HU195245B - Process and equipment for selection of specified biological cells from cell-set and for inspection of minimum one characteristics of the specified cells - Google Patents

Description

A találmány tárgya berendezés és eljárás sejtek kiválasztására, továbbá a kiválasztott egyedi sejtek meghatározott helyeken való megfigyelésére, amely átmenő nyílásokkal ellátott sejthordozó alapján valósul meg. A találmány szerinti berendezés és eljárás egy nagyobb sejtpopulációból legalább egy sejtpopuláció kiválasztását teszi lehetővé meghatározott közös paraméter alapján.

Sejtek kisebb populációinak kiválasztására szolgáló eljárások és berendezések, így például a vérben található biológiai sejtek kiválasztására alkalmas eszközök jól ismeretesek. A technika állásának jellemzésére ezek közül néhányat a következőkben röviden ismertetünk és kommentálunk.

Sejtadhézióra épülő elválasztás: Ez a módszer nem túlságosan hatékony és különböző sejtek elválasztására alig alkalmas, ha azok membránkarakterisztikája azonos, így tehát nem lehet például az üveghez tapadó sejteket szétválasztani.

Immunoíluoreszcens elválasztás: A módszer alapja az, hogy a sejtek különböző csoportjai különböző antigénekkel és/vagy antitestekkel szemben meghatározott specifikus kötési karakterisztika szerint viselkednek. Ez utóbbiaknak a sejtekhez való kötődése alapján lehetővé válik a sejtek azonosítása. Ennek a módszernek a hiányossága a korlátozott volta, mivel nem alkalmas sejtek oly módon történő kiválasztására, amelynek alapja biológiai aktivitás, vagya kötött anyaggal kapcsolatos válasz mérése.

Elektroforézises elválasztás: Ez az eljárás a sejtek elektromos töltésének nagyságát használja ki elválasztáshoz,és ennek megfelelően kevéssé alkalmas az ugyanakkora töltésű vagy tömegű sejtek különböző csoportjainak hatékony szétválasztására.

Radioaktivitásra épülő besugárzásos vizsgálatok, beleértve az immunvizsgálatokat, befogadási és enzimológiai értékeléseket: Ebben az esetben a sejtek szétválasztása során olyan csoportok alakulnak ki, amelyekben az aktivitás vagy az inaktivitás és az ezzel kapcsolatos válaszok alapját! csak kevéssé lehet részcsoportokat megkülönböztetni.

Morfológiai elválasztás: Az eljárás lényege, hogy a sejteket fizikai megjelenésük alapján különítik el. Ez az eljárás a leggyorsabb, de egyúttal a legkisebb felbontást biztosítja.

Sejtelválasztási technikák fajlagos sűrűség alapján (grádienstechnika): Ebben az eljárásban a sejtek izotonikus oldatban áramlanak, ahol az oldat sűrűsége, oszmozitása és viszkozitása ismert. Az elrendezést centrifugálással adott hőmérsékleten és gyorsulás mellett centripetális erők hatásának teszik ki. Az oldatnál nagyobb sűrűségű sejtek lesüllyednek, míg az azonos sűrűségűek az oldatban szuszpendálódnak, és a nagyobb sűrűségűek az oldat forgásfelszínére kerülnek. Az eljárás legnagyobb hiányossága 2 az, hogy a sejtek egy adott sűrűségi gradiens alapján eloszlanak, és ezt számos különböző tényező, mint hőmérséklet, oszmozitás, gyorsulás, stb. befolyásolja, és így például a vérvizsgálatban fontos tényező a vér átmeneti távolsága a forgástengelytől valamint az erre a tengelyre vonatkoztatott gradiens.

A technika állásához tartozó, ismert különböző módszerek előbbi rövid jellemzését egy közös hátrány megemlítésével kell kiegészíteni, mégpedig azzal, hogy a kiválasztott sejtpopuláció gyakorlatilag mindenkor tartalmaz olyan sejteket, amelyeket a vizsgálatba nem kellene bevonni. Ennek megfelelően az említett eljárásokkal kiválasztott sejteken végzett bármely ellenőrzés szükségszerűen dúrva eredményt ad, még akkor is, ha az eljárási lépéseket a lehető legnagyobb gondossággal hajtották végre.

fgy például L. Cercek és társai (Biophysical Journal, 1978,23.1 ,p.395) az ún.SCM-tesztet (Structuredness of Citoplastic Mátrix = a citoplasztikus mátrix strukturáltsága) írják le. A szerzők ebben a közleményben kifejtik, hogy az előzőekben ismertetett gradienstechnika segítségével kiválasztott sejtek között a nem kívánatos típusok részaránya 50%-ot is elér, bármilyen gondossággal is készítették elő a mintát a tesztvizsgálathoz.

Ennek megfelelően a találmány legfontosabb célja olyan eljárás és berendezés kidolgozása, amellyel sejtek egy csoportja hatékonyan kiválasztható más sejtek közül, és a kiválasztott sejtek egymástól is szétválaszthatok, mégpedig úgy, hogy pontosan kijelöli helyekre kerüljenek. így minden kiválasztott sejt alkalmassá válik azonos tesztvizsgálatok elvégzésére, az eredmény minden egyedi sejten meghatározható és ezért a diagnózis eredménye pontosabbá válik. Az egyes sejtekre irányuló tesztek és a vonatkozó eredmények felvétele automatikusan végezhető, amivel az ellenőrzés ideje lecsökken, és a diagnosztikai feladatok alacsonyabb képzettségi szintű személyzettel is elvégezhetővé válnak.

Az a tény, hogy a technika állása szerint a sejtek egy jól meghatározott csoportját nem lehet tiszta mintában kiválasztani a többi sejtek közül, kedvezőtlenül befolyásolja a diagnosztikai vizsgálatok pontosságát. Ezen túlmenően, és ez a leglényegesebb, az előzőleg leírt eljárások során a sejtelválasztást és az ezt követő tesztvizsgálatokat makromennyiségű vagy egy nagyobb csoportot alkotó sejteken hajtják végre, és nem egy homogén mikrocsoporton, ahol esetleg a kiválasztott sejtek egymástól is el vannak választva és minden sejt külön vizsgálható, tesztelhető. Minden olyan eljárás és módszer, amellyel lehetővé válik egy jól meghatározott sejtcsoport elválasztása a többi sejttől, ezt követően a kiválasztott csoportban levő sejtek szétválasztása egymástól, és ezzel

-2195245 az egyes sejtek egyedi teszteléséhez és/vagy vizsgálatához a szükséges feltételek megteremtése igen nagy jelentőségű a különböző biológiai feltételek, állapotok diagnosztizálása és egyéb felhasználások szempontjából. A nagyobb együttesből kiválasztott egyedi sejtek vizsgálata és tesztelése kiküszöböli azokat a hibákat, amelyek jelenleg számos diagnosztikai módszerre jellemzőek, mivel ezek eredményeit csak közelítőleg megbízható statisztikai kritériumok alapján értékelik.

A találmány elé kitűzött feladatot a javaslat szerint olyan módszer kidolgozásával oldjuk meg, amely a következő lépések sorozatát tartalmazza:

előre meghatározott tulajdonságú sejtek egy csoportjának kiválasztása sejtek nagyobb együtteséből, és minden egyes kiválasztott sejt megfogása egy jól meghatározott helyen.

A találmány szerinti eljárásban a következő lépések közül egy vagy több alkalmazása igen előnyös lehetőségeket teremt:

minden kiválasztott sejten egy meghatározott tesztvizsgálat elvégzése, majd ezt követően annak meghatározása, hogy a sejtek közül melyek mutatják a teszt eredményének elfogadott különleges tulajdonságot és így kiválasztott részcsoport meghatározása:

minden sejt elhelyezkedésének rögzítése a részcsoportban;

minden sejten egy vagy több tesztvizsgálat elvégzése és minden tesztvizsgálat befejezését követően minden egyes sejt tulajdonságainak ellenőrzése rögzített elhelyezkedésük szerint;

a részcsoportba nem tartozó sejtek elválasztása.

A jelen találmány szerint új berendezést is kidolgoztunk, amely sejtek befogadására alkalmas nyílások mátrixát tartalmazó hordozóeszközzel van ellátva, ahol a mátrixban minden nyílás elhelyezkedése, vagyis címe rögzített és ismeretes. A nyílások a hordozóeszköz fenékoldala és fedőoldala között meghatározott keresztmetszettel vannak kialakítva. Konfigurációjuk olyan, hogy amikor a sejtek egy nagyobb csoportja a hordozó fedőoldala fölé kerül, csak azok a sejtek választódnak ki és helyezkedhetnek el a nyílásokban, amelyek méretei egy meghatározott tartományba esnek. A kiválasztandó sejteknek megfelelő mérettartománynál kisebb sejtek a nyíláson átesnek, míg a nagyobbak nem tudnak abba belejutni. Ha a hordozóeszközt megfelelő anyaggal átmossuk, csak a kiválasztott sejtek jutnak be a nyílásokba mégpedig minden nyílásba, amelynek jól meghatározott helyzete a továbbiakban címként szerepel, egy-egy sejt kerül.

A hordozóeszköz nyílásaiban elhelyezkedő sejteken ezt követően el lehet végezni a biológiai tesztvizsgálatokat és sejtről-sejtre meg lehet határozni a vizsgálat eredményeként kialakult tulajdonságokat, amivel megállapítható, hogy mely sejtek tartoznak valamely olyan előre meghatározott részcsoportba, ahol egy-egy tulajdonság vagy egy-egy mérhető paraméter azonos. Miután a sejtek egy részcsoportját azonosítottuk, ebben a részcsoportban mindegyik sejt meghatározott címen érhető el és a részcsoportba tartozó összes sejt címe ismeretes. Bár egy adott minta összes sejtjén el lehet végezni egy vagy több tesztvizsgálatot, lehetséges a vizsgálat eredményét csak egy adott részcsoportra értékelni, ha a részcsoportba tartozó egyes sejtek már ismert sejtek címének megfelelően mérőeszközt vagy diagnosztikai készüléket alkalmazunk.

A találmány szerinti eljárás és berendezés leglényegesebb kiviteli alakjait és jellemzőit a következő példák alapján ismertetjük részletesen, amikor is a csatolt rajzra hivatkozunk, ahol az

IA. ábra a találmány szerinti berendezésben alkalmazott hordozóeszköz perspektivikus képe, az

IB. ábra a hordozóeszköz nyílásaiban a sejtek elhelyezkedése, az

IC. ábra a hordozóeszköz nyílásának keresztmetszete, a

2A. ábra olyan tartóeszköz vázlata, amelyben több hordozóeszköz helyezhető el számos vizsgálat egyidejű elvégzéséhez, a

2B. ábra a 2A. ábra szerinti tartóeszköz keresztmetszete, a

2C. ábra a 2A. ábra szerinti tartóeszköz felülnézete, a

2D. ábra a 2A. ábra szerinti tartóeszközben a sejtek elhelyezkedése címzés szerint, a

3A. ábra a 2A., 2D. ábrákon látható tartóeszköz keresztmetszetének kinagyított részlete, a

3B. ábra a 3A. ábra szerinti keresztmetszet egy részlete, a

4. ábra egy hordozóeszközön kialakított sejtpopuláció vizsgálatához sejtek egyedi letapogatására szolgáló optikai elemzőkészülék egy lehetséges kiviteli alakjában a sugármenetek vázlata, az

5. ábra az optikai elemzőkészülék egy másik előnyös kiviteli alakjának vázlata, a

6A. ábra a 2A....2D. ábrán bemutatott tartóeszkőz egy előnyös kiviteli alakja perspektivikus nézetben, a

6B. ábra a 6A. ábra szerinti tartóeszkőzhöz kialakított mikroszkóp egy részlete keresztmetszetben, a

6C. ábra a 6A. ábra szerinti tartóeszköz A jelű részlete perspektivikus nézetben, részbeni kimetszéssel, a

7A, ábra elemzőrendszer fenékoldalán kialakított átfolyáskamra egy kiviteli alapjának keresztmetszete vizsgálat előtti állapotban, a

-3195245

7Β. ábra a 7A. ábra szerinti átfolyáskamra keresztmetszete vizsgálat közben, a

8. ábra a 7A. és 7B. ábra szerinti átfolyáskamra egy módosított változata keresztmetszetben, a

9. ábra a 2A. ... 2D. ábrán bemutatott tartóeszköz és a 7A., illetve 7B. ábra szerinti átfolyáskamra illesztése elemzőrendszerben, a

10. ábra a 6A., 6B. és 6C. ábra szerinti tartóeszközt befogadó elválasztó egység sejtekkel kitöltött hordozóeszközzel perspektivikus nézetben, a

11. ábra a 10. ábrán bemutatott elválasztó egység egy részletének keresztmetszete, a

12A. ábra a 9. ábra szerinti tartóeszközt tartalmazó elválasztó egység, amellyel sejtek a hordozóeszközbe juttathatók, a

12B. ábra a 12A. ábra szerinti elválasztó egység egy részlete keresztmetszetben, a

13A. ábra a 12A. és 12B. ábra szerinti elválasztó egység együttműködő vérbeadagoló eszköz perspektivikus nézete, a

13B. ábra a 13A. ábra szerinti vérbeadagoló eszköz egyik kiviteli alakjában egy részlet keresztmetszete, a

13C. ábra a 13A. ábra szerinti vérbeadagoló eszköz másik kiviteli alakjában egy részlet keresztmetszete, a

14. ábra a 12A. és 12B. ábra szerinti elválasztó egységgel együttműködő vérbeadagoló eszköz egy további kiviteli alakjának keresztmetszete, a

15A. ábra klinikai alkalmazásra kidolgozott többhordozós rendszer vázlata perspektivikus nézetben, ahol az elválasztás és a mérés kombinált módon végezhető, a

15B. ábra a 15A. ábra szerinti rendszer egy részletének oldalnézete, részben keresztmetszetben, a

16. ábra a találmány szerinti hordozóval kialakított optikai-diagnosztikai rendszer vázlatos képe, míg a

17. ábra kiválasztott sejtek megfogására vagy szelektív elengedésére alkalmas sejthordozó eszköz perspektivikus nézete.

A találmányt először, lényegében korlátozása nélkül, biológiai folyadékban jelenlevő, adott típusú sejtek populációjának más sejtpopulációktól történő elválasztására és elemzésére irányuló eljárás kapcsán írjuk le. A kiválasztott populációból a találmány értelmében még további részpopuláció emelhető ki kívánt szempontok szerint. A találmányt emberi vérben jelenlevő lymphoeiták egy részpopulációjának kiválasztása és elemzése alapján ismertetjük, amikoris a lympocitákat a jelenlevő egyéb típusú sejtektől elválasztjuk, majd tesztvizsgálatnak vetjük alá, hogy a 4 részpopulációt vagy részcsoportot a lymphociták csoportján belül azonosíthassuk.

L. Cerceck és B. Cerceck a European Journal of Cancer (17, 1981, 167...171. oldal és 13, 1977, 903...915. oldal), valamint a Biophysical Journal (23, 1978, 395...405. oldal) hasábjain közölt cikkeikben elemzik élő sejtekhez kötött fluoreszcein gerjesztési és emissziós-polarizációs spektrumait, abban a vonatkozásban, hogy mennyire alkalmazhatók a citoplazmikus mátrix struktúráltságában (SCM) bekövetkező változásokkal kapcsolatos jelenségek vizsgálata a vérképző szervek betegségeinek diagnosztizálásában. Az említett cikkek szerzői az ún. SCM-tesztvizsgálat elvégzését javasolták, miután a lymphocitákat egy meghatározott tulajdonság szerint el kívánják választani a lymphoeiták egy másik csoportjától, valamint a többi sejttől a bevezetőben említett gradienstechnika alkalmazásával.

Mint már a bevezetőben is szó volt róla, a gradienstechnika alkalmazása nem hozza a kívánt eredményeket. Először is igen időigényes, amint az jól ismert a téma szakemberei előtt is kitűnik az említett cikkekből. Másodszor; mint az említett cikkek szerzői is megírják, a. végeredményben kapott sejtek nemcsak a vizsgálat szempontjából érdekes csoportba tartoznak, hanem más lymphocitákkal szennyezettek, amelyek száma igen magas, eléri a kiválasztott sejtek 50%-át. Ennek megfelelően az elválasztott sejtek által adott válaszokat a stimuláló hatások szerint elemezve csak korlátosán figyelembe vehető eredmények adódnak. Harmadszor és ez minden ismert stimulálás, valamint válaszmérés legnagyobb hibája, hogy az eredmények a sejtek egy nagyobb csoportjára vonatkoznak és belőlük nem lehet a kívánt tulajdonságú, típusú sejtekre vonatkozó egyedi eredményeket kiemelni. Az is nyilvánvaló, hogy a sejtről-sejtre végzett elemzés sokkal megbízhatóbb információt ad,és így az aktuálisan kutatott jelenség biológiai következményeinek megértése elmélyíthető.

A jelen találmány értelmében éppen az ilyen elemzések igen gyors és pontos elvégzése válik lehetségessé. Ebben az esetben mind a sebesség, mind a pontosság rendkívül fontos, tekintetbe véve azoknak a rákdiagnosztikai tesztvizsgálatoknak a lehetséges számát, amit esetleg szükséges elvégezni. Hasonlóképpen fontos, hogy a találmány, mind az eljárás, mind pedig a berendezés lehetőséget teremt a biológiai sejtek oly módon történő elválasztására egymástól, aminek révén a kiválasztott sejtek ismert címre kerülnek, ahova újra vissza lehet térni megismételendő sejtvizsgálatok vagy stimulációk elvégzése céljából, miután egy elemzési folyamat befejeződött.

összefoglalva, a jelen találmány értelmében sejtek, így például vérben levő lymphociták hogy száma osztható szét oly módon.

-4Ί hogy kialakul a sejtek különböző populációinak vagy csoportjainak halmaza. A lymphocitákat a leírásban olyan sejteknek tekintjük, amelyek sok csoportot vagy populációt tartalmazó sejtmennyiséget reprezentálnak. Az elválasztási folyamat során a kiválasztott és más sejtektől is elválasztandó lymphocitákat egymástól is szétválasztjuk, minden sejtet ismert helyre helyezünk et és ezt a helyet a következőkben címnek nevezzük. A szétválasztott lymphociták mindegyikét ezt követően egyidejűleg kiválasztott tesztvizsgálatoknak vetjük alá, majd minden sejtet külön-külön megvizsgálunk abból a szempontból, hogy a tesztvizsgálat vagy stimulálás eredményeként mutat-e valamilyen különleges keresett jellemzőt. Az adott jellemzővel rendelkező minden sejt címét meghatározzuk. Ennek megfelelően, miután minden kiválasztott sejtet ellenőriztünk, az adott tulajdonsággal jellemzett sejtek címe ismeretessé válik. Ezek a sejtek a lymphocitáknak egy külön részcsoportját képviselik a nagyobb kiindulási csoportban. Miután a részcsoportban levő sejteket azonosítottuk, ezeket a lymphociták maradékával együtt egy vagy több kiegészítő tesztvizsgálatnak vethetjük alá. Amikor a sejtek tulajdonságait a kiegészítő tesztvizsgálatok alapján elemezzük, ez ennek megfelelően már kedvezően csak a kiválasztott részcsoportba tartozó sejteket érinti. A részcsoport minden sejtjét egyedileg lehet megvizsgálni oly módon, hogy a sejt ismert egyedi elhelyezkedésének vagy címének megfelelően vizsgálóberendezést hozunk vele kapcsolatba. így a részcsoportján levő sejtek kijelölése után a vizsgálatokat már csak rajtuk végezzük el, míg az ugyanabba a csoportba tartozó, de a részcsoportba nem beosztott sejteket figyelmen kívül hagyhatjuk, és így azok a vizsgálatban nem vesznek részt. Ennek következményeként az egyszer meghatározott részcsoport sejtjeit vizsgáljuk meg, vagyis a vizsgálat csak azoknak a sejteknek a vizsgálatára korlátozódik, amelyek az előre kijelölt tulajdonságot hordozzák. Annak révén, hogy a vizsgálatokat sejtről-sejtre végezzük, pontosabb adatokat kapunk, és ezzel a diagnózis megbízhatósága növekszik, ideje csökken. Egy másik előny, hogy lehetőség nyílik egy részcsoport sejtjeinek azonosítására és minden sejt külön-külön vizsgálatára, aminek előnyeit a továbbiakban még elemezzük.

Mint az előzőekben már említettük, első lépésben a lymphocitákat a vérben levő többi sejttől elválasztjuk. Ez az elválasztás 1 sejthordozó segítségével történik (IA. ábra). Az 1 sejthordozó perforálással van kialakítva.

Az 1 sejthordozón 2 nyílások vagy lyukak különböző konfigurációja alakítható ki, elrendezésük is sokféle lehet. Az 1A. ábra szerint táblázatszerűén oszlopokba és sorokba vannak rendezve Y és X tengelyek mentén. A 2 nyí8 lások az 1A. ábra szerint felül nagyobb keresztmetszetüek, mint az 1 sejthordozó fenékfelületén, ahogy az az IB. ábrán is látható. A most ismertetendő változatban a 2 nyílások úgy vannak kialakítva, hogy lymphociták befogadására legyenek alkalmasak, amelyek között két különböző alapméretű, mégpedig kb. 7 pm és 10 ... 15 pm tartományba eső átmérőjű sejtek vannak. Az 1 sejthordozó lt felső felületén a 2 nyílások felső keresztmetszeti felületét mintegy 10 pm oldalfalú négyzetek határozzák meg. Az 1 sejthordozó lb alsó felületén a 2 nyílásokat mintegy 6 ps-es oldalfalú négyzetek határozzák meg. A nyílásokban az lt felső felülettől az lb alsó felületig az oldalfalak egyenletesen közelítve (IA. és IB. ábra) és/vagy lépcsőzetesen (IC. ábra) hajolhatnak egymáshoz.

Általában a 2 nyílásokat úgy kell kialakítani, hogy az lt felső felületen a keresztmetszeti területet meghatározó oldalél legyen a 2 nyílás legnagyobb mérete, tehát általában az lb alsó felületén levő oldalél kisebb legyen, mint a felső él, és így a 2 nyílásba bejutó, kívánt nagyságú sejt ne tudjon átesni, hanem maradjon benn az 1 sejthordozóban. Az is fontos, hogy az lt felső felület és az lb alsó felület között a kiválasztott sejtek méreteihez viszonyítva az 1 sejthordozó vastagsága és a 2 nyílásokat méretei akkorák legyenek, aminek alapján, ha a kívánt sejt bejut a 2 nyílásba, gyakorlatilag annak teljes belső terét kitöltse, abból ne álljon ki, és így a későbbiekben leírandó kimosással azt ne lehessen eltávolítani.

A 2 nyílások alakjának olyannak kell lenni, hogy az 1 sejthordozó illeszkedhessen meghatározott eszközökhöz, amilyenek például a felső és az alsó szintek közötti nyomáskülönbséget létrehozó egységek vagy elektromágneses teret létrehozó berendezések lehetnek. Ennek megfelelően ahhoz, hogy először a sejteknek egy meghatározott csoportját az egyéb csoportokba tartozó sejtektől elválaszthassuk, ahol minden csoportba ismert nagyságú sejtek tartoznak, melyek tipikusan különböznek a többi csoportokba sorolható sejtektől, az 1 sejthordozót úgy kell felépíteni, hogy a benne kialakított 2 nyílások méretei megfeleljenek a vizsgálandó anyagnak, például a különböző sejtcsoportokat tartalmazó vérnek, és amikor az anyag az 1 sejthordozó felső felületére kerül, a 2 nyílásokat gyakorlatilag csak a vizsgálandó sejtek foglalják el, mégpedig oly módon, hogy minden nyílásra egy sejt jusson.

Az előzőekben már említettük, hogy a 2 nyílások az 1 sejthordozóban szabályos elrendezésűek, például oszlopokat és sorokat kijelölve helyezkednek el, mivel ily módon minden 2 nyílás helyzete egyértelműen meghatározható, például az 1 sejthordozó síkjában kijelölt X és Y koordináták segítségével. A leírt kiviteli alakban a 2 nyílások olyan oszlopokat és sorokat határoznak 5

-5195245 meg, amelyek egymásra merőlegesek,és így négyszögletes mátrixszerű struktúrát alkotnak. A 2 nyílások számát mindenkor a kiválasztandó sejtek számától függően választjuk. így· például soronként és oszloponként száz-száz nyílást kialakítva összesen 10 000 nyílást kapunk,amelyekben 10000 sejt helyezhető el a leírt kialakítású 1 sejthordozó mellett,és mindegyik sejtnek meghatározhatjuk az egyedi X és Y koordinátával jellemzett pozícióját.

Az 1 sejthordozó kör alakú elemként is létrehozható, mint azt a 6C. ábra mutatja.

A 6C. ábrából kitűnik, hogy az 1 sejthordozók 8 fülekkel vannak kiképezve, amelyek révén a 8 füleket befogadó 9 illesztésekkel kialakított 40 első hordozószerkezetbe helyezhetők. A 9 illesztések olyan bemélyedés nyúlványaiként indulnak ki, amelyben az 1 sejthordozó megtámasztható. A 40 első hordozószerkezetben a bemélyedés folytatásaként annak tengelyirányában nyílás van kialakítva. Az illesztés más módon is megoldható, például különleges alakban létrehozott tartóelemekkel és hasonlókkal.

Az I sejthordozó különböző anyagokból készülhet. Különösen előnyösnek bizonyult a fémek közül a vörösréz, az arany, a nikkel és az ezüst felhasználása, de a műanyagokkal is kedvező eredmények voltak elérhetők. Ez utóbbi esetben célszerű 101 vezetékek beépítése, mint amilyenek a 17. ábra szerinti megoldásban 100 sejthordozó 102 nyílásait kapcsoló vezető elemek. Minden, a kiválasztott sejtet tartalmazó 102 nyílásnál ebben az esetben a villamos potenciál szabályozhatóan állítható be, és ennek révén a 101 vezetékek a sejt villamos töltésével kölcsönhatásba lépő elektromos teret generálnak. A különböző 102 nyílásoknál a potenciált vezérelve lehetővé válik a bennük levő sejtek elektrosztatikus töltés révén történő megfogása, illetve eltávolítása.

Az eljárás foganatosítása céljából a lymphocitákat tartalmazó oldat, például vér néhány cse^>pjét az 1, 100 sejthordozóra juttatjuk. A folyadék az 1, 100 sejthordozóban kialakított 2, 102 nyíláson áthalad, és a megfelelő méretű, sejtek az 1 sejthordozóban maradnak. Mivel a 2 nyílások méreteit oly módon választjuk, hogy csak a lymphocitákat fogják be, ezért ezek a sejtek kerülnek a 2 nyílásokba, mégpedig mindegyikbe egy-egy. A nagyobb méretű, vagy felesleges sejteket a sejthordozó felületéről mosófolyadék távolítja el. A sejtek lehetnek olyan nagyok, hogy nem férnek be a 2 nyílásokba, vagy pedig onnan kiszorulnak.

Ezt követően a sejteket megfelelően rögzíthetjük a 2 nyílásokban, hogy a hordozóról való távozásukat megakadályozzuk. Erre a célra például az 1 sejthordozót megfelelő kolloid ragasztóanyaggal vonjuk be vagy kihasználjuk az elektromos és mágneses tér nyújtotta lehetőségeket. További kombi6 nált módszert az említett sejtpopuláció szigetelésére és egyúttal az 1 sejthordozóban való rögzítésére a későbbiekben a 10., 11., 12A. és 12B. ábra kapcsán ismertetünk.

Minden olyan 1 sejthordozót, amely a^- kiválasztott sejtek csoportját, például a szükséges nagyságú lymphocitákat tartalmazza megfelelő, például 20. ábra szerinti 10 első hordozószerkezetben helyezzük el, ami lehetővé teszi a sejtek tesztvizsgálatát, vagy mérését, amint erről a későbbiekben szó lesz.

A 2A., 2B., 2C., 2D., 3A. és 3B. ábrán bemutatott tartóeszköz első kiviteli alakjában I sejthordozók egy nagyobb csoportját 10 első hordozószerkezeten (2D. és 3A. ábra) helyezzük el. Az 1 sejthordozóknak csak egyetlen elrendezése lehetséges oly módon, hogy a perforálások (2 nyílások) az 1 sejthordozókon X és Y tengelyeknek megfelelően legyenek elrendezve (1A. ábra). A 10 első hordozószerkezet, amely 15 átlátszó fallal kialakított átfolyáskamra felső részét alkotja, az átfolyáskamrában 11 második hordozószerkezet fölött van cserélhetően elrendezve (2A. ábra). A 11 második hordozószerkezet 12 csatornákat határoz meg, amelyek mindkét végükön egy-egy kívánt oldat betáplálására és elvezetésére alkalmas 13 csőre csatlakoznak, és alsó felületével az átfolyáskamra 14 alsó tartóelemen (2B. ábra) van megtámasztva, amely 15 átlátszó lemezt is hordoz. Erre akkor van szükség, ha az I sejthordozón levő sejteket beeső és áteresztett fényben kívánjuk elemezni.

A 3A. ábra szerinti felépítésben, ahol a 12 csatorna irányára merőleges keresztmetszet látható (az oldat a rajz síkjára merőleges irányban folyik) 16 áramlásirányító elem biztosítja, hogy az oldat az 1 sejthordozóval kapcsolatba kerüljön. A 3B. ábrán ugyanennek az elrendezésnek vázlatos oldalnézeti metszete látható.

Az 1 sejthordozókat befogadó 10 első hordozószerkezeten különböző személyektől (betegektől) vett mintákat tartalmazó I sejthordozók helyezhetők el a 12 csatorna mentén egyetlen bemélyedésben, míg az ugyanahhoz a személyhez tartozó mintákat tartalmazó 1 sejthordozók a 12 csatornára merőlegesen vannak elrendezve. A 12 csatorna egyetlen tesztvizsgálat elvégzésére szolgál, és így a tesztvizsgálatok számát meg lehet határozni azzal, hogy az átfolyáskamrában a 12 csatornák közül hányat alkalmazunk.

A 12 csatornák bármelyikén átáramló oldat az 1 sejthordozókon az adott 12 csatorna mentén elrendezett sejtek mindegyikét benedvesíti, és ezzel a különböző betegektől vett minták sejtjeinek vizsgálatát lehetővé teszi. Az 1 sejthordozók 17 üveglappal boríthatok le, aminek révén nagy törésmutatójú folyadék alkalmazása válik lehetővé optikai

-611 letapogatási (scanning) vizsgálatokhoz, ha ez kívánatos.

A 2A. ábra szerinti kivitelben az átfolyáskamra hét 12 csatornát tartalmaz. Ebben az esetben az egyes betegektől vett minták sejtjei hét 1 sejthordozóra kerülnek, vagyis minden 12 csatornára egy-egy jut belőlük, míg minden csatorna mentén különböző betegektől származó sejteket tartalmazó 1 sejthordozók vannak elrendezve, mint ez a 2D. ábrán látható. Az ilyen elrendezés révén lehetővé válik, hogy a különböző betegektől származó sejteket az egyes csatornákban különböző anyagokkal stimuláljuk, mégpedig kívánság szerint akár egyidejűleg, akár meghatározott időbeli sorrendben, és ezt követően az egyes sejtek által a különböző anyagokra, hatásokra adott válaszokat elemezzük.' A továbbiakban leírt kiviteli alakok is több 12 csatornát tartalmaznak. Ennek megfelelően minden többcsatornás kiviteli alakban az egyes betegektől származó sejteket tartalmazó 1 sejthordozók’száma általában egyenlő a csatornák számával. A továbbiakból azonban az is kitűnik, hogy a találmány nem korlátozható az ilyen többcsatornás elrendezésekre. Kitűnt, hogy miután a sejteket meghatározott anyagokkal vagy módon ingereltük és vizsgáltuk, megtisztítást követően az ingerlés előtti állapotukba visszatéríthetek, ha erre alkalmas anyagokkal kezeljük őket. Ilyen eljárás esetében elegendő lehet egyetlen 1 sejthordozó előkészítése betegenként. Az ezen elhelyezett sejteket sorban különböző anyagokkal stimuláljuk, minden stimulálás után állapotukat elemezzük, majd a következő stimulálás és ezt követő elemzés előtt őket alkalmas módon előkészítjük.

Az átfolyáskamra más kiviteli alakjainak elemzése előtt olyan ajánlott módszer és berendezés részleteit ismertetjük, amellyel az 1 sejthordozó meghatározott helyein elrendezett és az átfolyáskamrába behelyezett sejtek egyedi elemzése lehetővé válik. Itt újból hivatkozunk az SCM-tesztre, amint azt a bevezetőben említett munkában L. és B. Cerceck leírta. A szerzők szerint legalább két olyan jellegzetes tulajdonság észlelhető a lymphociták részcsoportjában, amelyek alapján az SCM-teszt elvégzése lehetővé válik. Amikor flureszcein molekulát kötünk a lymphocitákhoz, amit a fluorokromázis néven ismert jelenség felhasználásával lehet elérni, a nyugalmi fázisból az ingerületi fázisba való átmenet során a lymphocitákba beépült fluoreszcein fluoreszcenciájának polarizációs jellemzői jól meghatározott módon megváltoznak. A lymphociták, amelyekben a stimulációs folyamat kritikus változásokat hozhat létre, legalább két jellemző tulajdonságban⁴ térnek el a többi lymphocitától, mégpedig a fajlagos sűrűségben és abban a tényben, hogy ilyen sejtek esetében a fluoreszcens polarizáció viszonylag nagy értéke csak az 510 nm körüli igen szűk emissziós sávban észlelhető.

Ez a második jellemző igen előnyösen használható a megfelelő lymphociták megjelölésére vagy azonosítására a teljes populáción belül, és ily módon nincs szükség fizikai elválasztásukra. Ennek megfelelően, az ezt a különleges spektrális viselkedést mutató lymphociták csoportján kell a további stimulálási műveleteket elvégezni, míg az egyéb lymphocitákat a rendszerfejlesztési technikák során figyelmen kívül hagyhatjuk. Másként megfogalmazva, a találmánnyal összhangban először az 1 sejthordozót felhasználjuk ahhoz, hogy egy adott személyből vett vérmintákban a lymphocitákat más típusú sejtektől elkülönítsük, és ehhez az 1 sejthordozó 2 nyílásait hasznosítjuk. Ennek eredményeként a 2 nyílásokat egy-egy lymphocita tölti ki. A kisebb sejtek általában áthaladnak a nyíláson, feleslegük a nagyobb sejtekkel együtt az 1 sejthordozó felső felületéről lemosható. Ezt követően az 1 sejthordozón levő lymphocitákat fluoreszcein-diacetátot és pufferolt foszfátsót (FDA + PBS) tartalmazó oldattal lemossuk, aminek révén a fluorokromázis jelenségei' lejátszódnak és a fluoreszcein a sejtekhez kötődik, majd a színkép szűk, 510 nm körüli sávjában a fluoreszcens polarizációt minden sejtre megmérjük és rögzítjük. A rögzített értékeket elemezzük, és csak azokat a lymphocita sejteket soroljuk be a további vizsgálatok végzésére kijelölt részcsoportba, amelyek fluoreszcens polarizációja viszonylag magas értéket mutat. Mivel a 2 nyílások mátrixában minden sejt címe ismeretes, ennek megfelelően a részcsoportba tartozó sejteket címük alapján határozzuk meg. Miután ezzel a részcsoportba tartozó sejtek azonosítása lehetővé vált, minden további mérést és/vagy megfigyelést, amit el kell végezni, csak a részcsoportba tartozó sejtekkel kapcsolatban hajtunk végre. Eközben a részcsoportba nem tartozó, de az 1 sejthordozón jelen levő más lymphocitasejteket figyelmen kívül hagyjuk, tehát ezekkel kapcsolatban semmiféle mérést vagy megfigyelést nem végzünk. Mivel ennek a megoldásnak az alkalmazásával a méréseket és a megfigyeléseket csak egy meghatározott részcsoportba tartozó sejtek esetében kell elvégezni, az elemzés ideje jelentősen lerövidül és ez rendkívül fontos. Ezen túlmenően talán még fontosabb az a tény, hogy mivel minden sejt címe ismeretes, minden stimuláló hatással szemben a sejtek egyedi válasza megállapítható, így szelektív jellegű információ nyerhető. Ez a tény igen nagy jelentőségű, annál is inkább, mivel az ismert mérési és megfigyelési eljárások sejtek nagyobb csoportját ölelik fel, vagy átfolyási rendszerek alkalmazását igénylik. Amikor egy-egy sejtet mikroszkóp alatt figyelünk meg, akkor is igen nehéz több stimulálást alkalmazni és az ingerválaszokat egyedileg értékelni. Ez abból következik, hogy az egyedi sejteket nem egy rögzített mátrix szerint minden sejt helyének ismerete mellett helyezték el, és ezért a mérés és/vagy megfigyelés 7

-7195245 eszközét nem lehetett ismételt módon olyan helyre irányítani, hogy ugyanannak a sejtnek a többszöri megfigyelése lehetővé váljon.

A fluoreszcens emissziót két hullámhosszon, mégpedig 510 nm és 515 nm értékeken mérve a polarizáció egy minimális szintjét figyelembe véve a kiválasztásra alkalmas kritérium határozható meg. Ennek megfelelően a lymphociták vizsgálandó részcsoportjába tartozó sejteket az első lépésben úgy azonosítjuk, hogy az említett minimális szint elérését az 1 sejthordozón levő minden sejttel kapcsolatban ellenőrizzük, vagyis a kritérium teljesülését vizsgáljuk. Stimulált állapotba való átmenet során az említett részcsoportba tartozó stimulált sejtek polarizációs foka mintegy 0,14 körüli értékre csökken az 510 nm emissziós hullámhosszon. A polarizációs foknak ezt a csökkenését csak az említett részcsoport sejtjeire lehet megfigyelni.

A 4. ábrára hivatkozva a továbbiakban olyan elrendezést ismertetünk, amelyben az említett tesztek az 1 sejthordozón elhelyezkedő minden sejt esetében elvégezhető. Az 1 sejthordozón levő sejteket először általában foszfáttal pufferolt foszfátsó (PBS) és fluoreszcein-diacetát (FDA) oldatokkal mossuk át. Ez utóbbi a fluorokromázis jelensége révén behatol a lymphocita sejtekbe és ott fluoreszceinné alakul át. Ezt követően 470 nm hullámhosszú sugárzással a fluoreszceint gerjesztjük, és ezzel a jellegzetes emiszsziós spektrumú sugárzását kiváltjuk. Az 1 sejthordozón levő lymphocita-sejtek közül a kívánt részcsoportba tartozókat ezt követően oly módon választjuk ki, hogy 20 optikai elemzőkészülékkel (4. ábra) az 1 sejthordozón levő minden sejtet külön-külön egyenként megfigyeljük.

A 20 optikai elemzőkészülék (4. ábra) 21 cirkóniumlámpát (vagy megfelelő lézert tartalmaz, amely 470,1 nm és 468 nm hullámhosszúságú csúcsokkal jellemzett fény kibocsátására alkalmas, és így nincs szükség olyan gerjesztő szűrő alkalmazására, amely az 510 nm és 515 nm, tehát a vizsgálat szempontjából érdekes hullámhosszú fény kiküszöbölésére alkalmas lenne. A fény a 4. ábra síkjára merőlegesen síkban polarizált, ezt 22 polarizátor biztosítja, amelyre 21a gyűjtőlencsével összefogott fénynyaláb jut. A rajzon körök jelzik a síkbeli polarizációt. A síkban polarizált fény nyalábja 23 tükörre jut, amely nyalábosztóként működik, mégpedig oly módon, hogy az 500 nm-nél nagyobb hullámhosszúságú fényt átengedi, míg az ez alatti hullámhosszokat visszatükrözi. íly módon a 21 fényforrásból származó fény az 1 sejthordozóra jut 24 lencsén keresztül.

Az egyes sejtek által kibocsátott fluoreszcens fényt az 1 sejthordozó felületén külön-külön mérjük és rögzítjük. A fluoreszcens fény 23 tükrön és 24a lencsén keresztül 25 polarizátorra jut, amely például Glenn-Thompson-féle polarizátor. A 25 polarizátor 8 a fluoreszcens fényt két részre bontja, mégpedig a rajz síkjával párhuzamos síkban polarizált nyalábra (ezt a 4. ábrán vonalkák jelzik), amely az eredeti beesési irányban halad tovább, valamint a rajz síkjára merőlegesen polarizált másik nyalábra (ezt mutatják a körök), amit a beesési irányra merőlegesen a 25 polarizátor tükröz és irányban továbbít. A polarizált nyalábokat 26 és 27 nyalábosztók két-két egyenlő intenzitású és egymásra merőleges nyalábra osztják fel. Az így kialakított négy fénynyaláb 28, 29, 28’, 29’ interferenciaszürőkön halad át, amelyek 510 nm-re és 515 nm-re vannak beállítva. A szűrők után a fénynyaláb intenzitását 30, 31 fotosokszorozók mérik, amelyekből egyidejűleg négyet alkalmazunk.

A mért négy intenzitásértéket a 16. ábra szerinti számítógépes rendszerben tároljuk,és eközben meghatározzuk mindkét hullámhosszra, tehát az 510 nm és az 515 nm értékre a polarizáció fokát. A polarizáció P fokát, mint ismeretes a

P= (I;z—I-l)/(!,,—1±) képlet határozza meg, ahol I„ a párhuzamos, l-í a merőleges polarizációjú fénynyaláb intenzitása. A P_5IO és P_S|₅ kiszámítása után valós időben képezzük a P510/P515 hányadost, amelyet ellenőrző értéknek tekintünk. Miután minden sejtet ellenőriztünk, a vonatkozó ellenőrző értékeket meghatároztuk és tároljuk, a későbbiekben nagyon egyszerű kiválasztani azokat a sejteket, amelyekre az ellenőrző érték egy adott szintet elér, például nem marad meg 1,3, mint határérték alatt. Ezeket a sejteket a továbbvizsgálandó részcsoportba soroljuk. Miután ezt a meghatározást egyszer elvégeztük, a következő méréseket vagy megfigyeléseket, a különböző stimuláló hatásokkal szemben kapott válaszok rögzítését csak azokra a sejtekre vonatkozóan végezzük el, amelyek a kijelölt részcsoportba tartoznak, míg a többi sejtet figyelmen kívül hagyjuk. így például a részcsoportba tartozó sejteket újból ellenőrizhetjük abból a szempontból, hogy a polarizációs fok változása mekkora, vajon ez elegendő-e ahhoz, hogy ezeket a sejteket aktívaknak tekinthessük, és így alkalmasak lehetnek-e egy-egy antigén azonosítására.

A fentiekből nyilvánvaló, hogy az egyes sejtek egyedi elemzése csak akkor végezhető el, ha a 20 optikai elemzőkészülék optikai felbontóképessége egy sejtátmérő nagyságrendjébe esik, amit a mikroszkóp objektívjével kell átfogni. A sejteket tartalmazó hordozót lépésenként toljuk el a mikroszkóp alatt, a perforálásban kialakított egyik 2 nyílástól a másikig. Ennek megfelelően igen pontos működésű mechanikai elhelyező rendszerre van szükség, amilyent például a 16. ábra mutat be.

Az optikai elemzőkészülék egy másik kiviteli alakjában az 1 sejthordozó iépéserikénti eltolásának követelményét azzal kerüljük el.

-8195245 hogy gerjesztő fénysugárként lézernyalábot használunk. Ilyen berendezést mutat vázlatosan az 5. ábra. Az ábra szerinti készülékben 131 lézernyaláb, amelynek hullámhosszát a mérések követelményeinek megfelelően választjuk, vezérlő optikai elem, például 130 forgótükör felületére esik. A 131 lézernyaláb keresztmetszetét lényegében egy-egy sejt nagyságának megfelelően választjuk. A 130 forgótükör vagy hasonló működésű fényvisszaverő elem alkalmazása révén elérhető, hogy a 131 lézernyaláb a 2 nyílásokban levő sejteket egymás után besugározza, ezzel külön-külön mindegyiket ingerelje. Egy adott időpillanatban csak egyetlen sejtre esik a 131 lézernyaláb, és ezért csak ez a sejt tud az adott időpillanatban fluoreszcens fényt kibocsátani. A fényemissziót 131X optikai elemző észleli, amely az 1 sejthordozónak a 131 lézernyalábbal nem megvilágított oldalával szemben helyezkedik el. Ennek vizuális érzékelő mezője az 1 sejthordozó teljes felületét felöleli. Amikor emissziós jelet érzékel, ennek a jelnek az intenzitását a 131 lézernyaláb helyzetével összefüggésbe hozza, és ily módon a kapott és elemzett fényjelzés korrelációba hozható· a megfelelő sejt helyzetével, vagyis az emittált fényforrással azonosítható.'Az 5. ábrából jól kitűnik, hogy a gerjesztést az 1 sejthordozó 2 nyílásainak nagyobb keresztmetszetű oldala felöl végezzük. Optikai elemzés céljából éppen az a célszerű, hogy az emittált fény a 2 nyílások kisebb keresztmetszetű részénél hagyja el az 1 sejthordozót, aminek okait még a továbbiakban elemezni fogjuk.

Amikor a találmány szerinti eljárást és berendezést alkalmazó előnyös elemzőrendszereket tárgyaljuk, teljesen nyilvánvaló, hogy analóg módon más paraméterek mérésere alkalmas rendszerek is kifejleszthetők, amelyekben például az 1 sejthordozóban levő minden egyes sejtre fókuszált fényt lehet juttatni. A mérhető paraméterek közé kell sorolni például a fényintenzitást, az optikai sűrűséget, a törésmutatót, az elektromágneses jellemzőket, az abszorpciót és a szórást. A letapogatási (scanning) eljárások természetesen nem csak a látható fényben, vagy ultraibolya, inkravörös sugárzásban, esetleg elektronsugáralkalmazásával hajthatók végre, hanem úgy is, hogy minden sejttel fizikai kontaktust teremtünk. A mérhető vagy megfigyelhető tulajdonságok közé kell ezenkívül sorolni a mágneses magrezonanciát (NMR), a pH-értéket, továbbá a sejtmorfológiát és annak különböző ingerlések hatására bekövetkező változásait. így például egy, a sejtekre közvetlenül ráirányított mikroszkóp kimenete megfelelő alakfelismerő rendszer regisztráló készülékére is vezethető, aminek eredményeként kétdimenziós kép nyerhető a sejtek alakjáról. Ugyanígy a sejtek hőmérséklete, illetve hőmérsékletváltozása mérhető és rögzíthető.

Összefoglalva: a sejteknek tetszőlegesen egy vagy több mérhető vagy megfigyelhető jellemzője értékelhető, és ennek során mindig csak egy-egy sejten végezzük a szükséges műveleteket. Mivel minden sejt címe ismeretes, ezért mindenkor lehetséges visszatérni egy adott sejthez a szükséges mérés vagy megfigyelés újbóli vagy pótlólagos elvégzésére. Minden sejtre vonatkozóan a mérések és megfigyelések eredményei rögzíthetők, így minden egyes sejtre egyedi információ nyerhető. Ezek az információk összekapcsol ha tők diagnosztikai elemzésekkel, és ennek megfelelően rendkívül értékes következtetések alapjai lehetnek.

A találmány szerinti berendezésnek a klinikai gyakorlatban igen jól hasznosítható kiviteli alakját a 6A., 6B., és 6C. ábra alapján ismertetjük részletesen. Ezeken az ábrákon módosított 40 első hordozószerkezet látható, amely nagyobb számú 1 sejthordozót tud befogadni. A 40 első hordozószerkezet hullámformájú, és így 41 völgyei a 12 csatornában folyó oldatba menthetők. A 9 illesztésekbe a 8 fülek segítségével behelyezett 1 sejthordozók a 41 völgyek fenékrészére illeszkednek, benedvesíthetők,és így rajtuk a sejtek alulról és felülről is ingerelhetők. Ennek megfelelően ebben a kiviteli alakban nincs szükség olyan 16 áramlásirányító elemekre, amelyekről a 2A. és 3B. ábrák kapcsán már szó volt. A 2A., 2B., 2C. és 2D. ábrákkal kapcsolatban már említettük, hogy az 1 sejthordozók, amelyek egy adott 12 csatornában, vagyis 41 völgyben vannak elrendezve, különböző betegekhez tartoznak. Ennek ellenére nem áll fenn annak a veszélye, hogy kevert stimulálási jelenséget kapunk, mivel az 1 sejthordozók között nincs fizikai kapcsolat. Még akkor is, ha egy sejt valamelyik 1 sejthordozóról leválna, nagyon kicsi annak a válószínűsége, hogy valamely másik 1 sejthordozón lerakódik, sokkal inkább várható, hogy a 12 csatornán át az elrendezésből kisodródik. A 6A. ábra szerint az 1 sejthordozók csak egyetlen 41 völgyben vannak elrendezve. A gyakorlatban azonban minden 41 völgyben lehet egy-egy 1 sejthordozó, amely egy adott betegről vett minta sejtjeit tartalmazza.

A 6C. ábra szerint az 1 sejthordozó a 40 első hordozószerkezetből kiemelhető. A sejtek helyzetének egyértelmű meghatározása céljából az 1 sejthordozó 40 első hordozószerkezetben 9 illesztésekbe helyezhető 8 fülekkel van ellátva.

Mivel az itt ismertetett kiviteli alak szerint az 1 sejthordozók a 12 csatornán áramló oldatba merülnek, a sejtek letapogatására szolgáló mikroszkóp optikai rendszere 42 kvarctömbbel van kialakítva (6B. ábra), amely az objektív palástjára illeszkedik. A 12 csatornák és a 41 völgyek méretei olyanok, hogy ezzel az objektív és az 1 sejthordozók szükséges mértékű relatív mozgása válik lehetővé, vagyis az 1 sejthordozó teljes felületén a sejtek vizsgálata elvégezhető.

-9195245

Mint a fentiekből kitűnik, a sejtek egy adott részcsoportjának kiválasztása céljából, amikor is a fentiekben ismertetett vezérlő értékeket használjuk ki, a 12 csatornákat először pufferolt foszfátsó és fluoreszcein-diacetát (PBS + FDA) oldattal töltjük ki, aminek révén a kívánt sejtek kiválasztására minden egyes 1 sejthordozón mérési ciklust végezhetünk, fgy kapjuk a kívánt részcsoportokat. Ezt követően a különböző stimuláló közegekkel, környezetükkel szembeni sejtviselkedés meghatározása céljából az egyes 12 csatornákat különböző stimuláló anyagokat tartalmazó oldattal töltjük ki, és így például meghatározható a fito-hemaglutinin (PHA), EF, CaBP, tumorkivonatok, vagy bármely más kívánt mitogén, illetve antigén értékelendő hatása. Ezt követően csak a kiválasztott részcsoportba tartozó sejtek válaszait figyeljük és szükség szerint rögzítjük.

Az említett stimuláló közegeket vizsgálva megfigyelhető volt, hogy amikor a sejtet csak egyetlen közeg stimuláló hatása alatt vizsgáljuk, semmiféle befolyást nem gyakorlunk a következő stimulálási folyamatra, ha az előző stimuláláshoz használt anyagot, illetve jelenség hatását a következő vizsgálat előtt átmosással, illetve más alkalmas módon semlegesítjük. Ezzel az eljárással elkerülhető, hogy a stimuláló közegek között közvetlen kölcsönhatás vagy interferencia lépjen fel. Az előzőekben túlmenően az is kitűnt, hogy a sejteket az 1 sejthordozón rögzítve aktivációs szintjük nem változik. így az ingerlés! folyamat az adott helyen levő sejtben az 1 sejthordozó felhasználása mellett mindenkor ismételhető, mégpedig különböző aktiváló közegek, anyagok alkalmazásával, fgy az egyes, a részcsoportba tartozó egyedi sejtek pontos válaszfolyamata a vizsgálathoz használt aktiválási folyamatokban jól meghatározható, idő szerinti változása követhető, és így az aktivált sejtek pontos száma és válasza értékelhető. Az 1 sejthordozón kialakított mátrixban az egyes sejtek helye az előzőekben leírt mérési ciklusok során és után változatlan marad.

Az 1 sejthordozókkal kapcsolatban a fentiekben leírt tartószerkezetek többsége felülről történő letapogatásra van kialakítva, vagyis például az emittált fluoreszcens fényt az I sejthordozók 2 nyílásainak felső oldaláról lehet elemezni. Ennek előnye, hogy azonos optikai rendszer alkalmazható az optikai vizsgálatokhoz és elemzésekhez. A továbbiakban leírandó kiviteli alakokban az optikai elemző úgy helyezkedik el, hogy a 2 nyílások kisebb keresztmetszetű végén, vagy fenékrészén keletkező fényemisszió felfogására legyen alkalmas, fgy a sejt környezetében levő íluoreszcein fényemissziója által okozott zavaró hatások nemkívánatos optikai sugárzási hátteret jelentenek. Amikor a 2 nyílásokat hátulról vagy kisebb keresztmetszetű 10 felületekről tekintjük, ez a sugárzási háttér jelentősen lecsökkenthető, mivel a beszűkülő lyukpalást olyan ernyőként viselkedik, amely a nemkívánatos fényemissziót lezárja. Ezen túlmenően ingerlés esetén a nyílásokba behatoló fény, ha a nagyobb keresztmetszetű oldalról jut be, az összeszűkülő falakon tükröződik, és így mind a belső fény, mind pedig a fluoreszcens fény végeredményben visszaverődik. Az optikai elemzések javasolt elvégzési módjának másik előnyös hatása az, hogy az 1 sejthordozók adott pontjában csak a megfelelő nyílásban elhelyezkedő sejt íényemiszszióját mérjük, míg más olyan sejt, amely esetlegesen az 1 sejthordozó felső felületén jelen van, nem befolyásolja a mérési eredményt. További előnyt kell abban a tényben látni, hogy a 2 nyílások kisebb oldala felől sokkal könnyebb a gyakorlatban az egyes sejtektől származó fényemisszió külön-külön történő elemzése, nem áll fenn a szomszédos sejtek által emittált íénynyalábok kölcsönhatásának veszélye, amivel ellenkező esetben számolni kellene, hacsak a 2 nyílásokhoz viszonyítva nem a lehető legnagyobb pontossággal állítjuk be az optikai rendszert.

A 7A., 7B., 8. és 9. ábrán olyan kiviteli alakok láthatók, melyek révén az optikai elemzés a fentieknek megfelelően végezhető. A 7A. és 7B. ábrán látható és mikroszkóppal ellátott optikai elemzővel együttműködő kiviteli alakban átfolyáskamra 110 oldalfala rugalmas (például gumiból készült) 111 üveghordozókat tartalmaz, amelyek mindegyike 112 üveglapot fog meg. A 112 üveglapok az 1 sejthordozó egy jól meghatározott pontjához (egy kiválasztott sejthez) viszonyítva vannak elrendezve. A rugalmas 111 üveghordozó a 112 üveglap és az átfolyáskamra 110 oldalfala között folyadékzáró kapcsolatot biztosít, és lehetővé teszi, hogy a mikroszkópot 113 objektív révén elegendően közel hozzuk az 1 sejthordozóhoz. így az egyedi sejtek vagy 2 nyílások alulról megfigyelhetők (7B. ábra). Ha a mikroszkóp 113 objektívje alsó helyzetben van (7A. ábra), az átfolyáskamra csatornája teljes szélességében szabad marad. Az itt bemutatott berendezés egy kiviteli alakjában (8. ábra) az átfolyáskamra alsó és oldalfalai mind rugalmas anyagból, előnyösen gumiból készülnek és egy egységet alkotnak.

Ugyanennek a berendezésnek egy másik kiviteli alakjában (9. ábra) az optikai elemzést felső oldalról kiindulva végezzük. Itt az 1 sejthordozók 114 tartószerkezete 115 átfolyáskamra alsó részén van elrendezve, miután megfelelő berendezéssel a sejteket felvittük (ezt a berendezést a 12A. és 12B. ábrával kapcsolatban ismertetjük részletesen), és így az 1 sejthordozókban kialakított kúpos 2 nyílások lefelé növekvő átmérővel vannak elrendezve. Ahhoz, hogy a sejteket a kívánt helyen tartsuk,és az 1 sejthordozó 2 nyílásaiban hatékonyan megfogjuk, nyomás-10195245 különbséget hozunk létre az átfolyáskamra 115 alsó része és 116 felső része között (9. ábra), mégpedig oly módon, hogy a 115 alsó részben a folyadékot valamivel nagyobb nyomás alatt engedjük át, mint a 116 felső részben. A 117 tömítőelemek biztosítják, hogy a 115 alsó és a 116 felső rész között ne legyen folyadékút. Ha ezt a kiviteli alakot alkalmazzuk, célszerű a 4. ábrán látható optikai elemző felhasználása az 1 sejthordozón levő sejtek letapogatására, és egyidejűleg az előbb említett előnyök is biztosíthatók.

Az 1 sejthordozón a vizsgálatok szempontjából érdekes sejtek populációjának vagy részcsoportjának kiválasztására alkalmas módszerek problémájára visszatérve — ezt elvileg lényegében az előzőén leírt hagyományos ismert módokon hajthatjuk végre — a 6., 7A. és 7B. ábra olyan rendszert mutat, amellyel egyidejűleg egy adott sejtpopuláció kiválogatható a sejtek egy más csoportjából. Ez a rendszer a sejtszétválasztás hagyományos, sok hátrányos jellemzőt mutató módszerekkel megvalósuló rendszerektől alapvetően különbözik. Ezt a kiviteli alakot is a lymphociták kiválasztásának problémája kapcsán írjuk le, a fentiekben ismertetett SCM-tesztnek vérvizsgálat során történő alkalmazása kapcsán.

Mint a 10. és 11. ábrából látszik, a rendszer 50 hordozószerkezettel van kialakítva, amely a 6A. ábra szerinti átfolyáskamrára illeszthető és 51 csövek rendszerén nyugszik. A csőrendszer minden 51 csöve 52 alsó és 53 felső részből áll. Az 52 alsó rész folyadék vagy gáz (levegő) vezetésére alkalmasan van kialakítva, és itt viszonylag kis nyomás uralkodik. Ennek révén az 53 felső részből a folyadékok és a nemkívánatos méretű vérsejtek kiszívhatok. Az 53 felső részben 54 hidak, és ez utóbbiak alatt 55 átvezetések vannak kialakítva, amelyek között az 52 alsó rész felé irányuló 56 elszívónyílások vannak. Az 56 elszívónyílások az 50 hordozószerkezetben elhelyezett 1 sejthordozókat fogadják be. A 10. ábra szerinti kiviteli alakban csak egyetlen betegtől származó sejtmintákat tartalmazó 1 sejthordozó látható. Az 52 alsó és az 53 felső rész megfelelő folyadékot, például pufferolt foszfátsó (PBS) oldatát bevezető egységre csatlakoztatható. Mint az a 11. ábra keresztmetszeti vázlatából jól lá+szik, az 53 felső részben a folyadék az 54 hidak alatt halad át, és az 50 hordozószerkezetben az 57 bevágásokban folyik tovább. Az 52 alsó részben 58 kiemelkedések kényszerítik a folyadékot arra, hogy az 56 elszívónyílások környezetében és az 55 átvezetésekben gyorsabban folyjék, és így megfelelő nyomásviszonyok alakulhassanak ki. Ennek következtében az 53 felső részben áramló folyadék egy része az 56 elszívónyílások és az 55 átvezetések révén az 52 alsó részbe áramlik át.

Az 50 hordozószerkezetben cserélhetően 60 vérbevezető szerkezet van elrendezve, amelyből az 1 sejthordozók vérmintával tölthetők fel. A 60 vérbevezető szerkezet 61 lábakkal van ellátva, amelyek feladata annak megakadályozása, hogy az 50 hordozószerkezet 57 bevágásaiban a folyadék - az egyik bemélyedésből a másikba átfolyjék.

A fentiekben ismertetett berendezésben végrehajtott sejtelválasztás elméleti alapjainak megértéséhez a következő tényeket kell figyelembe venni:

a) a vizsgálat szempontjából érdekes lymphociták méretei kb. 7 μπι,

b) a makrofágok, granulociták jellemző méretei kb. 20...35 pm,

c) az eritrociták jellemző méretei kb. 3... 5 pm,

d) ismertek nagy, 15 pm-es lymphociták is,

e) a vérlemezkék méretei figyelmen kívül hagyhatók,

f) a sejtek felrobbanhatnak, ha desztillált vízben maradnak, és

g) az eritrociták élettartama desztillált vízben sokkal kisebb, mint a lymphocitáké.

Az 50 hordozószerkezetet az 1 sejthordozókkal együtt először a csőrendszer 51 csöveire helyezzük el oly módon, hogy az első (a csatornákra merőleges) horony 1 sejthordozói a nyílások felett helyezkednek el. A 60 vérbevezető eszközt 61 lábaival együtt az 1 sejthordozó adott oldalán helyezzük el. Az egész egységet a 11. ábra szerint állítjuk össze. Egy pácienstől vett vért tartalmazó fecskendőt 62 hordozón helyezünk el. A 10. ábrán két különböző pácienstől származó minták részére két ilyen hordozó látható, amelyekből csöveken keresztül jut tovább a vérminta. A minta anyagának áramlását a 62 hordozóban létrehozott,megfelelő nyomás révén szabályozzuk. A csövek P, és P₂ kimenetekkel vannak ellátva, ahol a két különböző pácienstől származó vér az első néhány nyomásimpulzus után már megjelenik.

A nyomásimpulzusok hatására előbb vagy utóbb egy-egy vércsepp esik mindegyik 1 sejthordozóra. Az 1 sejthordozókban a 2 nyílások méretei olyanok, hogy a vér nem tud az 1 sejthordozó felső oldaláról az alsó oldalra kerülni. Ez utóbbi alatt nyomáshiányos teret hozunk létre, mégpedig a cső 52 alsó részében, a fentieknek megfelelően, például úgy, hogy az 52 alsó részbe pufferolt foszfátsó (PBS) oldatát engedjük. Ennek hatására a vér szinte azonnal az 1 sejthordozó alá kerül.

Az 1 sejthordozón a kisebb méretű sejtek áthaladnak és a PBS-oldat áramával kimosódnak. Ugyanez történik a nyílások felső részében levő és ezért a jelenlevő lymphociták méreténél nagyobb sejtekkel, amelyek viszont fennakadnak az 1 sejthordozón és közülük a legnagyobbak a lemosás ellenére is ott maradnak. Az 1 sejthordozó eltömődésének megakadályozására a vér bevezetését megállítjuk, és a PBS-oldatot az 1 sejthordozó felső szintjén is megfelelő mennyiségben átvezetjük 11

-11195245 a nagyobb sejtek kimosása céljából. Ezek nagy többsége az 55 elszívónyílásokba jut (11. ábra). A sejtek kisebbik része a következő 1 sejthordozóra jut a folyadékárammal és ott eltávozik. Mint az előbbiekben már említettük, a csatornák irányára merőlegesen elhelyezett minden 1 sejthordozót egyazon betegtől származó vérmintával telítünk. Ennek megfelelően nem fordulhat elő, hogy különböző betegektől származó minták keverednek.

A vizsgálat következő szakaszában az 53 felső részben az áramlást megállítjuk és egy újabb vércseppet juttatunk a 62 hordozóból a megfelelő 1 sejthordozóra. Az első néhány vércsepp után a „felrobbant sejteket eltávolítjuk. A folyamatot addig ismételjük, míg a szükséges 1 sejthordozókat lényegében nem telítjük. Erre vonatkozóan durva, de megfelelő közelítést adhat az 1 sejthordozók villamos ellenállásának mérése minden egyes vércsepp után. A desztillált víz olyan időn keresztül folyik, hogy ez alatt hatásának következtében az eritrocitasejtek megsemmisülhessenek. A desztillált víz ugyanis a sejtek megduzzadását okozza, és ez előbb-utóbb fel robbanásokhoz vezet, ami az eritrociták esetében elpusztulásukat, míg a lymphocitáknál azt jelenti, hogy a sejtek az 1 sejthordozó 2 nyílásaiba erőteljesen befeszülnek. Megfelelő időtartam elteltével PBS-oldatot vezetünk be. A felrobbant eritrocitáktól megszabadult anyag nem befolyásolhatja már a lymphocitákat, míg a folyamatos oldatáramlással a nemkívánt anyagok eltávolítása érhető el.

A 2 nyílások mátrixát elektromosan feltöltve majd kisütve, esetleg váltakozó elektromágneses teret alkalmazva ugyanolyan hatás érhető el, mintha a mátrixot ultrahang hatásának tennénk ki, vagy hasonló technikákat alkalmaznánk.

Ez a folyamat a mosással egyidejűleg, azt kiegészítő,módon alkalmazható. A mérésekhez elegendő egy-egy betegtől legfeljebb 1 cm³ vért levenni, és azt a megfelelő P,, P₂ kimenetű 62 hordozókba juttatni.

Az elválasztási folyamat legfeljebb 5 percet vesz igénybe. Nincs felső határa annak, hogy hány vérmintából lehet egyszerre a sejteket kiválasztani. Az 50 hordozószerkezetet ezt követően kiemeljük az elválasztási rendszerből és a 4. ábra szerinti átfolyáskamrába illesztjük, ahol az előzőekben leírt optikai letapogatást lehet elvégezni.

A 9. ábra szerint 114 hordozószerkezethez illeszkedő, hasonló elválasztási rendszer alakítható ki, mint az a 12A. és 12B. ábrára való hivatkozással ismertetésre került. Ebben a rendszerben 120 alaplemez 121 csatornákkal van kialakítva, amelyekben folyadék áramlik,és az 1 sejthordozó alatt, 56 leszívónyílások környékén szükséges nyomáshiányos teret hoz létre. Ebből a célból 122 kiemelkedések vannak illesztve a 121 csatorna aljához. A 114 hordozószerkezet cserélhetően van a 120 alap12 lemezen elrendezve, és így a benne lévő 1 sejthordozók a 122 kiemelkedésekkel vannak kapcsolatban, mint az a 12B. ábrán látható. A kúpos 2 nyílások felfelé növekvő átmérővel vannak elrendezve, vagyis 123 támasztóelem felé nyílnak, amely támasztóelem a

10. ábra szerinti 60 vérbevezető szerkezet megtámasztásához hasonló funkciót lát el. A 123 támasztóelem az 1 sejthordozókat megfogja, mégpedig nyomáskülönbség hatására, mint az a 10. ábra kapcsán már ismertetésre került. Ebben az esetben azonban lehetőség nyílik a vérellátás hatékonyságának javítására oly módon, hogy megfelelő szétosztó elemeket alkalmazunk, amelyek a hordozókhoz képest elmozdíthatóan vannak elrendezve, ahogy ez a 13A., 13B., 13C. és 14. ábrából látható. A 13A., 13B és 13C. ábrák olyan kiviteli alakot mutatnak, amelynek 124 csúszólemezei vannak, és ezek a 121 csatornával illesztett 123 támasztóelemekben vannak elrendezve.

A tápellátó vezeték minden kimenetén rugalmas anyagú 125 szétosztó elem helyezhető el, mint ez a 13B. és 13C. ábrán látható. A 13B. ábrán a 124 csúszólemez irányára merőlegesen elrendezett 125 szétosztó elem látható, míg a 13C. ábra a 124 csúszólemez hossztengelyének irányában felvett keresztmetszetet mutat. A rugalmas anyagú 125 szétosztó elem szélessége nagyjából megfelel az alkalmazott hordozó oldalhosszának és tulajdonképpen kis méretű kimenetet alkot, amely vonal mentén a hordozófelületen eltolható, amikor a 124 csúszólemezt mozgatjuk, és ily módon minden 1 sejthordozót a sejtek vékony rétegével lehet bevonni. Ezt követően kezdődhet meg az előzőekben már ismertetett átmosás.

A 14. ábra a 125 szétosztó elem egy más lehetséges változatát mutatja be. Az itt keresztmetszetben látható elem a 121 csatornára merőlegesen helyezkedik el, és a 121 csatorna hosszirányában 126 bolygótengely helyezkedik el, míg benne 127 vezeték van kialakítva, amely minden 1 sejthordozónál kimenettel van ellátva és ez 128 elosztókefét tartalmaz. Amikor az elemzendő folyadékot, például a vért az 1 sejthordozóra juttatjuk, a 126 bolygótengely néhányszor elfordul,és ezzel lehetővé teszi a sejtek kinyomását az 1 sejthordozóra.

Miután az előzőekben leírt kiviteli alakban a vérbevezetést és a sejtek „durva szétválasztását különleges elválasztóegységgel elvégeztük, az azt befogadó hordozószerkezetet átfolyáskamrába kell helyezni optikai letapogatás céljából; egyes esetekben az említett lépés elvégzése felesleges vagy nem célszerű. A találmány szerinti berendezés egy további kiviteli alakjában, amelyet a 15A. és 15B. ábra mutat, a sejtek szétválasztása és az optikai letapogatás műveletei egyetlen berendezésben végezhetők el.

-12195245

Az itt látható berendezésben 70 támasztóeszköz felületén felülről nyitott 71 és 72 csatornák vannak kialakítva, amelyek egymásra merőlegesen helyezkednek el. A 70 támasztóeszköz belsejében ugyancsak egymásra merőlegesen 73 és 74 vezetékek vannak kialakítva. A csatornák kapcsolódási pontjaiban az 1 sejthordozók 75 forgatható tartóban vannak elhelyezve, amelynek keresztmetszetét a 15B. ábra mutatja. A 75 forgatható tartó alsó részében 76 kapcsolóelem van kialakítva, amely 77 mozgatóelemmel kapcsolódik. A 76 kapcsolóelem és a 77 mozgatóelem például fogazással van kialakítva, és az utóbbi a 71 támasztóeszköz teljes hossza mentén mozgathatóan van megvezetve. Egyetlen 77 mozgatóelem mozgatja az összes 75 forgatható tartót, amelyek a megfelelő 71, 72 csatornákkal vannak kapcsolatban. A 77 mozgatóelem lineáris mozgásával a 75 forgatható tartók tengely körüli mozgást végeznek. Durva elválasztáshoz, vagyis a lymphocitáknak az egyéb vérsejtektől való elválasztása céljából a mintát arra a síkra merőlegesen kell beadagolni, amelyben a későbbiekben az 1 sejthordozókat mikroszkóppal vizsgálni kívánjuk. A lymphocitákat tartalmazó és az egyes 75 forgatható tartókban elhelyezett 1 sejthordozókat a többi vérsejtektől való elválasztás után a letapogatási művelethez 90°-kal el kell fordítani.

Az „áteresztett fény technikáját alkalmazó vizsgálati eljárásokat (vagyis azokat a méréseket, amelyekben a 2 nyílás alsó végét elhagyó fényt érzékeljük) a leírt kiviteli alakban az teszi lehetővé, hogy a 71, 72 csatornáknak az a része, amelyben a 75 forgatható tartók helyezkednek el, az 1 sejthordozók alatt hosszúságuk mentén osztott 78 üvegcsővel vannak ellátva. Ez a cső úgy helyezkedik el, hogy nyitott oldala az 1 sejthordozók felé irányul (15B. ábra). Ennek megfelelően a vízszintes irányú folyadékáramlás a 75 forgatható tartóban lehetővé válik, míg a fény egyidejűleg függőleges irányban tud áthaladni. Ebben a rendszerben a belső 73 és 74 vezetékek zártak és kis keresztmetszetűek, míg a felülről nyitott 72, 71 csatornák nagyobb keresztmetszetűek és nyitottak. Ugyanezt a hatást lehet más megoldások révén elérni, például az átfolyás sebességét a belső 73, 74 vezetékekben a 71, 72 csatornákhoz képest nagyobbra választva.

Az eljárás a következő módon foglalható össze:

0° és 90° közötti méréstartományú szögellenörző eszköz segítségével a 75 forgatható tartók helyzetét megnatározzuk. A „durva“ elválasztás befejezése után az első lépésben a 71 csatornát és a belső 73 - vezetéket használjuk ki. Miután ezt a lépést végrehajtottuk, a 75 forgatható tartót 90°-kal elforgatjuk'. Ekkor a 71 csatorna és a 73 vezeték záródik, míg a 72 csatorna és az ugyancsak belső 74 vezeték nyílik.

Ebben a kiviteli alakban a letapogatást végző eszközökhöz, tehát például mikroszkóphoz vércseppentő fej illeszthető. A vezérlést biztosító egységből kiadott parancsjel hatására, amit például számítógép is kiadhat, az elválasztás és az optikai letapogatás automatikusan elvégezhető, nincs szükség szakképzett személyzetre. A kezelő egyetlen feladata a 10. ábra szerinti 62 elosztókhoz a megfelelő vérvételi fecskendők illesztése, majd a tesztvizsgálatok elvégzése után a 75 forgatható tartók kicserélése.

A 16. ábra szerinti kiviteli alakban egy nagyobb sejtelválasztó, letapogató és elemző (diagnosztikai) rendszer látható. A fentiekben leírtakhoz hasonló 81 áffolyáskamra 82 táblán van elrendezve, amely X, Y és Z tengelyek mentén 83, 84 és 85 léptető motorokkal eltolható. Az eltolást előnyösen számítógéppel vezérlik. A berendezés 86 mikroszkóphoz illeszkedő optikai rendszert tartalmaz, amelyben a 4. ábrához hasonló felépítésű 87 optikai elemző illeszkedik. A stimulálást 88 fényforrás, például cirkóniumlámpa biztosítja, amely azonos optikai rendszert alkalmaz. A berendezésben 89 tartály fogadja be mindazokat az oldatokat, amelyekbe szükség van a sejtek elválasztásához és tesztvizsgálataihoz, továbbá 90 vezérlőegység biztosítja, hogy mindig a megfelelő oldat kerüljön a vizsgált sejtekhez. A sejtekben a fluoreszcein koncentrációját állandó értéken kell tartani, hogy az abszolút polarizációs értékek ne változzanak, és ezért megfelelő elektrooptikai eszközökkel biztosított mechanikai visszacsatolást alkalmazunk, aminek lényege, hogy a fluoreszcens fényemisszió intenzitását időszakosan mérjük és referenciaértékkel összehasonlítjuk. Ha a mért értékek a referenciaértéktől eltérést mutatnak, akkor a PBS-oldatban a fluoreszcein-diacetát koncentrációját megváltoztatjuk. A mért értékek elemzését jól ismert számítógépes rendszerrel végezhetjük, amelyre 91 illesztőn át csatlakozunk. Ez utóbbi feladata a mért értékeknek a számítógép által megkívánt, tehát általában digitális formába való átalakítása. A számításokhoz 92 számítógépet alkalmazunk, amely célszerűen alkalmas 93 tárolóban rögzített programnak megfelelően számításokat és azonosításokat végezni. A 92 számítógép kimenetén 94 vezérlőegység van, amely a 83, 84, 85 léptető motorok részére, valamint a 89 tartályból a kívánt oldatok továbbítására vezérlő jeleket generál.

A fentiekben leírt rendszer működése a következőképpen foglalható össze: „durva elválasztási folyamat után a 81 átfolyáskamrát a 82 táblát rögzítjük. A 86 mikroszkópot beállítjuk. Ezt követően a tesztvizsgálatok automatikusan folynak. A PBS és FDA oldatot megfelelő csatornákon és vezetékeken keresztül juttatjuk be. Az oldat egy része áthatol a felső csatornából az alsó 13

-13195245 vezetékekbe az 1 sejthordozókon keresztül, míg másik része a felső csatornán átfolyva kimossa onnan a sejteket. Meghatározott, például 20 perces várakozási idő elteltével kezdődik a letapogatás. Kívánt hullámhoszszokon minden egyes sejt polarizációját külön-külön megmérjük. Nem áll fenn annak a veszélye, hogy a stimuláló fény túlságosan hosszú ideig hat, mivel a letapogatás ideje igen rövid. A fényforrás hullámhossza előnyösen 470 nm.

Az optikai információt először elektromos áramimpulzussá alakítjuk, majd így juttatjuk a számítógépbe, ahol feldolgozzuk és a szükséges adatokat tároljuk. Az egyedi sejteket a számítógép tárolóiban koordinátáik szerint, vagyis az 1 sejthordozókon kijelölhető címüknek megfelelően azonosítjuk. Ettől a szakasztól kezdve a sejtekről beszerezhető minden információt a számítógép a megfelelő címhez rendelve tárol.

Az adatgyűjtés folyamatát a következőkben foglalhatjuk össze: mindazon páciensek mintáihoz, akiknek sejtjeit az első csatornában elhelyezett 1 sejthordozók tartalmazzák, ellenőrző értékeket kell meghatározni. Ezt követően a letapogatást végző fejet a következő csatornához illesztjük (például a 82 tábla lesüllyesztésével, oldalirányú elmozdításával és felemelésével), majd a második csatornában levő minden sejthordozóra a sejteket jellemző ellenőrző értékeket meghatározzuk. A második csatornában végzett adatgyűjtéssel egyidejűleg az első csatornába stimuláló anyagot tartalmazó oldatot juttatunk. Amikor a második csatornában az adatgyűjtés befejeződik, a letapogatást végző fejet a harmadik csatornához illesztjük,és a második csatornába egy másik stimuláló anyagot tartalmazó második oldatot juttatunk, stb.

Miután az összes sejthordozóról a szükséges adatokat összegyűjtöttük, a letapogatást végző fejet kiindulási helyzetébe állítjuk vissza. Ezt követően a letapogatási műveleteket az egyes sejteken elvégezzük. Eközben az adatgyűjtés más szelektív módon zajlik, és csak azokat a sejteket vetjük vizsgálat alá, amelyek a leírt optikai kritériumnak megfelelnek, vagyis egy meghatározott tulajdonság alapján kiválasztott részcsoportba tartoznak. A kritériumnak eleget tevő sejtekről összegyűjtött információk a számítógépben a sejtek helyzete szerint gyűlnek össze és a következőket tartalmazhatják: vezérlő értékek, a polarizáció értékei PHA-val történő stimulálás után, a polarizáció értékei CaBP-vel történő stimulálás után, SCM-válaszarány (lásd L. Cerceck és tsai: Europ. J. Cancer, 17, 1981, 167...171. oldal), a polarizáció értékei specifikus tumorstimuláló anyagokkal végzett kezelés után, stb.

A különböző betegekhez tartozó sejteket tartalmazó 1 sejthordozók megkülönböztetését mágneses vagy optikai kódolással le14 hét biztosítani, és a kódokat például a dúrva elválasztás időszakában vihetjük fel. Ennek megfelelően az optikai leolvasást végző szervhez olyan mágneses vagy optikai olvasóceruza illeszthető, amely a megfelelő kódot kiolvassa, és így a számítógép számára a páciensek megkülönböztetését lehetővé teszi. A számítógép tárolóegységében egy adott páciensre vonatkozóan minden adatot egy előre meghatározott helyen lehet összegyűjteni.

Á leírt rendszer segítségével minden stimuláló közeg esetében meghatározható az aktivált lymphociták száma. A sejtvizsgálatok módszereiben járatos szakember a javasolt találmányt alkalmazva képes a rák igen korai szakaszában a diagnózis megállapítására. Bár a találmányt az előbbiekben mindenek előtt a rákdiagnosztizálás követelményeit tekintetbe véve írtuk le, nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárás és berendezés nem korlátozható csak erre az alkalmazási területre. Találmányunk általában olyan eljárást és berendezést javasol, amellyel gyorsan elvégezhető biológiai vizsgálatok válnak lehetővé, és így új klinikai diagnosztizálási módszer és kezelési eljárások hozhatók létre, de a találmány hasznos lehet a biotechnológia és a genetikai manipulációk minden területén.

Mint a fentiekben említettük, az 1 sejthordozókon minden aktivált sejt pontos helyzete meghatározható és azonosítható. Éppen ezért lehetséges a sejthordozón olyan sejtcsoportok vagy részcsoportok kiválasztása, amelyek mellől a további sejteket eltávolítjuk, és így csak azok a sejtek maradnak az 1 sejthordozón, amelyek a további vizsgálatokhoz szükségesek. Természetesen elképzelhető a kívánt sejtek kiemelése az 1 sejthordozóból. Ebből a célból azt a jól ismert jelenséget lehet felhasználni, hogy a sejtek általában elektromosan nem semlegesek, hanem bizonyos felületi töltéssel rendelkeznek. Ez a tény a fentiekben leírt kiviteli alakokban lehetővé teszi, hogy a sejteket az 1 sejthordozókhoz kössük, vagy bármilyen más módon helyzetüket biztosítsuk. Ugyanezen jelenség alapján szelektív módon a sejteket eltávolíthatjuk, vagy megfoghatjuk. Ezt a célt az 1A. ábrán bemutatott 1 sejthordozó egy előnyös kiviteli alakjával érhetjük el, amelyet a 17. ábrára hivatkozással ismertetünk részletesen. A kiválasztott sejtek befogására a 100 sejthordozó szolgál, amelynek alakja megegyezik az 1A. ábra szerinti 1 sejthordozóval. A 100 sejthordozó azonban a 101 vezetékekkel van ellátva, amelyek a 102 nyílások oldalfalai mentén hálószerű konfigurációban vannak elrendezve oly módon, hogy közöttük galvanikus kapcsolat nincs. A 100 sejthordozó külső szélén a 101 vezetékeket ismert módon (például integrált áramkörös illesztőkkel) számítógépvezérelt kapcsolóberendezésbe csatlakoztatjuk, amely alkalmas min-14195245 den 101 vezetékben az elektromos potenciál szelektív szabályozására. A 100 sejt hordozóhoz a kiválasztott sejtek megtartására minden 101 vezetéket ugyanolyan potenciálértéken tarthatunk, amely ellenkező előjelű, mint a sejtek töltéspontenciálja és gy vonzóerőt biztosítunk. Ha szükség van valamely A helyen levő sejt eltávolítására (17. ábra), a szomszédos V_x2, V_x.j, V_vi és V_a2 vezetékek együttesét megfelelő potenciálra kapcsoljuk, és ily módon elérhetjük, hogy az A helyen levő sejt a 100 sejthordozóból kiessen.

A 100 sejthordozó az integrált áramkörök gyártásából jól ismert technikákkal állítható elő. Ionos oldatok, tehát például a PBS-oIdat esetében a mérések során figyelembe kell venni, hogy lehetségesek olyan felületi töltések, amelyek nemkívánatos befolyást gyakorolnak. Ebből a célból a 100 sejthordozó megfelelő módon szigetelő réteggel látható el, és a csatornába kivezetett vezetékeket tartalmaz. Ennek hatására az ionok semlegesítődnek, a felületen íonbevonat nem képződik, és így előnytelen potenciálváltozások nem alakulhatnak ki. Egy másik lehetőség olyan nem-ionos szerves oldatok alkalmazása, amelyek az eljárásnak ebben a szakaszában a 100 sejthordozó munkáját nem befolyásolják kedvezőtlenül. Ilyen oldatok készülhetnek például a lipidekből.

A találmány szerinti eljárással lehetővé válik egy-egy sejt szelektív kiválasztása a többi sejt közül. Ez igen előnyös a klinikai eljárások során, a klónozás folyamatában. Kiválasztott sejtekből lehet kiónokat gyártani, és ehhez a sejteket a találmány szerinti eljárást alkalmazva kiválasztott kritériumok alapján lehet kiemelni. így például jól ismert, hogy bizonyos betegségektől, például bőrráktól szenvedő személyek teste különleges azonosítható sejteket állít elő, amelyek feladata a betegség legyőzése vagy leküzdése a kóros sejtek elpusztításával. A sikerhez azonban az kell, hogy ezekből a gyilkos sejtekből megfelelő mennyiségű legyen a beteg szervezetében. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával a vér, a nyiroknedvek és más testnedvek felhasználhatók ilyen gyilkos sejtek nagyobb számú előállítására, ha egy-egy gyilkos sejt belőlük kiválasztható. Az eddigiekben leírt kiválasztási eljárást alkalmazva a gyilkos sejteket kiemeljük a többi sejtek közül, majd a jól ismert, alkalmas sejlszaporításos eljárások segítségével szaporítjuk őket, és nagyobb mennyiségben visszajuttatjuk a beteg szervezetébe, aki így saját szervezetétől nem ide.gen sejteket kap a betegség legyőzése céljából. Ebben az esetben semmiféle kilökődési reakciótól nem kell tartani, hiszen a sejtek a beteg szervezetéből származó sejtekkel azonosak. így tehát a találmány szerinti eljá28 rás alkalmas lehet a beteg szervezetbe olyan sejtek visszavezetésére, amellyel a fertőzés, betegség leküzdhető.

Ki kell emelni, hogy bár az eddigiekben elmondottak szerint a vizsgálathoz szükséges sejtek kiválasztása a sejthordozón levő sejtek közül akár a kiválasztott sejtek kiemelésével és a többi sejteknek a sejthordozón való meghagyásával akár -pedig a sejthordozóról a vizsgálatok szempontjából érdektelen sejtek eltávolításával, és csak a szükséges sejteknek a sejthordozón való meghagyásával végezhető el, ha kívánatos, az elválasztás más módon is biztosítható, például úgy, hogy a vizsgálat szempontjából érdektelen sejteket a megfelelő nyílásokban a sejthordozón megöljük,és ily módon a nyílásokban csak a további vizsgálatokhoz szükséges sejtek maradnak. A sejteknek a, nyílásokban történő, tehát, in situ megölése jól biztosítható lézersugárzással, amelyet meghatározott címeken levő sejtekre irányítunk. Természetesen hasonló vagy analóg eljárások is alkalmazhatók. A nyílásokban levő nagyobb sejtek vagy életképtelen sejtek úgy is tekinthetők, hogy azokat a sejthordozóból már eltávolítottuk vagy kiválasztottuk, mivel az életképtelen sejtek a vizsgálat szempontjából érdektelenek. Ennek megfelelően a sejtek eltávolítása a találmány értelmében a sejthordozóból való kiemelést vagy a sejtek in situ megölését is jelenti.

Amikor a vizsgálat szempontjából érdekes sejt szaporításáról kell dönteni, lényeges lehet, hogy az többféle módon is elvégezhető:

a) a szaporítandó sejteket eltávolítjuk a sejthordozóról, amely a vizsgálat szempontjából lényegtelen élő sejteket is tartalmaz;

b) azokat a sejteket távolítjuk el a sejthordozóról, amelyek a vizsgálat szempontjából érdektelenek és ezután megfelelő módon ismert technikákkal a kiválasztott sejteket szaporítjuk; és

c) megöljük azokat a sejteket, amelyek a vizsgálat szempontjából nem érdekesek, még amikor azok a sejthordozó nyílásaiban vannak és a kiválasztott sejteket in situ, vagyis a sejthordozó nyílásaiban szaporítjuk.

Mivel a találmány alapelveit specifikus rendszerekkel, alkalmazásokkal és módszerekkel kapcsolatban írtuk le, nyilvánvalónak kell tekinteni, hogy a jelen leírás csak magyarázatul szolgálhat, és semmiféleképpen sem lehet a szabadalmi igény korlátozásának alapja.

A biológiai kutatásban, a klinikai kezelésben és az ipari gyakorlatban a jelen találmány számos új alkalmazási lehetőséget teremt meg. Várható, és ezt az előzetes kísérletek kielégítő módon bizonyították, hogy vannak olyan optikai paraméterek, amelyek a sejtek ciklikus fázisaival kapcsolód15

-15195245 nak. Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárás lehetőséget teremt a sejteknek életkor, ciklikus állapot és belső funkció szerinti szétválasztására és a populációk ezen adatokat figyelembe vevő vizsgálataira. A fentiek egy érdekes klinikai alkalmazása a fehérvérűség korai felfedezése, hiszen a kutatások szerint ennek a betegségnek ezt a szakaszát a vérben egy vagy több meghatározott ciklusú, fiatal korú sejtek nagy száma jelzi. Ezek a sejtek a csontvelőben is észlelhetők.

Másik klinikai alkalmazásként kell az immunoreaktivitási teszteket tekinteni, amelyek különösen szervátültetések esetében fontosak. Ebben az esetben a sejtek stimulálására a befogadásra kijelölt személytől vett mintát lehet felhasználni.

A találmány .alapvető és legfontosabb jellemzője, illetve előnye az a tény, hogy a biológiai kísérletekhez és vizsgálatokhoz szükséges idő jelentősen lerövidül, mivel a sejtek azonosítása és vizsgálata a hagyományos biológiai módszerekhez viszonyítva rendkívüli módon lerövidül. Ez utóbbiakban a természetes fejlődési folyamatokat igen gyakran mesterséges körülmények között reprodukálják, ami az eredményeket bizonytalanná teszi és használható eredménye eléréséhez intenzív statisztikai feldolgozást igényelnek. A találmány lehetővé teszi, hogy a környezet hatását minimálisra csökkentsük, az eredményeket numerikus elemzéssel, a statisztikai módszerek korlátos alkalmazása mellett határozzuk meg. A találmány szerinti eljárás és berendezés segítségével az ismert megoldásokhoz viszonyítva jelentős időnyereség érhető el, aminek az is a következménye, hogy a környezetben bekövetkező hőmérséklet-, nedvesség-, stb. változások nem tudnak nagyobb hatást kifejteni.

Bár a találmány szerinti eljárás és berendezés változatait a fentiekben csak néhány kiviteli, illetve foganatosítási példán mutattuk be, a szakember számára nyilvánvaló, hogy ezen túlmenően is számos változat és módosítás dolgozható ki, amelyek a csatolt igénypontok oltalmi körén belül maradnak.

Claims (19)

1. SZABADALMI IGÉNYPONT

   1. Berendezés sejthalmazból meghatározott biológiai sejtek kiválasztására, amely biológiai sejtek populációját fogadó, a kiválasztott sejteket felfogó sejthordozóval van ellátva, azzal jellemezve, hogy a sejthordozó (1) kiválasztandó sejtek befogadó méreteinek nagyságrendjébe eső nagyságú nyílások (2) rendezett sorozataival ellátott, előre megválasztott vastagságú lapszerű elemként van kialakítva, amelynek a kiválasztandó sejteket felfogó felső lapja és alsó lapja van, ahol a nyílások (2) felső lapra eső terüle16 te nagyobb, mint a nyílásnak (2) a felső, lap alatti legkisebb keresztmetszeti mérete.
2. 2. Berendezés sejthalmazból meghatározott biológiai sejtek kiválasztására,és a kiválasztott sejtek legalább egy tulajdonságának megfigyelésére, amely biológiai sejtek populációját fogadó, a kiválasztott sejteket felfogó sejthordozóval van ellátva, azzal jellemezve, hogy a sejthordozó (1) kiválasztandó sejtek befogadó méreteinek nagyságrendjébe eső nagyságú nyílások (2) rendezett sorozataival ellátott, előre megválasztott vastagságú, lapszerű elemként van kialakítva, amelynek a kiválasztandó sejteket felfogó felső lapja és alsó lapja van, ahol a nyílások (2) felső lapra eső területe nagyobb, mint a nyílásnak (2) a felső lap alatti legkisebb keresztmetszeti mérete, továbbá a sejthordozót (1) előre meghatározott elhelyezésben befogadó első hordozószerkezete (10, 40), a sejthordozóhoz (1) illesztett, legalább egy sejttulajdonság megfigyelésére és/vagy mérésére alkalmas műszeres eszköze, valamint a műszeres eszköz és a sejthordozó (1) egymáshoz viszonyított mozgatását és a nyílások (2) rendezett sorozataiban meghatározott címek szerinti beállítását biztosító vezérlőegysége (94) és szükség szerint az első hordozószerkezethez (10, 40) illeszthető, a sejthordozó (1) nyílásaiban (2) levő sejtek egyidejű stimulálását lehetővé tevő második hordozószerkezet (11) van..
3. 3. A 2. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a műszeres eszköz a sejtek optikai jellemzőinek meghatározására alkalmas optikai letapogató egységgel van ellátva, amely mikroszkópot (86) tartalmaz.
4. 4. A 2—3. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy az első hordozószerkezet (10, 40) több, térben egymástól elválasztott sejthordozó (1) megfogására alkalmasan van kiképezve, továbbá az első hordozószerkezethez (10, 40) képest beállítható és a sejthordozókon (1) elrendezett sejtekhez stimuláló hatást és/vagy anyagot eljuttató második hordozószerkezetet (II) tartalmaz, ahol a vezérlőegység (94) a műszeres eszköznek a sejthordozók (1) bármelyikének kijelölt nyílásához (2) való eltolására alkalmasan van kiképezve.
5. 5. A 4. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy az első és a második hordozószerkezet (10, 40, 11) a nyílásokban (2) elhelyezett sejteknek sejthordozó (1) alsó vagy felső felületéről való nedvesítésére alkalmasan van kialakítva.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a második hordozószerkezet (11) stimuláló anyagokat befogadó tartóeszközzel van ellátva.
7. 7. Az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a sejthordozóhoz (1) legalább egy sejtet a megfelelő nyílásba (2) behelyező vagy onnan kiemelő erőátadó egység van csatlakoztatva.

   -16195245
8. 8. A 7. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy az erőátadó egység a sejteket mozgató elektromágneses eszközzel pl. vezetékkel (101) van kialakítva.
9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti be- 5 rendezés, azzal jellemezve, hogy az erőátadó egység a sejthordozó (1) felületei mentén kiválasztott helyeken nyomáskülönbséget létrehozó eszközként van kialakítva.
10. 10. A 7—9. igénypontok bármelyike sze- 10 rinti berendezés, azzal jellemezve, hogy az erőátadó egység a sejthordozó (1) nyílásaiban (2) levő sejtek tapadását megszüntető vagy fokozó eszközként van kialakítva.
11. 11. Az 1 — 10. igénypontok bármelyike ₁₅ szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy minden nyílás (2) felső és alsó mérete mikrométer nagyságrendű.
12. 12. Az 1 —11. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy min- 20 den nyílás (2) egy-egy lymphocita befogadására alkalmasan van kialakítva.
13. 13. Az 1 —12. igénypontok bármelyike szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a sejthordozó (1) sík felülettel van kialakít- 25 va, és benne a nyílások (2) derékszögű koordinátarendszer előre meghatározott pontjainál vannak elrendezve.
14. 14. Eljárás sejthalmazból meghatározott biológiai sejtek kiválasztására, amikor is ₃θ kiválasztandó sejteket tartalmazó sejtpopulációt mozgásba hozunk, és meghatározott fizikai jellemző alapján a kiválasztandó sejteket a populációtól elválasztjuk, azzal jellemezve, hogy a sejtpopulációt a kiválasztandó sejtek befogadó méreteinek nagyságrendjébe eső nagyságú, a sejtpopulációt befogadó felületen legkisebb belső méretüknél nagyobb bemeneti méretű nyílások rendezett sorozataival ellátott lapra juttatjuk, a sejtpopulációt a nyílások irányába átmossuk és ezzel a kívánt méretű sejteket a nyílásokba juttatjuk, valamint a populáció többi sejtjét a lapról eltávolítjuk.
15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyílásokba vitt sejteket stimuláljuk és stimulálás után szükség szerint elöljük vagy kiindulási állapotába visszatérítjük és/vagy lerontjuk a sejtek tapadását a nyílásokban.
16. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyílásokba vitt sejteket stimuláljuk, majd semlegesítjük, és ezt követően a ismételten stimuláljuk.
17. 17. A 14—16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyílásokba vitt sejteket a sejteket befogadó lapon szaporítjuk.
18. 18. A 14—16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyílásokba vitt sejteket a nyílásokból eltávolítjuk és külön szaporítjuk.
19. 19. A 14—18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejteket elektromágneses erőhatással, vagy nyomáskülönbséggel juttatjuk a nyílásokba, illetve távolitjuk el őket onnan.