JP4749704B2 - 微生物の検出方法及び微生物検出用プレート - Google Patents
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Description
メンブランフィルタの平面度を確保する際には、次の方法で実施することが知られている(ChemScan RDI User Manual, Gunze Sangyo Scientific Instruments)。まず、メンブランホルダー(ステンレス製)に100μlの緩衝液(商品名:Chemsol B16)を滴下し、中間材として、円形のニトロセルロース製フィルタ(商品名:Support PAD)を置き、Support PADを完全に湿潤させる。続いて、その上に蛍光染色したメンブランフィルタをSupport PADに重ねる。このような手順を経て、最終的にはメンブランフィルタがそのホルダーに密着し、フラットな状態が保たれる。
すなわち、本発明は、メンブランフィルタ上の微生物を検出する方法であって、緩衝剤を介してセラミックからなる支持体にメンブランフィルタを配置することを特徴とする前記方法を提供する。
また、本発明は、緩衝剤及びネットフィルタ介してセラミックからなる支持体にメンブランフィルタを配置した微生物検出用プレートを提供する。
また、本発明は、グリセロールを含む微生物検出用プレート用緩衝剤を提供する。
本発明の方法において、メンブランフィルタは緩衝剤を介して前記支持体上に配置される。緩衝剤としては、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液(PBS)、マレイン酸緩衝液等を用いることができる。好ましくは、緩衝剤はグリセロールを含む。グリセロールの粘性によって前記支持体とメンブランフィルタとの密着性が向上し、メンブランフィルタの乾燥を防止する。また、粘度上昇により酸素濃度が低減し、蛍光染色した微生物の褪色をも防止することができる。さらに、p-フェニレンジアミンやDABCO(1,4-ジアザビスシクロ-2,2,2-オクタン)などの退色防止剤を添加してもよい。退色防止効果をさらに向上させることができる。
本発明の方法において、緩衝剤を介してメンブランフィルタを前記支持体上に配置する場合、さらにネットフィルタを介してメンブランフィルタを配置するのが好ましい。ネットフィルタとしては、ナイロン製、ポリプロピレンなどのネットフィルタが挙げられる。好ましくは、ナイロン製である。緩衝剤を速やかに浸潤させることができ、メンブランフィルタの高さを短時間で安定させることができる。ネットフィルタのメッシュサイズは、10〜200μm程度のものが適している。
ポリマー層を構成するポリマーは、通常メンブランフィルタとして使用されるポリマーであれば特に限定されるものではないが、例えばニトロセルロース、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリスルホン、ポリフッ化エチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンが挙げられる。好ましくは、ポリエステル、ポリカーボネートである。ポリエステルやポリカーボネートなどで製造するメンブランフィルタは細孔サイズが均一であるため、細菌などを捕捉し、蛍光染色観察するのに適している。
ポリマー層の厚さは、好ましくは10〜500μmであり、より好ましくは20〜30μmである。
金属層を構成する金属は、特に限定されるものではないが、例えば金、銀、銅、亜鉛、アルミニウム、チタン、タンタル、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、鉛、錫などの金属又はこれらの合金が挙げられる。好ましくは、錫である。錫は微生物に対する毒性がなく、染色後の細菌観察が容易であるので特に効果的である。
金属層の厚さは、好ましくは0.1nm〜1μmであり、より好ましくは10〜100nmである。
本発明の方法で用いるメンブランフィルタの細孔サイズは、好ましくはφ0.1〜10μmであるが、対象となる微生物細胞のサイズにより細孔サイズを選択することが好ましい。
細孔密度は、好ましくは105〜108個/m2である。細孔密度が大きければ大きいほど濾過性はよいが、メンブランフィルタの強度が低下する傾向があるため、これらを考慮して細孔サイズと細孔密度を選択する必要がある。
図1に示した9箇所の円形のウェルを持ち、各ウェルに各1枚の試料をセットできる形状のプレート(材質:セラミックSiC)を作成した。各ウェルにつき、円の中心および中心を通る2本の直行軸と円周の交点の5箇所のプレート底面からの高さを測定したところ、交差は2μm以下であり、極めて平行度の高いものであった。このプレートの任意の場所のウェルを用いて、以下のような緩衝剤とパッドの組み合わせで試料を調製した。
緩衝剤(PBS/グリセロール、等量混合)+パッド(ナイロンネットフィルタ:TYPE NY60、60μm、Millipore)
試料2:
緩衝剤(PBS)+パッド(ナイロンネットフィルタ:TYPE NY60、60μm、Millipore)
試料3:
緩衝剤(PBS)+パッド(ニトロセルロースフィルタ:TYPE HA、0.45μm、Millipore)
試料4:
緩衝剤(PBS/グリセロール、等量混合)+パッド(ニトロセルロースフィルタ:TYPE HA、0.45μm、Millipore)
Claims (8)
- メンブランフィルタ上の微生物を検出する方法であって、緩衝剤及びネットフィルタを介してセラミックからなる支持体にメンブランフィルタを配置することを特徴とする前記方法。
- 緩衝剤がグリセロールを含む、請求項1記載の方法。
- ネットフィルタがナイロンネットフィルタである、請求項1又は2記載の方法。
- メンブランフィルタがポリマー層と金属層とを有するメンブランフィルタである、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- メンブランフィルタ上の微生物を検出する方法が顕微鏡を用いる方法である請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 2以上のメンブランフィルタを同時に配置する請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 緩衝剤及びネットフィルタを介してセラミックからなる支持体にメンブランフィルタを配置した微生物検出用プレート。
- 2以上のメンブランフィルタを配置した請求項7記載のプレート。
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