JPS61501126A - 細胞選択のシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞選択のシステムおよび方法 本発明は、細胞選択（ｃｅｌｌ　５ｅｌｅｃＮｏｎ）の装置および方法、さらに 詳しくは、知られた位置に個別の細胞を捕捉するための装置および方法に関する 。より一般的には、本発明は、大集団の生きた細胞、たとえば１００００個また はそれ以上の個別の細胞を、各細胞ごとにｔｏｎ　ａ　ｃｅｌｌ−ｂｙ−ｃｅｌ ｌ　ｂａｓｉｓ）　、研究したり、調べたり、または操作したりするための装置 および方法に関する。

１９８２年５月１０日に出願されたスイス特許出願箱２８９７／８２−３号明細 書において、該明細書の関連部分はここで参考のために引用したが、我々は、各 細胞ごとに生きた細胞を研究する装置および方法について記載した。

手短かに言うと、我々のスイス特許出願では（ａ）　規則的に配列され、個別の 細胞を保持する大きざにされた多数の開孔を有するキャリヤー（ｃａｒｒｉｅｒ ）を用意し、 山）　生きたＩＢ胞を含有する液体（ｆｌｕｉｄ）を該キャリヤーに供給し、 （Ｃ）　細胞に力を加えて細胞を開孔の中へ移動させることからなる、個別の生 きた細胞を確認しつる位置に配置する方法について記載した。

いったん細胞が個々の開孔の中に入れば、細胞は、個々の細胞ごとに（ｏｎ　ａ 　ｏｎｅ−ｂｙ−ｏｎｅ　ｂａｓｉｓ）研究されたり、調べられたり、操作され たりする。たとえば、キャリヤーの開孔中の細胞は生物学的な試験に供づること ができ、個別の細胞の特有の性質を測定することができる。我々のスイス特許出 願において詳細に記載したように、この分析方法の特に重要な応用には、ガンを 診断するためのチェルチェック（Ｃｅｒｃｅｋ）の５ＣＨ（、％ｔｒｕｃｔｕｒ ｅｄｎｅｓｓ　ｏｆＣｙｔＯｐｌａＳｔｉＣＭａｔｒｉｘ）テストを行なう際に それを用いることが含まれる（たとえば、エル　チＪルチェックら（１−、Ｃｅ ｒｃｅｋ　ｅｔ　ａｌ）の［バイオフィジカル・ジャーナル（Ｒｉｏｐｈｙｓ、 　Ｊ、　）、１９７８年７月、２３巻、Ｍｌ、　３９５頁以下］参照）。

本発明は、我々の先行のスイス特許出願において記載した方法および装置を実用 化し利用するための新規な装置Ｎおよび方法に関する。とりわけ本発明の目的は 、細胞をキャリヤーＦに装填し、該細胞がキャリヤーから離れないようにするた めの改良された方法および装置；キャリヤーの開化中に捕捉さりた細胞の周囲を 浸している液体を交換するための改良された方法および装置；キャリヤーから特 定の細胞を選択し取り出すための改良された方法および装置；キャリヤーから余 分の細胞を洗い出すための改良された方法および装置；および改良されたキャリ ヤーおよびそのようなキャリヤーを作成する方法を提供する。

叙］二のおよび他の目的を達成するために、本発明は、本発明のある観点にしＩ Ｊかって、キャリヤーの上に′＠胞を装置４るために電Ｖａ場が用いられている 細胞キャリヤーｈの確認しつる位置に個別の生きた細胞を配置するための装置お よび方法を提供し、その際、細胞をキャリヤー上に装填するためにＮ磁場が用い られる。本発明のこれらの観点のある実施様態においては、ｍ胞の装填のために 交差した電場およびｖＡ場が用いられ、一方、他の実施様態においては、キャリ ヤーの表面に垂直な電場が用いられる。

本発明の他の観点にしたがって、キャリヤーの開孔に捕捉された細胞の周囲を浸 している液体を交換する速度を高めるために時間変化する磁場が用いられる。液 体の交換速度を高めることに加えて、そのような時間変化する磁場はまた、開孔 中の細胞を刺激する効果（Ｉｌｌａｓｓａｇｉｎｇｅｆｆｅｃｔ）がある。

本発明の他の観点にしたがって、ｍ胞の周囲を浸している溶液の浸透圧を調節し 、細胞を膨張させることによって、ＷＡ胞はキャリヤーの開孔の中に保持される 。

本発明のさらなる観点にしたがって、電磁場は、細胞キャリヤーから特定の細胞 を選択し取り出すために電磁場が用いられる。本発明のこれらの観点のある実施 様態においては、時間変化する電場と定磁場は、ある特定の電荷質量比ｆｃｈａ ｒｇｅ　ｔｏ　ｍａｓｓ　ｒａｔｉｏ）を有する細胞ヲ選択し取り出すために時 間変化する電場および定磁場が用いられる。他の実施様態においては、個別の細 胞をキャリヤーから取り出すために荷電した探針（ｐｒｏｂｅ）が用いられる。

本発明の他の観点にしたがって、細胞キ１７すＡアーの表面から余分の細胞を洗 い出すために装置Ｊ３よび方法が提供され、その際、洗浄過程において、細胞キ トリヤーを横切って圧力差が加えられる。本発明のこれらの観点のある一層好ま しい実施様態においては、キャリヤーは、注入管によってキャリヤーの上面に液 体を供給し排水管によって該液体を除去することによって洗浄される。

本発明のなおさらなる観点にしたがって、改良された細胞主１アリＡ７−および そのようなキャリヤーを作成するための方法が提供される。とりわけ本発明は、 コーティングされた細胞キャリヤー、および少なくとも１つの垂直な壁を含む開 孔を有づる細胞キャリＶ−を提供する。

後置のキャリヤーは、イオン衝撃法（ｉｏｎ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔＤｒＯＣ ｅＳＳ）を用いて都合よく作成される。

本発明のさらなる目的および特徴は、添付の図面にもとづいた本発明のいくつか の実施様態についての以Ｆの記述によって、−局完全に明らかとなるであろう。

添付の図面において、第１Ａ図〜第１Ｅ図は、本発明のより好ましい細胞キャリ ヤーの、一部断面から見た概略図Ｃある。

第２図〜第４図は、本発明で用いるための銅製のキャリヤーの走査型電子顕微鏡 写真である。

第５図は、シリコンでコーティングした銅製のキャリヤーの走査型電子顕微鏡写 真である。

第６図は、約７ミクロンの断面の大きさを有するリンパ球をさざえ保持する大き さにされた四角形の開孔を有する銅製のキャリヤーの走査型電子顕微鏡写真であ る。

第７図は、第２図〜第４図に示された型のキャリヤーに細胞を装填するのに適し た典型的な実験装置を示す。

第８図は、リンパ球で満たされたキャリヤーを示す走査型電子顕微鏡写真である 。

第９図および第１０図は、キャリヤーの個々の開孔中の個別の細胞を示す走査型 電子顕微鏡写真である。

第１１図は、洗δ前のキャリヤーの表面を示す走査型電子顕微鏡写真である。

第１２図は、キャリヤーの開孔中へｉ胞を導入づるための電場の使用法を示す。

第１３図は、キャリヤーの開孔中に細胞を導入するための交差した電場および磁 場の使用法を示す。

第１４図および第１５図は、キャリヤーに捕捉された細胞の周囲の液体交換を高 めるための時間変化する磁場の使用法を示す。

第１６図は、キャリヤーに捕捉されたｗＡＩｌｌの小集団を、その電荷質量比に もとづいて選択するための定磁場と交差するｖ１問変化する電場の利用法を示す 。

上述したように、本発明は、生きた細胞を各細胞ごとに研究し１こり、調べたり 、操作したりするための改良された装置および方法に関し、その際、個別の生き た細胞はｍ胞キャリヤー上の確認しうる位置に配置される。

細胞キャリヤーは、細胞を受容する穴の配列を有しており、それぞれの穴のため に、配列における位置、または住所（ａｄｄｒｅｓｓ）が定められておりわかっ て（Ｘる。穴（、ｔ１キャリヤーの上部側から、間隔をおいて離れて（する底部 側にのびている。穴は前もって選ばれた形状を有しており、細胞の一団がキャリ ヤーの上部側上を通過するときに、前もって選ばれた細胞のみが、その特有の大 きさにもとづいて該穴の中に入り支持されるようになって０る。

選ばれた細胞よりも小さな大ぎさの細胞（ま、穴を具通し、一方非常に大きな細 胞は穴に入ることができな（１゜（八つたんキャリヤーをすすぎ洗ってしまえ（ ｆ、選（Ｓれだ細胞のみが１つの定まった住所に穴あたり１個の細胞ずつキャリ ヤーの穴の中に配置される。

細胞キャリヤーの種々の形状を第１Ａ図〜第１［に示す。

キャリヤー１は、その中に開孔または穴２が形成されている基盤３からなる。開 孔また（４穴は、その配置だけでなく、種々の形状を有していてよい。第１Ａ図 において、穴はＸ軸とＹ軸にそってそれぞれケ］と行に配置されている。第１Ｂ 図に示すように、穴は底面よりも上面の方が太き４′ｉ：開孔部をイイしでいる 。開孔の側壁は、細胞キＡ・すＡ７−の底部側＋ｂにおける開口部の１ノへ連続 的に小さくなっていってもよいし、または第１Ｃ図に示すように、段階的に小さ くなっていってもよい。また第１Ｄ図に示すように、開孔のづべての側壁が内側 に傾斜している必要はない。

とりわけ細胞をキャリヤーの上面を横切って開孔の垂直面に実質的に垂直な方向 に流すことによって該細胞をキャリＡ’−に導入するばあいに、該細胞を開孔中 に捕捉し保持するのを助（ｊるために、開孔の壁面の一部分はむしろ、本質的に 垂直でありうる。

キャリヤーの上部側と底部側とのあいだの圧力差または電磁力のような手段を適 用することによって、開孔２の形は細胞が効果的に保持゛されることを可能にす る。手短かに言えば、各集団における細胞はその大きさがわかっており、各集団 の細胞は他の集団の細胞と典型的に異っているので、まずある特定の集団の細胞 を他の集団の細胞から分けるために、キャリヤー１は、物質、たとえば種々の細 胞集団を含有する血液がキャリヤー１の上に置かれるとき、穴のすべてではなく てもほとんどが目的の細胞集団によって、１つの穴に対して１個の細胞で占有さ れるような大きさの穴を有するようにキャリヤー１が選ばれる。

たとえば、上述したＳＣＨテストに関しては、穴はリンパ球を受容するのに適す るような人ささにされ、詠リンパ球には、約７ミクロンと約１０−１５ミクロン の２つの主な大ぎさのものがあり、７ミクロンの大きさのリンパ球が目的の細胞 である。この細胞集団を捕捉し７保持するために、ギヤリヤー１の上面つまり１ を側では開孔は約１０ミクロンの断面」法をｈ′すベニ８であり、底面つまり１ １）側で・は約１５ミクロンの断面寸法を有すべきであることがわがっている。

このように、所望の細胞集団は実質的な損傷をこうむることなく容易に開孔中に 入ることができ、しかも、いったん開孔中に入ると細胞はキトすＸ’−の底の方 から通過することはでさない。

−１２に開孔は、その底部側においても、１を側と１１）側のあいだの横断面に おいても、断面寸法は上部側におけるよりも小さく、そのため開孔に入った所望 の細胞が開孔を貫通しないでむしろその中に保持されるよ−）に形成されるべき である。第１Ｅ図は、最小の断面がキャリヤーの上部側と底部側どのあいだにあ る面に位置しでいるような開孔の形状を図示してい゛る。開孔の出入り口の寸法 を適切に選択することに加えて、開孔の大きざは所望の細胞の大きさと関係し、 所望の細胞が実際に開孔に入ったとき細胞全体が開孔の中に入り、それゆえキャ リヤーを洗浄するあいだに所望の細胞が洗い出されることを防ぐことができるよ うに上面と断面が最小である面とのあいだのキャリヤーの厚さを選択することも また重要である。

キャリヤー１は、適当な材料、たとえば銅、金、ニッケル、銀もしくはその他の 金属またはプラスチックのようないかなる適当な材料で作られていてよい。

純粋な金属またはプラスチックのキャリヤーを用いることに加えて、あるばあい には、キャ″リヤーの化学的な表面特性および機械的な表面特性の一方または両 方を変えるために種々の材料でキャリヤーをコーティングすることが望ましい。

適当なコーテイング材の例には、シリコン、二酸化ケイ素、および種々の無機ガ ラスが含まれる。このようなコーテイング材を用いるとき、さらに言えば、コー ティングされていないキャリヤーを作成するための材料を選ぶときには、コーテ イング材が行なおうとする試験を妨害するような仕方で細胞と相互作用１ノない ことを定めることが重要である。

たとえば、上述１ノだＳＣＨテストに関しては、キャリヤーをＳｉｎ、、ぐコー ティングすると細胞（リンパ球〉を活性化し、刺激剤に対するこれらの細胞の応 答をマスクしてしまうことがわかっている。同様の活性化がシリコンとＳｉ＋Ｏ ａとの混合物でも見出されている。一方、純粋なシリフンは細胞の活性化をひき おこさない。したがって、ＳＣＨテストの１こめにはシリコンでコーティングし たキャリヤーが適当であり、二酸化ケイ素またはシリコン＋５ｉ２０３のコーテ ィングは適当でない。コーテイング材の同様な選択は、当業者によって他のタイ プの診断試験に容易に行なわれうる。

本発明で用いた銅製のキャリヤーの走査型電子顕微鏡写真を第２図〜第４図に示 す。第２図は、キャリヤーの上面を１０００倍の倍率で示す。この表面において は、開孔は約１１ミクロンの断面寸法（直径）を有している。これらの開孔のば あいの最小断面寸法は、キャリヤーの上面と底面とのあいだの面に位置し、約４ ミクロンの大きさを有している。キＡ７リヤーのこの中間の面と上面とのあいだ の間隔は約６ミクロンである。開孔間の間隙は約１５ミクロンである。一般に、 開孔間の間隔は、細胞が開孔間のキャリヤーの部分よりも開孔内に置かれるよう になる機会を最大にするためにできるだけ小さくたもたれるべさである。

第３図および第４図は、第２図のキャリヤーの底面を１０００倍の倍率ひ示す。

第３図もまた、４−ヤリャーのさかきにしだずみの部分を示す。第２図〜第４図 のキャリＶ７−の断面を調べると、開孔が第１Ｅ図に示す型の垂直断面の形状を 有覆ることがわかる。

第２図−第４図に示でキャリヤーは、透過型電子顕微鏡のグリッドを作成するの に市販で用いられる型の栓型的なフォ１−丁ツチングの手法を用いて作成した。

抜術の分野で知られているように、この方法はその最後の段階において、グリッ ドの強度を増ずために、前もって作成したグリッドの片側への金属の蒸着を含ん ぐいる。透過型電子顕微鏡のグリッドを作製するときには、開孔の大きさをでき るだけ大きくたもっため、つまりグリッド部材（ｇｒｉｄ　ｍｅｍｂｅｒｓ）の 幅を最小にして、電子の試料から電子検出器への透過のグリッドによる妨害を最 小にするために、蒸着工程はほんの短時間で行なわれる。第２図〜第４図のキャ リＡ７−を作成するために、蒸着工程は、短いよりもむしろ、充分な金属が図に 示された程度に開孔の中を満たすようにグリッドの裏面に蒸着するまで、比較的 長い時間続けた。第４図に最も明白に示されているように、蒸着した金属（銅） は、グリッドの固体部分に蓄積し、開孔の中へ重なり合って開孔を閉じ、このよ うにして開孔の所望の最小断面寸法を形成する。

所望の形状のキャリヤー開孔を形成するための蒸着法を用いるよりもむしろ、伯 の方法、特に異った厚さのマスクを通すイオン衝撃法などが用いられうる。その ような方法は、特に第ｕ図に示された開孔のような非対称の開孔を製造するため に有用である。

第５図は、コーディングされたキャリヤーを示り“７２０倍の倍率での走査型電 子顕微鏡写真である。このばあいの基礎のキＡ・リヤーは銅から作られており、 コーティングは真空蒸着（ｖａｐｏｒ　ｄＨｏｓｉｔｉｏｎｌによってキャリヤ ー上に蒸着した純粋なシリコンである。第５図にみられるように、］−ディング は、１胞を接触させるために特になめらかなおよび′または不活性な表面を提供 するだけでなく、開花の断面寸法を変化（減少）させるために用いられ・）る。

第６図（５ｔ、もう一つの１−フイングされていない銅製のキャリヤー上示して ４−３つ、このばあい円形よりもむしろ四角形の開孔を有している。このキャリ ヤーの上面の開孔の断面寸法（よ約１０ミクロンであり、最小断面寸法は約１） ミク［二］ンひある。最小断面Ｊ法は、キャリヤーの上面力日ら約７〜８ミクロ ン下の面にある。開孔間の間隔は約１２ミクロンである。

第２図〜第４図および第６図のキャリヤーは、約７ミクｏ）ｚＪｌｉ面の大きさ を有１′ちリンパ球を捕捉し保持づるために特に良く適するような大きさになっ ている。本明細潟の開示から当業者には明白であるように、異なる種類や大きさ の細胞を捕捉し保持するために異った開孔の形状を有する他のキャリヤーを作成 しうる。

先に指摘したように、キャリヤー１中の穴はキャリヤー上またはキャリヤー中に おいて、たとえば行と列に規則的に配置されており、たとえばキャリヤーの面に おけるＸ、Ｙ座標によって、まさに穴２そのものの位置を明確に確認することが できる。記載した実施様態において、穴は行と列に配置され、互いに垂直にのび 、それによって格子様の構造を形成している。穴の数は、保持される細胞の数に したがって選択される。たとえば、行Ｊ３よび列あたり　１００個の穴を有する ものは全部で＋ｏｏｏｏ個の穴があり、記載した実施様態のキャリヤー上に１０ ０００個の細胞を保持し、それぞれの細胞はそれぞれ独自のＸどＹの位置をイｊ １″る。

本発明の方法を実施するために、ｔｌＡ胞を含有４る２゜３滴の溶液、たとえは リンパ球を含ｆｉする血液を細胞キャリヤーのＬに滴下する。力、たとえば圧力 差をキャリヤーを横切って加え、細胞を開孔中に移動させる。液体はギヤリヤ〜 ・の穴を通って流れる。しかしながら、細胞はキャリ１−上に残る。穴２の大き さはリンパ球のみを収容４るべく選ばれているので、リンパ球は穴に浸入する。

各々の穴はたフた１個の細胞のみを収容する。過剰のおよびその他の細胞、すな わら大きさが大きすぎて穴に入れない細胞および／または穴の数よりも多い過剰 の細胞は、キャリヤーの表面から洗い出される。その後、穴の中のＷＡ胞がキャ リヤーから離れるのを防ぐために、様々な手法でそこへ固定される。たとえば、 穴を横切って連続的な圧力差を加えることによって、細胞を膨張させるように浸 している溶液の浸透圧を変化させることによって、粘着性でコロイド状の物質で キャリヤーをおおうことによって、および外部の電場および／または磁場によっ てのみならず、電気的にキャリヤーを帯電させることによってである。

第７図は、第２図〜第６図に示す型のキャリヤー中に細胞をのせるのに用いた典 型的な実験装置を図示している。

キャリｔ−１は、プレート　１５２上の穴口　１５０の上の場所に、溶液皿１５ Ｇのカラー１５４を用いて保持される。カラーは、穴口１５０を取りかこみ、そ の部分とキャリヤーとのあいだをシールするプレート　１５２の部分にキャリヤ ーを押（）付ける。このシールは、実質的な数の細胞がキャリヤーの縁の回りを 通らないようにして、むしろ開孔に捕捉されるようにする。

穴０１５０は、排水管１ら０によってポンプ１６２に１結されている。ポンプは 、細胞をキャリヤーの開孔中に引き込むキャリヤー１を横切る圧力差を生じさせ るのに供される。より均一にキャリヤー１を満たすことは穴口１５０の口に浅い テーパー（ｔａｐｅｒ）　１６８をつけることによって達成されうることが見出 されている。この子−バーは、キャリヤーの周辺の開孔を満たすために必要な時 間を減少させる。

皿１５６は、顕微鏡の対物レンズ１５８をキャリヤーの開孔が焦点に来るように キャリヤー１に充分近づけるように設計されている。溶液は、注射針１６６に簡 便に連結している１つまたはそれ以上の注入管１６４によって皿１５６に供給さ れる。注入管は、種々な浸している溶液および反応溶液を導入するのに用いられ る。注入管はまＩζ、キャリヤー１の上面から過剰の細胞を洗い出すためにも用 いられる。このばあい、液体は排水管＋７０を用いて皿１５６から除かれる。細 胞は標準の注射器を用いてキャリヤー１に与えられる。この操作のあいだに、顕 微鏡の対物レンズ１５８と皿１５６は、キャリヤー１に容易に近づけるように離 しておく。皿１５６中の液体の水準は、細胞の試験のあいだにモニターされてい て、必要とあらば、液体はキャリヤー１に捕捉される細胞をたえず液体中に浸し ておくように皿に加えられる。

第７図の装置を用いてヒトのリンパ球をキャリヤーに捕捉し保持するために用い る典型的な手順は以下の通りであった。まずヒトの体全体からの試料を標準的な 方法によってえた。つぎにこの血液のＩｆ［ｌ漿両分を約６分間の約１００Ｑで の試料の遠心かまたは約半時間３７℃で試料をインキュベートすることによりえ た。どちらのばあいでも゛血漿画分はピンク色で、鼻血法の存在を示していた。

キャリヤーを満たすのに用いられた血漿画分の赤血球／′白血球比は約３０／１ と見積もられた。

血漿画分がえられたら、約５　ｘ　１０６細胞／（Ｃまたは１２Ｘ１０６細胞／ ＣＣの細胞濃度に達するまで、該血漿画分をリン酸で緩衝された生理食塩水で希 釈した。細胞が螢光を発し、その結果キャリヤーの上にのる際に顕微鏡下で容易 に観察されるように、フルオレセイン　ジアセテート（ｒｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ 　ｄｉａｃｅｔａｔｅ）　（ＦＤＡ）を約２．５μＨの濃度で細胞懸濁液に加え 、その細胞をキャリヤーに加えるのに先立ってＦＤＡと約１０〜３０秒間インキ ュベートした。

キャリヤーが汚染されていないことを確認するために、リン酸で緩衝された生理 食塩水をキャリヤー１にある■１５４に加え、ポンプ１６２を用いてキャリヤー １を通してポンプで引いた。ポンプ１６２は水の０５〜５．０ｃｍの覇囲のキャ リヤー１を横切る圧力差を生ずるように調節した。

細胞を、キャリヤーの近傍に細胞懸濁液を含む標準の注射器を近づけることによ りキャリヤー１に加えた。６×１０６細胞／ＣＣの濃度のばあい、主１１リヤー の近くに、しかし直接触れないように、３滴の細胞懸濁液を加えれば約１５００ 個の穴を有するキャリヤーのずべての開孔を完全に満たすのに適当であり、＋２ Ｘ　１０６細胞、／ＣｃＱ度レベルで同じ大きさのキャリヤーのばあいは、キャ リヤーに直接１滴加えると充分であることがわかった。どちらのばあいにおいて も、キャリヤーを実質上完全に満たすのには、いかに良くカラー１５４がキャリ ヤーをプレート１５２にシールしているかにしたがって、数秒から数分の時間が かかった。

第８図は、リンパ球を満たしたキャリヤーを示す１０００倍の倍率の走査型電子 顕微鏡写真である。この顕微鏡写真をとるのに用いた固定操作は細胞を収縮させ る。この操作は細胞を開孔よりいくらか小さく見えさせる。細胞が生きていると きは、細胞は、その上部をキャリヤーの上面かまたはそのすぐ下にしてすべての 開孔を完全に満たした。

第９図および第１０図は、個々の開孔中の個別の細胞を６６００倍の倍率で示す 走査型電子顕微鏡写真である。第９図に示す細胞はリンパ球であり、第１０図の 開孔中の細胞は赤血球である。赤血球はリンパ球よりも小さく比較的柔軟である ので、もし圧力がキャリヤーを横切って加えられ続けると、第１０図に示す赤血 球は開孔から落ちて外に出てしまうだろう。

第１１図は、過剰の細胞と細胞破片を取り除くための洗浄を行なう前のキャリヤ ー表面を示１４８０倍の倍率の走査型電子顕微鏡写真である。第７図の開孔のば あいは。

注入管１６４および排水管Ｉ７０を用いて洗浄を行なっている。開孔の形状のみ ならずポンプ１６２で生ずる圧力差が洗浄工程のあいだに開孔中の細胞を保持す るのを助けていることに注意せよ。

第１１図にみられるように、洗浄に先立って個々の開孔中に個別のリンパ球が存 在するが、キャリヤーの上部は、他の型のＩ１８胞や細胞破片のみならず過剰の リンパ球および赤血球の両方によっておおわれている。第１１図と洗浄剰の細胞 破片を取り除くために洗浄工程が効果的であることを明らかに示している。

叙上の例において、キャリヤー１を横切る圧力差は細胞をキャリヤーの開孔中に 導入し、開孔に細胞を保持するために用いられている。他の力もまたこれらの目 的に用いることができる。

たとえば、第１２図は細胞をキャリＡ７−の方へ、および開孔中へ移動させるた めの電場の使用法を示している。

Ｎ場は、キャリヤーの上面に垂直に配向している。技術の分野で知られているよ うに、リンパ球を含む生物の細胞は一般に正味の電荷を有しており、またはｐＨ や他のパラメーターを調節することによって正味の電荷を持たせることができる 。したがって第１２図に示すＮ場は、細胞、たとえば正に荷電した細胞を、今述 べたようにキャリヤーの方および開孔中へ望むように移動させるであろう。

もちろん、もしそれが負に荷電した細胞でキャリヤーに捕捉させたければ電場の 方向を逆にするだけでよい。

、駆動力として電場を用いることは、コーティングされていない金属のキャリヤ ーでの電解の問題をひきおこしうる。この問題の１つの解決策は、前述のように キャリヤーを非伝導体でコーティングすることである。第１２図に示すもう一つ の解決策は、キャリヤーを細胞が捕捉されている開孔から離れた点で電解の効果 のほとんどを局在化するような形にすることである。特に第１２図では、キャリ ヤーは電場を集中し、これによってイオンの流れや電解の効果をキャリヤーの本 体から離れた領域に集中させる耳、つまり突起１７２が備わっている。このよう な耳はまたｌ胞を誘引するが、一般には充分過剰な細胞が存在するので、たとえ 耳の領域に細胞がいくらか集中しても、なＪ５キャリヤーの本体の近くには開孔 を満たすのに充分な細胞が存在するであろう。

キャリ八ツーの表面に垂直に配向した電場を用いる代わりとして、キャリＡ７− の表面に平行な交差した電場と磁場を、細胞を開孔中に導入するために用いるこ とができる。第１３図に示すように、このばあい、電場は荷電した細胞をキャリ ヤーの上部を横切って移動させ、磁場は正に荷電した細胞に対しキャリヤーの表 面の方向へＶＸＢの力を生ずる。また、負に荷電した細胞は、磁場の方向を逆に することにより選択することができる。細胞を開孔中へ導入するために磁場を用 いると、いったん細胞が開孔中に静止するようになれば、駆動力による細胞への 力は■がこの時ゼロに等しくなるのでなくなるという利点がある。これに対し、 圧力差による駆動力は、細胞が開孔に捕捉されたのらでも細胞への力を行使し続 ける。

もっとも、一般にはこの力は非常に小さくて細胞に損傷を与えない。

細胞をキャリヤーに与えるのに電場と磁場を用いることに加えて、これらの場は 個別の細胞の周囲の液体交換の速度を高め、キャリヤーに捕捉された特定の細胞 を電荷質量比のようなパラメータにもとづいて選択するために用いることができ る。

液体交換に関して、第１４図は細胞を開孔内の軸の回りに回転させるためにキャ リヤーの表面に垂直な時間変化する電場の使用法を示している。より明確に言う と、時間変化する磁場はキャリヤーの面に平行な円周または接線方向の電場を生 ずる。そのような電場の大きさと方向は、レンツの法則としても知られているマ ックスウェル−ファラデーの法則で説明される。この電場は細胞膜の表面の固定 電荷に作用し、この結果、細胞を磁場に平行な軸の回りに回転させる。いったん 細胞が回転し始めると、その細胞膜は、膜の電荷と付加した磁場との間のＶＸＢ （ローレンツ）の相互作用に起因する内側かまたは外側へ圧迫する力を受けるで あろうことに注ｔｔ［−べきである（第１５図参照）。その力が内側へかまたは 外側へかは、細胞の表面電荷の符号と磁場の配向によるであろう。

本質において、時間変化する磁場は、細胞を回転させることに加えて細胞を刺激 覆る効果をも有する。さらに、回転している細胞は結果的に磁気双極子であるの で、磁場に平行に移動する傾向があるだろう。細胞へのこれらの効果に加えて、 その磁場はまた浸している媒体中で荷電を有するイオンと相互作用し、それを円 形の行路にそって移動させるだろう。

キャリヤーに捕捉されている集団の中から特定の型の細胞を選択づることに関し で、第１６図は特有の電荷質４止金口引るこれらの細胞を選択する装置を示す。

その図を示すように、時間変化（る、たとえば正弦波の電場をキｔ・リヤーを横 切って与え、定磁場をキャリヤーの上面に平行に与える。個別の細胞の電場への 応答は、電場の周波数および細胞の電荷質量比に依存するだろう。したがって、 電場の周波数を変えることによって、細胞の特定の小集団を開孔の外側の充分離 れたところに移動させることができ、その結果、移動している細胞に作用づる磁 場による力は、キャリヤーの表面の面の中でそれを動かすであろう。この工程の あいだに表面を洗浄することによって、これらの選択した細胞を取り出すことが できる。

上述したことに加えて、電場は個別の細胞を選択するために用いることができる 。たとえば、個別の細胞は特定の細胞の近傍に荷電した探針を近づけることによ って生ずる局在化した電場によってキャリヤーから取り出すことができる。細胞 の集団”は同様にしてキャリヤーから取り出すことができ、一連の可動の探針を 用いることによって所望の位置に移動させることができる。その際、配列され選 ばれた探針は、細胞を誘引しくａｔｔｒａｃＢ開孔から取り出すのに充分な値に 荷電することができる。

本発明の特別な実施襟態をここで記載し図示したが、改変と変更は当業者には容 易になされうろことが認められ、したがって、クレームはこのような改変および それと均等のものを包含するべく解釈されることが意図されている。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）規則的に配列され個別の細胞を保持する大きさにされた多数の開孔を 有するキャリヤーを用意し、（ｂ）生きた細胞を含有する液体を該キャリヤーに 供給し、 （ｃ）細胞に電磁力を加え細胞を開孔中へ移動させることからなる個別の生きた 細胞を確認しうる位置に配置する方法。 ２．電磁力が、キャリヤーの表面に対して垂直に配向された電場によって生成さ れる請求の範囲第１項記載の方法。 ３．電磁力が、キャリヤーの表面に対して平行に配向された交差した電場および 磁場によって生成される請求の範囲第１項記載の方法。 ４（ａ）規則的に配列され個別の細胞を保持する大きさにされた多数の開孔を有 するキャリヤー、および（ｂ）細胞を開孔中に移動させるために細胞に電磁力を 加えるための手段 からなる個別の生きた細胞を確認しうる位置に配置するための装置。 ５．電磁力を加えるための手段が、キャリヤーの表面に対して垂直に配向された 電場を生成するための手段を含む請求の範囲第４項記載の装置。 ６．キャリヤーが金属でできており非伝導体でコーティングされている請求の範 囲第５項記載の装置。 ７．キャリヤーが金属でできており装置の位置からの離れた点における電解効果 を局在化する形状を有する請求の範囲第５項記載の装置。 ８．キャリヤーが、開孔を含有するキャリヤーの部分からのびた突起を含む請求 の範囲第７項記載の装置。 ９．電磁力を加えるための手段が、キャリヤーの上面に対し平行に配向された交 差した電場および磁場を生成するための手段を含む請求の範囲第４項記載の装置 。 １０．キャリヤーの表面に対して垂直な時間変化する磁場を加えて細胞を開孔の 内部において細胞の軸のまわりに回転させることを特徴とする、キャリヤーの開 孔中に捕捉された細胞の周囲を浸している液体を交換する方法。 １１．（ａ）浸す液体を加え該液体をキャリヤーから取り除くための手段、およ び （ｂ）キャリヤーの表面に対して垂直な時間変化する磁場を生成させ開孔の内部 において細胞をその軸のまわりに回転させるための手段 からなる開孔中に捕捉された細胞の周囲を浸している液体を交換する装置。 １２．キャリヤーを洗浄して過剰の細胞および細胞破片を取り除き、つぎに細胞 の周囲を浸している溶液の浸透圧を調節して細胞を膨張させることを特徴とする 、キャリヤーの開孔中に細胞を保持する方法。 １３．キャリヤーを横切って時間変化する電場を加え、キャリヤーの表面に対し て平行に定磁場を加えて特定の電荷質量比を有する細胞を開孔から移動させる工 程からなる、キャリヤーの閥孔中に捕捉された細胞の集団から特定の電荷質量比 を有する細胞を選択する方法。 １４．該電場および磁場を加えながら、さらにキャリヤーの表面を洗浄する工程 を含む請求の範囲第１３項記載の方法。 １５．電場および磁場を生成するためのそれぞれ第１および第２の手段からなり 、該電場が時間変化しキャリヤーを横切るように配向されており、該磁場が一定 でありキャリヤーの表面に対して平行に配向されており、該電場は特定の電荷質 量比を有する細胞をその開孔から充分離れて移動させ該磁場が細胞をキャリヤー の表面の平面中に移動させうるようにすることからなる、キャリヤーの開孔中に 捕捉された細胞の集団の中から特定の電荷質量を有する細胞を選択する装置。 １６．さらにキャリヤーの表面を洗浄する手段からなる請求の範囲第１５項記載 の装置。 １７．探針を荷電させ、荷電した探針によって生じた局所的な電場を細胞に受け させ細胞を開孔から移動させることからなる、キャリヤー中に形成された開孔か ら個別の細胞を取り除く方法。 １８．一連の探針を荷電させ、一連の荷電した探針によって生じた局所的な電場 を細胞に受けさせ細胞をその開孔から外へ移動させることによって個別の細胞の 集団がその開孔から取り除かれる請求の範囲第１７項記載の方法。 １９．探針、および細胞を誘引し開孔から移動させるために充分な値に探針を荷 電するための手段からなる、キャリヤー中に形成された開孔から細胞を取り除く ための装置。 ２０．一連の探針、および一連の探針から選ばれた探針を細胞を誘引しその開孔 から細胞を移動させるために充分な値に荷電するための手段からなる、キャリヤ ーの開孔から細胞の集団を取り除くための装置。 ２１．洗浄工程のあいだにキャリヤーを横切って圧力差を加え細胞を開孔中に保 持することを特徴とずる、細胞で満たされた多数の開孔を有するキャリヤーから 過剰の細胞および細胞破片を洗浄する方法。 ２２．注入管によってキャリヤーの上面に液体を加え排水管によってそれを取り 除くことによって洗浄がなされる請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３．第１の材料でつくられ規則的に配列され個別の細胞を保持する大きさにさ れた多数の開孔を有する基盤、および第２の材料でつくられ該基盤の少なくとも 一部をおおうコーティングからなる、個別の細胞を確認しうる位置に保持するた めのキャリヤー。 ２４．基盤が伝導体でありコーティングが手伝導体である請求の範囲第２３項記 載のキャリヤー。 ２５．基盤が金属でありコーティングが無機ガラスである請求の範囲第２４項記 載のキャリヤー。 ２６．基盤が金属でありコーティングがＳｉ、ＳｉＯ２またはＳｉとＳｉ２Ｏ３ との混合物である請求の範囲第２４項記載のキャリヤー。 ２７．基盤が金属でありコーティングがＳｉである請求の範囲第２４項記載のキ ャリヤー。 ２８．基盤を異なった厚さのマスクを通してイオン衝撃することによって基盤中 に開孔を形成することからなり、該開孔は規則的に配列しており個別の細胞を保 持する大きさにされている、個別の細胞を確認しうる位置に保持するためのキャ リヤーを生成する方法。 ２９．実質的に平行な上面および底面を有し、該上面および底面を通して複数の 開孔を有し、該開孔が（ａ）規則的に配列されており、（ｂ）個別の細胞を保持 する大きさにされており、（ｃ）該基盤の該上面および該底面のあいだにのびる 側壁を有しており、該側壁が閥孔の中央の内部に向かって収れんする第１部分、 および該基盤の上面および底面に対して実質的に垂直である第２部分からなる、 個別の細胞を確認しうる位置に保持するためのキャリヤー。 ３０．開孔がイオン衝撃によって形成される請求の範囲第２９項記載のキャリヤ ー。