JP2012073032A - 蛍光一粒子検出方法および検出システム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】蛍光標識されたあるいは蛍光性を持つ蛍光物質と試料とを混合した試料溶液を調製する調製工程と、試料溶液の少なくとも一部を測定ステージに載置する載置工程と、共焦点光学系を用いて試料溶液中に設定された共焦点領域に励起光を照射し、測定ステージおよび共焦点光学系を所定の形式で相対運動させることで測定ステージに載置された試料溶液および共焦点領域の相対位置を移動させながら、共焦点領域を通過する蛍光物質が発する蛍光信号の蛍光強度の変動を所定時間だけ計測する計測工程と、を備えた蛍光一粒子検出方法とする。
【選択図】図1
Description
<蛍光一粒子検出方法>
まず、本発明の蛍光一粒子検出方法(一粒子検出法)の原理について説明する。
上記の本実施形態の蛍光一粒子検出方法を実施するための検出システムは、図2に示すように、共焦点光学系装置10と、解析装置40と、試料保持装置50と、コントローラ60と、を備えて構成されることが好ましい。
共焦点光学系装置10は、励起光照射部20と蛍光検出部30とを備えて構成される。励起光照射部20は、レーザー21と、対物レンズ22と、ダイクロイックミラー23と、NDフィルタ24と、平行レンズ25と、を必要に応じて組み合わせて構成される。また、蛍光検出部30は、光電子増倍管31と、ピンホール32と、EMフィルタ33と、反射ミラー34と、結像レンズ35と、を必要に応じて組み合わせて構成される。
解析装置40は、光電子増倍管31から入力された蛍光信号の蛍光強度の時間変化を解析し、例えば、予め設定された閾値以上の蛍光強度を持つ蛍光信号を計数する。この解析装置40は、所定のプログラムが記憶されたソフトウェアと、ソフトウェアのプログラムを実行するコンピュータなどの演算装置と、演算装置が解析した解析結果を表示するモニタなどの表示手段とによって構成することができる。
試料保持装置50は、図3に示すように、測定ステージ51と、X軸方向駆動機構52と、Y軸方向駆動機構53と、を備えている。
コントローラ60は、X軸モータ52aおよびY軸モータ53aを制御する手段であり、プログラムにしたがってX軸モータ52aおよびY軸モータ53aを制御し、測定ステージ51のスライドガラス55上の試料溶液をスライドガラス55と一体に所定の形式(例えば、円運動、螺旋運動、直線運動など)で移動させるようになっている。
測定ステージを動かした場合の効果を、次の実験により説明する。
次に、図7(a)および(b)を用いて、測定ステージを円運動させた場合の実験結果について説明する。
次に、図8(a)および(b)を用いて、測定ステージを螺旋運動させた場合の実験結果について説明する。
さらに、図9(a)〜(c)を用いて、円運動の場合と螺旋運動の場合とで比較した結果について説明する。図9(a)および(b)は、図7および図8に示す前述の実験の結果(105個/mLの濃度の試料溶液を対象にして、各移動速度で6回ずつ行った実験の結果)を、1回分ずつ個別にプロットしたものであり、図9(a)は円運動の場合の移動速度毎の蛍光強度積算値を示し、図9(b)は螺旋運動の場合の移動速度毎の蛍光強度積算値を示している。
最後に、インフルエンザウイルスを対象とした実験について説明する。
本実施形態の蛍光一粒子検出方法および検出システムは上述のように構成されているので、測定ステージを動かして共焦点領域を蛍光物質が通過する確率を積極的に増大させる能動的測定により感度が向上し、低濃度の試料溶液であっても蛍光物質を検出することができて、ウイルスなどの病原体を高感度に検出することが可能となる。
例えば、空港検疫所などで海外からの感染を水際で防止するために、旅行者の咽頭拭い液や唾液などからその場で感染の有無を迅速高感度且つ簡便に判定することができる。また、例えば国内の家禽への高病原性トリインフルエンザウイルスの侵入を迅速に検知確定するためのツールとして普及すれば、多大な経済的損失を未然に防ぐことも可能となる。
また、感染症治療薬の開発のためのスクリーニング系に利用可能である。本発明の蛍光一粒子検出方法および検出システムは、高感度・迅速性・定量性・コストについて優位性を持っている。従来技術としてはELISA法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)などが利用されてきたが、高感度・迅速性・定量性・コストについてすべてを満たしているわけではない。創薬研究では開発の迅速性と感度の高い測定法の確保が求められることから、感度・定量性を高めた高性能型機器を提供することが可能となる。
また、本発明の蛍光一粒子検出方法および検出システムは高感度であることから検体は微量で済み、採取が容易になり、臨床検査において患者の負担を低減させることができる。また、迅速測定であることから短時間での多検体処理が可能である。また、病原体粒子を直接的に検出できることから、培養が困難で直接検出と定量が必要とされている病原体(例えば、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ノロウイルスなど)に対する適用が可能である。
20 励起光照射部
30 蛍光検出部
40 解析装置
50 試料保持装置
51 測定ステージ
52 X軸方向駆動機構
53 Y軸方向駆動機構
60 コントローラ
70 シリンジポンプ
Claims (8)
- 蛍光標識されたあるいは蛍光性を持つ蛍光物質と試料とを混合した試料溶液を調製する調製工程と、
前記試料溶液の少なくとも一部を測定ステージに載置する載置工程と、
共焦点光学系を用いて前記試料溶液中に設定された共焦点領域に励起光を照射し、前記測定ステージおよび共焦点光学系を所定の形式で相対運動させることで前記測定ステージに載置された前記試料溶液および前記共焦点領域の相対位置を移動させながら、前記共焦点領域を通過する前記蛍光物質が発する蛍光信号の蛍光強度の変動を所定時間だけ計測する計測工程と、を備えた
ことを特徴とする、蛍光一粒子検出方法。 - 前記計測工程において、前記測定ステージまたは前記共焦点光学系を円運動または螺旋運動させる
ことを特徴とする、請求項1に記載の蛍光一粒子検出方法。 - 前記計測工程において、前記測定ステージまたは前記共焦点光学系を直線運動させる
ことを特徴とする、請求項1に記載の蛍光一粒子検出方法。 - 前記試料は所定の病原体が含まれている可能性があるものであり、前記蛍光物質は前記所定の病原体に結合する性質を持つものである
ことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の蛍光一粒子検出方法。 - 蛍光標識されたあるいは蛍光性を持つ蛍光物質と試料とを混合して調製された試料溶液の少なくとも一部が載置される可動式の測定ステージと、
共焦点光学系を用いて前記測定ステージに載置された前記試料溶液中に設定された共焦点領域に励起光を照射し、前記共焦点領域を通過する前記蛍光物質が発する蛍光信号を検出する共焦点光学系装置と、
前記測定ステージまたは前記共焦点光学系装置を所定の形式で運動させることで、前記測定ステージに載置された前記試料溶液および前記共焦点領域の相対位置を移動させる駆動機構と、
前記共焦点光学系装置が検出した前記蛍光信号の蛍光強度の変動を解析する解析装置と、を備えた
ことを特徴とする、蛍光一粒子検出システム。 - 前記駆動機構は、前記測定ステージまたは前記共焦点光学系装置を円運動または螺旋運動させる
ことを特徴とする、請求項5に記載の蛍光一粒子検出システム。 - 前記駆動機構は、前記測定ステージまたは前記共焦点光学系装置を直線運動させる
ことを特徴とする、請求項5に記載の蛍光一粒子検出システム。 - 前記試料は所定の病原体が含まれている可能性があるものであり、前記蛍光物質は前記所定の病原体に結合する性質を持つものである
ことを特徴とする、請求項5〜7のいずれか1項に記載の蛍光一粒子検出システム。
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