JP2016034264A - 試薬、培地成分、添加物、色や味などの成分の濃度勾配をつける培地の作製方法と調整方法およびこの方法を用いて得られる培地とこの培地を用いた微生物分離、培養ないしスクリーニング方法、ならびに濃度勾配をつける技術を用いた食品製造方法とその方法により製造された食品 - Google Patents

試薬、培地成分、添加物、色や味などの成分の濃度勾配をつける培地の作製方法と調整方法およびこの方法を用いて得られる培地とこの培地を用いた微生物分離、培養ないしスクリーニング方法、ならびに濃度勾配をつける技術を用いた食品製造方法とその方法により製造された食品 Download PDF

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【課題】試薬、培地成分や添加物の濃度勾配をつける培地の作製方法と調整方法の提供、この方法を用いて得られる培地の提供とこの培地を用いた微生物分離、培養ないしスクリーニング方法の提供、ならびに濃度勾配をつける技術を用いた食品製造方法とその方法により製造された食品の提供。【解決手段】様々な試薬、培地成分、添加物、色や味などの成分の混合比率を変化させることで連続的に濃度の勾配をつける。この作製方法を利用して培地を調整する。この調整方法で調整した培地を用いて、微生物を選抜することを特徴とする微生物分離、培養ないしスクリーニング方法。前記作製方法を利用して食品を製造する。様々な添加物、色や味などの成分を粘度がある寒天状の食品などの製造に利用する。この食品製造方法により製造された食品を提供できる。【選択図】なし

Description

本発明は、微生物の分離、培養、抗菌性、塩濃度や薬剤などへの耐性試験、生育因子の要求性試験の際に、様々な試薬、培地成分、添加物、色や味などの成分を連続的に混合比率を変えて、濃度勾配を付けた培地を簡単に作製する方法と調整方法およびこの方法を用いて得られる微生物の選抜を行うための培地とこの培地を用いて微生物を選抜する微生物分離、培養ないしスクリーニング方法に関する。
また、寒天、ゼリー、ゼラチン、グルコマンナンなどを用いた、粘度がある寒天状の食品などを製造する際に、様々な色、味、添加物などの成分を連続的に混合比率を変えて、濃度勾配を付けた寒天状の食品を簡単に製造する方法とその方法により製造された食品に関する。
現在、微生物は地球上に存在する1%程度しか分離できていないとされ、残りの99%は、「生きているけれども培養できない」状態にあることを指すVNC(viable but non−culturable)状態と呼ばれ、培養不能状態、培養不能菌や難培養性微生物として理解されている。このような状態は、未知の生育因子を要求するものなど、純粋培養が不可能もしくはきわめて困難な微生物も多く存在していることになる。そのため、微生物学の分野において、様々な生育因子の濃度や培養条件の設定が重要な課題である。
また、抗菌性、薬剤耐性などの試験においても、様々な濃度での設定を個々にしなければならないことが課題である。
従来、微生物の分離や抗菌性、薬剤耐性などの試験において、濃度を勾配ではなく、各段階濃度において、それぞれの濃度に培地を調整して試験をするなど、手間やコストがかかるという問題が多かった。
濃度勾配培地として、培地を作製するシャーレや容器などを傾斜させておき、そこに一定濃度に調整した培地を分注、凝固(下層)の後に、このシャーレや容器などを水平状態に戻し、そこにさらに培地を分注、凝固(上層)して、下層と上層の培地厚さ(距離)を利用した濃度勾配をつける重層法が提案されている(図1)(特許文献1,2、非特許文献1,2参照)。
一方、寒天、ゼラチンなどを利用する場面として、食品がある。現在、寒天、ゼリー、ゼラチン、グルコマンナンなどを用いた、粘度がある寒天状の食品は、子供向けのお菓子や食品および高齢者の嚥下食としての利用が増加してきている。
また、寒天、ゼラチン、グルコマンナンの他、カラギナン、キサンタンガム、グァーガムやペクチンなど様々な増粘剤が開発され、食品添加物として利用可能となってきている。
特開2005−270003号公報
特表2002−516661号公報
ディー イー ハント(D.E.Hunt),エイチ ジェー サンダム(H.J.Sandham)共著,「インプルーブド エイガー グレイディアント−プレート テクニック(Improved Agar Gradient−Plate Technique)」,「アプライド マイクロバイオロジー(Applied Microbiology)」,(米国),1969,Vol.17 No.2,p.329−330
リンチャオ ルオ(Linjiao Luo),アラビンサン サミエル イーディー(Aravinthan Samuel ed.)共著,「メイキング リニヤー ケミカル グレイディアンツ イン エイガー(Making linear chemical gradients in agar)」,「ザ ワーム ブリーダーズ ガゼット(The Worm Breeder’s Gazette)」,(米国),2010,Vol.18 No.3,p.10−11
しかしながら、先行技術文献にある重層法では、上層の培地に浸透圧の問題などで浸透しにくい成分では不適となり、下層と上層の培地厚さ(距離)を利用した濃度勾配であるため、浸透性など均一であれば一定な勾配となるが、浸透性が均一とはならず濃度勾配が不均一な状態であった。
このようなことから、微生物の分離、培養、抗菌性、塩濃度や薬剤などへの耐性試験、生育因子の要求性試験の際に、様々な試薬、培地成分や添加物などの成分を連続的に混合比率を変えて、濃度勾配を付けた培地を簡単に作製する方法と調整方法および濃度勾配を用いた微生物の選抜を行うための培地が望まれていた。
また、寒天、ゼリー、ゼラチン、グルコマンナンなどを用いた、粘度がある寒天状の食品などを製造する際に、様々な色、味などの成分を連続的に混合比率を変えて、濃度勾配を付けた寒天状の食品を簡単に製造する方法とその方法により製造される食品が望まれていた。
本発明は、これらの要望に応えるために開発されたものであって、以下の構成からなる発明である。すなわち、
(1) 様々な試薬、培地成分、添加物、色や味などの成分の混合比率を変化させることで連続的に濃度の勾配をつけることを特徴とする培地の作製方法である。
(2) 前記(1)に記載の培地の作製方法を利用して培地を調整することを特徴とする培地の調整方法である。
(3) 様々な試薬、培地成分、添加物、抗菌剤、薬品や栄養分などの成分の抗菌性試験、耐性試験、要求性試験、食品製造などに利用できることを特徴とする前記(2)記載の培地の調整方法である。
(4) 混合比率を均一に変化させるために、基礎培地として、寒天濃度0.5%〜1.0%で調整後、培地温度50℃〜70℃にして入れたシリンジと濃度勾配をつける成分などを入れて寒天濃度0.5%〜1.0%に調整して、培地温度50℃〜70℃にして入れたシリンジを、濃度勾配ができるように吐出量を変化させながら同時に、氷冷したシャーレや容器に分注することを特徴とする前記(2)記載の培地の調整方法である。
(5) 前記(2)〜(4)のいずれか1項に記載の培地の調整方法を用いて得られることを特徴とする微生物の選抜を行うための培地である。
(6) 前記(2)〜(4)のいずれか1項に記載の培地の調整方法で調整した培地を用いて、微生物を選抜することを特徴とする微生物分離、培養ないしスクリーニング方法である。
(7) 前記(1)に記載の培地の作製方法を利用して食品を製造することを特徴とする食品製造方法である。
(8) 様々な添加物、色や味などの成分を粘度がある寒天状の食品などの製造に利用することを特徴とする前記(7)記載の食品製造方法である。
(9) 混合比率を均一に変化させるために、濃度勾配をつける成分などを入れて、または入れずに寒天濃度0.5%〜1.0%で調整後、培地温度50℃〜70℃にして入れたシリンジと他の濃度勾配をつける成分などを入れて寒天濃度0.5%〜1.0%に調整して、培地温度50℃〜70℃にして入れたシリンジを、濃度勾配ができるように吐出量を変化させながら同時に、氷冷したシャーレや容器に分注することを特徴とする前記(7)記載の食品製造方法である。
(10) 前記(7)〜(9)のいずれか1項に記載の食品製造方法により製造されたことを特徴とする食品である。
請求項1記載の発明によれば、様々な試薬、培地成分、添加物、色や味などの成分の混合比率を変化させることで連続的に濃度の勾配をつけることを特徴とする培地の作製方法を、新規に提供できる効果がある。
請求項2記載の発明によれば、請求項1に記載の培地の作製方法を利用して培地を調整することを特徴とする培地の調整方法を、新規に提供できる効果がある。
請求項3記載の発明によれば、様々な試薬、培地成分、添加物、抗菌剤、薬品や栄養分などの成分の抗菌性試験、耐性試験、要求性試験、食品製造などに利用することを特徴とする請求項2に記載の培地の調整方法を、新規に提供できる効果がある。
請求項4記載の発明によれば、混合比率を均一に変化させるために、基礎培地として、寒天濃度0.5%〜1.0%で調整後、培地温度50℃〜70℃にして入れたシリンジと濃度勾配をつける成分などを入れて寒天濃度0.5%〜1.0%に調整して、培地温度50℃〜70℃にして入れたシリンジを、濃度勾配ができるように吐出量を変化させながら同時に、氷冷したシャーレや容器に分注すること特徴とする請求項2に記載の培地の調整方法を、新規に提供できる効果がある。
請求項5記載の発明によれば、請求項2〜4のいずれか1項に記載の培地の調整方法を用いて得られることを特徴とする微生物の選抜を行うための培地を、新規に提供できる効果がある。
請求項6記載の発明によれば、請求項2〜4のいずれか1項に記載の培地の調整方法で調整した培地を用いて、微生物を選抜することを特徴とする微生物分離、培養ないしスクリーニング方法を、新規に提供できる効果がある。
請求項7記載の発明によれば、請求項1に記載の培地の作製方法を利用して食品を製造することを特徴とする食品製造方法を、新規に提供できる効果がある。
請求項8記載の発明によれば、様々な添加物、色や味などの成分を粘度がある寒天状の食品などの製造に利用することを特徴とする請求項7に記載の食品製造方法を、新規に提供できる効果がある。
請求項9記載の発明によれば、混合比率を均一に変化させるために、濃度勾配をつける成分などを入れて、または入れずに寒天濃度0.5%〜1.0%で調整後、培地温度50℃〜70℃にして入れたシリンジと他の濃度勾配をつける成分などを入れて寒天濃度0.5%〜1.0%に調整して、培地温度50℃〜70℃にして入れたシリンジを、濃度勾配ができるように吐出量を変化させながら同時に、氷冷したシャーレや容器に分注することを特徴とする請求項7に記載の食品製造方法を、新規に提供できる効果がある。
請求項10記載の発明によれば、請求項7〜9のいずれか1項に記載の食品製造方法により製造されたことを特徴とする食品を、新規に提供できる効果がある。
重層法による培地概略図である。 混合比率を変化させることで連続的に濃度勾配をつけた培地の概略図である。 混合培地に菌を穿刺培養した概略図である。
本発明の好ましい実施の形態について、詳細に説明する。
濃度勾配がつくことを確認するために、基礎培地として黄色の色素を含む寒天培地濃度0.8%に調整し、シリンジに分注した。また、濃度勾配をつける成分として赤色の色素を含む溶液を寒天培地濃度0.8%に調整し、別のシリンジに分注し、温度を60℃に保ち、モデル475グラジェントデリバリーシステム(Bio−Rad Laboratories,Inc.,CA,USA)を用いて、試験管を氷冷しながら分注した。
その結果、試験管の底には基礎培地とした黄色の色素濃度100%から、濃度勾配に応じて混合し、中間点(濃度勾配50:50)では中間色のオレンジ色を呈し、試験管上層部では赤色色素濃度100%になるような濃度勾配培地ができた。
さらに、大腸菌(Escherichia coli)の塩分耐性を見る目的で、基礎培地はNutrient broth(Oxoid,Hampshire,England)に寒天濃度0.8%になるように調整し、シリンジに分注した。また、濃度勾配をつける塩分を濃度10%で寒天濃度0.8%になるように調整し、別のシリンジに分注し、温度を60℃に保ち、モデル475グラジェントデリバリーシステム(Bio−Rad Laboratories,Inc.,CA,USA)を用いて、試験管を氷冷しながら分注した。
上記で調整した濃度勾配培地に、大腸菌(Escherichia coli)を穿刺し、37℃、48時間培養をした。
その結果、塩分濃度0%から7%程度までの範囲で生育が確認でき、7%から10%付近においては、生育が確認できなかった。
このことから、濃度に勾配を持たせた培地の作製が可能となった。また、塩分耐性試験を行い、塩分による耐性濃度の範囲を特定することが可能となった。
様々な試薬、培地成分、添加物、色や味などの成分を連続的に混合比率を変えて、簡単に濃度勾配を付けた培地を作製する方法は、様々な微生物の分離、培養、抗菌性、塩濃度や薬剤などへの耐性試験、生育因子の要求性試験への適用や同様な作製方法および調整方法が可能な食品製造への応用も期待できる。
そして、前記濃度勾配を付けた培地を作製する方法を微生物選抜を行うための培地の提供ができ、さらに、この培地を利用することで新たな微生物分離、培養やスクリーニング方法への適用や同様な作製方法および調整方法が可能な食品の提供も期待できる。

Claims (10)

  1. 様々な試薬、培地成分、添加物、色や味などの成分の混合比率を変化させることで連続的に濃度の勾配をつけることを特徴とする培地の作製方法。
  2. 請求項1に記載の培地の作製方法を利用して培地を調整することを特徴とする培地の調整方法。
  3. 様々な試薬、培地成分、添加物、抗菌剤、薬品や栄養分などの成分の抗菌性試験、耐性試験、要求性試験などに利用できることを特徴とする請求項2記載の培地の調整方法。
  4. 混合比率を均一に変化させるために、基礎培地として、寒天濃度0.5%〜1.0%で調整後、培地温度50℃〜70℃にして入れたシリンジと濃度勾配をつける成分を入れて寒天濃度0.5%〜1.0%に調整して、培地温度50℃〜70℃にして入れたシリンジを、濃度勾配ができるように吐出量を変化させながら同時に、氷冷したシャーレや容器に分注することを特徴とする請求項2記載の培地の調整方法。
  5. 請求項2〜4のいずれか1項に記載の培地の調整方法を用いて得られることを特徴とする微生物の選抜を行うための培地。
  6. 請求項2〜4のいずれか1項に記載の培地の調整方法を用いて、微生物を選抜することを特徴とする微生物分離、培養ないしスクリーニング方法。
  7. 請求項1に記載の培地の作製方法を利用して食品を製造することを特徴とする食品製造方法。
  8. 様々な添加物、色や味などの成分を粘度がある寒天状の食品などの製造に利用することを特徴とする請求項7記載の食品製造方法。
  9. 混合比率を均一に変化させるために、濃度勾配をつける成分などを入れて、または入れずに寒天濃度0.5%〜1.0%で調整後、培地温度50℃〜70℃にして入れたシリンジと他の濃度勾配をつける成分などを入れて寒天濃度0.5%〜1.0%に調整して、培地温度50℃〜70℃にして入れたシリンジを、濃度勾配ができるように吐出量を変化させながら同時に、氷冷したシャーレや容器に分注することを特徴とする請求項7記載の食品製造方法。
  10. 請求項7〜9のいずれか1項に記載の食品製造方法により製造されたことを特徴とする食品。
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