CN109576339A - 一种细菌总数的快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细菌总数的快速检测方法，属于细菌总数检测方法技术领域。本发明提供的快速检测方法，包括以下步骤：待测样本液和体细胞ATP释放剂反应，再添加ATP发光试剂反应，再添加细菌ATP释放剂反应；荧光检测仪检测所得反应液；将得到的荧光数据代入换算公式a中计算，得到待测样本液中细菌数量。采用体细胞ATP释放剂和ATP发光试剂分步添加消耗待测样品中体细胞中ATP和游离ATP后，再在细菌ATP释放剂作用下使细菌ATP释放，实现仅检测细菌ATP产生的荧光信号的目的。本检测方法实现利用ATP检测仪准确对细菌计数的目的，还具有检测灵敏度高、检测时间短的特点，应用范围广。

Description

一种细菌总数的快速检测方法
技术领域
本发明属于细菌总数检测方法技术领域，具体涉及一种细菌总数的快速检测方法。
背景技术
细菌计数是应用范围较广的研究手段，例如水体中细菌的分布是检测水体受污染程度的一个重要指标，而研究细菌的分布是检测水体中受污染程度的一个重要指标，而研究细菌分布情况最重要的是对细菌数量的准确测定，这对环境评价以及实际工程应用具有重要意义。再例如，筛查尿路是否发生感染时需对尿液中细菌数量做检测，由此可知，细菌计数在筛查尿路感染中具有临床意义。因此，提供一种简便快速的细胞总数的检测方法具有重要意义。
目前，细菌计数的方法主要包括计数器计数法、比浊法、培养法等等。计数器计数法即用血细胞计数器进行计数。由于计数室的体积是一定的(0.1mm3)，可根据计数器刻度内的细菌数计算样品中的含菌数。此方法属于手工检测，细菌浓度要求严格(一般细菌浓度在104～107个/ml)，需要专业人员完成，耗时长，最后分析结果可能会因为操作人员的改变而出现差距。培养法是日常生活、生产检测以及实验室检测最常用的活菌计数法，包括平板培养法和涂布培养法，是根据每个活的细菌能生长出一个菌落的原理设计的。培养法成本低、操作简单，培养结果以30～300个菌落为宜，因而待测菌液浓度要求严格，且培养周期长(一般需要24～48h)，操作环境要求严格。比浊法又称浊度测定法，是根据液体的浑浊程度反推液体中悬浮物的浓度。细菌的生长使得培养液变浑浊，在一定波长范围内，菌液的浓度和浑浊度成正比，用分光度计测定浑浊度，即可推算出细菌浓度。这种方法简单、操作便捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，精确度低，对颜色太深的样品不能用此法测量。
目前，还有一种快速评价细菌污染程度的方法-ATP法。三磷酸腺苷(AdenosineTriphosphate，ATP)是一切生命体能量的直接来源，普遍存在于动植物细胞、微生物和食物残留中。ATP荧光检测法是根据萤火虫发光原理开发的快速检测技术。在有氧条件下，虫荧光素酶可催化虫荧光素和ATP之间发生氧化反应形成氧化荧光素并发出荧光，发出的荧光强度与ATP含量呈正比例关系。通过测试荧光信号的强度可得知待测目标被污染的程度，因此检测ATP可作为判断是否洁净的直观指标。
但是ATP法只能检测到目标物被污染的程度，即细胞内、细胞外所有ATP的值，包括游离、动植物体细胞以及细菌细胞内的ATP。动植物体细胞中所含的ATP量是细菌ATP量的100～1000倍，而释放生物细胞外的游离ATP同样也会对细菌ATP检测产生影响，因而如果要用ATP法检测细菌数量的话，必须排除游离、动植物体细胞ATP对检测的影响。当前的ATP法检测仪无法区分当前发光值是由于生物细胞释放到体外的游离ATP造成的，还是动植物、微生物细胞内ATP造成的，因而无法直接应用到细菌检测中去。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种细菌总数的快速检测方法，实现利用ATP检测仪准确对细菌计数的目的。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种细菌总数的快速检测方法，包括以下步骤：
1)待测样本液和体细胞ATP释放剂混合反应，得到除体细胞ATP溶液；
2)将所述除体细胞ATP溶液和ATP发光试剂混合反应30～60s，得到除游离ATP溶液；
3)将所述除游离ATP溶液和细菌ATP释放剂混合反应，得到荧光反应液；
4)荧光检测仪检测所述荧光反应液，得到荧光数据；
5)将所述荧光数据代入公式a中计算，得到待测样本液中细菌数量；
其中，Y表示检测得到的荧光数据，X表示细菌数量。
优选的，所述体细胞ATP释放剂的体积为待测样本液体积的2～5倍；
所述ATP发光试剂的体积为待测样本液体积的1～3倍；
所述细菌ATP释放剂的体积为待测样本液体积的2～5倍。
优选的，所述待测样本液的制备方法根据待测样本的形态的差异采用不同方法处理：
当待测样本为固体时，用棉签擦拭待检测样本的表面，将擦拭后的棉签置于无菌纯净水中反复搅拌，得到固体待测样品液；
当待测样本为气体时，用空气采样装置采样，得到气体待检测样品液；
优选的，所述快速检测方法在荧光检测系统中进行；
所述荧光检测系统包括荧光检测容器和荧光检测装置；所述荧光检测容器为上部开口的圆柱形容器；所述荧光检测容器选用透明的材质；所述荧光检测容器可拆卸固定在荧光检测装置的底面；
所述荧光检测装置在靠近底面的侧壁上设置有探测器，用于检测荧光信号；所述荧光检测装置在设置探测器的对面侧壁上设置有反射镜，用于增强荧光信号；所述荧光检测装置的上部开口处设置盖体；所述盖体和侧壁均选择不透光的材质。
优选的，步骤1)中所述待测样本液和体细胞ATP释放剂混合，步骤2)中所述将所述除体细胞ATP溶液和ATP发光试剂混合，步骤3)中所述将所述除游离ATP溶液和细菌ATP释放剂混合的操作均在所述荧光检测容器中进行；所述荧光检测容器为从荧光检测容器中拆卸下来的状态。
优选的，步骤4)中所述荧光检测装置检测所述荧光反应液的操作将所述荧光检测容器置于所述荧光检测装置中进行检测。
本发明提供了一种细菌总数的快速检测方法，将待测样本液和体细胞ATP释放剂混合反应，以除去体细胞ATP；再和ATP发光试剂混合反应，以除去游离ATP；再和细菌ATP释放剂混合反应，使细菌内的ATP产生荧光，经荧光检测装置检测，得到荧光数据；将得到的荧光数据代入荧光强度与细菌数量之间的换算公式a中计算，得到待测样本液中细菌数量。本发明通过去除体细胞和游离ATP，使最终检测得到的荧光信号均由待测样品中细菌的ATP产生，解决上述技术问题。
同时，本发明提供的检测方法具有检测灵敏度高的特点，最低可检测到10个菌；另外本发明提供的检测方法整个检测周期只需要2～3min，检测速度快，操作简单，应用范围较广。
进一步的，本发明提供的检测方法进一步限定了检测用系统，采用本发明提供的检测系统，更加准确快速地实现检测。
附图说明
图1为本发明提供的检测方法的流程图；
图2为本发明中荧光检测系统的示意图；其中1荧光检测容器；2荧光检测装置；3探测器；4反射镜；
图3为菌液浓度与ATP亮度线性关系曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种细菌总数的快速检测方法，包括以下步骤：
1)待测样本液和体细胞ATP释放剂混合反应，得到除体细胞ATP溶液；
2)将所述除体细胞ATP溶液和ATP发光试剂混合反应30～60s，得到除游离ATP溶液；
3)将所述除游离ATP溶液和细菌ATP释放剂混合反应，得到荧光反应液；
4)荧光检测仪检测所述荧光反应液，得到荧光数据；
5)将所述荧光数据代入公式a中计算，得到待测样本液中细菌数量；
其中，Y表示检测得到的荧光数据，X表示细菌数量。
本发明提供的检测方法的流程图如图1所示。本发明将待测样本液和体细胞ATP释放剂(试剂A)混合反应，得到除体细胞ATP溶液。
在本发明中，所述待测样本液的制备方法优选根据待测样本的形态的差异采用不同方法处理：
当待测样本为固体时，用棉签擦拭待检测样本的表面，将擦拭后的棉签置于无菌纯净水中反复搅拌，得到固体待测样品液；
当待测样本为气体时，用空气采样装置采样，得到气体待检测样品液；
当待测样本为液体时，无需做任何处理，直接检测即可。
在本发明中，所述体细胞ATP释放剂的体积优选为待测样本液体积的4倍。所述体细胞ATP释放剂用于破坏体细胞的细胞膜，释放ATP，但由于细菌有细胞壁的保护，所以细菌不会受到破坏。本发明对所述体细胞ATP释放剂的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的体细胞ATP释放剂即可。所述体细胞ATP释放剂购自武汉赛思锐微生物技术有限公司。所述混合反应的时间优选为50～60s，更优选为60s。
得到除体细胞ATP溶液后，本发明将所述除体细胞ATP溶液和ATP发光试剂(试剂C)混合反应30～60s，得到除游离ATP溶液。
在本发明中，所述ATP发光试剂的体积优选为待测样本液体积的2倍。所述ATP发光试剂能够激发ATP释放荧光。本发明对所述ATP发光试剂的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的所述ATP发光试剂即可。所述ATP发光试剂购自武汉赛思锐微生物技术有限公司。所述混合反应的时间优选为40～50s，最优选为45s。所述混合反应的时间的控制有利于将将样本中所有游离ATP完全消耗掉，此过程可以用荧光检测装置实时监测荧光信号，当信号已经降到了本底以下时再添加细菌ATP释放剂。
得到除游离ATP溶液后，本发明将所述除游离ATP溶液和细菌ATP释放剂混合反应，得到荧光反应液。细菌ATP释放剂裂解强度高于体细胞ATP释放剂，能够彻底破坏细菌结构，释放所含ATP。
在本发明中，所述细菌ATP释放剂的体积优选为待测样本液体积的4倍。本发明对所述细菌ATP释放剂的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的所述细菌ATP释放剂即可。所述细菌ATP释放剂购自武汉赛思锐微生物技术有限公司。所述混合反应的时间优选为5～15s，更优选为10s。
在本发明中，所述快速检测方法优选在荧光检测系统中进行；所述荧光检测系统的结构示意图如图2所示。所述荧光检测系统包括荧光检测容器和荧光检测装置；所述荧光检测容器为上部开口的圆柱形容器；所述荧光检测容器选用透明的材质；所述荧光检测容器可拆卸固定在荧光检测装置的底面；
所述荧光检测装置在靠近底面的侧壁上设置有探测器，用于检测荧光信号；所述荧光检测装置在设置探测器的对面侧壁上设置有反射镜，用于增强荧光信号；所述荧光检测装置的上部开口处设置盖体；所述盖体和侧壁均选择不透光的材质。
在本发明中，所述荧光检测容器优选为2ml离心管。所述荧光检测装置为圆柱形容器。所述荧光检测装置的底面直径优选为15～20mm。荧光检测装置为密闭不透光，避免外界光对荧光检测的干扰。探测器用于检测荧光信号。反射镜有利于提高光信号探测效率。
在本发明中，所述待测样本液和体细胞ATP释放剂(试剂B)混合，所述将所述除体细胞ATP溶液和ATP发光试剂混合，所述将所述除游离ATP溶液和细菌ATP释放剂混合的操作优选均在避光环境下。所述荧光检测装置检测所述荧光反应液的操作将所述荧光检测容器优选置于所述荧光检测装置中进行检测。操作时，在荧光检测容器中加入待测样品液和各种反应试剂后，然后立即放到荧光检测装置中进行荧光信号的采集。
采用所述荧光检测系统进行细菌总数的检测使操作更加简便，使检测结果更加准确、可信。
得到荧光反应液后，本发明用荧光检测仪检测所述荧光反应液，得到荧光数据；将所述荧光数据代入公式a中计算，得到待测样本液中细菌数量；
其中，Y表示检测得到的荧光数据，X表示细菌数量。
公式a通过绘制菌液浓度与ATP亮度线性关系曲线得到(图3)。
下面结合实施例对本发明提供的一种细菌总数的快速检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
用培养法确定菌液浓度，用荧光检测装置确定样本ATP亮度，然后在Excel中以菌液浓度的对数为横坐标，ATP亮度的对数为纵坐标做散点图，再添加拟合曲线(图3)，并显示拟合曲线的公式和拟合系数即可，显示的拟合曲线的公式即为菌液浓度和ATP亮度的关系公式。
实施例2
待测样本为医疗器械表面，用棉签来回擦拭待检测固体的表面的有限区域，然后将棉签放到盛有无菌纯净水中反复搅拌，直至棉签上的细菌完全溶解到纯净水中。取0.1～0.2ml待测样本溶液置于2ml离心管中，然后加入4倍体积的体细胞ATP释放剂混合反应，破坏体细胞，使其释放ATP，随后加入2倍待测样本溶液体积的ATP发光试剂，计时反应60s，进而将样本中所有游离ATP完全消耗掉，此过程可以用荧光检测仪实时监测荧光信号，当信号已经降到了本底以下，那么再加入4倍体积的待测样本的细菌裂解剂ATP释放剂，并立即用荧光检测仪记录荧光数据。将得到荧光数据代入公式a中计算，得到待测样本中细菌数量。
实施例3
待测样本为环境空气，用空气采样器采样，得到待检样品溶液。取0.1～0.2ml待测样本溶液置于1.5ml离心管中，然后加入4倍体积的体细胞ATP释放剂混合反应，破坏体细胞，使其释放ATP，随后加入2倍待测样本溶液体积的ATP发光试剂，计时反应60s，进而将样本中所有游离ATP完全消耗掉，此过程可以用荧光检测仪实时监测荧光信号，当信号已经降到了本底以下，那么再加入4倍体积的待测样本的细菌裂解剂ATP释放剂，并立即用荧光检测仪记录荧光数据。将得到荧光数据代入公式a中计算，得到待测样本中细菌数量。
实施例4
待测样本为饮用水。取0.1ml待测样本溶液置于2ml离心管中，然后加入4倍体积的体细胞ATP释放剂混合反应，破坏体细胞，使其释放ATP，随后加入2倍待测样本溶液体积的ATP发光试剂，计时反应60s，进而将样本中所有游离ATP完全消耗掉，此过程可以用荧光检测仪实时监测荧光信号，当信号已经降到了本底以下，那么再加入4倍体积的待测样本的细菌裂解剂ATP释放剂，并立即转移到本发明提供的荧光检测系统中的荧光检测装置内，探测器记录荧光数据。将得到荧光数据代入公式a中计算，得到待测样本中细菌数量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种细菌总数的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)待测样本液和体细胞ATP释放剂混合反应，得到除体细胞ATP溶液；
2)将所述除体细胞ATP溶液和ATP发光试剂混合反应30～60s，得到除游离ATP溶液；
3)将所述除游离ATP溶液和细菌ATP释放剂混合反应，得到荧光反应液；
4)荧光检测仪检测所述荧光反应液，得到荧光数据；
5)将所述荧光数据代入公式a中计算，得到待测样本液中细菌数量；
其中，Y表示检测得到的荧光数据，X表示细菌数量。
2.根据权利要求1所述快速检测方法，其特征在于，所述体细胞ATP释放剂的体积为待测样本液体积的2～5倍；
所述ATP发光试剂的体积为待测样本液体积的1～3倍；
所述细菌ATP释放剂的体积为待测样本液体积的2～5倍。
3.根据权利要求1所述，其特征在于，所述待测样本液的制备方法根据待测样本的形态的差异采用不同方法处理：
当待测样本为固体时，用棉签擦拭待检测样本的表面，将擦拭后的棉签置于无菌纯净水中反复搅拌，得到固体待测样品液；
当待测样本为气体时，用空气采样装置采样，得到气体待检测样品液。
4.根据权利要求1～3任意一项所述快速检测方法，其特征在于，所述快速检测方法在荧光检测系统中进行；
所述荧光检测系统包括荧光检测容器和荧光检测装置；所述荧光检测容器为上部开口的圆柱形容器；所述荧光检测容器选用透明的材质；所述荧光检测容器可拆卸固定在荧光检测装置的底面；
所述荧光检测装置在靠近底面的侧壁上设置有探测器，用于检测荧光信号；所述荧光检测装置在设置探测器的对面侧壁上设施有反射镜，用于增强荧光信号；所述荧光检测装置的上部开口处设置盖体；所述盖体和侧壁均选择不透光的材质。
5.根据权利要求4所述快速检测方法，其特征在于，步骤1)中所述待测样本液和体细胞ATP释放剂混合，步骤2)中所述将所述除体细胞ATP溶液和ATP发光试剂混合，步骤3)中将所述除游离ATP溶液和细菌ATP释放剂混合反应的操作均在所述荧光检测容器中进行；所述荧光检测容器为从荧光检测容器中拆卸下来的状态。
6.根据权利要求5所述快速检测方法，其特征在于，步骤4)中所述荧光检测装置检测所述荧光反应液的操作将所述荧光检测容器置于所述荧光检测装置中进行检测。
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