶ　賽できるよう
に選んであるので、リンパ球は孔に入りこむ。各孔は１
個の細胞のみを収容する。ｉ１／Ｉｌ刺の細ｊ抱および
リンパ球以外の細胞は１１１体表面から洗い流される。

たとえば大きすぎてどの孔にも入れない大きさの細胞お
よび（また（」）孔の数よりも多い過剰の細１抱は洗い
流される。ついで、孔中の細胞が相体から放出されるの
を防ぐために、電場および（または）磁場による方法だ
けでなく他の方法、たとえば粘着性でコロイド状の物質
によって担体を覆う方法、’ｆ（（、に的に細胞をチャ
ージする方法などによって細胞を担体に固定させる。細
胞の特定のボピュレーシ１ンを単離し、同時に担体に適
用する他の方法に関しては、第１０、ＩＬ　１２Ａおよ
び１２１図を用いて後で述べる。

目的とする細胞のグループ、たとえばリンパ球を保持し
た各担体はフローチャンバーの１１１体ホルダー、たと
えば第２Ｄ図のホルダー（」Ｃ））に置かれ、後で述べ
るテストまたは測定サイクルのために必要な環境を提供
する。

第２Ａ〜２Ｄ図、第６Ａ図および第６Ｂ図に示す第１の
実Ｍ態様においては、複数個のマトリックスまたは細胞
担体（１）はホルダー（至）（第２Ｄ図および第６Ａ図
）に置かれる。担体の孔が限定された軸、たとえばＸお
よびＹ軸（第１Ａ図参照）に関して整列されるようにす
るためには、ただひとつの相体の位置づけのみが可能で
ある。７０−チャンバーの上表にあるホルダー（ホ）は
７０−チャンバーの中心部分（ＩＩ）　（第２Ａ図）の
上に移動可能である。該中心部分（ｌυは、複数個のチ
ャフ・ネ、ル（ロ）を規定し、個々のチ）ヤン木ｔル（
ロ）はその両端で目的とする溶液を供給または排出する
ために複数個のチューブ（ロ）のうちのひとつに接続さ
れている。該中央部分はその底面において、担体上の細
胞を分析するのに光を投射および透過させる技法を用い
る際に必要となる透明な＠、’６　（＋５）からなるフ
ローチャンバーの下部０４）（１２Ｂ図）によって固定
されている。

第６Ａ図かられかるように、垂直区画のどの而がチャネ
ル０２）の方向に対しているか（そのため溶ｔ＆はペー
ジの中へ流れる）、フローディレクター（１６）は溶液
が細胞担体（１）と接触するのを確実にする。第３Ｂ図
において、該配列の側面を概略して示す。

ホルダ・−（１０）においていくつかの異なる検体（患
者のもの）の入った担体（１）をチャネルにそってのび
る列に置き、一方同じ患者の検体の入った相体の行をチ
ャネルに対して垂直方向にのばす。各チャネル（ロ）は
ひとつのテストに対応し、行なわれるテストの数が７０
−チャンバー中のチャネル０２）の数を決宗することに
なる。

のすべての細胞を湿めらすことになる。細胞担体（１）
は、必要があれば光学的スキャニング装置のための浸液
ｌの・利ｊ用を可能にするためのガラス板０７）によっ
て覆われていてもよい。

第２Ａ図においては、フローチャンバーは７個のチャネ
ル（１２）からなる。このようなばあい、各患者からえ
た細胞は１個のチャネルあたり７個の担体にのせられ、
各チャネルにそって第２Ｄ図に示すように異なる患者の
細胞を有する相体が与えられている。かかる配列によっ
て、異なる患者の細胞を同時にまたは連続的に各チャネ
ルを経て異なる刺激で刺激し、ついで特シｉ！の刺激に
対する各細胞の反応をテストまたは分析することができ
る。記載した他の実Ｍｔｉ　Ｉｌｌ様も複数個のチャネ
ルからなる。したがって各マルチ−チャネル実施態様に
おいては、各患者からえる細胞の数は一般にはチャネル
の数と等しい。

しかしながら、つぎに示す記載からも明らかになるよう
に、本発明はマルチ−チャネル配列に限定されるもので
はない。ある刺激によって刺激され、検査されたのちの
細胞を浄化し、それによって細胞を刺激される前の状態
に戻し、引き続いて他の刺激によって刺激しつることが
わかった。さらにもし必要があれば、１人の患者につき
（［１体の支えるひとつの細胞のみを用いることができ
る。かかる１目体上の細胞を引き続き刺激１７、各刺激
および分析後に次の刺激および分析の行程のために洗浄
しうる。

７０−チャンバーの他の実施態様について記載Ｊる前に
、該担体上の限定された位置に置かれ、該フローチャン
バーに導かれた細胞を個々に分析するための特に好まし
い方法および装置のひとつを記載する。このエンドリフ
ァレンスに対して、エル・ケルセックおよびビー・ケル
セックらによって公知の文献に記載されたＳＩＯＭ−テ
ストが再びあげられる。ケルセックらによれば、８（］
］Ｍ−テスに適したリンパ球のサブグループには少なく
とも２つの特徴的性質がある。

特異抗原が間知されるとリンパ球は休止期（ｒｅｓｔｓ
ｔａｇ・）から刺激期（ｓｉｍｕｌａｔ＠ｄ　ａｔａｇ
ｓ）へ移行する。フルオレセイン分子が、よく知られた
現象、いわゆるフルオロクロマシア（ｆ　ｌ　ｕ　ｏｒ
ｏｏｈｒｏｍａｓｉａＪを用いてリンパ球に埋めこまれ
ると、休止期から刺激期への移行が結果的に該リンパ球
中のフルオレセインの螢光発行の偏光における臨界的変
化となる。刺激過程が値上のごとき臨界的変化をひきお
こすかもしれないばあい、目的とするリンパ球は少なく
とも２つの特徴的性質において他のリンパ球とは異なる
。すなわち、固有密度および該リンパ球に関して比較的
高い（コントロール）値の螢光偏光が５１０ｎｍ付近で
の非常に狭いバンドの発光スペクトルに対してのみ観察
されるという事実である。

値上の２つ目の特性は、リンパ球の全体のポピユレーシ
ョンの間から目的とするリンパ球を区別または同定し、
それによって該リンパ球の物理的分離の必要性を除去す
るのに有利である。

したがって、さらに加わるすべての刺激によって影響を
及ぼされる特定のスペクトル行動を示すリンパ球のグル
ープが検査され、一方で他のすべてのリンパ球がこの光
装置の評価テクニックによって無視されることになる。

交互に述べられたように、本発明によれば相体はまず最
初にヒトの面液中のリンパ球を他の型の細胞から担体の
孔の大きさによって分離することに使われる。核化には
実質的にリンパ球が保持され、ひとつの孔に１個の細胞
が保持される。孔よりも小さい細胞は孔を通り抜け、孔
よりも大きい細胞は担体の上表面から洗い流される。し
かるのちに、担体上のリンパ球をＴＤＡとＰＢＳで洗浄
し、それによって細胞内のフルオロクロマシアをフルオ
レセインへ変換する。ついで５１０ｎｍ付近の発光スペ
クトルの狭いバンド内における各細胞からの螢光偏光を
測定し、記録する。比較的高い値の螢光偏光を示すＰと
して走転可能なリンパ球のみが特定の目的とするサブグ
ループに綱するものとして詔められる。担体上の孔の配
列における各々の細胞のアドレスが判別可能であるので
、サブグループ中の各細胞のアドレスは判別可能である
。したがってサブグループに属する細胞がわかれば、引
き続き行なわれるすべての測定および（または）観察は
サブグループ中の細胞に関してのみ行なわれ、該サブグ
ループには属さない担体上の他のすべての細胞は無視さ
れ、したがってそれら無視された細胞に関してはいかな
る測定も観察も行なわれない。

引き続き行なわれる測定または観察をサブグループ中の
細胞のみに限定することによって、非常に重要な要素で
ある分析時間を短縮できる。

さらにより重要なことには、各細胞のアドレスが判別可
能であるので、独特の情報を提供するための各刺激に対
する細胞固有のｌｉ応を記録することができ、今まで測
定および観察を細胞のバッチに対して行なっていた、あ
るいはフロー装置を用いて行なっていたために達成でき
なかったことが可能となる。また顕微鏡下である特定の
細胞を観察する際でもあとから他の刺激で細胞を刺激し
たり、該刺激に対する反応を観察することができなかっ
た。これは今までは、同じ細胞を観るために測定および
（または）観察器械を同じアドレスへくり返し導くこと
ができるように個々の細胞を各々判別可能な細胞のアド
レスを有する固定された配列に置くということがなされ
ていなかった小部によるものである。

適当な基準が袂→→噌−ト←トー、２つの螢光バ球の臨
界的サブグループの細胞は担体上のすべての単一細胞に
対して値上の基準をテストすることによって同定される
。刺激状態への過渡期においては該サブグループの刺激
された細胞の優先度は発光波長５１　Ｄｎｍでは約０．
１４まで減少する。この偏光度の変化は該サブグループ
の同定された細胞に対してのみ調べられる。

相体上の各細胞に閃して行なわれる値上のごときテスト
に用いる装置を１＠４図を用いて以下に説明する。相体
（１）上の細胞はまず一般的にはリン師紡衛生理食端水
（以下、ＰＢＳという）とフルオロセインジｒセテート
（以下、ＦＤＡという）の溶液で洗浄される。後者のＦ
ＤＡはフルオロク０″＋ｒシアの働きのために各リンパ
球中でフルオレセインに変換される。ついで該フルオレ
セインは４７０ｎｍの光の照射によって励起する。

なお４７Ｄｎｍにおいてフルオレセインはその特徴的な
発光スペクトルを発する。担体上のどのリンパ球が目的
とするサブグループに属するかは担体上の各々の細胞お
よびすべての細胞を光学分析器（財）（第４図）によっ
て段階をおってスキャニングして決定される。該光学分
析器に）は４７０．１ｎｍおよび４６８ｍｍにピークを
有する光源として働くジルコニウムランプ（またはレー
ザー）ψυを含み、それによって目的とする範囲、すな
わち５１０ｎｍと５１５ｎｍの光をフィルターするため
の励起フィルターを用いる必要がなくなっている。光は
焦点レンズ（ｆ　ｏ　ｃｕｓｉｎｇ　１ｅｎｓ　）　（
２１）　ａを通り抜けたのち、第４図の平面に対して垂
直に平面偏光される。該平面偏光は小さい円によって代
表される。平面偏光光線は光線スプリッター（ａｐｌｉ
ｔｔｅｒ）の役割をするミラーに）に衝突し、ついで５
００ｎｍより長い波長の光を透過させ、５０Ｏｎｍより
も短かい波長の光を反射する。したがって光源Ｑυから
の光はレンズ（ハ）を通り抜け、担体（１）に対して反
射される。

相体上の各＃Ｉｌ胞によって発せられた螢光は別々に測
定および記録される。細胞からの螢光はミラー（ハ）お
よびレンズ（ハ）ａを通り抜けてグレン−トンプソン（
Ｇ１＊ｎｎ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）偏光子（ｐｏｌａｒｉ
ｇｅｒ）　Ｈに達する。基本的には、偏光子に）は螢光
を２つの部分に分ける。すなわち、ひとつは紙の平面に
対してパラレルに偏光する（第４図中、ダッシュ記秒（
→で示される）ものであり、これは入射の元（ｏｒｉｇ
ｉｎａｌ）の方向に進む。もう一方は紙の平面に対して
正常に偏光する（第４図中、円（○）で示される）もの
であり、これは入射方向に対して正常に屈折する。各々
の偏光光線は光線スプリッター３樟、（財）によって同
等でかつ垂直な２つの光線に分割される。これら新しく
形成された４つの光線の各々は６１０ｍｍまたは５１５
ｎｍの干渉フィルター（それぞれ（ハ）、に）、（２的
、（２９つ）を通り抜け、それらの強さが４つのホトマ
ルチプライヤ−（ｐｈｏｔｏ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）
チューブ（３０，３１）によって同時に測定される。

値上のごとくしてＭＪ定された４つの強度は第１６図に
示すようなコンピューター装置に記憶され、各波長、す
なわち５１０ｍｍおよび５１５ｎｍに対する偏光度が計
算される。偏光度Ｐはつぎに示す式によって定義される
。

Ｐ＝（Ｌ＋−１１）／（Ｉｎ＋Ｉ上）、Ｐ５□。および
Ｐ５□５の計算後、それらの比、すなわちコントロール
値を示すＰ５□。／Ｐ、□５が即時計算される。Ｘおよ
びＹ軸で表わされる各細胞のアドレスは判別可能であり
、そのコントロール値と共に記憶される。

すべての細胞を検査し、そのコントロール値を決定し記
憶させたのち、少なくとも１．６のコントロール値を有
する細胞を決定することは容易である。目的とするサブ
グループに楓する細胞は畝上のごとき細胞である。かが
る決定がなされたら、引き続き行なわれる種々の刺激剤
に対する細胞の反応の測定または観察が目的とするサブ
グループの細胞のみについて行なわれ、他のすべての細
胞は無視される。たとえば、サブグループ中の細胞のみ
が再検査され、それらのうちのどれがそれらを活性のあ
るものとして同定し、それによって特定の抗原を同定し
うるに充分な偏光度の変化を示すかが決定される。

各々の細胞を個々にテストするために、光学分析器体ｉ
ｔ（第４図）はひとつの細胞の直径が顕微鏡で観察でき
る位の大きさの範囲で光学分割を行なわなければならな
い。細胞を有した担体は顕ｉ吸鏡下にひとつの孔から隣
の孔へと順次置かれる。したがって第１６図に示すよう
に正確な機械ディスプレー装置が必要である。

光学分析器の他の実施態様においては、レーザーを励起
光源として用いることによって細胞４１１体を順次ディ
スプレーする必要がなくなっている。第５図に該実施態
様の概略図を示す。適当な波長を有するレーザー光線が
制御された屈折光子、たとえば回転ミラー１６０を通り
抜ける。

該レーザー光線１６１は実質的に細胞の大きさに対応す
る断面を有する。屈折子１３０を用いることによって光
線１６１が続いて孔中の細胞をスキャンし、それによっ
て各細胞を次々と励起させる。ある一定の時間において
レーザー光線にょつて１つの細胞のみがヒツトされ、そ
れゆえヒツトされた細胞のみがその瞬間に螢光を発する
。

担体（１）の反対側に配置された光学分析器１３１Ｘは
担体（１）の全表面を覆う視覚（ｖｉｓｕａｌ）　領域
を有する。発光シグナルを受けとった時間は該シグナル
の強度スキャニングレーザー光線１６１の場所と相関性
があり、したがって各々の受けとられかつ分析された光
シグナルはその光シグナルを発した各々の細胞の場所と
相関性がある。第５図かられかるように、担体（１）の
孔（２）の大きい側から励起がおこる。一方、光学分析
のためには下記に示す理由から、孔の狭い方の端からで
きる発光を用いるのが好ましい。

本発明を用いた好ましい分析装置を説明すると、他のバ
ラメニターを測定するための類推装置を用いてもよいこ
とがよく理解できる。ただし、担体上の各々のひとつの
細胞に焦点をあてることは可能である。測定可能なパラ
メーターとしては、たとえば光の強度、光学密度、屈折
率、電磁性、吸収および分散などがあげられる。

さらに、スキャニング方法は可視光線、ＵＶ、工Ｒおよ
び電子光学装置ｗに限定されるものではなく、各細胞に
おける物理的接触を経た調査をも含むものである。その
他の測定可能または観察可能な特性としては、たとえば
核磁気共鳴（ＮＭＲ）、ＰＨ値、細胞の形頼、異なる刺
激に対する反応におけるそれらの変化などがあげられる
。たとえば、いずれの細胞においても顕微鏡で示された
出力を細胞パターンの２次元記録を作るためのパターン
記録器に導くことができる。細ｍ温度および（または）
温度変化艙測定し記録してもよい。要約すれば、いずれ
かひとつのまたはそれ以上の測定可能なまたは観察可能
な細胞の特性を細胞ひとつずつに基づいて求めてもよい
。

個々の細胞のアドレスが判別可能なので、あとから追加
する測定および（または）観察に常に同じ細胞を戻すこ
とができる。各細胞に対するすべての測定および観察は
記録され、個々の細胞に対する個有の情報かえられる。

該情報は今までえられなかった洞察および診断を提供す
ることができる。

本発明の実際の臨床用途の一部ＩＭＭ様を第６Ａ＝６０
図を用いて説明する。第６Ａ〜　６０図は複数個の担体
（１）のための修飾型ホルダ−４０を示すものである。

該ホルダー４０は波型であり、谷（ｔｒｏｕｇｈｓ）　
ｆ４１１がより高いレベルでチャネル（ロ）を流れる溶
液中に浸せるようになっＣいる。

谷４１１の底の上にのっている細胞担体は上表部および
下表部の両方からの細胞を洗浄するがまたは刺激できる
ように湿めらせることができる。

それゆえ、該実施態様においては、第２Ａおよび第６Ｂ
図を用いてすでに説明したようなフローディレクターの
必要がない。第２Ａ〜２Ｄ図に示すように、細胞担体は
異なる患者に属する同じ谷（４１）上に置かれる。この
ような配置をとるにもかかわらず、担体間の＃ｌ埋的接
触がないのでリンパ球の刺激効果が混合する危険がない
。

ひとつの細胞がひとつの相体から分離されたとしても、
その細胞が洗い流される確率はその細胞が他の担体上に
置かれる確率よりもはるかに高い。第６Ａ図においては
、相体はひとつの谷にのみ記載されている。しかしなが
ら、各患者に適用するに際しては相体は各省に存在する
。

第６０図において、相体（１）はホルダー−から取りは
ずし可能なものとして示されている。しかしながら、孔
の配列をＸおよびＹで限定するために、刻み込み（ｉｎ
ｄａｎｔａｔｉｏｎａ　）　（９）に配置可能な取って
（θａｒｓ）（８）を含んでいる。

本夾施態様の相体（１）は各チャネル（ロ）を流れる溶
液中に浸っているので、細胞スキャニングのための光学
装置の顕微鏡には観察用シリンダーの付いたクォーツス
リーブ（ｑｕａｒｔｚ　５ｌｅｅｖｅ）　ｔＡ３　（第
６Ｂ図）が備えつけられている。チャネル（ロ）および
谷（４■）は目的物および各相体の全表面をスキャニン
グするのに必要な相体の相対的な動きが可能な大ぎさを
有している。

畝上に示したごとく、前記のコントロール値に、Ｍ；づ
いて細胞のサブグループを選別するには、まず該サブグ
ループに属する各相体上の適当な細胞を同定するだめの
制御測定サイクルの間にＰＢＳとＦＤＡの溶液をチャネ
ルに供給する。しかるのちに、異なる刺激剤に対する選
別された細胞の反応を決定するために各チャネルに異な
る刺激剤、たとえばフィトヘマグルチニン（ＰＨＡＪ、
ＭＰ　％　ＯａＢＰ　％癌抽出物、または他の目的とす
る変異源もしくは抗原を供給する。ついで選別された細
胞のみに対する反応を調べ記録する。

畝上の刺激剤に関して、ひとつの刺激剤による細胞の刺
激は、つぎの刺激テストの前に該刺激剤を洗浄および（
または）中性化して該刺激剤間の直接相互作用または何
らかの競合効果を防げば、つぎの刺激には何ら影箒を及
ぼさない。

さらに、担体に細胞を結合させても細胞の活性には何の
影響も及ばない。さらに続いて担体上の同じ位置にある
同じ細胞に対して刺激操作をくり返すことができ、異な
る活性化剤を用いることもできる。したがって、サブグ
ループの個々の細胞の活性化に対する反応の正確な概要
が時間の関数としてえられ、それゆえ活性化された細胞
の正確な数と反応および前に測定サイクル中および後に
同じ場所を維持するマトリックス上の細胞の位置を知る
ことができる。

はとんどの担体ホルダー装置は前記のごとく上部スキャ
ニング用にデザインされていた。たとえば、相体の孔の
上表部の大きい方から発せられた螢光を分析できるよう
になっており、同じ光学分析装置ｆｔ−細胞の光学的試
験および分析に用いることを可能ならしめている。二者
択一的な実施態様においては、つぎに示すように光学分
析器が孔（２）の狭い側または底面を通り抜ける発光を
受けとれるように配置されている。したがって、細胞か
ら漏れ出て、その周囲に存在するフルオレセインの発光
によって惹起される妨害効果が、除去される。周囲のフ
ルオレセインによって発せられた光は好ましくない光学
的バックグランドを示す。孔の狭い側あるいは底の方か
ら細胞をみると、不要の発光に対するシールドとして慟
＜　ｏｏｎｕ＠を狭くするので該バックグランドは実質
的に減少する。さらに、孔の大きい方または上側を通っ
て孔に入りこんだ励起光のばあいは、円錐形の壁での反
射が生じ、それによって螢光だけでなく入射光も反射さ
れる。畝上の方法で行なう光学分析によってもたらされ
るいまひとつの利点は、相体Ｊ−のすべての場所におい
て各孔にとりこまれた細胞の発光のみが受けとられ、担
体の上表面に存在する除外してよい他の細胞が測定結果
に１暢を及（二ｆさないことである。さらにその他の利
点として、孔の担体上の開口の大きさがより小さいため
、各細胞の発光を別々に分析するのがきわめて容易であ
り、その隙孔に対する光学装置の適合メカニズムがあま
り正確なものでなくても近傍の細胞間におけるクロス−
トーキングの危険性がない。

つぎに第７Ａ、７Ｂ％　８および９図によって、先に説
明したように光学分析を行なう種々の実施態様を説明す
る。第７Ａおよび第７Ｂ図は顕微線光学分析に用いる実
施態様であり、フローチャンバーの底壁（１１０）は伸
縮性のある（ゴム性の）ガラスホルダー（１１１）から
なり、各々は上に置かれる細胞担体（１）に適合された
ガラス板（１１２）を担持している。伸縮性のあるガラ
スホルダー（１１１）はフローチャンバーのガラス板（
１１２）と底壁（１１０）の間に液体−固定シールを供
給し、細胞担体（］）の位置または下側から孔をスキャ
ニングするために顕微鏡の対物レンズ（１１６）を細胞
担体（１）のところへ充分に動かずことができる（第７
Ｂ図）。もし顕微鏡の対物レンズ（１１３）が下の方に
位置しているとすると、フローチャンバーのチャネルは
その最初の広さにまで開けられる。

該実施態様の改造型（第８図）において、フローチャン
バーの底壁および側壁はゴムでできでいる。

第２の実施態様（第９図）においては、光学分析が上側
から行なわれる。しかしながら、細胞担体（１）に対す
るホルダー（１１４）は、特別のユニッ）（１１２Ａ図
および第１２Ｂ図で説明する）に細胞が供給されたのち
、フローチャンバーの下部（１１５）の上にさかさまに
置かれており、担体（１）の円錐形の孔は下方に向かっ
て広がっているわけである。細胞をとりこみ効率よく細
胞を担体に結合させるために７０−チャンバーの下側（
１１５、第９図）と上側（１１６）の間の圧力差が用い
らチャンバーの２つの部分が漏れることを防ぐ。

該実施態様を用いれば、第４図の光学分析器を担体（１
）上の細胞を畝上の利点を損うことなくスキャニングす
るのに用いることができる。

原理的には畝上の常法を用いて実質的に行な題を戻すと
、第６．７Ａおよび７Ｂ図は細胞分離の好ましくない常
法による以外に他の細胞グループから目的とする細胞の
ポピユレーションを同時に分離する装置の概略図である
。該実施態様はまた前記のＳＯＭ−テストに用いるため
の、血液細胞からリンパ球を分離するための装置として
使える。

第１０図および第１１図から明らかなように、第６Ａ図
のフルーチャンバーに挿入可能なホルダー■はバイブロ
１１の配列上にのっており、各々のパイプは上側の６１
と下側の６″２に縦方向に分かれている。パイプの下側
の６湯は液体および不適切な血液細胞をパイプの上側の
６■から排出するための低圧流体（空気または液体）水
路を形成する。

パイプの上側６３１はブリッジ６４１１その下に存在す
る排水孔（（へ）、その間に存在する吸引孔（ハ）がら
なり、ホルダー−上の１１１体（１）と連合している。

第１０図にただ１人の患者からの細胞を保持するための
相体を示す。バイブロ１）の上側（至）および下側６ａ
には流体、ＰＢＳ溶液が人っている。断面図の第１１図
から明らかなように、上側の流体はブリッジ６（の下を
通りホルダー−の適当なス四ット６ηを通り抜ける。下
側６２の流体は突出部（至）によって排水孔６→および
吸引孔間の領域をより速いスピードで流され、それによ
って畝上の孔の中にお番プるサブ−プレッシャーを作る
。それゆえ最初に上側６１を流れる流体は前記孔を通し
て−部下側へ導かれる。

ホルダーＦｉ１ｍ上にある取りはずし可能な血液供給単
位―は担体（１）に血液を供給するものである。

供給単位−のレッグ６υはホルダー６１のスロット６Ｄ
のひとつの列から他の列へ液体が通り抜けるのを防ぐも
のである。

畝上のユニットによって行なう細胞分離を理解するため
の理論的基礎として、つぎに示す事実が強調される。

（ａ）対応するリンパ球の大きさは７μ以上、（’ｂ）
マク四ファージ、顆粒白血球の大きさは２０〜６５μ以
上、 （（１）赤血球の大きさは６〜５μにまで達しつる、（
ｄ）１５μ位の大きいリンパ球が存在する、（６１）血
小板の大きさを無視できない、（ｆ）細胞は蒸留水中に
放置されると破裂する、（ｇ）蒸留水中の赤血球の寿命
はリンパ球のそれよりはるかに短い。

細胞担体ホルダー団はまずパイプ配列上に置かれ、それ
によって第１列の担体が孔の上に置かれる。供給単位−
がそのレッグ６Ｄと共に担体のどちらかの側に置かれる
。第１１図に示すように全装置が集められている。患者
から採血した全面の入ったシリンジはシリンジホルダー
１２に置かれる。第１１図において、２つのシリンジホ
ルダーは２人の異なる患者用である。各パイプ中の血液
の流れはシリンジに適当な圧力をかけることによって制
御される。最初の数回の圧力パルス接パイプ（Ｐｌ）お
よび（Ｐ２）の出口に血液が到達する。

ある時期に、圧力パルスが血液の点滴を各細胞担体上に
落とす。相体中の孔の大きさは、血液細胞が細胞担体の
一方から他方へ通り抜けることを詐さない。該行程の終
末で畝上のごとくパイプの下牛分にＰＢＳ　ｋ流すこと
によって分離パイプの下平分にサブ−プレッシャーが形
成される。ＩＩ）Ｉ液は速かに担体の下へ吸引される。

より小さい細胞は４１１体を通り抜け、ＰＢＥＩの流れ
で洗い流される。（１体の上表部の開口とほぼ同じ大き
さ、すなわち７ｐｍ位の大きさの細胞は相体上に止まり
、その中でも最も大きいものは担体の上にのっている。

担体の封止を防ぐために、血液の供給を止め、より大き
い細胞を洗い流すためにマトリックスの上側にＰＢＳを
流す。

それによってほとんどの細胞が第１１図の排水孔６つに
吸引される。残った少数の細胞かつぎの担体（流れの方
向にそって）へ運ばれる。畝上に指摘したように、チャ
ネルの広がりに対して垂直に置かれた細胞担体は１人の
供血者の血液で満たされているため他の供血者の血液と
混合する問題がない。

つぎの段階で上側の流れが止められ、さらにつぎの血液
が滴下され、必要に応じてサイクルはくり返される。数
滴の血液を滴下したのち、いわゆる［上側破裂洗浄（ｕ
ｐｐｅｒ　ｋｕｒｓｔｉｎｇ　ｗａｓｈ）ｊを行なう。

該過程は担体が充分に満たされるまで続けられる。この
大よそのテストは各滴下後の相体の電気抵抗をテストす
ることによって行なわれる。必要なときにはいつでも蒸
留水が流され、赤血球を破裂させる。蒸留水は細胞を膨
張させるため、赤血球は破裂し、リンパ球は担体の孔の
中に保持される。必要な時間間隔の終点でｐｎｓを導入
する。破裂した赤血球が除かれた物質は、該物質を洗い
流す溶液の流れが常に存在するためリンパ球に影響を与
えることはできない。マトリックスに電荷または再電荷
を与える、あるいは電磁場を与えたり止めたりすること
は超音波またにその他の用いうる技術によってマトリッ
クスを振動させることの類推である。

該行程は洗浄の過程に加えたり関連させたりしうる。各
患者、Ｐ工、稲から採血する血液は１ＣＣより少ないこ
とが必要である。

該分離過程は多くても約５分間ですむ。同時に分離され
うる細胞を供給する血液サンプルの数は限走されない。

ホルダー団はついで分離装置から取り除かれ、畝上のご
とく光学的スキャニング操作を行なうために第４図のフ
ローチャンバーに挿入される。

第９図のホルダー（１１４）に適応されるほかは同様で
ある分離装置を＃１２Ａ図および第１２Ｂ図によつて説
明する。基底板（１２０）には流体を流、すためのチャ
ネル（１２１）が備えられており、相体（１）の下の部
分および排水孔−において必要な局所サブ−プレッシャ
ーを生じる。ついでチャネル（１２１）の基底　上にプ
ロジェクション（１２２）が形成される。

ホルダー（１１４）は基底板（１２０）上に取りはずし
可能な状態で置いてあり、第１２Ｂ図かられかるように
担体（１）がプロジェクション（１２２）と連合してお
り、円錐形の孔は上向に開口、たとえば第１０図の血液
供給単位−と機能的に類似である上に横たわる取りはず
し可能な供給単位（１２３）に向かって開口している。

供給単位（１２３）は細胞担体に第１０図で説明した王
力の作用によって細胞を供給することはめったにない。

しかしながら、第１６Ａ　％　１６Ｂ　Ｎ　１３ｏおよ
び１４図に示すように担体に対して配置できないスミア
リングエレメント（ｓｍｅａｒ境ｅ：ｈｅｍｅｎｔ）を
供給することによって血液供給の能率を上げることがで
きる。第１３Ａ、　１３Ｂおよび１３０図において、チ
ャネル（１２１）と連合した供給単位（１２３）に広が
るスライド板（１２４）を有する実施態様を示す。

供給導管の出口において弾性のあるスミアリングニレメ
ン）　（１２５）が第１３Ｂおよび第１３０図に示すよ
うにとりつけられている。第１３Ｂ　ｆｉ４にスライド
板（１，２４）に対して垂直方向のスミアリングニレメ
ン）　（１２５）の断面図を示し、第１６ｃ図にスライ
ド板（１，２４）の拡大断面図を示す。弾性スミアリン
グニレメン）　（１，２５）の１１ｆ［は担体の横の長
さに実質的に対応し、該スミアリングエレメントは細胞
の薄層によって各相体が覆われている際にスライド板（
１２４）を動かずとき、担体表面上を直線的に洗浄する
ための小さな出口を形成する。

しかるのち、畝上の洗浄が行なわれる。

第１４図はスミアリングエレメントのいまひとつの実施
態様のチャネル（１，２１）に対して垂直方向の断面図
である。各チャネルにそってのびる回転体（］Ｊ２６）
において、各相体につきひとつの血液の導管（１，２’
７）が形成され、該導管には分配ブラシ（１２８）を有
する出口がついている。担体に血液を供給する際に、該
回転体（１２６）が数回回転し、それによって担体（１
）上に細胞が払われる。

畝上の実施態様において、血液の供給と特別の分離ユニ
ットによって大まかな分離が行なわれ、しかるのちに光
学的スキャニングを行なうためにホルダー（４Ｌａｌお
よび（１１４）がそれぞれフローチャンバー上に置かれ
なければならないが、この段階を除去することが要求さ
れるばあいもある。第１５Ａ図および第１５Ｂ図に示す
本発明のさらに別の実施態様においては、細胞分離およ
び光学的スキャニングの操作をひとつの装置Ｗに組合せ
である。

支持装置（７０）には互いに横方向にのびる表面チャネ
ル（７］）、（７２）と互いに横方向に広がる内部導管
（＋７３）　、（７４，）がある。すべての接合部にお
いて、担体（１）が回転可能なホルダー（７５）上に配
置されており、その断面を第１５Ｂ図に示す。該ホルダ
ーの基底部には各々のラック（７７）とかみあう支持装
Ｍ　（’７０）を通して広がるビニオン（７６）が形成
され゛〔いる。ひとつのラック（７７）はそれぞれの行
のすべてのホルダー（７５）を駆動する。該ラック（７
７）のｉＨ線運動がホルダー（７５）の回転なひきおこ
す。大まかな分離にＩｎ＋液を導く方向、たとえば油液
細胞の他のグループからリンパ球のグループを分離する
ために血液を導く方向は細胞相体が顕ｆｆ＆Ｍ下でスキ
ャンされる面に対して垂直である。したがって、他の血
液細胞からリンパ球を分離したのちホルダー（７５）を
スキャニング操作のために９０°回転させる。

畝上の実施態様において「透過光」の技法（孔の下端を
励起させる光の測定）を可能にするために、細胞担体下
でホルダー（７５）と交差するチャネル部分を縦方向に
分割するガラスのパイプ（７８）にする。該パイプはそ
の開口側が担体の方向に向くように配置される（第１５
Ｂ図参照）。

畝上のごとくしてホルダーにおいて液体が水平に流れる
ことが可能となり、同時に光は垂直方向に透過する。該
装置においてサブ−プレッシャとによって生じせしめる
。他の方法、たとえば上側のチャネルの流速に対して内
部導管中の流速を増加させることによっても同じ効果か
えられる。

該方法を以下に要約する。０〜９０°のコントローラー
の補助を用いてホルダー（７５）の位置が決められる。

第１段階において「大まがな分離」を行なう際、チャネ
ル（７１）および導管（７３）が操作される。該段階が
完了した時点でホルダー（７５）を９０°まで回転する
。したがってチャネル（７１）および導管（７３）は封
止または閉じられ、チャネル（７２）および導管（７４
）は開かれる。

該実施態様において血液滴下ヘッド（ｄｒｉｐ　−ｂｅ
ａＡ　）はスキャニングヘッド、たとえば顕微鏡に取り
つけてもよい。ついでコントローラー、たとえばコンピ
ューターからの指令シグナルに応答して自動的に分離お
よび光学的スキャニングが行′ｌｒわれ、熟練オペレー
ターは必要でなｌ／モオペレーターが必要なのはシリン
ジをつけるときと、第６図に示すようにテスト終了後ホ
ルダー　（７５）をとり換えるときだけである。

第１６図は細胞分離、スキャニングおよび分析（診断）
の全体にわたる装置である。畝上のごとくフローチャン
バー（ａ］）はテーブル（８２）の上にのっており、該
テーブルはそれぞれコンピューター制御ステップモニタ
ー（ａｓ）、（８４）および（８５）によってｘ、　ｙ
、　ｚの３つの軸に置き換えられる。光学装置は第４図
に示すように光学分析器（８７）のついた顕微鏡（８６
）を含んでいる。励起光源（ａａ）　、たとえばジルコ
ニウムランプは逆反応において同じ光学装置を利用する
。溶液タンク（８９）にはｍ１胞分離およびテストに必
要なすべての溶液が蓄積されている。溶液制御ユニット
（９０）によって各々の溶液の供給が制御される。

絶対偏光度に影響を与える細胞中のフルオレセイン濃度
を安定化するために、螢光発光の強度が定期的に測定さ
れ対照値と比較される電子−光メカニカルフィードバッ
ク制御が用いられる。

対照値からの測定値の偏差はＰＢＳ溶液中のＦＤＡの濃
度を変化させるのに用いてもよい。また測定値の分析を
よく知られているコンピューターシステムによって行な
ってもよい。プレコンピューターインターフェイス（９
１）は測定値をコンピューターの判読可能な情報、一般
的にはデジタルの情報に変換する。コンピューター（９
２）　ニおいて必要な計算および同定ステップが行なわ
れ、メモリー（９３）に記憶される。ポストコンビニ−
ターコントルーラ（９４）はステップモーターおよび溶
液制御ユニットに対する制御シグナルを発する。

畝上の装置の操作をつぎに要約する：大まかな分離操作
後、７０−チャンバーをテーブル（８２）に固定する。

顕微鏡を調整する。しかるのちに自動的にテストを進め
る。チャネルおよび導管を通してＰＢＳと’ＦＤＡの溶
液を導入する。そのうち、一部は相体を通して上側のチ
ャネルから下側の導管へ入りこみ、一部は上側のチャネ
ルを流れつづけ、上から細胞を洗い流す〇一定の時間後
、たとえば２０分後、スキャンを開始する。単一細胞す
べてにつきその偏光を目的とする波長で測定する。スキ
ャニングが非常に速かに行なわれるので励起光、たとえ
ば４７０皿によって細胞が過剰照射（ｏｖθｒ　−ｅｘ
ｐｏｓｕｒｅ　）される危険がない。

光学情報は電流パルスに変換されたのちコンピューター
に入力され、評価されメモリーに記憶される。すべての
単一細胞は座標、たとえば担体上のアドレスによってメ
モリー中で同定される。該過程から、各単−ａ胞につい
て検討されうるすべてのものがそのアドレスに関連して
コンピューターに記憶される。

データの収集をつぎに要約する：まずすべての患者の細
胞のコン）ｏ−ル値を決める、ただし患者の担体はひと
つのチャネルに連合しである。ついでスキャニングヘッ
ドをつぎのチャネルに移動しくテーブルを低くシ、横に
動かす）、２番目のチャネルと連合している担体上のす
べての細胞のコントロール値を決定するのに用いる。２
番目のチャネルからデータを収集するのと同時に刺激用
の溶液を１番目のチャネルへ導入する。２番目のチャネ
ルからデ〜りを収集し終わった時点でスキャニングヘッ
ドを３番目のチャネルに移動し、２番目の刺激用の溶液
を２番目のチャネルへ導入する。

すべての相体からデータを収集したのちスキャニングヘ
ッドを最初の位置に戻す。ついでスキー？　ニング操作
を刺激された細胞でくり’Ｍｌ、行なう。今度はデータ
収集を選択的に行ない、記載された光学的規準、たとえ
ばある特定のサブグループに属する細胞のみを再び読む
。それゆえ、コンピューターに蓄積される情報は細胞の
位置、コントロール値、ＰＨＡ刺激後の偏光度、ＯａＩ
］Ｐ刺激後の偏光度、ＳＯＭ−反応比（エル・ケルセッ
クら；　ｌ１ｌｕｒｏｐ、Ｊ、　０ａｎｃｅｒ、　１７
．１６７〜１７１（１９８１））、特異的癌刺激物質に
よる刺激後の偏光度などである〇 異なる思考の細胞担体間の区別は大まかな分離の段階で
ホルダーに固定されうる磁気もしくは光のコーディング
によって行なってもよい。

磁気もしくは光リーダーを患者のコードを読み取りそれ
をコンピューターへ送る光学的スキャニングヘッドに取
りつけることができる。各患者に祠するすべての情報は
コンピューターのメモリーの予め決められた場所に移し
てもよい。

該装置によってすべての刺激剤に対して活性化されたリ
ンパ球の正確な数を決定しうる。本発明を用いれば、当
該技術に熟練した者は非常に速い時期に癌の診断を行な
うことが可能である。本発明を値上のごとく癌の診断に
関連して述べてきたが、本発明の装置および方法はそれ
のみに限定されるものではない。一般に本発明は迅速に
生物学的分析を行ない、それによってバイオテクノロジ
ーおよびバイオエンジニアリングの分野に新しく応用さ
れるのみならず、新しい臨床の診断および治療を行なう
ものである。

値上のごとく、担体上の活性化された各々の細胞の正確
な位置が決定され記憶される。それゆえ、担体から他の
すべての細胞を選択的に除去して目的とする細胞のサブ
グループのみが担体上に保持されるようにすることによ
って、あるいは目的とするサブグループのみを相体から
放出および除去することによって担体上の目的とする細
胞のグループまたはサブグループを単離することができ
る。該目的のために、細胞は電気的に中性ではなく表面
電荷を有しているという公知の事実が用いられる。該事
実は細胞を相体に結合させるかまたはさもなければ固定
するための値上の実施態様に用いてもよい。また目的と
する却１胞を選択的に放出または保持するために同じ効
果を用いてもよく、第１Ａ図の細胞相体の改造型の実施
態様によって行なってもよく、それを第１７図によって
説明する。担体（１００）の外形は第１Ａ図に示したの
と同じであるが、該担体（１００）にはグリッド様（ｇ
ｒｉｄ　−１ｉｋｅ　）の形状をした孔の間にのびる電
導体（１０１）が備わっており、お互いに電気的に＊１
Ｍされている。相体の周辺において、該導体は公知の方
法（工０−テクニック）でコンピューターで制御される
スイッチ装置に接続されており、各々の電導体（１０１
）の電位に選択的に影響を与えることができる。担体に
細胞を固定するためにすべての電導体（１０１）は結果
的に細胞の電気的引力となる細胞の電位に向かいあって
同じ電位に保持してもよい。細胞を放出させるには、た
とえば第１７図の人で示した孔の中のひとつの細胞に関
していうと、瞬り合う電導体ｖＸ２’、ｖＸ３′、ｖｙ
工′、ｖｙ２は担体から孔Ａの中の細胞を放出させるた
めに適当な電位にセットしてよい。

細胞担体（１００）を１０−プロダクションから知りつ
る多層テクニックによって作ってもよい。イオン溶液、
たとえばＰＢＳを用いたばあい、ホルダー上に表面電荷
の望ましくない影響が及ぶのを防ぐようにｅＪ定は行な
わなければならない。該目的のためにホルダーはチャネ
ルの末端で導電素子を単独に被覆または供給されてもよ
い。これによってイオンがひきつけられ中性化し、それ
によってホルダー表面がイオンで覆われるのを防ぎ、担
体の電位に影響が及ぶこともない。

いまひとつの方法として、非イオン性有機溶液、たとえ
ば脂質のｍ液を該過程で担体に流す方法がある。

本発明によればすべての他の細胞からある特定の細胞を
分離することをクローン産生における臨床治療の分野に
独自に利用しうる。クローンはある選ばれた特性に基づ
いて本発明によって他の細胞から選別された特定の細胞
から産生される。たとえば、ある疾病、たとえば皮フ癌
に犯されたヒトの体が疾病と戦うまたは疾病を殺す同定
可能な細胞を産生ずることはよく知られている。しかし
たとえいくら成功したとしても、そのような多数の細胞
（以下、キラー（ｋｉｌｌθｒ）細ＩＩＩＩｌという）
は体内に存在している。

本発明によれば、キラー１１ｉＩｌｌ胞を含む血液、リ
ンパ節およびその他の体組織は該キラー細胞の原料とし
て使われるかもしれない。以下に記載するように他のす
べての細胞からキラー細胞を分離したのち、該キラー細
胞を適当な細胞培養技法によって増殖させ、ついで患者
に投与し、それによって元の細胞は疾病と戦うためにう
け入れられる。かかるばあい、＃ｌＩＪＭは患者由来の
ものであるから拒給される細胞はない。したがって本発
明は患者の体に患者の疾病と戦うのに充分な細胞を供給
しうるものである。

担体上の目的とする細胞と他の細胞とを分離することは
、他の＃Ｉ胞のみが担体上に残るＪ：うに目的とする細
胞の方を担体から除去することによっても可能であるが
、もし孔の中の目的としない細胞を殺し、担体上に残っ
ている生きている細胞のみが目的とする細胞であるよう
にしてかかる分離を行ないたいばあいには目的としない
細胞を除去し、選ばれた細胞のみを担体上に残すことに
よってもかかる分離が可能である。

孔中の細胞を殺す、たとえばその場で殺すことは他の類
似の方法と同様に判別可能なアドレスにある各細胞にレ
ーザー光線をあてることによって行なわわる。したがっ
て殺された細胞、たとえば相体上で死んだ細胞は担体か
ら分離または除去されたものとみなされ、あらゆる実際
的な目的のためにひとたび殺されれば無視される。

以下、細胞の［放出（ｅｘｐθｕｉｎｇ）Ｊという語は
担体から細胞を除去するまたは細胞を担体上で殺すとい
う意味で使われるものとする。

目的とする細胞の増殖については、つぎに示すことが明
らかである。

（ａ）増殖さぜたい＃Ｉ胞を目的としない生きている細
胞を持っている担体から除去する、 （１］）目的としない細胞を担体から除失し、ついで目
的とする細胞を増殖させるおよび （０）孔中に目的としない細胞がまだ残っていたらそれ
らを殺し、目的とする細胞をその場で増殖さぜる、ずな
わち、担体上の孔の中で増殖させる。

本発明の原理を特殊な装置、その応用および方法によっ
て述べてきたが、かかる記載は本発明の詳細な説明する
ためになされるものであり、本発明の範囲を限定するも
のではない。

生物学的研究、臨床治療および工業生産への多くの新し
い応用が本発明によって開かれる。

細胞の周期に関連する光学的パラメーターが存在すると
いうことが予測され、満足のいく程度まで確立されてき
た。本発明によれば、細胞のエイジ（ａｇｅ　）　、周
期および固有の機能にしたがって細胞のポピユレーショ
ンを区別させることができ、また各々の検査を行なうこ
とができる。

値上の臨床への応用は、血中および骨髄中にある型の若
い細胞が多数存在することで特徴づけられる白血病の早
期発見にある０ いまひとつの臨床への応用として、臓器移植のための免
疫反応性テストかある。該目的のために本発明中の刺激
剤として移植組織が使われる。

本発明の一般的かつ主たる特徴および利点は、自然発生
がしばしば人工条件下で再生産され、その結果不確実な
結果を導き、広範な統計的評価が必要と′なる通常の生
物学的方法に比して細胞の同定およびテストが実質的に
短時間のうちに行なわれるので生物学的実験およびテス
トに要する時間が実質的に短かくなるという事実である
。本発明は環境の影響を減少させ、それによって多くの
分析を最小の統計でもって行なうことができる。本発明
を用いれば測定に要する時間は先行技術を用いた場合に
比して非常に短かく、それによって周囲の環境条件、た
とえば温度、湿度などの変化を減少せしめる。

本発明の特定の実施態様全本明細書中に記載してぎたか
、当該ｆ−ＩＺ術に熟練した者にとって該実施態様の改
造および変更は容易であり、さらにかかる改造型および
同価のもの（ｅｇｕｊ−ｖａｌθｎｔｓ　）を包含する
ように特＃ｌ＋請求の範囲は解釈されるものである。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ−０図は本発明の細胞担体の一部施態様の概略見
取図および一部切裂断面図；第２Ａ〜２Ｄ図は細胞（（
１体が複数個あるばあいにサイクルを測定するためのマ
ルチプル細胞担体ホルダーの一部施態様の概略見取図；
第３Ａ−図および第３Ｂ図は第２Ａ〜２Ｄ図のホルダー
の概略拡大断面図；第４図は細胞１１１体に含まれる細
胞のポピユレーションを個々にスキャニングするだめの
光学分析器の一部施態様の概略図；第５図は光学分析器
のいまひとつの一部施態様の概略図；第６Ａ〜６０図は
第３図のホルダーの改造型ホルダーの概略見取図および
概略断面図；第７Ａ図および第７Ｂ図は分析装置の下側
に対する７ｏ−チャンバーの一部施態様の概略断面図；
第８図は第７図の７０−チャンバーの改造型の一部施態
様の概略断面図；第９図は分析装置のホルダーおよびフ
ローチャンバーの一部施態様の概略図；第１０図は細胞
担体に細胞を供給するために第６図のホルダーを受けと
めるように適応された分離ユニツシの一部施態様の概略
図；第１１図は第１０図の分離ユニットの概略断面図；
第１２Ａ図および第１２Ｂ図は細胞担体に細胞を供給す
るために第９図のホルダーを受けとめるように適応され
た分離ユニットの概略図；第１５Ａ〜１３０図は第１２
図の分離ユニットとともに使用できるように適応された
血液供給単位の概略図および概略断面図；第１４図は第
１２図の分離ユニットとともに使用できるように適応さ
れた血液供給単位のいまひとつの実施態様の概略断面図
；第１５Ａ図および第１５Ｂ図は分離および測定行程が
組合されてなる臨床用のマルチ−担体装置の一部施態様
の概略図および概略断面図；第１６図は本発明による光
学的診断装置の全体の概略図；第１７図は目的とする細
胞を選択的に引きつけるかまたは放出する細胞担体の概
略見取図である。 （図面の主要符号） （１）！細胞担体 （１ｔ）＋細胞担体の上表面 （Ｉｂ）　ｉ細胞相体の下表面 （２）：細胞担体の孔 （Ｉｎ）　！細胞担体のホルダー Ｈ＋光学的スキャニング装置 （４１１細胞担体のホルダー ＠１細細胞体のホルダー （１１４）！細胞相体のホルダー （１００）！細胞拐体 １　　　１　　　　に を万ｐａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ある特定の生物細胞を他の細胞から選別し、選別さ
   れた生物細胞の少なくともひとつの選ばれた特性を観察
   する装置において、生物細胞の配置可能な上表面と下表
   面に予め選ばれた配列で該上表面と下表面の間に広がる
   複数個の孔を有する予め選ばれた厚さの担体手段であっ
   て、該担体の孔が担体の上表面と下表面にそれぞれ上表
   面と下表面の開口の大きさで規定しうる予め選ばれた大
   きさと予め選ばれた形状を有しており、該担体の上表面
   に生物細胞が配置されると予め選ばれた大きさの選ばれ
   た細胞のみが実質的に該孔中に保持され、ひとつの孔に
   実質的に１個の細胞が保持されることを特徴とする装置
   。 ２　前記担体手段の上表面の各開口の大きさが孔内部の
   断面の最も小さい部分の大きさよりも大ぎい特許請求の
   範囲第１項記載の装置０３　前記担体手段の上表面と下
   表面のそれぞれの開１１の大きさがマイクロメーターの
   範囲である特許請求の範囲第１項または第２項記載の装
   置０ ４　前記担体手段の厚さおよび担体手段の上表面の開口
   の大きさが選ばれた細胞の直径のオーダーである特Ｆｌ
   ’ｉｉｌ求の範囲第１項記載の装置０ ５　前記担体手段の孔がひとつの孔にひとつのリンパ球
   を保持する大きさである特許請求の範囲第４項記載の装
   置。 ６　前記担体手段を規定された位置に保持し、それによ
   って担体の各孔をアドレスとして定義可能な判別可能な
   場所に配置するための第１構造手段、該構造手段に関し
   て、少なくともひとつのａｌｌ＆ｌの特性を観察および
   （ｔたは）測定するための器具手段および該器具手段を
   制御し、該器具手段を担体の孔の特定の１個に導き、孔
   のアドレスに基づいて孔の中に保持された細胞の少なく
   ともひとつの特性を観察および（または）測定する制御
   手段をさらに含んでなる特許請求の範囲第１項記載の装
   置ｌＯ ７前記器具手段が細胞の光学的特性を決定するための光
   学的スキャニング手段からなる特許請求の範囲第６項記
   載の装置。 ８　前記第一構造手段が、各孔に細胞を保持する間隔を
   あけた複数個の担体手段を支えるための手段および該間
   隔をあけた担体手段上の細胞が予め選ばれたもので同時
   に刺激されつるようにするために第一構造手段に対して
   位置を定められた第二構造手段であり、担体中のｍ胞を
   観察するためにいずれかひとつの担体手段のいずれかひ
   とつの孔のアドレスに前記器具手段を導くように適応さ
   れた制御手段を有する第二構造手段を含んでなる特許請
   求の範囲第６項記載の装置。 ９　前記第一および第二＃Ｉｌ造手段がお互いに決めら
   れた配置にあり、それによって生物細胞が担体の孔の上
   表部またはｆ表部全通して湿めっていることによつ°Ｃ
   刺激されつる特許請求の範囲第８項記載の装置。 １０　　前記第二構造手段が異なる刺激物質を含むため
   の手段を含んでおり、第一構造手段と第二構造手段の配
   置がお互いに決まっており、それにＪ：つて前記間隔を
   あけた担体手段の少なくともいくつかに存在する細胞が
   該異なる刺激物質によって同時に刺激される特＃！ｉ−
   請求の範囲第８項記載の装置０ １１　　前記ｊｌＡ体手段が、細胞の保持されている孔
   から細胞を放出するかまたは孔の中へ細胞を引きつける
   ための力発生手段を含んでなる特＃）’１＃求の範囲第
   １項記載の装置。 １２　　前記力発生手段が、電磁手段によって孔の中に
   保持されている細胞のいずれがひとつを孔から放出する
   かまたは孔へ引きつけるための孔に対して予め決められ
   たパターンで配列された手段からなる特許請求の範囲第
   １１項記載の装置。 １６　　前記力発生手段が担体手段の少なくとも選ばれ
   た部分を横切って圧力差を生じせしめるための手段から
   なる特許請求の範囲第１１項記載の装置。 １４　　前記力発生手段が孔の中の細胞の粘着力を強化
   するものからなる特許請求の範囲第１１項記載の装置。 １５　　前記第一構造手段が各孔に細胞を保持する間隔
   をあけた複数個の担体手段を支えるための手段および該
   第−構造手段とは別に配置され、該間隔をあけた担体手
   段上の細胞を予め選ばれた物質によって同時に刺激しう
   る第二構造手段であって、孔のいずれかひとつまたは担
   体手段のいずれかひとつのアドレスに前記器具手段を導
   くために適応された前記制御手段を有する第二構造手段
   を含んでなる特許請求の範囲第１１項記載の装置。 １６　　前記第一および第二構造手段の位置がお互いに
   決まっていて、それによって細胞が担体の孔の」―表部
   または下表部を通して湿めっていることによって刺激さ
   れる特１Ｆｌ−請求の範囲第１５項記載の装置０ １７　　前記第二構造手段が異なる刺激物質を含むため
   の手段を含んでおり、第一構造手段と第二構造手段の配
   置がお互いに決まっており、それによって前記間隔をあ
   けた担体手段の少なくともいくつかに存在する細胞が該
   異なる刺激物質によって同時に刺激される特許請求の範
   囲第１５項記載の装置。 １８　　上表部と反対側の下表部の間に広がる予め決め
   られた配列で配置された孔を有する予め選ばれた厚みの
   担体の上表部を目的とする選ばれた細胞を含む細胞でお
   おい、それによって担体が細胞でおおわれる際細胞の大
   きさに基づいて選ばれた細胞のみが実質的に孔に保持さ
   れ、ひとつの孔に実質的に１個の細胞が保持される行程
   からなる選別された生物細胞のグループにおいて選別さ
   れた生物細胞を観察しやすくするために少なくともひと
   つの特定の生物細胞のグループを分離する方法。 １９　　孔に保持されない細胞を除くために前記担体の
   上表部を洗浄し、それによって担体の孔に選ばれた細胞
   のみを実質的に保持し、ひとつの孔に実質的に１個の細
   胞を保持する行程をさらに含んでなる特許請求の範囲第
   １８項記載の方法０ ２０　　公知のａｍの特性の作用として、細胞を保持さ
   れた孔から放出するかまたは孔に引きつける行程をさら
   に含んでなる特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２１　　前記担体手段が担体支持構造上の予め選ばれた
   位置に支えられており、それによって細胞のアドレスと
   して定義可能な各孔の位置および該孔中の細胞が判別可
   能であり、予め選ばれたもので刺激したのち孔中の細胞
   の多くの性質のいずれかひとつを観察または決定するた
   めに該孔のいずれかひとつに前記器具手段を導きやすく
   する特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２２　　最初の刺激後に担体上の細胞を処理して細胞を
   実質的に蝋初の状態に戻す行程をさらに含んでなる特１
   ｒＰｉ求の範囲第２１項記載の方法０２６綬初の刺激後
   に担体上の細胞を中性化し、異なる手段で少なくとも細
   胞を刺激する行程をさらに含んでなる特許請求の範囲第
   ２２項記載の方法。 ２４　　選別された細胞の数を増すために選別された細
   胞を増殖さセる行程をさらに含んでなる特許請求の範囲
   第１８項記載の方法。 ２５　　増殖させる細胞が相体手段から除去された細胞
   である特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２６　　増殖させる細胞が担体上に残っている選ばれた
   細胞である特Ｗ１・請求の範囲第２０項記載の方法。 ２７　　細胞を相体のそれぞれの孔中に維持している間
   に細胞を増殖させてなる特許請求の範囲第２６項記載の
   方法。 ２日　　細胞が相体の孔にあるばあい選ばれた細胞では
   ないａｍを少なくともひとつ殺す行程をさらに含んでな
   る特許請求の範囲＃１１８項記載の方法。 ２９　　担体上に存在する生きている細胞を増殖せしめ
   る行程をさらに含んでなる特［１１１求の範囲第２８項
   記載の方法。 ６０　　増殖する少なくともひとつの細胞の増殖過程を
   その場で観察する行程をさらに含んでなる特許請求の範
   囲第２９項記載の方法。