JPH0588417B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、種々の液体および気体の試料に含
まれている微生物の数を計測する方法に関する。

（従来の技術） 飲料水、ビール、清涼飲料水、廃水、空気など
に含まれている微生物の数を計測することは、製
品の品質管理上、衛生保健上、また製造工程管理
上などで必要である。

例えば、出荷される生ビールは、その品質上、
製品中に酵母が残存してはならないとされてい
る。従つて、製造工程において生ビール中から酵
母が除去され、酵母を除去する過操作が完全に
行なわれたかを確認するために、製品ビール中の
酵母数を計測する品質検査が出荷前に行なわれ
る。この品質検査に必要な計測精度は通常１リツ
トルあたり０〜100個程度と極めて少ない。

このように大量の試料中に非常に少ない数の微
生物が含まれている場合、直接検鏡法によつて酵
母を視野内に捕捉することが困難なために培養に
よる計数法、すなわち、培養によつて酵母数を増
して直接検鏡するあるいは培養によつて生じたコ
ロニー数を計数することからなる方法が採られて
いる。

（発明が解決しようとする問題点） 従来の培養による計数法では、微生物の培養の
ために通常24〜48時間という長い培養時間を要
し、しかも操作も煩雑である。このために、培養
による計数法を製造工程のモニタリングに使用す
ることができず、また、製品の出荷判定に使用す
るとその結果がでるまで長時間製品出荷を待たな
ければならないという問題点がある。

他方、微生物、細胞等を短時間で計数する方法
として、フローサイトメーターを利用する方法、
すなわち、蛍光色素で処理された細胞等を含む試
料を、細い流路を持つ水晶製フローチヤンネル内
に流し、レーザー光をレンズによつてフローチヤ
ンネルの試料流上に焦点を合せ、細胞等から放出
された蛍光、散乱光を検知して計数する方法があ
る。しかしながら、この方法では１リツトル程度
以上の大容量の試料を分析しようとすると長時間
を要し、ビールなどの発泡性の高い試料をこの方
法に供することが困難である。

また、特開昭61−20839号公報に示された方法
があるが、この方法では、測定対象が超純水であ
り、半導体ウエハの基板上に噴射供給するもの
で、短時間に大量に処理することができず、更に
レーザー光のビーム径も１mm程度と大きいことか
ら、種々の成分を含む試料の場合には、ノイズも
大きくなるという問題がある。

この発明は上記の背景にもとずきなされたもの
であり、その目的とするところは、水、ビール、
清涼飲料水、空気などの流体試料に希薄に含む細
胞、酵母、バクテリアなどの微生物を迅速に計数
する方法を提供することである。

（問題点を解決するための手段） 本発明者は、培養によらない計数法を種々検討
した結果、試料をメンブランフイルターで過
し、別した微生物を蛍光染料で染色し、これに
光を照射すれば微生物が蛍光を発し、その数を計
測できることに注目し、更に検討して、照射光と
してレーザー光を用いしかもレーザー光のスポツ
ト径を、計数すべき微生物と実質的に同程度の大
きさに絞つてフイルター面を走査すれば、種々の
成分によるノイズを小さくできるとともに、短時
間に大量の試料水の測定に対して利用でき、この
発明の目的達成に有効であることを見出しこの発
明を完成するに到つた。

すなわち、この発明による微生物の計数法は、
微生物を含有する流体試料をメンブランフイルタ
ーで過してそのフイルターに該微生物を捕捉
し、メンブランフイルター上の微生物を蛍光染料
で処理して選択的に染色し、微生物を捕捉したま
まのメンブランフイルター面を、計数すべき微生
物の寸法と実質的に同程度のビーム径のレーザー
光で走査して微生物から蛍光を放出させ、例え
ば、その蛍光を光電子増倍管で選択的に受光して
該蛍光を検知し、その検知信号から微生物の数を
計数することからなるものである。

以下、この発明をより詳細に説明する。

この発明の計数法において、まず微生物を含有
する流体試料をメンブランフイルターで過して
メンブランフイルターに該微生物を捕捉する。

この発明において用いられる流体試料は、微生
物を含む液体または気体であつて、例えば、飲料
水、廃水、河川水、発酵酒、清涼飲料水、病院や
精密部品製造工場のクリーンルームの空気、処理
水などがある。試料に含まれる微生物が非常に少
ない場合もしくは微生物が過多である場合、必要
に応じて試料を濃縮もしくは希釈してもよい。こ
のメンブランフイルターは、計数を目的とする微
生物の寸法よりも小さい孔径を有するものであ
る。メンブランフイルターの材質、寸法などは
種々のもののなかから適宜選択することができる
が、そのよううなものとしてポリカーボネート、
ポリエチレン、アセチルセルロースなどがある。
フイルターによる試料の過は、外からの微生物
の混入を防止するように実施され、この操作によ
つてフイルターの孔径より小さい微生物、その他
の固形物、半流動物などがメンブランフイルター
上に捕捉される。例えば、平均寸法10μmの酵母
を含む633mlの生ビールを、孔径0.45μmのポリカ
ーボネート膜（直径47mm）で約15分間吸引過し
て酵母をフイルター上に捕捉することができる。

この発明においてメンブランフイルター上の微
生物が蛍光染料で処理されて選択的に染色され
る。これは、フイルター上に捕捉した微生物を容
易に選択検出するためである。蛍光染料の処理
は、メンブランフイルター上の微生物を失なわな
いように、フイルターへの蛍光染料による浸漬、
噴霧、塗布などによつて行なう。この発明におい
て用いることのできる蛍光染料は、微生物を選択
的に染色・標識するものであり、そのようなもの
として具体的には、DNA結合性蛍光色素、蛋白
質結合性蛍光色素などの蛍光標識試薬があり、例
えば、プロピデイウム・イオダイド（PI）、フル
オレセインイソチオシアニン（FITC）、テトラ
メチルローダミンイソチオシアニン（RITC）な
どがある。これらは、標識対象の微生物の種類、
レーザー光の波長に応じて適宜選択することが望
ましい。試料が生ビールである場合、ビール中の
蛋白質がフイルター上に残留すること、酵母以外
の無機質の夾雑物もフイルター上に残留して紫外
励起で自家蛍光を発すること、退色の早い蛍光色
素では後の計測の際に不都合であること等の理由
から、この発明の好ましい蛍光染料として、プロ
ピデイウム・イオダイド（PI）、アクリジンオレ
ンジ、エチジウムブロマイドなどがある。通常、
蛍光染料の処理によつてメンブランフイルター上
の微生物が死滅し、実質的に100％の細胞が染色
される。染色後、余分の蛍光染料を除去し、洗
浄、乾燥、フイルターをホルダー、例えば２枚の
ガラス板で挾み込む固定などの後処理をする。

この発明において、微生物の計数は、微生物が
固定されたメンブランフイルターの表面をレーザ
ー光で走査してこの微生物から蛍光を放射させ、
この放射された蛍光を検知して行なう。この発明
において用いられるレーザー光は、蛍光染料が励
起する波長などに応じて適宜選択すべきである
が、そのようなものとして、アルゴンレーザー、
クリプトンレーザー、炭酸ガスレーザー、ガラス
レーザー、その他、液体レーザー、半導体レーザ
ーなどがある。レーザー光の照射は、この発明に
おいて、全面照射もしくは広範囲照射ではなく、
ビーム径を絞つたレーザー光でメンブランフイル
ター表面上を走査して行なわれる。レーザー光の
ビーム径は、計数しようとする微生物の寸法と実
質的に同程度の大きさである。より具体的には、
ビーム径は微生物の平均寸法の好ましくは５倍〜
１／５倍の大きさである。走査速度は適宜変更する
ことが望ましい。また、レーザー光の強度等の照
射パラメータも各々の条件に応じて適宜選択する
ことができる。

レーザー光の照射により放射される蛍光は検知
され、その検知信号から微生物の数が計測され
る。この発明の好ましい態様として、蛍光の検知
は、バツクグラウンドからの散乱光を例えばカツ
トフイルターで遮断し、蛍光を光電子増倍管で選
択的に受光して行なう。この態様では、パルスな
どの電気信号に変換された検知信号が記録計のグ
ラフに記録され、グラフに示されたパルスの数を
数えて微生物を計数することができると共に、そ
の検知信号をＡ／Ｄ変換器を介してマイクロコン
ピユータのインターフエースに送出し必要なデー
タ処理をコンピユータで行なつて微生物の計数を
実施してもよい。

（作用） 上述のような構成を有するこの発明は、以下の
ように作用する。

メンブランフイルター上に捕捉された微生物を
蛍光染料で選択染色する。この発明の特徴の一つ
は、この染色処理されたフイルターをレーザー光
で走査照射して蛍光を検知することである。この
発明において用いられる、位相のそろつた一直線
に進み広がりのないレーザー光は、高エネルギー
の光であると共に、単一波長の光であるので、微
量の蛍光で検出可能であり、しかも散乱光と蛍光
との分離が容易である。従つて、広いメンブラン
フイルターによる散乱光から微小な微生物による
蛍光を検出することをレーザー光の利用によつて
可能にする。メンブランフイルター上の広い面積
を一様にレーザー光で照射すると、メンブランフ
イルター自身が発するバツクグラウンドの蛍光も
あるので、高い信号(S)とノイズ(N)との比、すなわ
ち高いＳ／Ｎ比を得ることができない。この発明
においてレーザー光の照射は、ビーム径を絞つた
レーザー光の走査によつて行なう。この走査照射
中に、レーザー光ビームが微生物を照射している
とき、微生物からのみ強い蛍光が発生し、バツク
グラウンドから蛍光が発生せず微生物の蛍光に混
入しない。他方、レーザー光のビームが微生物か
ら外れたとき、バツクグラウンドから弱い蛍光が
発生するだけである。従つて、走査照射によつて
得られた分析結果は、微生物の存在する箇所で強
い蛍光を検知し、逆に微生物が存在しない箇所で
弱い蛍光のみを検知する。

（実施例） この発明を、図面を参照しつつ具体的な例によ
つて説明する。

調製例 孔径0.45μmのポリカーボネート製メンブラン
フイルター（直径47mm）を備えた過装置で、外
部から微生物が混入しないように、１〜100個の
酵母（直径10μm）が実験のために添加された633
mlの生ビールを吸引過し、約15分で完了した。

メンブランフイルター上に捕捉された微生物を
染色するために、プロピデイムイオダイド（PI）
の蛍光溶液（PI1〜５mg／−4.5％エタノール）
に上記のメンブランフイルターを１〜５分間浸漬
した。次いで、蛍光溶液からフイルターを引き出
し、余分の液を吸引過して除去した。このフイ
ルターを２枚のガラスに挾み、サンプルを調製し
た。

装置例 この発明の方法に使用することのできる装置例
の概要図を第１図に示す。

この装置は、アルゴンイオンレーザーを放射す
るレーザー光源１と、試料であるメンブランフイ
ルター４を載置する試料用XYテーブル５と、レ
ーザー光源１からテーブル５へのレーザー光路中
に設けられたスキヤニングミラー２および集光レ
ンズ３と、試料からの蛍光を検知する受光用光電
子増倍管９と、光電子増倍管の前面に設けられた
カツトフイルター７および集光レンズ８と、XY
テーブル５を駆動するXYテーブル駆動装置６
と、光電子増倍管が検知した信号を記録する記録
計１１と、上記の各要素と接続し計数を制御する
制御部１０とからなる。

次いでこの装置の動作を説明する。まず、XY
テーブル５の上に試料のメンブランフイルター４
を置く。次いで、レーザー光源１から照射された
レーザー光は、集光レンズ３で試料フイルター４
上に一定のビーム径で集光される。レーザー光
は、スキヤニングミラー２で一定の周波数でＸ方
向に振られるので、試料表面がＸ方向へ走査され
る。メンブランフイルターのうち特定の蛍光波長
の光のみを、カツトフイルター７および集光レン
ズ８を通して光電子増倍管９で受光し、この光の
強度を電気信号に変換する。一方、Ｙ方向へは、
XYテーブル駆動装置６でXYテーブル５を機械
的に送り、メンブランフイルター４を移動させ、
上記のＸ方向と同様に走査して、メンブランフイ
ルター全面を走査・受光する。

制御部１０では、上記の各要素の動作、すなわ
ち、XYテーブル５の位置決め制御、スキヤニン
グミラーの制御、光源の制御、および光電子増倍
管９からの信号を処理して記録計１１にデータを
送出する制御を行なう。

応用例 調製例で得た試料を、装置例の装置を用いて微
生物の計数を行なつた。その結果の一部であるメ
ンブランフイルターからの典型的出力波形を第２
図に示す。この図から判かるように、バツクグラ
ウンド(N)に対しＳ／Ｎ比の高いパルス状の検知信
号(S)が得られた。また、計数時間は短時間（約10
分以内）であつた。なお、レーザー光として出力
10mWのアルゴンレーザーを用い、このビーム径
は10μmであつた。

酵母の直径は10μmであつて、この酵母の大き
さと同程度のビーム径を用いたので、第２図のよ
うにクリアーなピークが得られた。

（発明の効果） この発明によつて次の効果を奏する。

(a) 従来法のように24〜48時間を要する培養によ
らないので、10分間以内の短時間で、微生物を
計数することができ、工程のモニタリング、製
品の品質管理の検査を大幅に短縮することがで
きる。

(b) 高いＳ／Ｎ比の測定を行なうことができるの
で、精度の高い微生物の計数を行なうことがで
き、また、データ処理および自動化が容易とな
る。

(c) 純水中の微生物の検出等のように微生物濃度
が低いために、従来は培養法にたよらざるを得
なかつた分野でも応用が期待でき、さらに、固
体レベルでの細胞の解析等の試験研究の目的に
も応用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の方法に用いることのできる
装置例の概要図、第２図は微生物の計数の出力波
形を示す線図である。 １……レーザー光源、２……ミラー、３……集
光レンズ、４……試料、５……XYテーブル、６
……XYテーブル駆動装置、７……カツトフイル
ター、８……集光レンズ、９……光電子増倍管、
１０……制御部、１１……記録計。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 微生物を含有する流体試料をメンブランフイ
   ルターで濾過してメンブランフイルターに該微生
   物を捕捉し、メンブランフイルター上の微生物を
   蛍光染料で処理して選択的に染色し、該微生物を
   固定したメンブランフイルター面を、計数すべき
   微生物の寸法と実質的に同程度であるビーム径の
   レーザー光で走査して微生物から蛍光を放出さ
   せ、該蛍光を検知し、該検知信号から微生物を計
   数することからなる微生物の計数法。 ２ 放出された蛍光の検知が、光電子増倍管で選
   択的に蛍光を受光して行う特許請求の範囲第１項
   記載の計数法。