CN113249428A - 一种快速检测活菌量的方法 - Google Patents

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肖传兴
袁文功
李源涛
陈章然
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Abstract

本发明公开了一种快速检测活菌量的方法，其特征在于，所述方法包括，S1、获取标准样品，将待检通过缓冲液稀释至102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍待用；S2、使用平板计数法对102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍的稀释标准样品进行计算菌落；这种方法利用apurase酶对样品的进行处理，使测定的荧光值较全面的反映菌群中的活菌量。本发明把ATP生物发光法应用到活菌检测中，具体检测粪菌，菌群移植过程中菌群起来简单、快速、准确的检测，既可以做到对移植菌群的质量常态化控制，又可以对菌群移植供体进行初步筛查避免因为供体质量的不合格造成设备人员资金的不必要浪费。

Description

一种快速检测活菌量的方法
技术领域
本发明涉及活菌检测领域，具体涉及一种快速检测活菌量的方法。
背景技术
活菌量检测的常规方法有培养基法、PCR分子检测法、PMA-qPCR法、流式细胞仪法和ATP生物发光法等。传统培养基法是利用培养基培养细菌，然后利用平板计数法进行计数而确定肠道菌群中活菌含量。传统培养基法计数的线性范围大，能够较好的反映菌落的稀释程度、重复性好，但是操作繁琐、需要操作者有熟练的技术、耗时太长；PCR分子检测方法需要特殊的仪器和器材，需专门提取样品的DNA，样品前处理步骤繁琐，操作人员需要具备专门技能。流式细胞仪法操作相对繁琐且对操作人员的要求较高。
ATP生物发光法是20世纪80年代发展起来的一种检测技术，该方法是基于萤火虫发光原理，在荧光素酶的催化作用下，ATP与荧光素反应释放荧光，通过测试发光强度来实现微生物的快速检测。腺苷三磷酸(ATP)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是细胞内的主要磷酸载体和生物能量通货，可作为主要供能物质参与体内的许多代谢反应。ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源，每种微生物细胞中的ATP含量是恒定的。通过测定样品中的ATP浓度，即可推算出菌群中活菌数，如何将ATP生物发光法较为准确的应用于活菌检测中尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测活菌量的方法，这种方法解决了现有活菌检测操作繁琐，简单的检测方法检测不准的问题，为了实现上述目的，本发明提供一下技术方案：
一种快速检测活菌量的方法包括，
S1、获取标准样品，将待检通过缓冲液稀释至102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍待用；
S2、使用平板计数法对102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍的稀释标准样品进行计算菌落；
S3、对102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍的稀释标准样品分别取1.5ml标准样品，加入0.3U/ml的apurase酶0.9μL，30℃水浴10min，再100℃水浴1min，检测发光强度；
S4、收集不同倍数标准样品通过平板计数法得到菌落的数据及检测得到的发光强度数据，得到荧光值/活菌量标准工作曲线；
S5、取1.5ml待检样品，加入0.3U/ml的apurase酶0.9μL，30℃水浴10min，再100℃水浴1min，获得发光强度，然后通过荧光值/活菌量标准工作曲线获取活菌量。
优选地，所述标准样品与待检样品为同类物质。
优选地，所述标准样品为粪菌，所述粪菌的制备方法包括以下步骤：将健康供体的粪便溶解，通过粪便分析前处理仪除去残渣，将去除残渣后的粪便稀释，再使用0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液梯度稀释至102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍。
优选地，所述粪菌的制备方法包括以下步骤：选取健康供体的粪便100-200g，将粪便溶解于750ml-1L的0.9NaCl溶液中，通过粪便分析前处理仪除去残渣，获得30-40g粪菌，称取0.1-0.2g粪菌放入2ml离心管中稀释10倍，用含有0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液梯度稀释至102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍。
有益效果
1、本发明利用apurase酶对样品的进行处理，使测定的荧光值较全面的反映菌群中的活菌量。
2、本发明把ATP生物发光法应用到活菌检测中，具体检测粪菌，菌群移植过程中菌群起来简单、快速、准确的检测，既可以做到对移植菌群的质量常态化控制，又可以对菌群移植供体进行初步筛查避免因为供体质量的不合格造成设备人员资金的不必要浪费。
具体实施方式
为突出本发明的实施目的、技术方案和结构优点，下面本发明实例中的技术方案做详细描述，所描述的实例是本发明的一部分实例，而不是全部的实例。基于本发明中的实例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实例，都属于本发明保护的范围。
S1、选取健康供体的粪便100-200g，将粪便溶解于750ml-1L的0.9NaCl溶液中，经承葛生物科技有限公司生产的粪便分析前处理仪TG-01粪便分析前处理仪除去残渣，获得30-40g粪菌，称取0.1-0.2g粪菌放入2ml离心管中稀释10倍，用含有0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液梯度稀释至102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍。
S2、使用平板计数法对102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍的稀释标准样品进行计算菌落；
平板计数：取100μL涂布在MRS、TATAC、EMB、BP、PMS、FS、EC等培养基上并在37℃厌氧、需氧培养箱中分别进行培养(每个稀释倍数进行3个重复)。
S3、对102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍的稀释标准样品分别取1.5ml标准样品，加入0.3U/ml的apurase酶0.9μL，30℃水浴10min，再100℃水浴1min，检测发光强度；
S4、收集不同倍数标准样品通过平板计数法得到菌落的数据及检测得到的发光强度数据，得到荧光值/活菌量标准工作曲线。
实施例1
(1)准确称取的志愿者A粪便0.1-0.15g并利用生理盐水稀释到103倍，分别取1.5ml样本于2ml离心管中，加入0.3U/ml的apurase酶(9μL)，于30℃水浴10min，用于酶解游离ATP，然后100℃水浴1min使该酶失活(每个检测样本三个重复，取平均值)。
(2)荧光值测定：取步骤(1)的样品利用ATP荧光检测仪测定发光强度，重复(2)，直至测试的荧光值不再发生变化，测得样品的荧光值并记录，通过上述荧光值/活菌量标准工作曲线得到活菌量。
实施例2
(1)准确称取的志愿者B粪便0.1-0.15g并利用生理盐水稀释到103倍，分别取1.5ml样本于2ml离心管中，加入0.3U/ml的apurase酶(9μL)，于30℃水浴10min，用于酶解游离ATP，然后100℃水浴1min使该酶失活。(每个检测样本三个重复，取平均值)
(2)荧光值测定：取步骤(1)的样品利用ATP荧光检测仪测定发光强度，重复(1)，直至测试的荧光值不再发生变化，测得样品的荧光值并记录，通过上述荧光值/活菌量标准工作曲线得到活菌量。
实施例3
(1)准确称健康的粪便0.1-0.15g并利用生理盐水稀释到103倍，分别取1.5ml样本于2ml离心管中，加入0.3U/ml的apurase酶(9μL)，于30℃水浴10min，用于酶解游离ATP，然后100℃水浴1min使该酶失活。(每个检测样本三个重复，取平均值)
(2)荧光值测定：取步骤(1)的样品利用ATP荧光检测仪测定发光强度，重复(1)，直至测试的荧光值不再发生变化，测得样品的荧光值并记录，通过上述荧光值/活菌量标准工作曲线得到活菌量。
实施例4
(1)准确称健康的粪便0.1-0.15g并利用生理盐水稀释到103倍，分别取1.5ml样本于2ml离心管中，加入0.3U/ml的apurase酶(9μL)，于30℃水浴10min，用于酶解游离ATP，然后100℃水浴1min使该酶失活(每个检测样本三个重复，取平均值)。
(2)荧光值测定：取步骤(1)的样品利用ATP荧光检测仪测定发光强度，重复(1)，直至测试的荧光值不再发生变化，测得样品的荧光值并记录，通过上述荧光值/活菌量标准工作曲线得到活菌量。
使用PMA-qPCR分子检测法对实施例1-4所检测的试样进行平行检测，以分别验证本发明所用的ATP生物发光反应法快速检测肠道菌群活菌量的检测准确性。两种方法测量结果见下表1。
表1
Figure BDA0003069426810000051
由表1可见实施例1-4，ATP荧光检测结果与通过PMA-qPCR法检测结果差距极小，即本发明方法检测活菌实现了简单、高效准确的技术效果。
最后声明的是：以上详细描述的仅用于本发明的实施方案，而并非对本发明专利范围内的限制。需要指出的是，本领域的普通技术人员在本发明的构思范围内进行若干变形和修改，或者对其中的部分技术特征进行相关替换，这些都属于本发明的保护范围。上述专利保护范围以所附权利要求为准最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神及范围。

Claims (4)

1.一种快速检测活菌量的方法，其特征在于，所述方法包括，
S1、获取标准样品，将待检通过缓冲液稀释至102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍待用；
S2、使用平板计数法对102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍的稀释标准样品进行计算菌落；
S3、对102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍的稀释标准样品分别取1.5ml标准样品，加入0.3U/ml的apurase酶0.9μL，30℃水浴10min，再100℃水浴1min，检测发光强度；
S4、收集不同倍数标准样品通过平板计数法得到菌落的数据及检测得到的发光强度数据，得到荧光值/活菌量标准工作曲线；
S5、取1.5ml待检样品，加入0.3U/ml的apurase酶0.9μL，30℃水浴10min，再100℃水浴1min，获得发光强度，然后通过荧光值/活菌量标准工作曲线获取活菌量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准样品与待检样品为同类物质。
3.根据权利要求2所述的方案，其特征在于，所述标准样品为粪菌，所述粪菌的制备方法包括以下步骤：将健康供体的粪便溶解，通过粪便分析前处理仪除去残渣，将去除残渣后的粪便稀释，再使用0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液梯度稀释至102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍。
4.根据权利要求3所述的方案，其特征在于，所述粪菌的制备方法包括以下步骤：选取健康供体的粪便100-200g，将粪便溶解于750ml-1L的0.9NaCl溶液中，通过粪便分析前处理仪除去残渣，获得30-40g粪菌，称取0.1-0.2g粪菌放入2ml离心管中稀释10倍，用含有0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的PBS缓冲液梯度稀释至102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍。
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