JP4947341B2 - 共焦点顕微鏡の同期縞除去方法 - Google Patents

Description

本発明は共焦点顕微鏡に関し、詳しくは、観察試料に際して同期縞（モワレ縞）の発生を除去した共焦点顕微鏡の調整方法に関するものである。

共焦点顕微鏡は、レーザ（以下、光画像計測用光ビームという）によって試料上の集光点を走査し、試料からの戻り蛍光を結像させて画像を得ることにより試料を観察するもので、生物やバイオテクノロジーなどの分野おける生きた細胞の生理反応観察や形態観察、あるいは半導体市場におけるＬＳＩの表面観察等に使用されている。

図1は、従来及び本発明に用いる共焦点顕微鏡の一例を示した要部構成図である。図１において、共焦点スキャナユニット１は、顕微鏡ユニット２のポート３に接続されており、画像計測用光ビーム４は、マイクロレンズアレイディスク５のマイクロレンズ６により個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー７を透過後、ピンホールディスク（以下、ニポウディスクという）８の個々のピンホール９を通過し、顕微鏡ユニット２の対物レンズ１０により、ステージ１１上の試料（図示省略）に集光される。

この画像計測用光ビーム４の照射により、試料が蛍光する。試料から出た戻り蛍光は、再び対物レンズ１０を通り、ニポウディスク８の個々のピンホール９上に集光される。個々のピンホールを通過した戻り蛍光は、ダイクロイックミラー７で反射され、リレーレンズ１２を介してイメージセンサ１３に結像される。

このような装置では、図示しないモータでマイクロレンズアレイディスク５及びニポウディスク８を同軸で一定速度回転させており、この回転によるピンホール９の移動により試料上への集光点を走査している。

ニポウディスク８のピンホール９が並んでいる表面と、試料の被観察面と、イメージセンサ１３の受光面とは互いに光学的に共役関係に配置されているので、イメージセンサ１３には、試料の光学的断面像、即ち共焦点画像が結像される。ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡の詳細に関しては、特許文献１に開示されている。

特許文献１には、結像特性を向上し、ピンホール面からの迷光を低減できるようにした
共焦点用光スキャナが記載されている。

特開平５−６０９８０号公報

ところで、このような共焦点顕微鏡ではピンホールディスクが３０度回転するたびにピンホールがイメージセンサを介して表示される画面上をもれなく走査して１画面が生成されるようになっている。
例えば、ディスクが５０００ｒｐｍで回転しているときに１画面が生成される時間は次の計算より１ｍｓとなる。即ち、
５０００ｒｐｍ／６０秒＝８３．３３ｒｐｓ
フレームレート＝８３．３３×１２＝１０００ｆｐｓ(毎秒１０００コマ)

フレーム周期＝１÷１０００ｆｐｓ＝１ｍｓ

共焦点顕微鏡を用いた画像観察では、カメラの露光時間が短く（１００ｍｓ以下、特にビデオレート３３ｍｓ以下）なってくると、図２（ａ）に示すような同期縞と呼ばれる円弧状の横縞が画像に現れることがある。これは例えばニポウディスクが３０度回転したときに１画像を形成するとした場合におけるＣＣＤデジタルカメラの露光時間との位相がずれることによるものである。
なお、ピンホールの配置方式としては等角螺旋配置、正方配置、等ピッチ螺旋配置などがあるが、本発明で使用するピンホールの配置は図２(ｂ)で示すような等ピッチ螺旋配置を用いている。

ＮＴＳＣ（National Television System Committee）カメラを使用する場合、共焦点顕微鏡の同期入力端子にカメラの映像コンポジット信号を入力して、回転を同期させる機構が用意されているが、ノンインターレス撮像を行うＣＣＤデジタルカメラの場合には同期させるための有効なメカニズムが無い。

従って本発明は、露光時間から最適な回転数を計算で求め、共焦点スキャナユニット（ＣＳＵ）に対して回転数設定コマンド等で回転数を合わせることにより、共焦点顕微鏡のピンホールディスクの最適な回転数を設定して同期縞を除去することを目的としている。

このような課題を達成するために、本発明は、請求項１においては、
顕微鏡ユニットとニポウディスク方式の共焦点スキャナユニットから構成され
、前記ニポウディスクの回転とＣＣＤデジタルカメラの露光時間の位相を一致さ
せ、試料に照射される画像計測用光ビームの戻り蛍光をＣＣＤデジタルカメラに
結像させた共焦点画像により前記試料の観察を行なう共焦点顕微鏡の同期縞除去
方法であって、
前記共焦点スキャナユニットを構成するピンホールディスクが３０度回転する
たびに前記ピンホールディスクに形成されたピンホールがイメージセンサを介し
て表示される画面上をもれなく操作して一画面が生成される共焦点顕微鏡の同期
縞除去方法において、
下記のステップ１ないし３によりニポウディスクの回転数を選択して同期縞の
ない画像を得ることを特徴とする共焦点顕微鏡の同期縞除去方法。
記
ステップ１
戻り蛍光をＣＣＤデジタルカメラに結像させたときの共焦点画像の明るさを確
認して露光時間［ｔ］をまず決める。
ステップ２
決めた露光時間［ｔ］に当てはまる積算回数［ｎ］と回転数［ｆ］の組合せを求
める。
露光時間ｔ＝積算回数［ｎ］×一画面生成時間［ｓ］
ここで、ｓ＝６０［ｓｅｃ］／（ニポウディスクの回転数［ｒｐｍ］×１２）
但し、１２はニポウディスクが３０度回転したときに１画面を生成するとした
ときの１回転の値（３６０／３０）。
ｆ＝１／｛（露光時間［ｔ］／積算回数［ｎ］）×（１２／６０［ｓｅｃ］
）｝
ステップ３
ステップ２で得られた組合せの中で、ニポウディスクの回転数が整数となる
値で、かつ、共焦点顕微鏡の仕様回転範囲内で、積算回数が一番大きい回転数を
最適回転数とする。

請求項２においては、請求項１に記載の共焦点顕微鏡の同期縞除去方法において、
前記ニポウディスクの回転とＣＣＤデジタルカメラの露光時間の位相を外部装置を用いて通信により設定することを特徴とする。

請求項３においては、請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡の同期縞除去方法において、
前記ニポウディスクの回転とＣＣＤデジタルカメラの露光時間の位相を設定すると共に画像転送時間のあとに待ち時間を設けたことを特徴とする。

以上説明したことから明らかなように、本発明によれば、試料の観察を行なう共焦点顕微鏡の調整方法において、
ニポウディスクの回転とＣＣＤデジタルカメラの露光時間の位相を一致させ、共焦点スキャナユニットのディスク回転を最適値に設定したので、ＣＣＤデジタルカメラの撮像同期縞を除去することができる。また、ニポウディスクの回転とＣＣＤデジタルカメラの露光時間の位相を一致させることにより同期縞が流れないようにすることができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
はじめにニポウディスクの回転数から次式により一画面生成時間［ｓ］を求める。
ｓ＝６０［ｓｅｃ］／（ニポウディスクの回転数×１２）・・・（１）
但し、１２はニポウディスクが３０度回転したときに１画面を生成するとしたときの１回転の値（３６０／３０）。
ここで、同期縞を消去するためには、露光時間［ｔ］が１画面生成にかかる時間［ｓ］の整数倍［ｎ倍］となるように設定すれば良い。このｎを積算回数と呼ぶ。
露光時間［ｔ］＝積算回数［ｎ］×一画面生成時間［ｓ］・・・（２）

露光時間が決まった場合の最適な回転数［ｆ］は次式により求めることができる。
回転数［ｆ］＝１／｛（露光時間／積算回数）×（１２／６０）｝・・・（３）
但し、毎分の回転数は１５００ｒｐｍ回転数以上５０００ｒｐｍ以下でなければならない。即ち、１５００≦回転数［ｒｐｍ］＜５０００

上記の条件を（１），（２），（３）式を満たし、且つ回転数が整数に近くなるような値で積算回数が多くなるように回転回数を選択すると同期縞のない画像を得ることができる。

図３は露光時間を例えば２４ｍｓとしたときの最適積算回数の選定を行うための図である。即ち、露光時間を０．０２４秒とし、積算回数を整数の８〜２４としたときのニポウディスクの回転数を求めたものである。

ここで積算回数を７とした場合の回転数は前記３式より、
回転数［ｆ］＝１／｛（０．０２４／７）×（１２／６０）｝＝１４５８．３
となり、１５００≦回転数［ｒｐｍ］の条件を満たさない。また、積算回数を２４とした場合は、
回転数［ｆ］＝１／｛（０．０２４／２４）×（１２／６０）｝＝５０００
となるので、回転数［ｒｐｍ］＜５０００の条件を満たさない。

図３の中では積算回数が９，１２，１５，１８，２１の場合が整数に割り切れた値を示し、その中で積算回数のもっとも多い２１の４３７５ｒｐｍが最適な回転数であることが分かる。

次に、図４〜図７を用いて本発明による効果について説明する。なお、測定条件は下記の通りである。
１） ＣＣＤカメラの画像を転送することによって生じる同期縞を最小化するため、読み出し速度を遅く設定した。
２） 図１に示す共焦点顕微鏡のステージ上に試料を置かず光源としてはハロゲンランプの落射光を用いて均一なホワイト画像が得られるようにした（実際の測定ではレーザを用いるが、試料より出る蛍光を画像エリアに均一にすることは大変難しいため効果の検証をするため、画像エリア内の光強度分布が一定になるようハロゲンランプを使用した）。
３） ニポウディスクの回転数を、最小、最大、最適値、最適値＋２，最適値＋４および任意速度とし、ホワイト画像を撮影して現れた同期縞を観察する。
４） 各画像を１６ｂｉｔＴＩＦＦに変換し定域領域の縦方向の値を表計算ソフト上にプロットしデータの標準偏差を求め、他に比べて値が小さなものを効果があったと判定した。

図４は例えばパソコンに取り込んだ画像のうち、Ａで示す定域領域を選択した状態を示す参考図である。以下の図はこの範囲におけるニポウディスクの回転数と明るさの関係を示している。
図５はＡで示す領域における列方向(Ｘ方向)の明るさの平均とＹ方向の関係をプロットしたもので縦軸は明るさの平均値、横軸は図４におけるＹ方向を示している。この図はＹ方向の光強度の分布を調べるためのものである。

図６(ａ，ｂ)はＣＣＤカメラの露光時間を２４ｍｓとしたときのニポウディスクの回転数（ｓｐｅｅｄ）と平均値（ＡＶＥ）および標準偏差（σ）の関係を示すものである。図６(ａ)では最小回転数を１５００ｒｐｍとし、任意速度として３０００，３２００、最適速度を４３７５および最大速度を４９９９ｒｐｍとした場合について平均値（ＡＶＥ）および標準偏差（σ）を求めている。

ここで、標準偏差、および標準偏差／平均の値が小さいほうが、効果があることが分かる。なお、最大回転数４９９９ｒｐｍも標準偏差が小さいが、実用的にはモータやニポウディスクの寿命を考慮して最適回転数（４３７５ｒｐｍ）で回転させている。

図６(ｂ)は６(ａ)における回転数のそれぞれにおける輝度を示すものである。横軸に図４におけるＹ方向の数値（無単位）を示し、縦軸に輝度を示している。
図によれば、青で示す１５００ｒｐｍの輝度は上下の振れがが大きく同期縞が現れやすいことを示している。また、３０００ｒｐｍ〜４９９９ｒｐｍでは上下の振れは小さく同期縞は比較的に現れにくいことを示している。

図７(ａ，ｂ)は共焦点スキャナユニット（ＣＳＵ）に対して外部に設けたパソコン（ＰＣ）などを用いて通信により最適回転数を制御するように構成したものである。
即ち、図７ａにおいては、外部ＰＣ２０とＣＳＵ１を通信回線により接続しＰＣからＣＳＵ１に対して露光時間と転送時間（ＣＣＤに貯まった電荷を電圧信号に変えて読み出す時間）を入力する。

ＣＣＤデジタルカメラはＰＣから送信された条件設定（露光時間、転送時間やゲインなど）に従いＰＣに画像を転送する。このことによりＣＳＵ１は同期縞のない最適条件で回転する。

図７ｂにおいては、外部ＰＣ２０とＣＳＵ１を同期制御装置２１を介して通信回線により接続しＰＣからＣＳＵ１に対して露光時間と転送時間あるいは回転数を入力する。即ち、
露光時間＋転送時間の場合は同期制御装置２１の中で最適回転数を計算し、そのタイミングにあったトリガを発生する。また、回転数の場合は、同期制御装置２１は回転数にあったトリガを発生させる。ＣＳＵ１は外部よりトリガが入力された場合、そのトリガの周期に合わせて内部ディスクが同期する機構を持っている。従って、この場合もＣＣＤデジタルカメラはＰＣから送信された条件設定に従いＰＣに画像を転送する。

ところで、ニポウディスクの回転を最適な回転数に設定して、位相を合わせてカメラの露光時間を設定し、画像を時間順に追っていくと、画面に現われた縞が回転灯のように上方（下方）に動いていく現象が生じる。
図８(ａ〜ｃ)は(ａ)→(ｂ)→(ｃ)のように同期縞が流れている現象を示し、イ、ロで示す同期縞が上方に移動している状態を表している。

このような同期縞の流れ現象を２積算（３０度×２）で１枚の画像を撮る場合について説明する。
ノンインターレスカメラの場合、露光時間（６０度）の後に転送時間（２０度）がある。そのため図８（ｄ）に示すように、２枚目の露光が始まるのが８０°からになり、３０°刻みからは位相がずれてしまう。その結果、１回目の画像の縞の位置からシフトするものと推察される。

従って、図８（ｅ）に示すように、転送時間の後に、任意の待ち時間(ここでは１０度の)を設けてフレームが３０度の倍数から始まるように設定（この設定はパソコン側から行う）すれば流れを防止することができる。なお、この場合は転送時間＋待ち時間があるため、１回転で４フレームとなる。

なお、以上の説明は、本発明の説明および例示を目的として特定の好適な実施例を示したに過ぎない。従って本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形を含むものである。

本発明および従来例の一実施例を示す共焦点顕微鏡の要部構成図である。 円弧状の同期縞およびピンホールの配置例を示すである。 露光時間所定の時間に設定したときの最適積算回数の選定を行うための説明図である。 パソコンに取り込んだ画像のうち、定域領域を選択した状態を示す参考図である。 明るさの平均値とコマンドの結果を示す図である。 ＣＣＤカメラの露光時間を所定の時間としたときのニポウディスクの回転数（ｓｐｅｅｄ）と平均値（ＡＶＥ）および標準偏差（σ）の関係を示す図である。 共焦点スキャナユニット（ＣＳＵ）に対して外部に設けたパソコン（ＰＣ）などを用いて通信により最適回転数を制御するように構成したものである。 同期縞の流れと、その流れ対策を施すための模式図である。

符号の説明

１ 共焦点スキャナユニット（ＣＳＵ）
２ 顕微鏡ユニット
３ ポート
４ 画像計測ビーム(レーザ光)
５ マイクロレンズアレイディスク
６ マイクロレンズ
７ ダイクロイックミラー
８ ピンホールディスク
９ ピンホール
１０ 対物レンズ
１１ ステージ
１２ リレーレンズ
１３ イメージセンサ
２０ パソコン（ＰＣ）
２１ 同期制御装置

Claims (3)

1. 顕微鏡ユニットとニポウディスク方式の共焦点スキャナユニットから構成され
   、前記ニポウディスクの回転とＣＣＤデジタルカメラの露光時間の位相を一致さ
   せ、試料に照射される画像計測用光ビームの戻り蛍光をＣＣＤデジタルカメラに
   結像させた共焦点画像により前記試料の観察を行なう共焦点顕微鏡の同期縞除去
   方法であって、
   前記共焦点スキャナユニットを構成するピンホールディスクが３０度回転する
   たびに前記ピンホールディスクに形成されたピンホールがイメージセンサを介し
   て表示される画面上をもれなく操作して一画面が生成される共焦点顕微鏡の同期
   縞除去方法において、
   下記のステップ１ないし３によりニポウディスクの回転数を選択して同期縞の
   ない画像を得ることを特徴とする共焦点顕微鏡の同期縞除去方法。
   記
   ステップ１
   戻り蛍光をＣＣＤデジタルカメラに結像させたときの共焦点画像の明るさを確
   認して露光時間［ｔ］をまず決める。
   ステップ２
   決めた露光時間［ｔ］に当てはまる積算回数［ｎ］と回転数［ｆ］の組合せを求
   める。
   露光時間ｔ＝積算回数［ｎ］×一画面生成時間［ｓ］
   ここで、ｓ＝６０［ｓｅｃ］／（ニポウディスクの回転数［ｒｐｍ］×１２）
   但し、１２はニポウディスクが３０度回転したときに１画面を生成するとした
   ときの１回転の値（３６０／３０）。
   ｆ＝１／｛（露光時間［ｔ］／積算回数［ｎ］）×（１２／６０［ｓｅｃ］
   ）｝
   ステップ３
   ステップ２で得られた組合せの中で、ニポウディスクの回転数が整数となる
   値で、かつ、共焦点顕微鏡の仕様回転範囲内で、積算回数が一番大きい回転数を
   最適回転数とする。
2. 前記ニポウディスクの回転とＣＣＤデジタルカメラの露光時間の位相を外部装置を用いて通信により設定することを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡の同期縞除去方法。
3. 前記ニポウディスクの回転とＣＣＤデジタルカメラの露光時間の位相を設定すると共に画像転送時間のあとに待ち時間を設けたことを特徴とする請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡の同期縞除去方法。