CN217639050U - 一种用于快速检测土壤中大丽轮枝菌微菌核的采样装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种用于快速检测土壤中大丽轮枝菌微菌核的采样装置，其包括空气压缩机、压力表和微生物采样器，所述空气压缩机的气体进口与所述微生物采样器的排气口通过管路连接，连接所述空气压缩机和所述微生物采样器的管路上设有所述压力表。本实用新型通过启动空气压缩机，用精细称量勺称量土样，并将称取的土样快速倒入微生物采样器顶端入口中，用手掌抵住装置入口，土样在微生物采样器中的空气抽离的作用下，会均匀平铺在培养皿中；然后经培养形成肉眼可见的菌落，对菌落进行计数并根据采样体积计算个体的浓度，可快速准确检测不同地块大丽轮枝菌微菌核的含量。

Description

一种用于快速检测土壤中大丽轮枝菌微菌核的采样装置

技术领域：

本实用新型涉及一种采样装置，特别是涉及一种用于快速检测土壤中大丽轮枝菌微菌核的采样装置。

背景技术：

向日葵黄萎病的病原菌是由大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)引起的，属于半知菌亚门真菌。大丽轮枝菌寄主范围广泛，可危害200多种植物，包括多种农作物、景观植物、果树和一年或多年生牧草，并且其寄主范围仍在扩大。该菌菌丝体呈明显轮枝状，有分隔，老熟时加粗变褐，后期产生黑色微菌核。微菌核是病原菌在土壤中主要的休眠结构，抵抗不良环境能力强，是土壤中病原菌长期存活及初侵染的主要形式。因为其为病害的初侵染源，微菌核的数量及存活状态决定着黄萎病的发生严重程度。

目前，土壤中黄萎病菌微菌核定量检测方法多而复杂，最为常规的检测方法为土壤稀释梯度分离法，该方法操作复杂、实验周期长并且易受主观判断影响。利用分子检测对精细度要求较高且代表性不强。用湿筛法和果胶盐选择性培养基可定量分析土壤中大丽轮枝菌的定殖情况，但对微菌核含量较少的土壤检测能力弱。而后大量研究人员通过选择用选择性培养基分离培养微菌核，但存在的弊端为培养基成分复杂且难以进行观察和统计。

实用新型内容：

本实用新型的目的在于提供一种用于快速检测土壤中大丽轮枝菌微菌核的采样装置。

本实用新型的目的由如下技术方案实施：一种用于快速检测土壤中大丽轮枝菌微菌核的采样装置，其包括空气压缩机、压力表和微生物采样器，所述空气压缩机的气体进口与所述微生物采样器的排气口通过管路连接，连接所述空气压缩机和所述微生物采样器的管路上设有所述压力表。

所述的一种用于快速检测土壤中大丽轮枝菌微菌核的采样装置，还包括有采样器固定座，所述微生物采样器置于所述采样器固定座上方，所述微生物采样器的底部与所述采样器固定座的边缘之间设有至少两根弹性挂钩，所述弹性挂钩的一端固定在所述微生物采样器的底部，另一端拉紧钩挂在所述采样器固定座的边缘。

本实用新型的优点：本实用新型通过启动空气压缩机，用精细称量勺称量土样，并将称取的土样快速倒入微生物采样器顶端入口中，用手掌抵住装置入口，土样在微生物采样器中的空气抽离作用下，会均匀平铺在培养皿中；其是基于撞击法原理，按一定流量抽取空气，使气流中的土壤微生物粒子加速撞击到含营养选择性培养基的培养皿表面，然后经培养形成肉眼可见的菌落，对菌落进行计数并根据采样体积计算个体的浓度，可快速准确检测不同地块大丽轮枝菌微菌核的含量。

附图说明：

图1为一种用于快速检测土壤中大丽轮枝菌微菌核的采样装置示意图；

图2为培养基改良前后微菌核分离结果比较图，图中，a：MESA培养基；b：MNP-10培养基；c：本实用新型改良后培养基；

图3为土壤中微菌核的检测结果，图中a：培养12h；b：培养14d；c：微菌核菌落镜检图；

图4为不同地块土壤中微菌核数量比较箱线图；

图5为利用Q-PCR技术检测土壤中大丽轮枝菌生物量柱状图。

图6为本实用新型装置进行检测的检测结果与Q-PCR检测结果对比柱状图。

图7基于采样器-干筛法与q-PCR检测结果的相关性分析图。

空气压缩机1，压力表2，微生物采样器3，采样器固定座4，弹性挂钩5。

具体实施方式：

一种用于快速检测土壤中大丽轮枝菌微菌核的采样装置，其包括空气压缩机1、压力表2和微生物采样器3，空气压缩机1的气体进口与微生物采样器3的排气口通过管路连接，连接空气压缩机1和微生物采样器3的管路上设有压力表2。

在一具体实施方式中，其还包括有采样器固定座4，微生物采样器3置于采样器固定座4上方，微生物采样器3的底部与采样器固定座4的边缘之间设有三根弹性挂钩5，弹性挂钩5的一端固定在微生物采样器3的底部，另一端拉紧钩挂在采样器固定座4的边缘，将微生物采样器3通过弹性挂钩5固定在采样器固定座4上，避免微生物采样器3在采样过程中受气流冲击导致移位，影响检测结果。

使用方法：

将微生物采样器3与空气压缩机1用气管相连接，连接好后将压强稳定至-0.06MPa。上述培养皿放入微生物采样器3中，微生物采样器3中放置两层培养皿，下层培养皿用于接住上层培养皿取样过程中漏下的菌，保证检测结果的准确性。

启动空气压缩机1，用精细称量勺称量0.1克土样，快速倒入微生物采样器3顶端入口中，用手掌抵住装置入口5-10s，土样在微生物采样器3中的空气抽离作用下，会均匀平铺在培养皿中。

取出培养皿，将培养皿放置在霉菌培养箱中黑暗培养14天。培养后用自来水轻轻冲洗培养基表面，以去除土壤颗粒。洗过的培养皿镜检，显微镜下观察大丽轮枝菌微菌核。最后子样本单元计数，并换算每克土中所含微菌核的多少。

检测效果实验：

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1土样的采集

用于检测向日葵黄萎病菌微菌核的土壤采集自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特前旗西小召镇贾头圪旦村不同农作田。

1.1.2实验设备和培养基

微生物采样器3采用微生物ANDESON采样器(LD-FC01,山东莱恩德智能科技有限公司)；空气压缩机1采用无油静音空气压缩机(OL550A，网购)；

90mm一次性培养皿；50mL无菌离心管。

参照MSEA培养基即2g NaNO₃、1g KH₂PO₄、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.5g KCl、0.01gFeSO₄·7H₂O、2g多聚半乳糖醛酸、1mL tergitol NP10(Sigma，UK)和15g琼脂(Fluka，UK)用蒸馏水定容至1L，添加琼脂前用1mol/L KOH调pH值至6.4和MNP-10^[19]培养基即5g PGA、1.2gNaOH、1g KNO₃、1g KH₂PO₄、0.5g KCl、0.5MgSo4、15g Agar、0.5mL Tergitol、Chloramphenicol 50mg/L、Streptomycin 50mg/L、Chorletracycline 50mg/L，将二者结合后优化得到新的改良培养基NP-10培养基：

PartⅠ：5g Polygalacturonic Acid(P-3889，SIGMA)、1.4g NaOH，500mL蒸馏水；

PartⅡ：500μL Tergitol(NP-10，SIGMA)、1g KNO₃、1g KH₂PO₄、0.5g KCI、0.5gMgSO₄·7H₂O、15g Agar、500mL蒸馏水；

PartⅢ：Chloramphenicol(C8050，Solarbio)50μg/mL、Streptomycin(CS10481，Coolaber)50μg/mL、Chorletracycline(C9100，Solarbio)50μg/mL、D-Biotin 5μg/mL。

改进前培养基可定量分析土壤中大丽轮枝菌的定殖情况，但对微菌核含量较少的土壤检测能力弱，且对镰刀菌等杂菌抑制效果差。常规选择用选择性培养基分离培养微菌核，但存在的弊端为培养基成分复杂且难以进行观察和统计。而新的改良培养基NP-10培养基，具有明显的杂菌抑制效果，且成分较为简单，操作简便，易于观察。

1.2实验方法

1.2.1土壤样品预处理

利用土壤取样器取植株附近0～20cm耕作层土壤，每块地按照五点取样法寻找5个样点，每个样点取3份，共计约500g，将土壤装进透气性良好的牛皮纸袋里，做好标记带回实验室。将取回的潮湿土壤需在通风处快速风干。待土壤完全干燥后，然后用木杵将其碾碎。按照人工四分法，即将采集的土壤样品混合均匀并铺成正方形，划分对角线，分为四份，保留对角的两份，弃掉其余两份，将保留的两份均匀混合后继续用四分法处理，直至对角的两份达到所需数量为止。弃掉多余土样，从每份土样中称取10g，并倒入事先贴好标签纸的塑料瓶中。每瓶加入2.5mL DL-蛋氨酸溶液，摇动并混匀。封盖后在28～31℃的黑暗条件下静置培养5～7d,以抑制土壤中霉菌的生长。培养后找一通风良好的房间，将瓶盖打开，风干5-7d.待瓶中土样干燥后，再次小心将土样粉碎备用，此过程无菌处理，避免染菌。

1.2.2培养基配制与仪器连接

按照1.1.2材料中培养基配方，将PartⅠ、Ⅱ分别配制好后经121℃灭菌15min，灭菌后待培养基PartⅠ和PartⅡ温度降至56℃左右加入PartⅢ。混匀后倒入培养皿，每皿25mL。将微生物采样器3与空气压缩机1用气管相连接，连接好后将压强调至-0.06MPa。上述培养皿放入微生物采样器3中，微生物采样器3中放置两层培养皿，下层培养皿用于接住上层培养皿取样过程中漏下的菌，保证检测结果的准确性。

1.2.3土壤中微菌核的检测

启动空气压缩机1，用精细称量勺称量0.1克土样，快速倒入微生物采样器3顶端入口中，用手掌抵住装置入口5-10s，土样在微生物采样器3中的空气抽离作用下，会均匀平铺在培养皿中。每个样品0.5g土样，均匀分置在A，B，C，D，E和F的6个平板上。实验设置3次重复。将培养皿放置在霉菌培养箱中黑暗培养14天。培养后用自来水轻轻冲洗培养基表面，以去除土壤颗粒。洗过的培养皿镜检，显微镜下观察大丽轮枝菌微菌核。最后子样本单元计数，并换算每克土中所含微菌核的多少。最终结果与Q-PCR体系检测土壤中黄萎菌的结果相比较，以验证该检测方法的准确性。

1.2.4利用Q-PCR技术检测土壤中微菌核定殖情况

将田间取回的鲜土混匀按四分法分出2g，通过100μm尼龙滤膜过滤土壤中杂质后，按照DNeasyPowerSoil试剂盒方法提土壤微生物总DNA，并利用大丽轮枝菌特异性引物VertBt-F/R(5’-CATCAGTCTCTCTGTTTATACCAACG-3’/5’-CGATGCGAGCTGTAACTACTACGCAA-3’)对提取到的DNA进行PCR扩增。PCR反应体系如下表：

表2荧光定量PCR反应体系

Table 2The reaction system of real-time PCR

将以上试剂混匀后，放入实时荧光定量PCR仪中，按如下条件进行扩增：

从荧光PCR仪中将反应CT值拷贝出，计算出大丽轮枝菌基因相对表达量。采用SPSS软件进行方差分析(ANOVA)。各处理的平均值用Duncan进行组间差异显著性比较。

2结果

2.1土壤中微菌核的检测

利用本实用新型装置(图1)首先检测了北圪堵1号地土壤中的微菌核，并结合选择性培养基，可以检测到微菌核在培养基中生长(图3-b)，同时也观察到其它杂菌的生长。但经过显微镜下对微菌核的观察(图3-c)，通过菌落形态大小、菌落表面基内颜色可以相对容易的区分其他杂菌的污染。

2.2不同地块土壤中微菌核数量

利用本实用新型装置的检测方法对大田中不同地块的土壤进行了微菌核数量的检测，以验证其工作灵敏度。本实验将CK-0(边缘地块)的土样作为对照组，其他三个不同的地块的土样作为处理组，检测土壤中微菌核密度，检测结果见图4。

由图4箱线图可知，取自JT-1(1号地)的土样中微菌核密度最高，每克土中含有微菌核为32.80个；取自JT-2(2号地)的土样中微菌核密度最低，每克土中含有微菌核为11.80个；取自JT-3(3号地)的土样中微菌核密度介于JT-1和JT-2之间，平均值为19.08个/g土。由以上实验结果可以看出本实用新型检测方法具有较高的灵敏度。

2.3利用Q-PCR技术检测土壤中微菌核定殖情况

为了进一步校准本方法的灵敏度和准确性，本实验采用对土壤中大丽轮枝菌进行了实时荧光定量分析。同样以CK-0(边缘地块)的土样作为对照组，其他三个不同的地块的土样作为处理组。检测不同处理的大丽轮枝菌生物量与对照组作比，Q-PCR检测结果见图5。

由图5柱状图可知，取自JT-1(1号地)的土样中大丽轮枝菌生物量为对照组的4.23倍；取自JT-2(2号地)的土样中大丽轮枝菌生物量为对照组的1.58倍；取自JT-2(2号地)的土样中大丽轮枝菌生物量为对照组的1.74倍。

2.4采样器-干筛法与Q-PCR检测结果相关性分析

由图6柱状图可知，用本采样器-干筛法测得的不同地块间土壤中向日葵黄萎病的微菌核数量波动情况与实时荧光定量PCR技术检测结果具有一定相关性。微菌核数量高的地块大丽轮枝菌相对表达量也相应越高。反之，大丽轮枝菌相对表达量低的土壤检测到的微菌核数量也较少。

将基于采样器-干筛法结合选择性培养基方法和q-PCR检测的结果进行相关性分析，结果表明不同地块土壤样本中向日葵黄萎病的微菌核数量和利用实时荧光定量PCR技术检测结果呈现显著的正相关性，拟合系数(R²值)为0.85，相关系数r＝0.92，(P<0.01)如图7所示。预示着采样器-干筛法结合选择性培养基方法能够用于快速、准确的定量检测土壤中黄萎病微菌核的数量。

以上所述仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种用于快速检测土壤中大丽轮枝菌微菌核的采样装置，其特征在于，其包括空气压缩机、压力表和微生物采样器，所述空气压缩机的气体进口与所述微生物采样器的排气口通过管路连接，连接所述空气压缩机和所述微生物采样器的管路上设有所述压力表。

2.根据权利要求1所述的一种用于快速检测土壤中大丽轮枝菌微菌核的采样装置，其特征在于，其还包括有采样器固定座，所述微生物采样器置于所述采样器固定座上方，所述微生物采样器的底部与所述采样器固定座的边缘之间设有至少两根弹性挂钩，所述弹性挂钩的一端固定在所述微生物采样器的底部，另一端拉紧钩挂在所述采样器固定座的边缘。

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