JP6266601B2 - 画像取得装置、試料のフォーカスマップを作成する方法及びシステム - Google Patents

Description

本発明は、画像取得装置、試料のフォーカスマップを作成する方法及びシステムに関する。

組織細胞などの試料を観察するための画像取得装置において、ステージ上の試料と対物レンズとの距離を一定にすると、試料の表面の凹凸によって焦点の合わない領域が混在した画像になってしまうことがある。このため、合焦点情報を取得しながら試料の撮像を行うダイナミックフォーカス方式や、試料の撮像前に合焦点情報を取得するプレフォーカス方式といった各種のフォーカス方法を適用した画像取得装置が開発されている。

このような画像取得装置として、例えば特許文献１に記載の顕微鏡装置がある。この装置は、複数の画素ラインを有し、ローリングシャッターモードで駆動する撮像素子を備えている。そして、画素ラインの受光時間より長い間隔をあけて光源を断続的に発光させ、ステージを移動させながら撮像した画像に基づいて顕微鏡光学系の焦点位置情報を取得している。

また、例えば特許文献２に記載のスライドスキャナでは、試料に対する対物レンズの視野位置を移動させながら、対物レンズの焦点位置を連続的に往復させ、ラインスキャンカメラを用いて試料の画像データを取得している。このスライドスキャナでは、取得した画像データのコントラスト値の高さに基づいて試料の合焦点位置を所定領域ごとに算出し、試料全体のフォーカスマップを作成している。

特開２０１２−１０８１８４号公報 米国特許第７５１８６５２号明細書

上述のような画像取得装置は、上例えば２０倍〜４０倍といった高倍率で撮像を行う顕微鏡装置として用いられるため、被写体深度が小さく、顕微鏡光学系の視野は、試料に対して非常に小さくなることが考えられる。このため、試料全体の合焦点情報を取得するには顕微鏡光学系の視野を移動させて撮像を行う必要があるが、特許文献１に記載の装置では、試料に対する対物レンズの視野位置の移動がないため、試料の広範囲にわたって合焦点情報を取得するには時間を要することとなる。また、最初に読み出される画素列と最後に読み出される画素列には、試料上の異なる位置からの光が入力されるため、コントラスト値の比較に基づいて算出される合焦点情報の精度が不十分になるおそれもある。

一方、特許文献２に記載の装置では、試料に対して対物レンズを高さ方向に往復動させながら、ラインスキャンカメラで試料の画像データを取得している。しかしながら、各画像データは、試料上の異なる位置からの光によって生成されるため、特許文献１と同様に、コントラスト値の比較に基づいて算出される合焦点情報の精度が不十分になるおそれがある。また、特許文献２の方式では、スキャンごとに取得される合焦点情報の数が安定せず、フォーカスマップの作成精度が十分に確保できないおそれがある。

本発明は、上記課題の解決のためになされたものであり、フォーカスマップを迅速かつ精度良く作成できる画像取得装置、試料のフォーカスマップを作成する方法及びシステムを提供することを目的とする。

上記課題の解決のため、本発明の一側面に係る画像取得装置は、試料が載置されるステージと、ステージ上の試料と対峙するように配置された対物レンズを含む導光光学系と、導光光学系によって導光された試料の光像を撮像する撮像素子と、撮像素子からの画像データに基づいて試料の合焦点情報を算出する合焦点算出部と、合焦点情報に基づいて試料のフォーカスマップを作成するフォーカスマップ作成部と、試料に対する対物レンズの視野位置を移動させる第１の駆動部と、試料に対する対物レンズの焦点位置を変更する第２の駆動部と、撮像素子、第１の駆動部、及び第２の駆動部を制御する制御部と、を備え、撮像素子は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子であり、制御部は、試料に対する対物レンズの視野位置を移動させながら、試料に対する対物レンズの焦点位置が対物レンズの光軸方向に往復動するように第１の駆動部及び第２の駆動部を制御すると共に、撮像素子のローリング読み出しによる画像データの取得を実施し、フォーカスマップ作成部は、合焦点算出部で算出された複数の合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成する。

この画像取得装置では、試料に対する対物レンズの視野位置を移動させつつ、試料に対する対物レンズの焦点位置を対物レンズの光軸方向（試料の高さ方向）に往復動させている。これにより、試料に対する対物レンズの視野位置の移動と共に、視野位置での画像データのコントラスト情報を順次取得することが可能となる。また、この画像取得装置では、撮像素子のローリング読み出しによる画像データの取得を実施している。このため、対物レンズの焦点位置のスキャンごとに算出される合焦点情報の数も安定する。したがって、フォーカスマップを迅速かつ精度良く作成できる。

また、制御部は、第２の駆動部による試料に対する対物レンズの焦点位置の対物レンズの光軸方向についての往復動の条件を決定する範囲決定部を有していてもよい。試料の表面の凹凸や試料を載置するスライドガラス等の反りが無視できない場合も想定されるが、対物レンズの焦点位置の往復動の条件を決定することにより、多様な試料に対して合焦点情報の算出をより確実に実施できる。

また、範囲決定部は、一の合焦点情報の算出の際、一の合焦点情報よりも前に算出された合焦点情報に基づいて、往復動の折り返し位置における対物レンズの焦点位置を決定してもよい。この場合、試料の表面の凹凸や試料を載置するスライドガラス等の反りが無視できない場合であっても、対物レンズの焦点位置の往復動が試料の表面から外れてしまうことを防止できる。したがって、合焦点情報の算出をより確実に実施できる。

また、範囲決定部は、対物レンズの焦点位置の対物レンズの光軸方向についての変更幅を往復動の往路ごと及び復路ごとに可変としてもよい。この場合、試料の表面の凹凸や試料を載置するスライドガラス等の反りが無視できない場合であっても、その形状に応じて対物レンズの焦点位置の変更幅を決定することにより、対物レンズの焦点位置の往復動が試料の表面から外れてしまうことを防止できる。したがって、合焦点情報の算出をより確実に実施できる。

また、フォーカスマップ作成部は、対物レンズの焦点位置の往復動により往路で算出された合焦点情報及び復路で算出された合焦点情報のうち、少なくとも一方の合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成してもよい。往路で算出された合焦点情報及び復路で算出された合焦点情報のうち、いずれか一方の合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成する場合、第２の駆動部の制御が容易になる。また、往路で算出された合焦点情報及び復路で算出された合焦点情報の双方の合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成する場合、より多くの合焦点情報を算出できるので、フォーカスマップの精度を十分に確保できる。

また、フォーカスマップ作成部は、対物レンズの焦点位置の往復動のうち、往路で算出された合焦点情報及び復路で算出された合焦点情報の双方の合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成してもよい。この場合、より多くの合焦点情報を算出できるので、フォーカスマップの精度を十分に確保できる。

また、制御部は、試料に対する２次元の画像取得領域を設定すると共に画像取得領域中で一方向に延びる複数の撮像ラインを設定する撮像ライン設定部を有し、制御部は、撮像ライン設定部によって設定された撮像ラインから一又は複数の撮像ラインを選択し、選択した撮像ラインについて試料に対する対物レンズの視野位置が移動するように第１の駆動部を制御してもよい。この場合、画像取得領域の設定によって試料の存在しない部分について不要な合焦点情報の算出が行われることを防止できる。したがって、フォーカスマップを一層迅速に作成できる。また、撮像ラインの選択により、更なる処理の迅速化を実現できる。

また、フォーカスマップ作成部は、複数の撮像ラインにわたって算出された合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成してもよい。この場合、フォーカスマップの精度の向上が図られる。

また、制御部は、試料における所定部位の光像が撮像素子の各画素列で露光されるように、第１の駆動部による対物レンズの視野内での試料の所定部位の移動と撮像素子のローリング読み出しとを同期させてもよい。これにより、撮像素子の各画素列からの画像データには、試料の同一部位において対物レンズの焦点位置が変更されたときのコントラスト情報が含まれることとなり、当該情報に基づいて合焦点情報を迅速かつ精度良く算出できる。

また、本発明の一側面に係る画像取得方法は、試料が載置されるステージと、ステージ上の試料と対峙するように配置された対物レンズを含む導光光学系と、導光光学系によって導光された試料の光像を撮像する撮像素子と、撮像素子からの画像データに基づいて試料の合焦点情報を算出する合焦点算出部と、合焦点情報に基づいて試料のフォーカスマップを作成するフォーカスマップ作成部と、試料に対する対物レンズの視野位置を移動させる第１の駆動部と、試料に対する対物レンズの焦点位置を変更する第２の駆動部と、撮像素子、第１の駆動部、及び第２の駆動部を制御する制御部と、を備えた画像取得装置における画像取得方法であって、撮像素子として、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を用い、制御部によって、試料に対する前記対物レンズの視野位置を移動させながら、試料に対する対物レンズの焦点位置が対物レンズの光軸方向に往復動するように第１の駆動部及び第２の駆動部を制御すると共に、撮像素子のローリング読み出しによる画像データの取得を実施し、フォーカスマップ作成部により、合焦点算出部で算出された複数の合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成する。

また、本発明の一側面に係るフォーカスマップ作成方法は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を用いて試料のフォーカスマップを作成する方法であって、ステージに保持された試料に対する対物レンズの視野位置を移動させながら、試料に対する対物レンズの焦点位置が対物レンズの光軸方向に移動するようにステージ及び対物レンズの少なくとも一方を移動させる間に、撮像素子のローリング読み出しによる画像データの取得を実施し、画像データに基づいて試料の合焦点情報を取得し、試料における複数の合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成する。

これらの画像取得方法及び試料のフォーカスマップ作成方法では、試料に対する対物レンズの視野位置を移動させつつ、試料に対する対物レンズの焦点位置を対物レンズの高さ方向（試料の高さ方向）に移動させている。これにより、試料に対する対物レンズの視野位置の移動と共に、視野位置での画像データのコントラスト情報を順次取得することが可能となる。また、これらの画像取得方法及び試料のフォーカスマップ作成方法では、撮像素子のローリング読み出しによる画像データの取得を実施している。このため、対物レンズの焦点位置のスキャンごとに算出される合焦点情報の数も安定する。したがって、フォーカスマップを迅速かつ精度良く作成できる。

また、試料に対する対物レンズの焦点位置の対物レンズの光軸方向（試料の高さ方向）における移動は、往復動であってもよい。この場合、試料の異なる所定部位における合焦点情報を迅速に取得することが可能となる。

本発明の一側面に係る試料のフォーカスマップを作成するシステムは、試料を保持するステージと、ステージ上の試料と対峙するように配置された対物レンズを含む導光光学系と、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子によって構成され、導光光学系によって導光された試料の光像を撮像する撮像素子と、撮像素子からの画像データに基づいて試料の合焦点情報を算出する合焦点算出部と、試料における複数の合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成するフォーカスマップ作成部と、を備え、撮像素子は、試料に対する対物レンズの視野位置を移動させながら、試料に対する対物レンズの焦点位置が対物レンズの光軸方向に移動するようにステージ及び対物レンズの少なくとも一方を移動させる間に、撮像素子のローリング読み出しによる画像データの取得を実施する。

このシステムでは、試料に対する対物レンズの視野位置を移動させつつ、試料に対する対物レンズの焦点位置を対物レンズの光軸方向（試料の高さ方向）に移動させている。これにより、試料に対する対物レンズの視野位置の移動と共に、視野位置での画像データのコントラスト情報を順次取得することが可能となる。また、このシステムでは、撮像素子のローリング読み出しによる画像データの取得を実施している。このため、対物レンズの焦点位置のスキャンごとに算出される合焦点情報の数も安定する。したがって、フォーカスマップを迅速かつ精度良く作成できる。

また、試料に対する対物レンズの焦点位置の対物レンズの光軸方向（試料の高さ方向）における移動は、往復動であってもよい。これにより、試料の異なる所定部位における合焦点情報を迅速に取得することが可能となる。

本発明によれば、フォーカスマップを迅速かつ精度良く作成できる。

本発明に係る画像取得装置の一実施形態を示す図である。 撮像素子の一例を示す図であり、（ａ）は撮像素子の受光面、（ｂ）は撮像素子におけるローリング読み出しを示す。 試料に対する画像取得領域のスキャンの一例を示す図である。 撮像ラインの設定の一例を示す図である。 撮像ラインにおける合焦点情報算出位置の一例を示す図である。 対物レンズの焦点位置の往復動の条件の一例を示す図である。 対物レンズの焦点位置の往復動の条件の別の例を示す図である。 対物レンズの焦点位置の往復動の条件の更に別の例を示す図である。 合焦点算出部で処理されるコントラスト情報の一例を示す図である。 図１に示した画像取得装置の動作を示すフローチャートである。

以下、図面を参照しながら、本発明に係る画像取得装置、試料のフォーカスマップを作成する方法及びシステムの好適な実施形態について詳細に説明する。

図１は、本発明に係る画像取得装置の一実施形態を示す図である。同図に示すように、画像取得装置１は、試料Ｓが載置されるステージ２と、試料に向けて光を照射する光源３と、ステージ２上の試料Ｓと対峙するように配置された対物レンズ２５を含む導光光学系５と、導光光学系５によって導光された試料Ｓの光像を撮像する撮像素子６とを備えている。

また、画像取得装置１は、試料Ｓに対する対物レンズ２５の視野位置を移動させるステージ駆動部（第１の駆動部）１１と、試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置を変更させる対物レンズ駆動部（第２の駆動部）１２と、撮像素子６、ステージ駆動部１１、及び対物レンズ駆動部１２を制御する制御部１３と、撮像素子６で撮像された試料Ｓの画像データを処理する画像処理部１４とを備えている。

画像取得装置１で観察する試料Ｓは、例えば組織細胞などの生体サンプルであり、スライドガラスに密封された状態でステージ２に載置される。光源３は、ステージ２の底面側に配置されている。光源３としては、例えばレーザダイオード（ＬＤ）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、スーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）、ハロゲンランプといったランプ方式光源などが用いられる。

導光光学系５は、光源３とステージ２との間に配置される照明光学系２１と、ステージ２と撮像素子６との間に配置される顕微鏡光学系２２とによって構成されている。照明光学系２１は、例えば集光レンズ２３と投影レンズ２４とによって構成されるケーラー照明光学系を有し、光源３からの光を導光して試料Ｓに均一な光を照射するようになっている。一方、顕微鏡光学系２２は、対物レンズ２５と、対物レンズ２５の後段側（撮像素子６側）に配置された結像レンズ２６とを有し、試料Ｓの光像を撮像素子６に導光する。なお、試料Ｓの光像とは、明視野照明の場合は透過光、暗視野照明の場合は散乱光、発光計測の場合は発光（蛍光）による像である。また、試料Ｓからの反射光による像であってもよい。これらの場合、導光光学系５として、試料Ｓの透過光画像、散乱光画像、及び発光（蛍光）画像の画像取得に対応した光学系を採用することができる。

撮像素子６は、複数の画素列を有すると共にローリング読み出しが可能な二次元撮像素子である。このような撮像素子６としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサが挙げられる。撮像素子６の受光面６ａには、図２（ａ）に示すように、読み出し方向に垂直な方向に複数の画素が配列されてなる画素列３１が読み出し方向に複数配列されている。

撮像素子６では、図２（ｂ）に示すように、駆動クロックの駆動周期に基づいて、リセット信号、読み出し開始信号、及び読み出し終了信号が出力されることで、画素列３１毎に露光及び読み出しが制御される。一の画素列３１の露光期間は、リセット信号に伴う電荷の排出から読み出し開始信号に伴う電荷の読み出しまでの期間である。また、一の画素列３１の読み出し期間は、読み出し開始信号に伴う電荷の読み出し開始から読み出し終了信号に伴う電荷の読み出し終了までの期間である。なお、次の画素列に対する読み出し開始信号を読み出し終了信号として用いることもできる。

ローリング読み出しでは、画素列３１毎に出力する読み出し開始信号が所定の時間差で順次出力される。このため、全ての画素列の読み出しを同時に行うグローバル読み出しとは異なり、画素列３１毎の読み出しが所定の時間差をもって順次行われる。ローリング読み出しにおける読み出し速度は、各画素列３１を読み出すための読み出し開始信号の時間間隔によって制御される。読み出し開始信号の時間間隔を短くすると読み出し速度は早くなり、読み出し開始信号の時間間隔を長くすると読み出し速度は遅くなる。隣接する画素列３１，３１間での読み出し間隔の調整は、例えば駆動クロックの周波数の調整、読み出し期間中の遅延期間の設定、読み出し開始信号を規定するクロック数の変更といった手法によって実施できる。

ステージ駆動部１１は、例えばステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータといったモータやアクチュエータによって構成されている。ステージ駆動部１１は、制御部１３による制御に基づいて、ステージ２を対物レンズ２５の光軸の直交面に対して所定の角度（例えば９０度）を有する面についてＸＹ方向に移動させる。これにより、ステージ２に固定された試料Ｓが対物レンズの光軸に対して移動し、試料Ｓに対する対物レンズ２５の視野位置が移動することとなる。

対物レンズ駆動部１２は、ステージ駆動部１１と同様に、例えばステッピングモータ（パルスモータ）或いはピエゾアクチュエータといったモータやアクチュエータによって構成されている。対物レンズ駆動部１２は、制御部１３による制御に基づいて、対物レンズ２５を対物レンズ２５の光軸に沿ったＺ方向に移動させる。これにより、試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置が移動する。

なお、ステージ駆動部１１が、対物レンズ２５の光軸に沿ったＺ方向に沿ってステージ２を移動させることができる場合、制御部１３は、ステージ駆動部１１によって対物レンズ２５に対するステージ２のＺ方向の位置を変更させ、ステージ２と対物レンズ２５の間隔を変更させてもよい。この場合、ステージ駆動部１１は、試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置を移動させる駆動部となるため、対物レンズ駆動部１２と同等の機能を果たす。

画像取得装置１では、例えば２０倍や４０倍といった高倍率で試料Ｓの撮像が行われる。このため、対物レンズ２５の視野Ｖは、試料Ｓに対して小さく、図３に示すように、一回の撮像で画像を取得できる領域も試料Ｓに対して小さくなる。したがって、試料Ｓの全体を撮像するためには、対物レンズ２５の視野Ｖを試料Ｓに対してスキャンする必要がある。

そこで、この画像取得装置１では、タイリングスキャン方式と呼ばれる画像取得方式が採用されている。具体的には、画像取得装置１では、後述の制御部１３により、試料Ｓを保持する試料容器（例えばスライドガラス）に対して試料Ｓを含むように画像取得領域３２が設定され、画像取得領域３２及び対物レンズ２５の試料Ｓ上の視野Ｖに基づいて複数の分割領域（タイル）３３が設定される。そして、分割領域３３に対応する試料Ｓの一部画像（タイル画像）をそれぞれ撮像し、これらの一部画像データを画像処理部１４で結合することにより、試料Ｓの全体の画像データが作成される。

画像取得装置１では、分割領域３３に対応する試料Ｓの一部画像を撮像するにあたり、各分割領域３３ごとの試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置を決定するため、予め試料Ｓについてのフォーカスマップの作成が行われる。フォーカスマップの作成のための機能的な構成要素として、画像取得装置１には、制御部１３において。撮像ライン設定部１５と、範囲決定部１６とが設けられている。また、画像取得装置１は、撮像素子６からの画像データに基づいて試料Ｓの合焦点情報を算出する合焦点算出部１７と、合焦点情報に基づいて試料Ｓのフォーカスマップを作成するフォーカスマップ作成部１８とを備えている。

撮像ライン設定部１５は、試料Ｓに対する２次元の画像取得領域３２を設定すると共に、画像取得領域３２中で一方向に延びる複数の撮像ラインを設定する部分である。図４に示す例では、画像取得領域３２における分割領域３３の各列について、撮像ラインＬ（Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３…Ｌｎ）が設定されている。

撮像ライン設定部１５で設定された各撮像ラインに対し、制御部１３は、試料Ｓに対する対物レンズ２５の視野位置Ｖが移動しながら、試料Ｓに対する対物レンズの焦点位置が試料の高さ方向に往復動するようにステージ駆動部１１及び対物レンズ駆動部１２を制御する。また、制御部１３は、対物レンズ２５の焦点位置の往復動に応じて撮像素子６によるローリング読み出しを実施する。このとき、制御部１３は、試料Ｓにおける同一部位の光像が撮像素子６の各画素列３１で露光されるように、ステージ駆動部１１による対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの移動と撮像素子６のローリング読み出しとを同期させることが好ましい。そして、一のフレームの読み出しが終了したタイミングで次のフレームの読み出しを開始させることで、図５に示すように、合焦点情報の算出に用いられる試料Ｓの所定部位Ｓａが一定間隔で出現し、撮像ラインＬに含まれる分割領域３３ごとに少なくとも一つの合焦点情報算出位置Ｐが形成される。

範囲決定部１６は、対物レンズ駆動部１２による試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置の対物レンズ２５の光軸方向（試料Ｓの高さ方向）についての往復動の条件を決定する部分である。制御部１３は、範囲決定部１６で決定された条件に基づいて、対物レンズ２５とステージ２との間のＺ方向における距離（間隔）が拡大及び縮小を繰り返すように、対物レンズ駆動部１２による対物レンズ２５の駆動を制御する（具体例は後述する）。

また、合焦点算出部１７は、撮像素子６からの画像データに基づいて試料Ｓの合焦点情報を算出する部分である。具体的には、画像処理部１４は、撮像素子６の各画素列３１からの画像データに基づいて試料Ｓの合焦点情報を算出する。合焦点情報としては、例えば対物レンズ２５の焦点位置に試料Ｓが一致する対物レンズ２５もしくはステージ２のＺ方向の位置情報が挙げられる。また、例えば対物レンズ２５のＺ方向における位置や試料Ｓ（ステージ２）に対する対物レンズ２５の高さ（間隔）、ステージ２のＺ方向における位置、対物レンズ２５に対する試料Ｓ（ステージ２）の高さ（間隔）などであってもよい。

上述したように、制御部１３は、対物レンズ駆動部１２によって対物レンズ２５の焦点位置を変更させながら、ステージ駆動部１１による対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と撮像素子６のローリング読み出しを実施している。また、より好ましくは、制御部１３は、試料Ｓにおける所定部位Ｓａの光像が撮像素子６の各画素列３１で露光されるように、ステージ駆動部１１による対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と撮像素子６のローリング読み出しとを同期させている。例えば、ステージ駆動部１１によるステージ２の移動と撮像素子６のローリング読出しとを同期させている。したがって、各画素列３１は、試料Ｓの所定部位Ｓａの光像を露光するため、上記焦点位置の取得を実行した際の撮像素子６からの画像データには、試料Ｓの所定部位Ｓａにおいて対物レンズ２５の焦点位置が変更したときのコントラスト情報が含まれる。

図６は、合焦点算出部で処理されるコントラスト情報の一例を示す図である。同図に示す例では、撮像領域の第１列目の画素列３１から第ｎ列目の画素列３１までの画像データのコントラスト値が示されており、第ｉ列目の画素列３１における画像データのコントラスト値がピーク値となっている。この場合、合焦点算出部１７は、第ｉ列目の画素列３１で試料Ｓの所定部位Ｓａの露光を行ったときの対物レンズ２５の焦点位置が合焦点位置であるとして合焦点情報を生成する。なお、コントラスト値は、各画素列３１に含まれる画素のうちの特定の画素におけるコントラスト値を用いてもよく、各画素列３１に含まれる画素の全体又は一部のコントラスト値の平均値を用いてもよい。

ここで、図７は、上述した範囲決定部１６で決定される対物レンズ２５の焦点位置の往復動の条件の一例を示す図である。図７（ａ）に示す例では、対物レンズ２５の焦点位置の往路方向（ここでは試料Ｓに対する高さが低くなる方向）についての変更幅Ｗ１と、対物レンズ２５の焦点位置の復路方向（ここでは試料Ｓに対する高さが高くなる方向）についての変更幅Ｗ２とが同一となっている。また、対物レンズ２５の焦点位置を往路方向に変更するときの開始位置ａ１と、対物レンズ２５の焦点位置を復路方向に変更するときの終了位置ｂ２とが一致し、対物レンズ２５の焦点位置を復路方向に変更するときの開始位置ｂ１と、対物レンズ２５の焦点位置を往路方向に変更するときの終了位置ａ２とが一致している。

このような往復動の条件を用いる場合、図７（ｂ）に示すように、試料Ｓにおける合焦点情報算出位置Ｐごとに対物レンズ２５の焦点位置が往路方向及び復路方向に順に同一幅で変更される。そして、対物レンズ２５の焦点位置の変更幅の中で試料Ｓの表面と一致する位置が合焦点位置Ｆとして算出される（算出方法は後述する）。

また、図８は、範囲決定部１６で決定される対物レンズ２５の焦点位置の往復動の条件の別の例を示す図である。図８に示す例では、対物レンズ２５の焦点位置の往復動の折り返し位置を、一の合焦点情報算出位置Ｐよりも前の合焦点情報算出位置Ｐで既に算出された合焦点情報に基づいて決定する。より具体的には、図８に示す例では、一の合焦点情報算出位置Ｐにおいて対物レンズ２５の焦点位置を往路方向又は復路方向に変更するにあたり、その一つ前の合焦点情報算出位置Ｐにおいて算出された合焦点位置Ｆを参照し、合焦点位置Ｆが変更幅Ｗ１，Ｗ２の略中央位置となるように対物レンズ２５の焦点位置を変更するときの開始位置ａ１若しくはｂ１を決定する。

かかる往復動の条件を用いる場合、試料Ｓの表面の凹凸や試料を載置するスライドガラス等の反りが無視できない場合であっても、対物レンズ２５の焦点位置の往復動が試料Ｓの表面から外れてしまうことを防止できる。したがって、合焦点情報の算出をより確実に実施できる。

さらに、図９は、範囲決定部１６で決定される対物レンズ２５の焦点位置の往復動の条件の更に別の例を示す図である。図９に示す例では、対物レンズ２５の焦点位置の対物レンズ２５の光軸方向（試料Ｓの高さ方向）についての変更幅が往復動の往路ごと及び復路ごとに可変となっている。より具体的には、図９に示す例では、図８に示したように、対物レンズ２５の焦点位置の往復動の折り返し位置を、一の合焦点情報算出位置Ｐよりも前の合焦点情報算出位置Ｐで既に算出された合焦点情報に基づいて決定していることに加え、試料Ｓに対して最初に対物レンズ２５の焦点位置を変更する際の変更幅Ｗ３が、それ以降の対物レンズ２５の焦点位置の往路方向の変更幅Ｗ１及び復路方向の変更幅Ｗ２よりも大きくなっている。

かかる往復動の条件を用いる場合、最初の合焦点位置Ｆの発見が容易となり、以降の合焦点情報の算出をより確実に実施できる。また、最初の合焦点情報算出位置Ｐ以外の合焦点情報算出位置Ｐについては対物レンズ２５の焦点位置の変更幅Ｗ１，Ｗ２を変更幅Ｗ３よりも小さくすることで、合焦点情報算出位置Ｐごとの対物レンズ２５の焦点位置の変更時間が一定である場合に対物レンズ２５の駆動の速度を遅くすることが可能となる。したがって、合焦点情報の算出精度を十分に担保できる。なお、変更幅を変える合焦点情報算出位置Ｐは、最初の合焦点情報算出位置Ｐに限られず、試料の凹凸やスライドガラスの反りの影響が大きい位置が予想できる場合等には、任意の合焦点情報算出位置Ｐで対物レンズ２５の焦点位置の変更幅を可変とすることができる。

フォーカスマップ作成部１８は、合焦点算出部１７で算出された複数の合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成する部分である。より具体的には、フォーカスマップ作成部１８は、複数の撮像ラインＬにわたって算出された合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成する。フォーカスマップの作成にあたっては、各合焦点情報算出位置Ｐにおける合焦点位置Ｆ自体を用いてもよく、各合焦点情報算出位置Ｐにおける合焦点位置Ｆを元に最小二乗法を適用してフォーカス平面を演算し、フォーカス平面同士を結合してもよい。フォーカスマップ作成部１８で作成されたフォーカスマップは、制御部１３に出力され、試料Ｓの一部画像を撮像する際、試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置の制御に参照される。

なお、フォーカスマップ作成部１８は、対物レンズ２５の焦点位置の往復動のうち、往路で算出された合焦点情報及び復路で算出された合焦点情報のいずれか一方の合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成してもよく、往路で算出された合焦点情報及び復路で算出された合焦点情報の双方の合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成してもよい。前者の場合、対物レンズ２５の往復動のうち、往路及び復路のいずれか一方の駆動精度のみが要求されるため、対物レンズ２５の制御が容易となる。また、後者の場合、より多くの合焦点情報を算出できるので、フォーカスマップの精度を十分に確保できる。

続いて、上述した画像取得装置１の動作について説明する。図１０は、画像取得装置１の動作を示すフローチャートである。

図１０に示すように、画像取得装置１では、まず、ステージ２に載置された試料Ｓに対して画像取得領域３２の設定が行われる（ステップＳ０１）。また、設定された画像取得領域３２に対して複数の撮像ラインＬが設定される（ステップＳ０２）。続いて、試料Ｓに対する対物レンズ２５の視野位置Ｖを移動させながら、設定された往復動の条件に基づいて試料Ｓに対する対物レンズの焦点位置が試料の高さ方向に往復動し、対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と撮像素子６のローリング読み出しとを実施させ、撮像ラインＬごとの合焦点情報を算出する（ステップＳ０３）。なお、このステップＳ０３において、試料Ｓにおける所定部位Ｓａの光の光像が撮像素子６の各画素列３１で露光されるように、対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と撮像素子６のローリング読み出しとを同期させることが好ましい。

撮像ラインＬごとの合焦点情報を算出後、算出した合焦点情報に基づいてフォーカスマップが作成される（ステップＳ０４）。そして、作成されたフォーカスマップに基づいて、対物レンズ２５の焦点位置を試料Ｓに合わせながら画像取得領域３２の各分割領域３３の画像（一部画像）の取得が行われ（ステップＳ０５）、一部画像の合成によって試料Ｓの全体画像が作成される（ステップＳ０６）

以上説明したように、この画像取得装置１では、試料Ｓに対する対物レンズ２５の視野位置Ｖを移動させつつ、試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置を試料の高さ方向に往復動させている。これにより、試料Ｓに対する対物レンズ２５の視野位置Ｖの移動と共に、視野位置Ｖでの画像データのコントラスト情報を順次取得することが可能となる。また、この画像取得装置１では、対物レンズ２５の焦点位置の往復動に応じて撮像素子６によるローリング読み出しを実施している。このため、対物レンズ２５の焦点位置のスキャンごとに算出される合焦点情報の数も安定する。したがって、フォーカスマップを迅速かつ精度良く作成できる。さらに、この画像取得装置１では、ローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を撮像素子６として用いているので、画像データを取得する際のノイズも低減でき、フォーカスマップの精度を担保できる。

また、画像取得装置１では、対物レンズ駆動部１２による試料Ｓに対する対物レンズ２５の焦点位置の対物レンズ２５の光軸方向（試料Ｓの高さ方向）についての往復動の条件が範囲決定部１６によって決定される。試料Ｓの表面の凹凸や試料Ｓを載置するスライドガラス等の反りが無視できない場合も想定されるが、対物レンズ２５の焦点位置の往復動の条件を決定することにより、多様な試料Ｓに対して合焦点情報の算出をより確実に実施できる。

また、画像取得装置１では、試料Ｓに対する２次元の画像取得領域３２が設定されると共に、画像取得領域３２中で一方向に延びる複数の撮像ラインＬが設定され、当該撮像ラインＬに沿って試料Ｓに対する対物レンズ２５の視野位置Ｖが移動するようにステージ駆動部１１が制御される。このような制御により、試料Ｓの存在しない部分について不要な合焦点情報の算出が行われることを防止できる。したがって、フォーカスマップを一層迅速に作成できる。

また、画像取得装置１では、試料Ｓにおける所定部位Ｓａの光像が撮像素子６の各画素列３１で露光されるように、ステージ駆動部１１による対物レンズ２５の視野Ｖ内での試料Ｓの所定部位Ｓａの移動と撮像素子６のローリング読み出しとを同期させることが好ましい。これにより、撮像素子６の各画素列３１からの画像データには、試料Ｓの同一部位において対物レンズ２５の焦点位置が変更されたときのコントラスト情報が含まれることとなり、当該情報に基づいて合焦点情報を迅速かつ精度良く算出できる。

本発明は、上記実施形態に限られるものではない。例えば上述した実施形態では、一の合焦点情報算出位置Ｐについて、対物レンズ２５の焦点位置が往路方向及び復路方向のいずれか一方向に１回のみ走査されているが、一の合焦点情報算出位置Ｐについて複数回の走査を行うようにしてもよい。試料Ｓが組織細胞である場合、その厚みは例えば１０μｍ程度である。したがって、画素列３１ごとの対物レンズ２５の焦点位置の移動距離を０．１μｍ程度に設定すると、１００画素列程度で試料Ｓの全体の厚みに対してコントラスト情報を取得できる。これに対し、ＣＭＯＳイメージセンサといった二次元撮像素子は、例えば数千程度の画素列を有しているため、１フレームの間に複数回のコントラスト情報の取得が可能である。したがって、対物レンズ２５を高さ方向に複数回走査させることによって、一の合焦点情報算出位置Ｐについて複数の合焦点情報を算出することができ、フォーカスマップを一層精度良く作成することが可能となる。

また、上記実施形態では、全ての撮像ラインＬについて合焦点情報を算出した後、試料Ｓの全体について作成したフォーカスマップに基づいて試料Ｓの一部画像の撮像を行っているが、一の撮像ラインＬについて合焦点情報の取得及びフォーカスマップを作成して試料Ｓの一部画像を取得し、これを全ての撮像ラインＬについて繰り返し実行するようにしてもよい。また、全ての撮像ラインＬについて合焦点情報を取得することに限らず、設定された撮像ラインＬのうち、一又は複数の撮像ラインＬを制御部１３で選択し、選択した撮像ラインＬについて合焦点情報の取得を行うようにしてもよい。撮像ラインＬの選択は、特に制限はなく、隣り合う撮像ラインＬを含む複数の撮像ラインＬを選択してもよく、一列又は複数列おきに撮像ラインＬを選択してもよい。この場合、フォーカスマップの作成の迅速化が可能となる。

なお、上記実施形態では、画像取得方式としてタイリングスキャン方式を例示したが、本発明は、ラインスキャン方式にも適用が可能である。この場合、例えば対物レンズ２５と結像レンズ２６との間に対物レンズ２５からの光を分岐するビームスプリッタを配置し、ビームスプリッタで分岐した光をラインセンサやＴＤＩ（Time delay Integration）センサ等の電荷転送可能なＣＣＤイメージセンサで撮像するようにすればよい。

１…画像取得装置、２…ステージ、３…光源、５…導光光学系、６…撮像素子、１１…ステージ駆動部（第１の駆動部）、１２…対物レンズ駆動部（第２の駆動部）、１３…制御部、１５…撮像ライン設定部、１６…範囲決定部、１７…合焦点算出部、１８…フォーカスマップ作成部、２５…対物レンズ、３１…画素列、３２…画像取得領域、Ｌ…撮像ライン、Ｓ…試料、Ｓａ…試料の所定部位、Ｖ…対物レンズの視野。

Claims (10)

1. 試料が載置されるステージと、
   前記ステージ上の前記試料と対峙するように配置された対物レンズを含む導光光学系と、
   前記導光光学系によって導光された前記試料の光像を撮像する撮像素子と、
   前記撮像素子からの画像データに基づいて前記試料の合焦点情報を算出する合焦点算出部と、
   前記合焦点情報に基づいて前記試料のフォーカスマップを作成するフォーカスマップ作成部と、
   前記試料に対する前記対物レンズの視野位置を移動させる第１の駆動部と、
   前記試料に対する前記対物レンズの焦点位置を変更する第２の駆動部と、
   前記撮像素子、前記第１の駆動部、及び前記第２の駆動部を制御する制御部と、を備え、
   前記撮像素子は、複数の画素列を有すると共に、画素列毎に出力する読み出しが所定の時間差をもって順次行われるローリング読み出しが可能な二次元撮像素子であり、
   前記制御部は、前記試料に対する前記対物レンズの視野位置を移動させながら、前記試料に対する前記対物レンズの焦点位置が前記対物レンズの光軸方向に往復動するように前記第１の駆動部及び前記第２の駆動部を制御すると共に、前記撮像素子のローリング読み出しによる前記画像データの取得を実施し、
   前記フォーカスマップ作成部は、前記合焦点算出部で算出された複数の合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成する、画像取得装置。
2. 前記制御部は、前記第２の駆動部による前記試料に対する前記対物レンズの焦点位置の前記対物レンズの光軸方向についての往復動の条件を決定する範囲決定部を有している、請求項１記載の画像取得装置。
3. 前記範囲決定部は、一の合焦点情報の算出の際、前記一の合焦点情報よりも前に算出された合焦点情報に基づいて、前記往復動の折り返し位置における前記対物レンズの焦点位置を決定する、請求項２記載の画像取得装置。
4. 前記範囲決定部は、前記対物レンズの焦点位置の前記対物レンズの光軸方向についての変更幅を前記往復動の往路ごと及び復路ごとに可変とする、請求項２又は３記載の画像取得装置。
5. 前記フォーカスマップ作成部は、前記対物レンズの焦点位置の往復動により往路で算出された合焦点情報及び復路で算出された合焦点情報のうち、少なくとも一方の合焦点情報に基づいて前記フォーカスマップを作成する、請求項１〜４のいずれか一項記載の画像取得装置。
6. 前記制御部は、前記試料に対する２次元の画像取得領域を設定すると共に前記画像取得領域中で一方向に延びる複数の撮像ラインを設定する撮像ライン設定部を有し、
   前記制御部は、前記撮像ライン設定部によって設定された前記撮像ラインから一又は複数の前記撮像ラインを選択し、選択した前記撮像ラインについて前記試料に対する前記対物レンズの視野位置が移動するように前記第１の駆動部を制御する、請求項１〜５のいずれか一項記載の画像取得装置。
7. 前記フォーカスマップ作成部は、前記複数の撮像ラインにわたって算出された前記合焦点情報に基づいて前記フォーカスマップを作成する、請求項６記載の画像取得装置。
8. 前記制御部は、前記試料における所定部位の光像が前記撮像素子の各画素列で露光されるように、前記第１の駆動部による前記対物レンズの視野内での前記試料の所定部位の移動と前記撮像素子のローリング読み出しとを同期させる、請求項１〜７のいずれか一項記載の画像取得装置。
9. 複数の画素列を有すると共に、画素列毎に出力する読み出しが所定の時間差をもって順次行われるローリング読み出しが可能な二次元撮像素子を用いて試料のフォーカスマップを作成する方法であって、
   ステージに保持された前記試料に対する対物レンズの視野位置を移動させながら、前記試料に対する前記対物レンズの焦点位置が前記対物レンズの光軸方向に移動するように前記ステージ及び前記対物レンズの少なくとも一方を移動させる間に、前記撮像素子のローリング読み出しによる画像データの取得を実施し、
   前記画像データに基づいて前記試料の合焦点情報を取得し、
   前記試料における複数の合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成する、方法。
10. 試料のフォーカスマップを作成するシステムであって、
    前記試料を保持するステージと、
    前記ステージ上の前記試料と対峙するように配置された対物レンズを含む導光光学系と、
    複数の画素列を有すると共に、画素列毎に出力する読み出しが所定の時間差をもって順次行われるローリング読み出しが可能な二次元撮像素子によって構成され、前記導光光学系によって導光された前記試料の光像を撮像する撮像素子と、
    前記撮像素子からの画像データに基づいて前記試料の合焦点情報を算出する合焦点算出部と、
    前記試料における複数の合焦点情報に基づいてフォーカスマップを作成するフォーカスマップ作成部と、を備え、
    前記撮像素子は、前記試料に対する対物レンズの視野位置を移動させながら、前記試料に対する前記対物レンズの焦点位置が前記対物レンズの光軸方向に移動するように前記ステージ及び前記対物レンズの少なくとも一方を移動させる間に、前記撮像素子のローリング読み出しによる前記画像データの取得を実施する、システム。

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