IT202000006031A1 - Dispositivo fluidico per analisi di corpuscoli e relativo metodo - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE del brevetto per invenzione industriale avente per titolo
DISPOSITIVO FLUIDICO PER ANALISI DI CORPUSCOLI E RELATIVO METODO
L?invenzione qui descritta presenta un dispositivo e relativo metodo per la misura di densit? di massa, peso, dimensioni e forma di corpuscoli come microsfere, cellule, sferoidi ed organoidi. In particolare, l?architettura del dispositivo ? atta alla misura di corpuscoli aventi una dimensione compresa tra l?uno ed i cinquemila micrometri.
La raccolta di informazioni dettagliate su tali parametri pu? avere un impatto importante in applicazioni industriali e/o di ricerca riguardanti ambiti quali la farmacologia, la biologia cellulare, l'agroindustria, i settori alimentari ed ambientali. Questa crescente esigenza ? imputabile al massivo utilizzo di singole cellule e di aggregati cellulari su un?ampia gamma di applicazioni biomedicali.
In particolare, le cellule mostrano spesso variazioni pi? accentuate sulla densit? di massa piuttosto che sulle dimensioni, e l?ottenimento di dati affidabili su valori di questo tipo rappresenta una sfida da superare. La determinazione di tali valori, pu? quindi fornire un efficace mezzo di analisi per monitorare le risposte cellulari a stimoli esterni, quali farmaci e cambiamenti ambientali. Inoltre, ottenere informazioni simultanee sul volume del corpuscolo e sulla densit? di massa permette la correlazione con le attivit? biologiche, e l?ottenimento di importanti informazioni. Tra queste vi sono il livello di organizzazione e vitalit? della popolazione cellulare all'interno di un aggregato cellulare.
STATO DELLA TECNICA
I metodi per determinare la massa e la densit? di cellule, corpuscoli o molecole, sono stati implementati con l'avvento dei sistemi nano-elettromeccanici (nanoelectromechanical systems, NEMS), ed in particolare con lo sviluppo di risonatori nano-meccanici.
Questi sistemi sono risonanti quando sottoposti ad una frequenza specifica a seconda della loro massa, struttura e rigidit?. La massa del campione viene misurata dalla variazione della frequenza di oscillazione del risonatore quando interagisce con esso. Il limite iniziale per le applicazioni biologiche di questa tecnica era dovuto alla necessit? di operare in condizioni di vuoto. I risonatori a micro-canali sospesi (Suspended microchannel resonators, SMR) hanno superato questo ostacolo applicativo, consentendo di misurare la densit? di singole cellule in soluzione e ricavare quindi statistiche sulla distribuzione della densit?.
Tuttavia, utilizzando canali fluidici di dimensioni micrometriche, i sistemi sopra menzionati permettono l?analisi di corpuscoli che hanno dimensioni inferiori alle decine di micrometri. Questo ? un limite tecnologico importante per applicazioni o studi su aggregati cellulari come sferoidi e organoidi che possono arrivare a raggiungere diametri nell?ordine dei millimetri.
Sono noti metodi per calcolare la densit? di fitoplancton e di sfere di polistirene usando la velocit? di sedimentazione. Questa tecnica non consente di raggiungere la dimensione media di sferoidi e organoidi. Ancora pi? importante, i dati vengono raccolti in un unico passaggio, senza la possibilit? di ripetere la misura per un output pi? accurato.
Altre tecniche impiegano un sistema di elettrocinetica indotta ottica (optical induced electrokinetics, OEK) per sollevare i corpuscoli precedentemente introdotti in un canale microfluidico.
Tale soluzione ? costosa da realizzare, e non ? adatta per misurare corpuscoli che hanno dimensioni maggiori di venti micrometri.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
Un primo aspetto della presente invenzione descrive un dispositivo fluidico per la misura di almeno uno tra densit? di massa e peso di un corpuscolo. Il dispositivo fluidico comprende una camera di sedimentazione fluidicamente collegata a un canale d?ingresso configurato per essere immerso in un liquido. Il dispositivo fluidico comprende inoltre un sistema di pompaggio collegato alla camera di sedimentazione. Il sistema di pompaggio ? adatto a controllare il flusso del liquido nella camera di sedimentazione. Un processore del dispositivo fluidico ? configurato per ottenere dati di corpuscolo relativi a un corpuscolo in almeno una regione della camera di sedimentazione; e calcolare almeno una tra densit? di massa e peso del corpuscolo sulla base dei dati ricevuti.
Il liquido pu? essere un liquido di coltura o una soluzione, per esempio una soluzione salina, adatta a conservare e mantenere uno o pi? corpuscoli o agglomerati di corpuscoli da immettere nella camera di sedimentazione.
Grazie alla presenza di un canale d?ingresso direttamente collegato alla camera di sedimentazione, ? possibile effettuare misure individuali di densit? di massa e peso su una popolazione di corpuscoli. Questa configurazione permette di effettuare tali misure in sequenza e in maniera automatizzata. I valori misurati, in combinazione con i dati di corpuscolo, come ad esempio la dimensione e forma del corpuscolo, sono importanti ad esempio per lo studio di dinamiche cellulari, o per lo sviluppo di modelli biologici di organi umani.
In una forma di implementazione del primo aspetto, il dispositivo fluidico comprende inoltre almeno un dispositivo di rilevamento configurato per acquisire i dati di corpuscolo e per fornire al processore i dati di corpuscolo.
In una ulteriore forma di implementazione, il dispositivo fluidico dove il processore ? configurato per controllare il sistema di pompaggio sulla base di almeno una parte dei dati di corpuscolo ricevuti.
In una ulteriore forma di implementazione, i dati di corpuscolo comprendono almeno uno tra velocit?, forma, posizione, dimensione del corpuscolo.
In una ulteriore forma di implementazione, il dispositivo fluidico comprende inoltre un dispositivo di controllo di temperatura, configurato per fornire al processore una misura di temperatura di un liquido nella camera di sedimentazione. Il processore ? configurato per calcolare almeno una tra la densit? di massa e il peso del corpuscolo anche sulla base di detta misura di temperatura.
La misura della temperatura permette di ottenere misure precise anche in condizioni in cui il dispositivo non si trova in un ambiente a temperatura controllata. Infatti il moto del corpuscolo nella camera di sedimentazione dipende anche dalla viscosit? del liquido nel quale si muove, la quale dipende dalla natura dello specifico liquido utilizzato e dalla sua temperatura.
In una ulteriore forma di implementazione, il dispositivo di controllo temperatura ? inoltre configurato per regolare la temperatura del liquido nella camera di sedimentazione sulla base di almeno una tra informazioni fornite dal processore e un valore predefinito di temperatura.
Il controllo della temperatura permette di aggiungere alla precisione di misura, anche il mantenimento delle condizioni ideali per il mantenimento del corpuscolo. Ad esempio, nel caso in cui il corpuscolo ? costituito da materiale biologico, le condizioni ideali sono il mantenimento a 37 gradi centigradi, ed in alcuni protocolli di utilizzo potrebbe essere richiesta la variazione della temperatura per l?osservazione di specifici fenomeni biologici.
In una ulteriore forma di implementazione, il dispositivo fluidico comprende inoltre un supporto mobile adatto ad alloggiare almeno una parte dell?almeno un dispositivo di rilevamento. Il processore ? inoltre configurato per guidare il supporto mobile sulla base di almeno una parte dei dati di corpuscolo ricevuti.
Grazie al supporto mobile ? possibile seguire il corpuscolo durante il suo movimento, e quindi ottenere una maggior precisione nella misura di densit? di massa e peso, ed ? inoltre possibile effettuare misure su corpuscoli che si muovono a grandi velocit? in camere di sedimentazione particolarmente lunghe. Inoltre ? possibile ottenere informazioni tridimensionali sul corpuscolo, grazie ad esempio all?osservazione del campione da diverse angolazioni, o su diversi piani focali. I dati ottenuti sulla forma tridimensionale dell?oggetto permettono una migliore ricostruzione del coefficiente di viscosit?, e quindi una maggior risoluzione della misura di densit? di massa e peso.
In una ulteriore forma di implementazione, la camera di sedimentazione comprende inoltre un canale di flusso connesso fluidicamente al canale d?ingresso e avente una sezione trasversale interna che si restringe in una porzione del canale di flusso.
In particolare, la camera di sedimentazione comprende un canale di flusso avente almeno due porzioni dove la sezione interna della prima porzione ha dimensioni maggiori della sezione interna della seconda porzione.
La seconda porzione ? posizionata in modo tale che un corpuscolo nella camera di sedimentazione e atto a muoversi dalla seconda sezione alla prima sezione in assenza di flussi nel liquido in cui ? immerso il corpuscolo.
Variazioni di sezione della camera di sedimentazione permettono di ottenere linee di flusso convergenti. Durante una fase in cui viene prodotto un flusso nella camera di sedimentazione, il corpuscolo segue tali linee di flusso, e di conseguenza si sposta verso una regione pi? centrale della camera di sedimentazione. Grazie a questo fenomeno, si evitano artefatti di misura che dipendono dalle interazioni tra il corpuscolo e le superfici laterali della camera di sedimentazione, e si riescono a produrre misure pi? precise. Questo inoltre garantisce il centramento del corpuscolo anche per tempi lunghi di misura, abilitando cos? il mantenimento del campione nella camera di sedimentazione per sperimentazioni biologiche. Il centramento ? inoltre un aspetto utile per il prelievo del campione, poich? diminuisce la probabilit? di perdere il campione nel sistema fluidico ad esempio per adesione alle superfici di canali.
In una ulteriore forma di implementazione, la camera di sedimentazione comprende canali di flusso collegati in parallelo tra loro e al canale di ingresso. Ogni canale di flusso ? inoltre collegato a un regolatore di flusso. In tale implementazione il processore ? configurato per ricevere dati di ingresso relativi a un corpuscolo nel canale d?ingresso, e controllare i regolatori di flusso sulla base di detti dati di ingresso.
La presenza di pi? camere di sedimentazione permette di direzionare un corpuscolo in base alla sua dimensione in una camera di sedimentazione adeguata. ? cos? possibile implementare in un unico strumento la misura di corpuscoli di dimensioni anche significativamente differenti, ad esempio da un micrometro a 5 millimetri. Alternativamente, la presenza di pi? camere di sedimentazione permette una maggiore portata nella misura di popolazioni di corpuscoli.
In una ulteriore forma di implementazione il dispositivo fluidico comprende inoltre un canale di ricircolo collegato in parallelo alla camera di sedimentazione. Il canale di ricircolo comprende un dispositivo di ricircolo, e il processore ? configurato per controllare dispositivo di ricircolo per il ricircolo del liquido nella camera di sedimentazione.
Grazie al sistema di ricircolo ? possibile evitare la presenza di pi? di un corpuscolo all'interno del sistema fluidico e quindi effettuare analisi ripetute non distruttive di singoli corpuscoli, ed il recupero degli stessi. Inoltre la quantit? di liquido di analisi usato ? minore per misure prolungate nel tempo.
In una ulteriore forma di implementazione, il dispositivo fluidico comprende inoltre un canale secondario collegato fluidicamente alla camera di sedimentazione. Il processore ? configurato per controllare selettivamente il flusso nel canale secondario per immettere liquido nella camera di sedimentazione e/o per espellere liquido dalla camera di sedimentazione attraverso il canale secondario.
Il canale secondario pu? essere collegato alla camera di sedimentazione direttamente o tramite canale d'ingresso o tramite circuito fluidico secondario.
La presenza di almeno un canale secondario permette l?immissione di un nuovo liquido nella camera di sedimentazione durante la misura. ? cos? possibile ad esempio effettuare protocolli di sperimentazione biologica. Inoltre ? possibile anche introdurre nuovi liquidi adatti alla misura di precisione dello specifico corpuscolo. Ad esempio, selezionando tra un pannello di liquidi di misura il liquido che ha densit? di massa pi? vicina a quella del corpuscolo, ? possibile migliorare precisione e accuratezza della misura. Inoltre, lo stesso canale secondario pu? essere utilizzato per la rimozione del campione ed il suo smistamento in contenitori specifici. Ad esempio, tramite apposite derivazioni fluidiche, diversi corpuscoli possono essere raccolti in diversi contenitori, anche in base ai risultati delle misure effettuate.
Un secondo aspetto della presente invenzione descrive un metodo per la misura di almeno uno tra densit? di massa e peso di un corpuscolo. Secondo il metodo un corpuscolo da analizzare viene immesso in una camera di sedimentazione di un dispositivo fluidico attraverso un canale d?ingresso immerso in un liquido. Dati di corpuscolo relativi a un corpuscolo in almeno una regione della camera di sedimentazione sono ottenuti. Il corpuscolo ? in movimento in un liquido a riposo nella camera di sedimentazione. Almeno una tra densit? di massa e peso del corpuscolo ? calcolato sulla base dei dati ricevuti.
La misura pu? essere fatta mentre il corpuscolo ? in movimento nel liquido a riposo. Per liquido a riposo si intende che nel canale di sedimentazione non ? presente alcun flusso. In una implementazione il corpuscolo si muove di moto accelerato sottoposto a un campo di forza. Per esempio la camera di sedimentazione pu? essere posizionata in modo tale che il corpuscolo si muova nel liquido a riposo sottoposto ad accelerazione gravitazionale.
In una forma di implementazione del secondo aspetto ottenere i dati di corpuscolo comprende acquisire, per mezzo di almeno un dispositivo di rilevamento, i dati di corpuscolo, e fornire a un processore i dati di corpuscolo acquisiti.
In una ulteriore forma di implementazione Il metodo comprende inoltre controllare un flusso nella camera di sedimentazione sulla base di almeno una parte dei dati di corpuscolo ricevuti.
In una ulteriore forma di implementazione, il metodo comprende inoltre misurare una temperatura del liquido nella camera di sedimentazione; e calcolare la almeno una tra la densit? di massa e il peso del corpuscolo anche sulla base di detta misura di temperatura.
In una ulteriore forma di implementazione, il metodo comprende inoltre regolare la temperatura del liquido nella camera di sedimentazione sulla base di almeno una tra informazioni fornite dal processore e un valore predefinito di temperatura.
In una ulteriore forma di implementazione, il metodo comprende inoltre guidare almeno una parte dell?almeno un dispositivo di rilevamento sulla base di almeno una parte dei dati di corpuscolo ricevuti.
In una ulteriore forma di implementazione, il metodo comprende inoltre ricircolare il liquido in cui ? immerso il corpuscolo da analizzare in un canale di ricircolo fluidicamente connesso in parallelo alla camera di sedimentazione.
In una ulteriore forma di implementazione, il metodo comprende inoltre sostituire, prima e/o dopo di una misura di almeno uno tra la densit? di massa e peso del corpuscolo, il liquido in cui ? immerso il corpuscolo da analizzare con un secondo liquido diverso da detto liquido.
In una ulteriore forma di implementazione, il metodo comprende inoltre selezionare un corpuscolo sulla base di uno tra densit? di massa, peso, dimensione e forma; e raccogliere il corpuscolo selezionato in un contenitore predefinito sulla base di almeno uno tra densit? di massa, peso, dimensione e forma del corpuscolo.
I vantaggi descritti sopra in relazione al dispositivo fluidico si applicano anche al metodo descritto in relazione al secondo aspetto e alle sue forme di implementazione.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1. Visione frontale della camera di sedimentazione contenente il mezzo d?analisi ed il corpuscolo. Rappresentazione delle forze coinvolte e della velocit? terminale.
Figura 2. Rappresentazione schematica dell?invenzione.
Figura 3. Rappresentazione schematica dell?implementazione relativa al dispositivo di controllo temperatura.
Figura 4. Dati di regressione lineare ottenuti dalla variazione verticale della posizione del corpuscolo in funzione del tempo.
Figura 5. Risultati sperimentali delle densit? medie ottenute su sette diverse microsfere di PS misurate per ogni lotto analizzato (20, 50 e 90 ?m), e le rispettive deviazioni standard ottenute su sette ripetizioni per ogni misura.
Figura 6. A) Risultati sperimentali delle densit? medie ottenute sui tre lotti di microsfere di PS, riportati a confronto con il valore dichiarato dal produttore, e rispettiva deviazione standard. B) Velocit? terminale determinata sperimentalmente, a confronto con la velocit? teorica, per le tre grandezze di microsfere esaminate.
Figura 7. Rappresentazione schematica del dispositivo di centraggio (A). Ingrandimento della porzione 100c (A,B) per la rappresentazione schematica del centraggio del corpuscolo tramite flusso pulsato (B) e tramite flusso modulato (C).
Figura 8. Rappresentazione schematica la camera di sedimentazione comprendente diversi canali di flusso aventi diverse grandezze, collegati a regolatori di flusso indipendenti, al fine di soddisfare la diversit? corpuscolare.
Figura 9. Rappresentazione schematica della soluzione tecnologica relativa alla misura del movimento di corpuscoli di grandi dimensioni, tramite il riconoscimento del passaggio del corpuscolo da diverse posizioni target a distanza regolabile e nota.
Figura 10. Rappresentazione schematica del sistema a doppia fotocamera per la caratterizzazione morfologica bilaterale del corpuscolo.
Figura 11. Rappresentazione schematica dell?implementazione relativa all?acquisizione di informazioni tridimensionali sul corpuscolo basata sull'acquisizione di immagini riflesse da pi? angoli.
Figura 12. Rappresentazione schematica dell?implementazione relativa all?acquisizione di immagine 3D basata su un dispositivo di rilevamento orbitante rispetto ad una camera di sedimentazione cilindrica.
Figura 13. Rappresentazione schematica dell?implementazione contenente un canale di ricircolo, e relativo sistema di pompaggio secondario.
Figura 14. Rappresentazione schematica dell?implementazione contenente un canale secondario per l?introduzione e scambio di ulteriori mezzi d?analisi.
Figura 15. Rappresentazione grafica del monitoraggio del diametro e della densit? di sferoidi rispetto al tempo, per la valutazione del loro grado di maturazione prima del trattamento con il farmaco.
Figura 16. Rappresentazione schematica dell?implementazione dedicata al Sorting dei corpuscoli.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
? sempre pi? comune per un singolo laboratorio medico o biologico studiare corpuscoli di diversa natura come cellule, microsfere, sferoidi, organoidi e/o altre forme di aggregati corpuscolari.
Data l'enorme variet? di campioni e l'interesse per la misurazione di peso, densit?, dimensioni e forma, le forme di attuazione e implementazioni descritte di seguito presentano soluzioni tecnologiche che consentono di misurare tali parametri adottando un singolo dispositivo e diversi metodi di utilizzo associati ad esso. Una forma di attuazione della presente invenzione descrive una prima soluzione che permette di compiere tali misure. In un esempio, la misura del peso, densit?, dimensioni e forma possono essere effettuate in maniera concomitante, simultanea o combinata su campioni aventi dimensioni che possono variare da uno a cinquemila micrometri. Oltre ad avere il vantaggio di operare con un singolo strumento per una larga distribuzione dimensionale di campioni, ci? consente una solida correlazione tra i dati ottenuti sui singoli corpuscoli.
Le forme di realizzazione del dispositivo fluidico e relativi metodi descritti nella presente divulgazione permettono di effettuare l?analisi descritta sopra in maniera economica, accurata e non invasiva. Tali metodi e dispositivi fluidici possono essere usati per compiere misure non solo su target organici e biologici, ma anche su campioni inorganici.
I seguenti paragrafi descrivono diverse forme di realizzazione esemplificative della presente invenzione. A titolo d?esempio, e per facilitare la comprensione, le forme di realizzazione saranno descritte con riferimento all'analisi di materiale biologico come cellule o agglomerati cellulari, indicati di seguito con il termine generico di corpuscoli. Resta comunque inteso che il metodo ed il dispositivo relativi all?invenzione qui presentata permettono di misurare densit? di massa, peso, dimensioni e forma di corpuscoli non biologici. In particolare, le implementazioni con riferimento alle forme di realizzazione esemplificative descritte di seguito, possono anche essere utilizzate per analizzare corpuscoli che non siano cellule o agglomerati cellulari. Di conseguenza, il termine "corpuscolo", usato nel contesto delle forme di attuazione della presente invenzione per indicare cellule, agglomerati cellulari o in generale materiale biologico pu? anche essere usato per indicare microparticelle, particelle residue di processi di produzione industriale, polveri atmosferiche sospese, pollini, vescicole, gocce di olio in sospensione acquosa, bolle d'aria nei liquidi.
Allo stesso modo, il termine "mezzo d'analisi" o il termine pi? generico ?liquido? ? usato negli esempi esplicativi della presente invenzione per indicare un mezzo compatibile con colture cellulari. Tuttavia, sar? chiaro all'esperto del ramo che il termine ?mezzo d'analisi? ed il termine ?liquido? devono essere interpretati nel loro senso pi? generale. In particolare, in base alle esigenze di progettazione ed alla natura dei corpuscoli da analizzare, sar? chiaro all'esperto del ramo che il liquido pu? essere un mezzo di coltura cellulare o liquidi di altra natura, come soluzioni in base acquosa, o oli.
La presente invenzione ha lo scopo di colmare il divario all?interno dello stato dell'arte riguardante la possibilit? di adoperare un singolo apparato tecnologico, ed il relativo metodo di utilizzo, per la misura concomitante di densit? di massa, peso, dimensioni e/o forma di corpuscoli anche di differenti dimensioni. Infatti, i dispositivi presenti oggigiorno possono operare parzialmente in una ristretta distribuzione dimensionale. Inoltre, questi non permettono di ottenere misure simultanee o combinate di tali parametri. Ci? porta all?ottenimento d?informazioni frammentate, difficilmente correlabili tra loro.
Anche se l'oggetto ? stato descritto con particolare riferimento alle figure allegate, i numeri di riferimento usati nella descrizione e nelle rivendicazioni sono utilizzati per migliorare l'intelligenza dell?invenzione e non costituiscono alcuna limitazione all'ambito di tutela rivendicato.
L?invenzione presenta un nuovo dispositivo, e la relativa metodologia di utilizzo, capace di effettuare la misura concomitante di densit? di massa, peso, dimensioni e/o forma di corpuscoli biologici e non biologici come microsfere, cellule, sferoidi e organoidi, aventi una dimensione compresa tra 1 e 5.000 micrometri.
Dopo una descrizione dettagliata delle diverse implementazioni atte alla realizzazione di tale misura, saranno divulgate plurime modalit? di utilizzo della presente invenzione. Quest?ultime comprendono riadattamenti del sistema di base, con particolare riferimento alla loro utilit? in campo biomedicale. La presente invenzione ? atta ad analizzare un corpuscolo (420) in movimento in condizioni di flusso a riposo, guidato dalla forza di gravit? (Figura 1). Tale movimento del corpuscolo ? principalmente influenzato dalla densit? di massa, dal volume, dalla forma, dall'orientamento dello stesso e dalla densit? di massa e viscosit? del liquido circostante.
Una rappresentazione schematica di una forma di attuazione della presente invenzione ? mostrata in Figura 2.
Le forme di implementazione descritte con riferimento alle figure dalla 3 alla 16 descrivono successivi miglioramenti e sviluppi del dispositivo fluidico di Figura 1. Singole caratteristiche descritte di seguito con riferimento a una singola figura possono essere pertanto combinate con caratteristiche descritte con riferimento alle altre figure.
Il dispositivo fluidico comprende una camera di sedimentazione 100, un sistema di pompaggio 200, un dispositivo di rilevamento 300 ed un processore 500. Il movimento del corpuscolo 420 avviene all?interno di un canale fluidico con pareti trasparenti, qui chiamata camera di sedimentazione 100. Il sistema di pompaggio 200, comprende un sistema per la generazione di flusso 230 che, in via esemplificativa, pu? essere una pompa peristaltica o un sistema di controllo della pressione. Un canale di ingresso 210 ed un canale di uscita 220 possono essere collegati ad un serbatoio di carico o di scarico, in alternativa possono essere utilizzati come sfiato. Il sistema comprendente il dispositivo di rilevamento 300 collegato al processore 500 svolge il duplice ruolo di monitorare il movimento di un corpuscolo 420, e di misurare la forma e le dimensioni dello stesso. Sia la camera di sedimentazione 100 che il dispositivo di rilevamento 300 sono dimensionati per consentire misure accurate del movimento, della forma e delle dimensioni del corpuscolo 420, come descritto dettagliatamente nel prosieguo del testo.
Sebbene il dispositivo di Figura 2 includa il dispositivo di rilevamento 300, il dispositivo di rilevamento ? opzionale. in implementazioni alternative, il dispositivo fluidico pu? essere realizzato senza il dispositivo di rilevamento.
In particolare, nel contesto delle forme di attuazione della presente invenzione, per "misurare la forma e la dimensione" del corpuscolo, viene intesa la misura di qualsiasi caratteristica del corpuscolo utilizzabile per rappresentare o approssimare la geometria tridimensionale del corpuscolo. Questa potrebbe coincidere con la misura del raggio, nel caso di un corpuscolo sferico, o di altre caratteristiche geometriche nel caso di corpuscoli quasi sferici e non sferici.
Per un corretto funzionamento del dispositivo, il corpuscolo 420, contenuto all?interno del mezzo d'analisi 450, viene prelevato dal serbatoio 400, introdotto e trasportato, all?interno della camera di sedimentazione 100 attraverso il canale di ingresso 210. Il trasporto del corpuscolo all?interno del sistema di pompaggio 200 avviene tramite l?azionamento di un sistema per la generazione di flusso 230. Dopo l'introduzione del corpuscolo 420, il flusso viene bloccato e il corpuscolo si muove all?interno del mezzo d?analisi 450 guidato dalla forza di gravit?. In assenza di altri flussi, e dopo un tempo transitorio dovuto ad una fase di accelerazione, il corpuscolo raggiunger? la sua velocit? costante, qui definita velocit? terminale, velocit? di deriva o velocit? di sedimentazione.
Una volta svolta la misura, il canale di ingresso 210 ed il canale di uscita 220 possono essere utilizzati indifferentemente per il recupero del corpuscolo 420.
Il dispositivo pu? essere utilizzato per effettuare misure relative, nelle quali vengono valutate le differenze tra diversi corpuscoli, oppure per effettuare misure assolute. Nell?ultimo caso, ? utile la conoscenza della temperatura, al fine di definire la densit? di massa e della viscosit? del mezzo d'analisi 450. In una forma di attuazione della presente invenzione il dispositivo ? adattato per essere utilizzato all?interno di un ambiente a temperatura controllata, come per esempio in un incubatore. Alternativamente, la temperatura pu? essere misurata durante gli esperimenti. In una forma di realizzazione (Figura 3) della presente invenzione, la temperatura media del mezzo d'analisi 450 viene misurata tramite un dispositivo di controllo temperatura 600 composto da almeno un sensore 610, posizionato in prossimit? della camera di sedimentazione 100. Successivamente il processore 500 adatta i valori di viscosit? calcolati in funzione della temperatura misurata.
In un'altra forma di realizzazione, quando le condizioni operative richiedono un valore di temperatura specifico (ad esempio, 37?C per campioni biologici vivi), il dispositivo di controllo temperatura 600 ? configurato per regolare la temperatura del liquido nella camera di sedimentazione sulla base di informazioni fornite dal processore 500, quali il valore corrente della temperatura, il tipo di corpuscolo, la viscosit? del liquido, il valore corrente della viscosit? del liquido, etc. In una specifica forma di realizzazione, il dispositivo di controllo temperatura 600 gestisce l?unit? di regolazione della temperatura 620, la quale consente il mantenimento di uno specifico valore durante l'analisi. Ad esempio, il dispositivo di controllo temperatura 600 pu? comprendere diversi riscaldatori (620a e 620b) e sensori (610a e 610b), situati in varie posizioni del dispositivo fluidico, del sistema sistema di pompaggio 200, ed in particolare in prossimit? della camera di sedimentazione 100.
Dal punto di vista fisico, ed al fine di massimizzare l?accuratezza del dato ottenuto, il movimento del corpuscolo pu? venire considerato al raggiungimento della sua velocit? terminale, e non durante il periodo transitorio. La velocit? relativa del corpuscolo rispetto al mezzo d'analisi v(t), pu? essere ottenuta risolvendo l'equazione dinamica nell'equazione di moto:
Dove ? ? il periodo transitorio della dinamica del corpuscolo:
dove mp ? la massa del corpuscolo, ?p ? la densit? di massa del corpuscolo, a ? l'accelerazione del corpuscolo,?m? ? la densit? di massa del mezzo d'analisi, Vp ? il volume del corpuscolo, vd ? la velocit? di deriva del corpuscolo, v0 ? la velocit? iniziale del corpuscolo, r ? il raggio del corpuscolo, k ? il coefficiente di attrito,? ? la viscosit? del mezzo d'analisi e g ? l'accelerazione gravitazionale.
Per avere una stima dell'ordine di grandezza di tale periodo transitorio, sono di seguito riportati calcoli nel caso di corpuscoli biologici di diverse dimensioni e tipologia, misurati in soluzioni acquose. Le soluzioni a base acquosa presentano una viscosit? di circa 1 mPa ? s, e la densit? di massa dei corpuscoli biologici ? mediamente 1020 fg/?m3. Nel caso di corpuscoli con diametro compreso tra 1 ed i 2.000 micrometri, l'ordine di grandezza di? varia da 60 ns (per un diametro di 1 ?m) a 250 ms (per un diametro di 2.000 ?m). In tale intervallo, i corpuscoli raggiungono la velocit? terminale in breve tempo. Poich? tale lasso temporale ? trascurabile, l'accelerazione del corpuscolo non ha alcun impatto sulla misurazione e la dinamica del corpuscolo pu? essere quindi considerata come un movimento lineare uniforme.
Altre implementazioni tecniche delle forme di attuazione della presente invenzione consentono la misura di corpuscoli di maggiori dimensioni, in particolare tra i 2 ed i 5 millimetri di diametro. Per tali implementazioni il tempo transitorio deve essere considerato, in quanto pu? raggiungere 1,5 secondi nel caso di campioni di 5 millimetri di diametro.
Ad esempio, in una forma di attuazione della presente invenzione, il corpuscolo viene portato ad una distanza prestabilita al di sopra della regione di lavoro del dispositivo di rilevamento 300, al fine di escludere il periodo transitorio dalla misura.
In un'altra implementazione della presente invenzione, la regione di lavoro del dispositivo di rilevamento 300 ? sufficientemente grande, e la camera di sedimentazione 100 ? sufficientemente lunga, da permettere la rilevazione del movimento dinamico completo del corpuscolo, includendo l'accelerazione e la velocit? terminale. I dati raccolti durante il periodo transitorio del moto corpuscolare potranno non venir considerati per il calcolo della velocit? terminale.
In una forma di attuazione della presente invenzione, la teoria usata per la misura si basa su un'elaborazione della legge di Stokes, in cui:
(eq. 1)
e
Dove Wp ? il peso del corpuscolo.
Al fine di dimostrare l?affidabilit? di tale invenzione, un'implementazione specifica della stessa (Figura 2) ? stata utilizzata per la misura della densit? di massa e della dimensione di microsfere di polistirene comprese tra i 20 ed i 90 micrometri.
In tale implementazione il sistema di rilevamento 300 ? composto da un sistema di microscopia ottica con ingrandimento 4X. La camera di sedimentazione 100 ? ricavata all?interno di un chip trasparente di polidimetilsilossano (PDMS) adeso covalentemente ad un vetrino. L?architettura della camera di sedimentazione 100 presenta una lunghezza di 6 cm, ed una sezione trasversale di 1 x 1 mm. Il corpuscolo viene posizionato nella parte superiore della camera di sedimentazione 100 da un sistema per la generazione di flusso 230, costituito in questa implementazione da una pompa peristaltica. Precedentemente all?arrivo nella camera di sedimentazione 100 il campione viene trasportato attraverso il sistema sistema di pompaggio 200, costituito in questo caso da tubi in politetrafluoroetilene (PTFE). il processore 500 ? composto da un computer e da un relativo software, capaci di elaborare le immagini raccolte dall'unit? di microscopia. Da queste immagini vengono estrapolate la proiezione bidimensionale della forma del corpuscolo e la sua velocit? terminale. Quest?ultima viene calcolata attraverso la regressione lineare ottenuta dalla variazione della posizione del centroide del corpuscolo in funzione del tempo (Figura 4). il processore 500 calcola successivamente la densit? di massa ed il diametro dei corpuscoli adottando il modello matematico precedentemente presentato. Questa procedura viene ripetuta pi? volte su ciascun corpuscolo per ottenere risultati statisticamente significativi.
Questa specifica implementazione ? stata utilizzata per misurare corpuscoli con densit? e diametri noti ai fini di validare l'invenzione. In particolare, sono stati selezionati tre lotti di microsfere di polistirene (PS) (Polybead?, Polysciences Inc. US) aventi il diametro di 20, 50 e 90 micrometri. La scheda del prodotto fornita dal venditore indica, per le sfere di PS, il valore della densit? di massa media pari a 1.050 ? 10 fg/um3. Per ogni lotto di microsfere sono state analizzate sette unit? differenti, e la misura ? stata ripetuta sette volte per ogni unit?, al fine di aumentare la significativit? statistica. La Figura 5 mostra il valore di densit? media delle sette diverse microsfere analizzate, e la rispettiva deviazione standard estrapolata dalle sette ripetizioni per ciascun lotto. In linea con le aspettative sperimentali, le deviazioni standard delle misure eseguite su tutte le microsfere risultano essere comparabili, dimostrando l'accuratezza e l'affidabilit? di questa implementazione.
Inoltre, i valori di densit? ottenuti per le microsfere di PS, sono risultati essere notevolmente pi? accurati del valore medio dichiarato dal produttore (Figura 3a). In particolare, si pu? notare che la deviazione standard media risulta essere un ordine di grandezza inferiore al quella del valore commerciale (Figura 6a). Un'ulteriore conferma dell'accuratezza dei risultati si ottiene dal confronto tra la velocit? terminale teorica (eq.1) e quella sperimentale (Figura 6b).
Nello specifico, la stessa configurazione presentata in Figura 2, utilizzata per l'analisi di validazione effettuate sulle microsfere di PS, pu? essere adottata per l?analisi di campioni biologici di grandi dimensioni, quali sferoidi o organoidi.
La rilevanza di tali applicazioni riguarda la possibilit? di utilizzare il metodo qui presentato per esempio per monitorare le fasi di crescita degli sferoidi. Si tratta infatti di un importante aspetto che permette di comprendere il momento in cui una popolazione di sferoidi raggiunge la maturit? necessaria, o desiderata dall?operatore, per continuare la sperimentazione biologica. Il processo di formazione degli sferoidi subisce infatti una compattazione nel tempo, partendo da un agglomerato di cellule disgregate, e raggiungendo uno stadio di aggregato compatto. Ci? ? particolarmente importante nei campi biomedici, in cui il materiale biologico normalmente utilizzato per le analisi non ? standardizzato, portando cos? all'ottenimento di risultati meno affidabili. La misura simultanea della densit? di massa, insieme al peso, alla forma ed alle dimensioni del campione, potrebbe consentire di comprendere le migliori condizioni per la crescita di sferoidi standard. Inoltre, gli sferoidi possono essere generati da diversi tipi di cellule o da una combinazione di esse, di conseguenza, sia il tempo necessario per raggiungere la maturazione, sia la densit? di massa caratteristica della fase matura, sono diversi per ciascun tipo di sferoide. Un importante campo applicativo per il quale ? importante determinare il valore della densit? di massa durante il processo di formazione di sferoidi, riguarda il processo industriale di screening dei farmaci. In questo ambito, pu? essere valutata l'efficacia di un trattamento farmacologico tramite lo studio dell?assorbimento del farmaco negli sferoidi stessi. ? noto infatti che la penetrazione del farmaco ? altamente correlata al livello di compattezza dell'aggregato, che a sua volta pu? essere messo in relazione con la sua densit? di massa. Pertanto, la valutazione della corretta struttura degli sferoidi, in termini di densit? di massa, pu? migliorare notevolmente la riproducibilit? dei risultati. Tale implementazione dell?invenzione mira a migliorare questo aspetto della ricerca che attualmente rappresenta uno dei limiti principali per l'applicazione di modelli biologici 3D, rivolto alla scoperta ed allo sviluppo di farmaci.
Tuttavia, gli sferoidi non sono gli unici corpuscoli utilizzati in campo biomedicale. La varia natura dei corpuscoli si rispecchia anche nella vasta gamma di dimensioni che essi ricoprono, andando dalle singole cellule agli organoidi. Noto l?interesse dei ricercatori sull?intera gamma di corpuscoli, la possibilit? di effettuare la misura simultanea della loro densit? di massa, peso, dimensioni e forma, tramite un unico strumento, sarebbe di notevole impatto per la comunit? scientifica.
A tal proposito, i successivi paragrafi descrivono le implementazioni, metodologiche e/o tecnologiche, adottate per ampliare la gamma dimensionale dei corpuscoli analizzabili.
Ad esempio, in un adattamento dell'invenzione, per l?analisi di corpuscoli micrometrici ? necessaria un'ottica ad alto ingrandimento, in grado di avere una risoluzione sufficiente per rilevarne dimensioni e forma. Un altro adattamento riguarda il fatto che, generalmente, un corpuscolo di dimensioni millimetriche tender? ad avere una velocit? di caduta pi? elevata rispetto ad un corpuscolo di dimensioni micrometriche. Di conseguenza, la camera di sedimentazione 100 deve essere abbastanza lunga da consentire la misura della sua velocit? terminale. Pertanto, la corretta selezione di uno specifico dispositivo di rilevamento 300 e della camera di sedimentazione 100 potrebbe essere rilevante per ampliare il campo operativo dell'invenzione.
In un esempio dell?implementazione precedentemente descritta, il dispositivo di rilevamento 300 ? composto da un sistema di acquisizione d?immagini, che acquisisce una serie di fotogrammi del corpuscolo 420 durante il suo movimento all'interno della camera di sedimentazione 100. Tali immagini vengono elaborate per ottenere la dimensione, la forma e la posizione del centroide del corpuscolo rispetto al tempo. La velocit? terminale viene calcolata tramite un algoritmo di regressione lineare, come mostrato in Figura 2. Questa implementazione specifica richiede che siano raccolte un numero sufficiente di immagini del corpuscolo in movimento al fine di ottenere un numero corretto di punti, che verranno poi utilizzati dall?algoritmo di regressione. Ad esempio, in condizioni di corpuscoli sferici, un numero accettabile di punti potrebbe essere 5, mentre in condizioni di corpuscoli non sferici, il numero accettabile di punti potrebbe essere pi? elevato a causa dell'incertezza aggiuntiva nel riconoscimento del centroide del corpuscolo. Nello specifico, il numero di punti che il dispositivo ? in grado di ottenere durante una misura dipende da diversi fattori sperimentali e tecnologici. Questi comprendono la velocit? terminale del corpuscolo, la lunghezza della porzione della camera di sedimentazione osservabile dal sistema di riconoscimento, la frequenza dei fotogrammi e la risoluzione ottica. Tali fattori possono essere combinati in una formula che prevede il numero di punti d'analisi rilevati nelle specifiche condizioni tecnologiche e sperimentali, qui riportati come:
In una particolare implementazione della forma di attuazione della presente invenzione, il numero accettabile di punti d'analisi ? fissato ad un valore specifico, ad esempio 10. Diversamente, in un'altra forma di realizzazione della presente invenzione, tale numero accettabile di punti d'analisi ? variabile, ed ? regolato da un algoritmo di ottimizzazione. Ad esempio, l'algoritmo pu? regolare il numero ideale di punti d'analisi in base alla qualit? del fitting dei dati di posizione del corpuscolo, in funzione del tempo.
Inoltre, al fine di migliorare l?accuratezza delle misure, il dispositivo permette di posizionare il corpuscolo al centro della camera di sedimentazione prima di effettuare l?analisi. Per esempio, in una forma di realizzazione della presente invenzione, il dispositivo utilizza un sistema di centraggio del corpuscolo tramite una variazione della geometria e/o un restringimento della camera di sedimentazione 100. Il principio di funzionamento si basa sull?utilizzo di una specifica geometria della camera di sedimentazione che permetta di ottenere al suo interno flussi laminari con componente orizzontale non nulla. In tali condizioni, tramite un opportuno controllo del sistema di pompaggio 200, il corpuscolo pu? essere trasportato nella zona del canale di sedimentazione in cui il flusso ha componente orizzontale nulla. Di seguito, e pi? in generale nell?ambito della presente invenzione, per verticale si intende la direzione parallela al vettore di forza gravitazionale, e per orizzontale si intende qualunque vettore perpendicolare alla direzione verticale.
Per esempio, nel caso in cui la camera di sedimentazione sia disposta verticalmente, se il corpuscolo si trova in una posizione, all?interno della camera di sedimentazione, dove le linee di flusso hanno componente orizzontale non nulla, il corpuscolo risente anche di una spinta laterale dovuta alla componente orizzontale del flusso. In una particolare forma di attuazione della presente invenzione, la camera di sedimentazione 100, ? orientata verticalmente ed ? costituita da due porzioni aventi sezione orizzontale di diversa grandezza, in modo tale che il canale a sezione pi? ampia (100a) si trovi al di sotto del canale a sezione pi? stretta (100b), come mostrato in Figura 7A. Inoltre, in questo particolare esempio, le due porzioni (100a e 100b) della camera di sedimentazione (100) sono connesse in maniera coassiale da una porzione di canale a sezione inclinata (100c). Il tempo necessario per il centraggio del corpuscolo pu? variare, a seconda del valore dell?angolo di inclinazione delle pareti della porzione 100c, della percentuale di restringimento della sezione della porzione del canale di sedimentazione pi? piccolo (100b) rispetto al pi? grande (100a), o del rapporto tra le aree delle due sezioni (Figura 7A). In ogni caso, il valore specifico di questi parametri non ? essenziale per il funzionamento del sistema di centraggio. In una ulteriore forma di attuazione della presente invenzione, la porzione di canale a sezione inclinata (100c) ? sostituita da un cambio discontinuo di sezione, ovvero da pareti a 90? rispetto all?asse verticale.
Un esempio specifico del sistema di centraggio ? presentato in Figura 7A al fine di descriverne il funzionamento. In questo particolare esempio la geometria della porzione pi? larga della camera di sedimentazione 100 presenta una sezione quadrata avente lato 2 mm (100a), mentre la porzione pi? stretta della camera di sedimentazione 100 presenta una sezione quadrata avente lato 1 mm (100b). Le due porzioni sono collegate tramite una porzione di restringimento (100c), in questo caso graduale, avente un angolo di 45? rispetto all?asse longitudinale della camera di sedimentazione. Le misure riguardanti la sezione quadrata della camera di sedimentazione date in questo esempio sono indicative. Il rapporto tra le sezioni delle due porzioni della camera di sedimentazione e l?inclinazione della porzione di restringimento non sono quindi limitati a quelli derivabili da tali misure. Le dimensioni date in questo esempio sono indicative e questi particolari valori sono opzionali.
In una particolare metodica di utilizzo del dispositivo di centraggio, il sistema fluidico viene regolato in modo pulsato. In un esempio il corpuscolo 420 si trova nella posizione descritta in Figura 7B, al tempo t1 (420t1). Una volta attivato il sistema di pompaggio 200, il corpuscolo viene trasportato seguendo le linee di flusso imposte dalla geometria, fino a posizionarsi come mostrato in Figura 7B al tempo t2 (420t2). Il flusso viene quindi interrotto, permettendo al corpuscolo di iniziare la sua caduta sotto l?azione bilanciata della forza gravitazionale ed idrostatica. A seguito di questo, il corpuscolo si trover? in una posizione pi? centrata rispetto alla camera di sedimentazione 100, al tempo t3 (420t3). L?ulteriore attivazione del sistema di pompaggio 200 permette la ripetizione del processo fino al raggiungimento del centramento del corpuscolo 420.
In un?ulteriore metodica di utilizzo del sistema di centraggio, il corpuscolo 420 viene mantenuto nella porzione di restringimento 100c tramite un flusso appositamente modulato all?interno della camera di sedimentazione 100 in modo da bilanciare l?azione gravitazionale, come indicato in Figura 7C. In questo modo la componente laterale dovuta alle linee di flusso generate dalla variazione di geometria del canale, agisce come spinta laterale, spostando in corpuscolo da una posizione laterale al tempo ta (420ta) a una posizione pi? centrale al tempo tb (420tb).
Per entrambe le soluzioni presentate il sistema di pompaggio 200 pu? essere azionato manualmente o in modo automatizzato.
In una forma di realizzazione della presente invenzione, il dispositivo di rilevamento 300 ? costituito da un dispositivo ottico che comprende un sistema di microscopia montato su di un supporto mobile. La risoluzione del dispositivo ottico ? atta ad acquisire immagini di tutti i corpuscoli di interesse, raggiungendo un livello di dettaglio sufficiente per elaborarne le dimensioni e la forma. Il supporto mobile ? guidato dal processore 500 per seguire il movimento del corpuscolo all'interno della camera di sedimentazione 100, in modo che la lunghezza di caduta osservata possa essere sufficientemente lunga da misurare abbastanza punti per ottenere un'elaborazione affidabile della velocit? terminale del corpuscolo 420. Allo stesso modo, in un'altra forma di realizzazione, il supporto mobile ? atto a spostare la camera di sedimentazione 100, in modo che il corpuscolo 420 rimanga all'interno del campo di lavoro del dispositivo di rilevamento 300.
In un'altra forma di realizzazione, il dispositivo di rilevamento 300 comprende un sistema ottico in grado di supportare diversi ingrandimenti. Questo si ottiene ad esempio tramite un asse ottico ad azionamento meccanico. Il processore 500 seleziona l'ingrandimento corretto per il corpuscolo specifico in esame, ed inoltre ? in grado di selezionare il giusto equilibrio tra risoluzione, per la misura delle propriet? geometriche del corpuscolo, e dimensione del campo visivo. Quest?ultimo dovr? essere sufficientemente ampio da permettere l?elaborazione della velocit? terminale del corpuscolo.
In un'altra forma di realizzazione, ? possibile selezionare l'ingrandimento corretto per misurare un corpuscolo specifico senza l'ausilio di parti mobili. In questa forma di realizzazione, la camera di sedimentazione comprende diversi canali di flusso ed il dispositivo di rilevamento monitora i diversi canali di flusso, ciascuno con un diverso ingrandimento. Prima della misura, il dispositivo di rilevamento riconosce il corpuscolo ed il processore ne gestisce l?introduzione all?interno del canale di flusso adeguato. Inoltre, l'architettura dei canali di flusso pu? essere realizzata in differenti configurazioni, al fine di soddisfare l'esigenza della diversit? corpuscolare. Si possono infatti variare dimensioni, sezioni trasversali e geometrie, con particolare attenzione per la lunghezza del canale. In questo modo, un corpuscolo di dimensioni maggiori viene inserito in un canale pi? lungo e viene monitorato ad una risoluzione inferiore per un campo visivo pi? ampio. Diversamente, un corpuscolo pi? piccolo viene inserito in un canale pi? corto e viene monitorato ad una risoluzione pi? elevata per un campo visivo pi? piccolo.
In una variante di questa particolare forma di realizzazione, il meccanismo per l'introduzione del corpuscolo nella camera di sedimentazione 100 ? un multiplexer fluidico. In un'ulteriore variante di questa forma di realizzazione (Figura 8), la camera di sedimentazione comprende diversi canali di flusso (ad esempio 110a, 110b e 110c) collegati a regolatori di flusso indipendenti (per esempio le valvole di apertura/chiusura 271a, 271b, 271c). Tutti i canali di flusso sono collegati in parallelo all'interno del dispositivo fluidico. In questo caso, il dispositivo di rilevamento 300 riconosce il corpuscolo prima che raggiunga la ramificazione, in uno specifico canale otticamente accessibile 150, e seleziona il canale di flusso in cui il corpuscolo verr? introdotto tramite il controllo sulle valvole. In un'altra variante di questa forma di realizzazione, l'operatore seleziona manualmente il canale di flusso utilizzato per la misurazione, operando su una valvola di selezione posizionata sul canale di ingresso 210.
Una strategia diversa per consentire la misura del movimento di corpuscoli particolarmente grandi consiste in un diverso metodo di localizzazione degli stessi, in cui il dispositivo di rilevamento 300 ? in grado di riconoscere il passaggio del corpuscolo 420 attraverso diverse posizioni target nella camera di sedimentazione 100. La distanza tra tali posizioni target, come anche la distanza complessiva coperta da tale sistema di localizzazione, pu? essere regolata in modo da determinare precisamente la velocit? terminale del corpuscolo. La velocit? terminale del corpuscolo ? quindi determinata dividendo la distanza percorsa per il tempo trascorso.
In un'implementazione tecnica di questo dispositivo, e del relativo metodo, il dispositivo di rilevamento 300 comprende diversi sistemi di riconoscimento d?immagine dedicati alle posizioni target della camera di sedimentazione 100. Quest?ultimi, oltre a contribuire alla misura della velocit? terminale, raccolgono informazioni sulla forma e sulle dimensioni del corpuscolo. In un?altra implementazione tecnica, il dispositivo di rilevamento 300 comprende una serie di sensori (ad esempio 315a, 315b e 315c nella Figura 9), che si trovano nelle posizioni target (per esempio 115a, 115b e 115c) della camera di sedimentazione 100, ed un sistema di riconoscimento di immagine indipendente 320 per la raccolta delle informazioni di forma e dimensione del corpuscolo 420.
Un'ulteriore strategia per consentire la misura del movimento di corpuscoli particolarmente grandi consiste nell'agire sulla densit? di massa e sulla viscosit? del mezzo d'analisi. Ad esempio, in una forma di realizzazione della presente invenzione, il sistema ? adattato ad ospitare un mezzo d'analisi 450, con una densit? di massa specifica per il tipo di corpuscoli analizzati 420, ed in particolare corrispondente alla densit? di massa media della popolazione dei corpuscoli (ad esempio 1035 fg/um3 nel caso di sferoidi SW620). Quindi, la forza totale che agisce sul corpuscolo, ovvero la somma delle forze gravitazionali ed idrostatiche, ? diretta verso il basso o verso l'alto a seconda della densit? di massa del corpuscolo. Di conseguenza, durante la fase di misura in assenza di flusso, i corpuscoli pi? densi del mezzo d'analisi tenderanno a muoversi verso il basso, viceversa per i meno densi.
In questa forma di realizzazione specifica, il processore 500 ed il relativo algoritmo di elaborazione sono adattati per calcolare la velocit? terminale discendente o ascendente. Inoltre, il sistema per la generazione di flusso 230 ? capace di promuovere un flusso all?interno della camera di sedimentazione 100 sia a favore che contrario al vettore gravitazionale.
Questo permette di spostare il campione nella direzione opposta rispetto alla sua velocit? terminale, consentendo quindi la ripetizione della misura. Allo stesso modo, in un'altra forma di realizzazione della presente invenzione, il sistema ? adattato ad ospitare un mezzo d'analisi 450 con elevata viscosit?, che diminuisce la velocit? terminale del corpuscolo.
In un'altra forma di realizzazione della presente invenzione, il dispositivo ? adattato a cambiare il mezzo d'analisi 450, con uno o pi? mezzi d'analisi 450 aventi densit? di massa diverse. L'architettura del dispositivo di questa implementazione ? la stessa architettura descritta nella Figura 2, in cui il sistema di pompaggio 200 ? adattato a selezionare il nuovo mezzo d'analisi da introdurre nel sistema. In questo caso, il dispositivo di rilevamento 300 misura la velocit? terminale del corpuscolo, ed attiva il sistema di pompaggio 300 per modificare il mezzo d'analisi in modo tale che la velocit? terminale del corpuscolo diminuisca. Questo protocollo pu? essere ripetuto fino a quando la velocit? terminale del corpuscolo risulta essere sufficientemente bassa per essere facilmente rilevabile e misurabile.
Nella precedente descrizione delle forme di attuazione della presente invenzione e di alcune sue implementazioni, sono stati descritti metodi e relativi strumenti per effettuare misure combinate di densit? di massa, peso, dimensioni e/o forma di un ampio insieme di corpuscoli sferici. Tuttavia, molti dei campioni biologici utilizzati nei campi biomedici, inclusi i campioni citati, possono presentare una certa deviazione dalla sfericit?. In particolare per sferoidi ed organoidi la sfericit? dipende principalmente dalla variabilit? locale della composizione, e/o dell'attivit? cellulare durante la formazione e la maturazione degli aggregati stessi. Le singole cellule possono avere lievi variazioni dalla forma sferica, dovute, ad esempio, all'architettura interna del citoscheletro, ad una pressione esterna irregolare della matrice extracellulare o alla presenza di strutture cellulari rigide. Pertanto, nei paragrafi seguenti vengono divulgate variazioni della presente innovazione che tengono conto dei casi in cui la forma tridimensionale dei corpuscoli si discosti dalla sfericit?.
A differenza del caso di un corpuscolo sferico, per il quale sono disponibili molti metodi ed algoritmi di rilevamento per calcolare il coefficiente di attrito in relazione al suo raggio, il caso di un corpuscolo non sferico risulta essere pi? complesso, e necessita della generalizzazione della teoria precedentemente discussa.
In particolare, le equazioni 1 e 2 si generalizzano nelle seguenti:
e
In questa forma, sia il coefficiente di attrito k che il volume Vp dipendono dalla forma e dall'orientamento del corpuscolo. Esiste una vasta letteratura su teorie che elaborano le caratteristiche geometriche di un oggetto per approssimare il coefficiente di attrito k. Tali caratteristiche geometriche possono essere l'ellitticit?, o il rapporto tra l?area superficiale di una sfera avente il medesimo volume del corpuscolo in esame e la superficie reale del corpuscolo stesso. Inoltre, il coefficiente di attrito k pu? essere teoricamente calcolato attraverso simulazioni di fluidodinamica computazionale, se la forma 3D completa del corpuscolo ? nota.
Pertanto, il termine "raggio" utilizzato nel contesto delle forme di attuazione della presente invenzione, includendo i paragrafi precedenti, ? inteso come raggio geometrico nel caso di un corpuscolo sferico. Tuttavia, il termine raggio ? da intendere come ?raggio efficace?, e pu? anche essere usato per intendere una caratteristica geometrica unidimensionale che rappresenta un corpuscolo quasi sferico o non sferico. Ad esempio, il termine raggio pu? essere inteso come la distanza media dei punti di superficie dal centroide, o anche come due volte il rapporto tra l'area bidimensionale rispetto al perimetro, o ancora come il raggio di Feret (perimetro diviso due volte pi greco).
Di conseguenza, come scritto in precedenza, i termini "forma" e "dimensione" utilizzati nel contesto delle forme di attuazione della presente invenzione sono intesi come qualsiasi descrizione geometrica del corpuscolo, che pu? essere utilizzata per rappresentare o approssimare la sua geometria bidimensionale o tridimensionale. Ad esempio, pu? essere inteso come misura del raggio, nel caso di un corpuscolo sferico, o misura di altre caratteristiche geometriche nel caso di corpuscoli quasi sferici e non sferici.
Inoltre, di conseguenza, il termine "densit? di massa" o semplicemente "densit?", usato nel contesto delle forme di attuazione della presente invenzione, ? inteso come il rapporto tra la massa ed il volume nel caso di un corpuscolo sferico. Tuttavia, questi termini possono anche essere usati per intendere la "densit? di massa efficace", la quale include, oltre la definizione di densit? precedentemente descritta, anche le variazioni dipendenti da fattori di forma, come ellitticit? e rugosit? superficiale nel caso di particelle quasi sferiche e non sferiche.
Allo stesso modo, il termine "peso" utilizzato nel contesto delle forme di attuazione della presente invenzione ? inteso come massa gravitazionale nel caso di un corpuscolo sferico. ? invece inteso come "peso efficace" nel caso di corpuscoli non sferici o quasi sferici. Analogamente a quanto descritto per il termine "densit? di massa", il termine "peso efficace" comprende variazioni che dipendono da fattori di forma quali ellitticit? e rugosit? superficiale.
Come descritto precedentemente in diverse forme di attuazione della presente invenzione, l?esecuzione di diverse misure dello stesso corpuscolo permette di aumentare l'affidabilit? dei risultati. Nel caso di corpuscoli sferici, la distribuzione statistica ottenuta ? correlata esclusivamente all'incertezza di misura. Diversamente, per corpuscoli quasi sferici e non sferici, la distribuzione sperimentale della misurazione della velocit? terminale, pu? essere utilizzata per descrivere le dimensioni e la forma di un corpuscolo. In una variante di questa forma di realizzazione, la deviazione standard della velocit? terminale pu? essere utilizzata come parametro per determinare l'ellitticit? corpuscolare. Questa informazione ? rilevante, ad esempio, per la generazione e la selezione di sferoidi uniformi, da utilizzare come modello per lo sviluppo di farmaci. Nelle diverse varianti di questa forma di realizzazione, l'asimmetria della distribuzione dei dati ottenuti dalle misure pu? essere correlata a fattori geometrici di simmetria, l?indice di curtosi pu? essere correlato all'eterogeneit? della forma, e la multimodalit? pu? essere correlata alla distribuzione delle proiezioni bidimensionali del corpuscolo.
In un'ulteriore implementazione delle forme di attuazione della presente invenzione, le immagini del corpuscolo vengono elaborate per ottenerne la ricostruzione tridimensionale, ad esempio, tramite l?utilizzo di algoritmi tomografici. Tale ricostruzione pu? essere quindi elaborata da strumenti computazionali per il calcolo del coefficiente di attrito. Questo approccio migliora la misura del valore assoluto della densit? di massa per corpuscoli quasi sferici e non sferici.
In particolare, possono essere adottate diverse implementazioni tecnologiche per ottenere la ricostruzione della forma 3D del corpuscolo o per migliorarne la caratterizzazione morfologica.
In una specifica implementazione della forma di attuazione della presente invenzione, il dispositivo di rilevamento 300 include un sistema a doppia fotocamera (Figura 10). L?orientamento delle fotocamere, perpendicolari tra loro rispetto alla camera di sedimentazione 100, garantisce l?acquisizione delle immagini del corpuscolo da due angolazioni differenti. Tali immagini vengono quindi elaborate dal processore 500, per ottenere il modello 3D.
Diversamente, nel caso dell?utilizzo di un singolo sistema di acquisizione d?immagini, ? possibile adottare diverse strategie ottiche, fluidiche o meccaniche. Ad esempio, in un'altra implementazione delle forme di attuazione della presente invenzione, il dispositivo fluidico include al suo interno due specchi ottici 113 e 114, in prossimit? delle pareti posteriori della camera di sedimentazione 100, ed aventi un'inclinazione prestabilita rispetto al dispositivo di rilevamento 300 (Figura 11). La fotocamera frontale mantiene il piano focale tale da includere le immagini riflesse del corpuscolo 430 e 440 ottenute rispettivamente dagli specchi 113 e 114. Tramite tale implementazione, ? possibile raccogliere contestualmente immagini da diverse prospettive spaziali del corpuscolo ed utilizzarle per la ricostruzione 3D dello stesso.
In un'altra implementazione delle forme di attuazione della presente invenzione, il dispositivo ? adattato ad acquisire stack di immagini del corpuscolo 420. In tale implementazione il dispositivo di rilevamento 300 ? composto da almeno una fotocamera, in cui il piano di fuoco viene regolato per consentire la scansione del corpuscolo tramite l'acquisizione di immagini multiple. Tali immagini raccolte possono essere elaborate dal processore 500 tramite l'applicazione di filtri di immagine come ad esempio la deconvoluzione, per effettuare la ricostruzione 3D del corpuscolo. Ulteriori forme di realizzazione della ricostruzione 3D del corpuscolo, come altre tecniche di stack di immagini, microscopia olografica o microscopia light-sheet, possono essere implementate.
In un'ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, il dispositivo di rilevamento 300 ? composto da un sistema di acquisizione d?immagini che orbita intorno alla camera di sedimentazione 100, come rappresentato nella Figura 12. In una specifica implementazione di questa forma di realizzazione, la camera di sedimentazione 100 ? cilindrica. Ci? consente di acquisire immagini da diverse angolazioni del corpuscolo che vengono poi processate, tramite una ricostruzione tomografica, per la ricostruzione 3D della sua morfologia. In questa specifica implementazione, sono utilizzati dei segni di riferimento in prossimit? della camera di sedimentazione 100 per diminuire l?incertezza nella misura della posizione del corpuscolo 420 introdotta dalla rotazione del dispositivo di rilevamento 300. La medesima strategia pu? essere utilizzata per ridurre al minimo le incertezze introdotte in qualsiasi altra implementazione che includa parti mobili del sistema di rilevamento 300. In una variante di questa forma di realizzazione, il dispositivo di rilevamento rotante 300 ? adattata per spostarsi verticalmente e seguire il movimento del campione in correlazione con la sua velocit? terminale. Le implementazioni e i metodi qui sopra riportati adottano tecnologie note, riarrangiate per l'ottenimento della ricostruzione 3D del corpuscolo. Ci? nonostante, altre soluzioni esistenti ma non riportate in questo documento possono essere combinate con le forme di attuazione della presente invenzione.
I paragrafi precedenti hanno descritto il metodo, la tecnologia e la modalit? di utilizzo principale dell'invenzione. Tuttavia, diverse modalit? di utilizzo dell?invenzione verranno qui riportate al fine di dimostrare ulteriori vantaggi della stessa.
Per esempio, alcune alternative possono riguardare: le misure combinate di popolazioni di corpuscoli, importati per le analisi high throughput (aumento del volume di dati prodotti); la coltura e l?analisi prolungata nel tempo del corpuscolo, rilevante per applicazioni come i test farmacologici; e lo smistamento dei corpuscoli, rilevante per le applicazioni mediche o per le standardizzazioni di modelli biologici.
Le analisi high throughput, ottenute da studi eseguiti su un numero elevato di corpuscoli singoli, o su popolazioni, sono estremamente importanti nei campi biologici. Ad esempio, informazioni come l'eterogeneit? della popolazione in esame, consentono di comprendere il comportamento specifico delle sottopopolazioni presenti all?interno del campione biologico. Tale comportamento infatti tende spesso ad avere una variazione notevole da quello medio dell'intera popolazione, e diventa un importante fattore d?analisi discriminatorio. Al giorno d'oggi, gli strumenti per la misura di densit? di massa, peso, dimensioni e forma di ciascun corpuscolo della popolazione non sono disponibili sul mercato.
L?invenzione propone la soluzione a questa lacuna nello stato dell?arte, permettendo inoltre l'estrapolazione dei dati necessari per l'analisi statistica della popolazione corpuscolare in generale tramite un?implementazione del dispositivo fluidico dove i dati di corpuscolo che il processore 500 riceve dal sistema di rilevamento 300 sono relativi a una moltitudine di corpuscoli, e comprendono almeno uno tra velocit?, forma, posizione, e dimensione di pi? di un corpuscolo. Una specifica forma di attuazione sfrutta il medesimo schema descritto in Figura 2, dove sistema di rilevamento 300 ? composto da un sistema di microscopia, collegato al processore 500. Questa implementazione consente la misura concomitante di densit? di massa, peso, dimensione e forma di ciascun corpuscolo della popolazione. Analogamente al modo d'uso principale precedentemente descritto, i corpuscoli 420 contenuti nel mezzo d'analisi 450, vengono raccolti dal serbatoio 400 ed introdotti attraverso il canale d?ingresso 210 del sistema di pompaggio 200. Il sistema per la generazione di flusso 230 viene attivato per guidare i corpuscoli nella camera di sedimentazione 100, il flusso viene successivamente fermato e l'analisi viene effettuata durante la caduta dei corpuscoli per gravit?. In questa specifica modalit? di utilizzo, il dispositivo di rilevamento 300 ? adattato per monitorare simultaneamente ogni corpuscolo 420 presente all?interno della camera di sedimentazione 100 durante la misura. La velocit? terminale e la dimensione di ogni singolo componente della popolazione, sono calcolate indicizzando ciascun corpuscolo 420 monitorato all'interno della camera di sedimentazione 100. In questo modo, le distribuzioni di densit? di massa, peso, dimensione e forma della popolazione vengono estrapolate dopo diverse ripetizioni della misura, mentre le informazioni su ciascun corpuscolo vengono comunque mantenute.
In un'altra implementazione, un volume maggiore di dati ? ottenuto tramite particolari geometrie della camera di sedimentazione 100. Nonostante nei dispositivi illustrati nelle figure la camera di sedimentazione 200 o i canali di flusso 110 compresi in essa siano rettilinei e non presentino curve, la camera di sedimentazione 200 pu? alternativamente avere una geometria anche curvilinea. In questa forma di realizzazione, la camera di sedimentazione pu? ad esempio comprendere un singolo canale avente un?architettura a serpentina, in modo tale che diverse sue porzioni verticali, nelle quali avviene l?analisi, possano essere monitorate dal dispositivo di rilevamento 300. L'high throughput, applicato alle forme di attuazione della presente invenzione, consente di estrapolare dati importanti come la distribuzione statistica della popolazione corpuscolare analizzata. Ad esempio, una distribuzione normale (o gaussiana), fornisce indicazioni sull'omogeneit? della popolazione. L'analisi della deviazione standard di tale distribuzione, pu? quindi essere rilevante per definire la qualit? di un campione. Questo ? importante ad esempio nel caso di banche dati cellulari, le quali possono certificare la qualit? dei campioni disponibili. Diversamente, una distribuzione bimodale o multimodale pu? identificare la presenza di diverse sottopopolazioni o categorie. Ad esempio, pu? fornire informazioni sulle varie linee cellulari presenti in una popolazione eterogenea, oppure pu? distinguere le cellule che si trovano in differenti fasi del ciclo di vita cellulare, nel caso di popolazioni omogenee. Inoltre, considerando ancora il caso di una popolazione omogenea sottoposta a trattamento farmacologico, una differenza nella distribuzione statistica da normale a bi- o multi- modale, pu? discriminare ad esempio la permeazione del farmaco e/o la sua efficacia.
Un altro aspetto dell'invenzione mira ad evitare lo spreco del mezzo di analisi, tramite un dispositivo in grado di mantenere il corpuscolo sospeso all'interno della camera di sedimentazione, attraverso un sistema fluidico a circolo chiuso. Ci? ? particolarmente importante per le applicazioni che adottano costosi mezzi d?analisi, come ad esempio durante le lunghe fasi di caratterizzazione dei farmaci precedenti la commercializzazione.
Un?ulteriore implementazione della presente innovazione ? legata alla coltura e all'analisi simultanea di singole cellule o aggregati cellulari nel tempo. Tale aspetto ? di forte interesse nell?ambito biomedico e clinico. Ad esempio, il monitoraggio delle variazioni delle propriet? fisiche dei campioni durante il trattamento con farmaci ? utile in campo farmacologico per applicazioni quali medicina personalizzata, oncologia e procreazione medicalmente assistita.
Questa implementazione consiste in un dispositivo e nel rispettivo metodo per la misura di densit? di massa, peso, dimensioni e/o forma di un corpuscolo per un periodo di tempo desiderato, fino a diverse settimane. Inoltre la metodica ? non distruttiva, e il corpuscolo specifico selezionato per l'analisi pu? essere opportunamente recuperato successivamente all?analisi per ulteriori indagini.
Nonostante nei dispositivi fluidici illustrati nelle figure 2 e 3, i sistemi di pompaggio 200 sono lineari, il sistema di pompaggio 200 pu? comprendere anche uno o pi? sistemi per il ricircolo di liquido, ed uno o pi? sistemi per la generazione di un flusso per la circolazione del liquido all?interno del sistema di pompaggio 200 e della camera di sedimentazione. In una specifica implementazione, rappresentata in Figura 13, il sistema di pompaggio 200 comprende un ulteriore canale di ricircolo 250 ed un sistema di pompaggio secondario, qui chiamato dispositivo di ricircolo 240 (Figura 13). Il protocollo di introduzione del corpuscolo nel dispositivo fluidico ? simile a quello precedentemente descritto. Un corpuscolo 420, contenuto nel mezzo d'analisi 450, viene estratto dal serbatoio 400 ed introdotto nel sistema di pompaggio 200 attraverso il canale d?ingresso 210. Il sistema per la generazione di flusso 230 viene attivato per introdurre nella camera di sedimentazione 100 il corpuscolo, che viene monitorato dal dispositivo di rilevamento 300. Il sistema di pompaggio 200 comprende inoltre un canale di ricircolo 250 collegato circolarmente con la camera di sedimentazione e un dispositivo di ricircolo 240 (Figura 13), che viene attivato dal processore 500 per mantenere il corpuscolo all'interno della camera di sedimentazione 100, attraverso la generazione di un flusso circolare controllato sulla base dei dati di corpuscolo ricavati dal sistema di rilevamento 300. Il canale di ricircolo 250 consente il riciclo del mezzo d?analisi, con il vantaggio di ridurre al minimo il dispendio dello stesso.
Un'implementazione delle forme di attuazione della presente invenzione consente di misurare la densit? di massa, il peso, le dimensioni e la forma del corpuscolo prima e dopo la sostituzione del mezzo d'analisi principale 450 con uno o pi? mezzi d'analisi differenti 451. In questa implementazione il sistema di pompaggio 200 comprende inoltre uno o pi? canali secondari collegati fluidicamente alla camera di sedimentazione 100 per l?introduzione o la rimozione di liquidi e/o corpuscoli da uno o pi? serbatoi aggiuntivi. I canali secondari possono essere collegati direttamente alla camera di sedimentazione 100, oppure possono essere collegati tramite un canale di ingresso o tramite un circuito fluidico secondario. Una specifica implementazione di questa forma di attuazione adotta una variazione del dispositivo fluidico descritto dalla Figura 2. Il corpuscolo 420 viene introdotto e mantenuto sospeso all'interno del primo mezzo d'analisi 450, nella camera di sedimentazione 100, attraverso il sistema di pompaggio 200. In questa implementazione, il sistema di pompaggio 200 comprende un canale secondario per cambio buffer 260 (Figura 14), collegato ad un secondo serbatoio 401 che contiene il nuovo mezzo d'analisi 451. Il sistema permette l?introduzione del nuovo mezzo d'analisi 451 all'interno della camera di sedimentazione 100 attraverso il canale secondario per cambio buffer 260. Il corpuscolo viene mantenuto all'interno della camera di sedimentazione 100 durante la sostituzione del mezzo d?analisi principale 450. Questa procedura, ripetuta alcune volte, porta allo scambio completo tra i mezzi di analisi sia nella camera di sedimentazione 100 che nel canale di ricircolo 250. In una specifica variante di questa forma di realizzazione, la giunzione tra il canale secondario per cambio buffer 260 ed il canale di ingresso 210 ? una valvola di selezione 270. In un?altra variante di questa forma di realizzazione, il sistema ? adattato per attingere da un serbatoio 401 che contiene il nuovo mezzo d'analisi 451 tramite lo stesso canale d?ingresso 210 attraverso il quale si introduce il corpuscolo, tramite sostituzione manuale o automatizzata del serbatoio 400. In una ulteriore variazione di questa implementazione, il sistema di pompaggio 200 comprende il canale secondario per cambio buffer 260 (Figura 14), il canale di ricircolo 250, ed il sistema di ricircolo 240 (Figura 13). Questa implementazione permette di effettuare misure di densit? di massa, peso, dimensione e/o forma del corpuscolo, durante periodi di tempo anche lunghi diversi giorni o settimane, durante i quali ? possibile effettuare cambi del liquido nel quale il corpuscolo viene mantenuto e analizzato. La combinazione di queste modalit? di utilizzo pu? infatti risultare vantaggiosa per diverse applicazioni. Ad esempio, il corpuscolo pu? essere trattato per un lungo periodo di tempo mentre si eseguono frequenti cambi del mezzo d'analisi. Cos? facendo, durante ogni sostituzione ? possibile introdurre un secondo liquido che possiede caratteristiche differenti dal precedente, ad esempio piccole variazioni nella concentrazione di un farmaco per l'analisi della sua tossicit?. Diversamente, il trattamento pu? essere pi? intenso, introducendo un secondo mezzo d'analisi che abbia caratteristiche significativamente diverse dal primo, e quindi monitorando la reazione del corpuscolo a tale variazione. In una forma di realizzazione della presente invenzione, uno stesso corpuscolo viene analizzato quando sottoposto ad una sequenza di mezzi d'analisi con differente forza ionica. Tramite questa forma di realizzazione, ? possibile misurare l'effetto della forza ionica sul corpuscolo 420. In alcuni modi d?uso, l'utilizzo del mezzo d'analisi corretto ? un aspetto critico per l'implementazione tecnica di questa forma di realizzazione: se il corpuscolo ha una membrana semipermeabile (ad esempio se ? una singola cellula o uno sferoide), un mezzo d'analisi isoosmotico (ad esempio PBS 0.9% p/v per cellule) consente di misurare la densit? di massa naturale del corpuscolo. In una diversa forma di realizzazione della presente invenzione, il mezzo d'analisi non ? iso-osmotico con il corpuscolo e l'influenza della forza ionica sul corpuscolo pu? essere misurata.
In una diversa forma di realizzazione della presente invenzione, la sequenza di mezzi d'analisi utilizzati per trattare il corpuscolo 420, pu? contenere un farmaco, o un altro composto biologicamente attivo, che pu? influenzarne la dimensione, il volume, la densit? di massa e/o il peso. In tal caso, il sistema misura l'effetto del composto sulla cellula, sullo sferoide o sull?organoide. Un potenziale risultato del monitoraggio della densit? di massa e della dimensione dei campioni vivi, ? riportato in una rappresentazione grafica mostrata nella Figura 15. Qui, il corpuscolo ? considerato avente geometria sferica, e la sua dimensione ? riportata in grafico come diametro. L'esempio presentato mira al riconoscimento dello stadio di maturazione dello sferoide, ed il tempo necessario alla sua interazione con il farmaco. In questo grafico esemplificativo, il corpuscolo cresce sia in diametro che in densit? di massa, fino al raggiungimento del tempo T1. Successivamente si osserva la stabilizzazione del diametro, malgrado la densit? continui ad aumentare. Questo indica una fase di compattazione fino al tempo T2, momento in cui anche la densit? raggiunge il plateau, in cui lo sferoide si trova in una condizione di maturit? ideale per il cambio del mezzo di analisi. Il tempo T3 rappresenta il momento relativo all?introduzione di un farmaco, e l?andamento successivo ne mostra il suo effetto. Questa procedura offre la possibilit? di osservare e confrontare la variazione di densit? e diametro nel tempo e di raccogliere dettagli preziosi sull'interazione del corpuscolo con il farmaco.
Una variante di questa forma di realizzazione riguarda la combinazione di coltura ed analisi del corpuscolo a lungo termine, con una soluzione per il cambio del mezzo d'analisi. Infatti, un ulteriore aspetto importante della ricerca scientifica riguarda la possibilit? di monitorare un campione durante le variazioni del suo ambiente circostante, come pH, forza ionica, variazione dei fattori di crescita nel terreno di coltura, o durante trattamenti specifici con agenti farmacologici e/o chimici.
Un'ulteriore modalit? di utilizzo della forma di attuazione della presente invenzione permette il Sorting di corpuscoli, ovvero l'organizzazione e lo smistamento di sottopopolazioni di corpuscoli. Questa operazione ? importante in campo biomedicale in quanto consente la raccolta di sottopopolazioni di corpuscoli in base a specifiche propriet? o caratteristiche geometriche. Il Sorting cellulare ? comunemente usato in medicina, in farmacologia e nella ricerca scientifica in generale. Le sue applicazioni abbracciano ad esempio i campi della medicina rigenerativa e della medicina personalizzata, come anche quelli della terapia antitumorale o della virologia. I metodi attuali per il Sorting cellulare, basano la selezione dei campioni su fattori quali la presenza di marcatori proteici, o specifiche interazioni biochimiche. Attualmente per?, non esiste una tecnologia in grado di selezionare ed ordinare un'ampia gamma di campioni in base a densit? di massa, peso, dimensione e forma. Pertanto, un'altra implementazione della presente invenzione riguarda un metodo, e relativo dispositivo, per lo smistamento selettivo dei corpuscoli in base alla misura concomitante di queste propriet?.
In una specifica realizzazione di tale implementazione, la camera di sedimentazione 100 include una biforcazione che la collega a un canale di recupero 120 a sua volta fluidicamente collegato ad una specifica porzione del sistema di pompaggio 200, qui chiamato canale secondario per Sorting 280 (Figura 16). Sia il canale di ingresso 210 che il canale secondario per Sorting 280 sono controllati da un regolatore di flusso, come ad esempio le valvole 270 e 290. In questa implementazione, un corpuscolo 420 viene introdotto nella camera di sedimentazione 100 attraverso il canale di ingresso 210 mentre la valvola 290 ? chiusa e la valvola 270 viene mantenuta aperta. Una volta terminata la misurazione del corpuscolo secondo quanto descritto nelle implementazioni precedenti, i risultati vengono valutati per il Sorting del campione in base ai valori di densit? di massa, peso, dimensioni e forma. Il corpuscolo selezionato viene quindi raccolto tramite l?attivazione del sistema di pompaggio 200, mentre la valvola 270 ? chiusa e la valvola 290 viene mantenuta aperta per permettere il passaggio del corpuscolo attraverso il canale di recupero 120 ed il canale secondario per Sorting 280, per raggiungere infine il serbatoio 700 (Figura 16).
In una variante della presente realizzazione, il corpuscolo viene selezionato ed ordinato esclusivamente in base alla sua densit? di massa. Questo ? rilevante per la diminuzione della disomogeneit? di test scientifici, permettendo ad esempio la selezione e raccolta di una sottopopolazione di sferoidi aventi un simile grado di compattazione. In un'altra variante della presente forma di realizzazione, ? possibile combinare pi? parametri misurati per la selezione dei corpuscoli raccolti. Ad esempio, caratteristiche come la deviazione standard del diametro misurato e della velocit? terminale, possono essere utilizzate per ordinare corpuscoli in base al loro grado di sfericit?. Questa specifica applicazione potrebbe essere rilevante per testare la diffusione dei farmaci su diversi lotti omogenei di sferoidi, e potrebbe fornire informazioni sul tempo necessario al farmaco per raggiungere il nucleo. Questa stessa applicazione potrebbe anche fornire informazioni sul livello di concentrazione del farmaco richiesto per attraversare efficientemente un certo numero di strati cellulari, come anche per effettuare studi sulla sua tossicit?.
In ulteriori variazioni della presente forma di realizzazione, i parametri ed i valori limite da utilizzare per il Sorting, potrebbero ad esempio essere definiti dall'utente, o essere estratti da banche dati; o ancora potrebbero essere definiti automaticamente da un algoritmo non supervisionato che possa ordinare famiglie simili di corpuscoli all'interno di popolazioni.
Un ulteriore aspetto dell?innovazione riguarda l?importanza della traslazione dal processo di utilizzo manuale verso quello automatizzato, in particolare quando si passa dall'uso da laboratorio ad applicazioni mediche ed industriali su larga scala. L?invenzione presentata ? concepita in modo tale da essere facilmente automatizzata tramite l?utilizzo di dispositivi esistenti, grazie al basso numero di componenti hardware. Tali componenti possono inoltre essere facilmente miniaturizzati con tecnologie esistenti.
Claims (13)
- DISPOSITIVO FLUIDICO PER ANALISI DI CORPUSCOLI E RELATIVO METODO RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo fluidico per la misura di almeno uno tra densit? di massa e peso di un corpuscolo, dove detto dispositivo fluidico comprende: una camera di sedimentazione fluidicamente collegata a un canale d?ingresso, dove detto canale d?ingresso ? configurato per essere immerso in un liquido; un sistema di pompaggio collegato alla camera di sedimentazione, dove detto sistema di pompaggio ? adatto a controllare il flusso del liquido nella camera di sedimentazione; un processore configurato per: ottenere dati di corpuscolo relativi a un corpuscolo in almeno una regione della camera di sedimentazione, e calcolare almeno una tra densit? di massa e peso del corpuscolo sulla base dei dati ricevuti.
- 2. Il dispositivo fluidico secondo la rivendicazione 1, comprendente inoltre almeno un dispositivo di rilevamento configurato per acquisire i dati di corpuscolo e per fornire al processore i dati di corpuscolo.
- 3. Il dispositivo fluidico secondo la rivendicazione 1 o 2, dove il processore ? configurato per controllare il sistema di pompaggio sulla base di almeno una parte dei dati di corpuscolo ricevuti.
- 4. Il dispositivo fluidico secondo almeno una delle rivendicazioni dalla 1 alla 3, dove i dati di corpuscolo comprendono almeno uno tra velocit?, forma, posizione, dimensione del corpuscolo.
- 5. Il dispositivo fluidico secondo almeno una delle rivendicazioni dalla 1 alla 4, comprendente inoltre un dispositivo di controllo di temperatura, configurato per fornire al processore una misura di temperatura di un liquido nella camera di sedimentazione; dove il processore ? configurato per calcolare almeno una tra la densit? di massa e il peso del corpuscolo anche sulla base di detta misura di temperatura.
- 6. Il dispositivo fluidico secondo la rivendicazione 5, dove il dispositivo di controllo temperatura ? inoltre configurato per regolare la temperatura del liquido nella camera di sedimentazione sulla base di almeno una tra informazioni fornite dal processore e un valore predefinito di temperatura.
- 7. Il dispositivo fluidico secondo almeno una delle rivendicazioni dalla 1 alla 6, comprendente inoltre un supporto mobile adatto ad alloggiare almeno una parte dell?almeno un dispositivo di rilevamento, dove il processore ? inoltre configurato per guidare il supporto mobile sulla base di almeno una parte dei dati di corpuscolo ricevuti.
- 8. Il dispositivo fluidico secondo almeno una delle rivendicazioni dalla 1 alla 7, dove la camera di sedimentazione comprende un canale di flusso avente una sezione trasversale interna variabile, tale da permettere al sistema di pompaggio di indurre flussi nella camera di sedimentazione aventi componente orizzontale non nulla.
- 9. Il dispositivo fluidico secondo almeno una delle rivendicazioni dalla 1 alla 8, dove la camera di sedimentazione comprende canali di flusso collegati in parallelo tra loro e al canale di ingresso, dove ogni canale di flusso ? inoltre collegato a un regolatore di flusso, dove il processore ? configurato per ricevere dati di ingresso relativi a un corpuscolo nel canale d?ingresso, e controllare i regolatori di flusso sulla base di detti dati di ingresso.
- 10. Il dispositivo fluidico secondo almeno una delle rivendicazioni dalla 1 alla 9, dove il sistema di pompaggio comprende un canale di ricircolo collegato in parallelo alla camera di sedimentazione, dove detto canale di ricircolo comprende un dispositivo di ricircolo, e dove il processore ? configurato per controllare detto dispositivo di ricircolo per il ricircolo del liquido nella camera di sedimentazione.
- 11. Il dispositivo fluidico secondo almeno una delle rivendicazioni dalla 1 alla 10, dove il sistema di pompaggio comprende inoltre un canale secondario collegato fluidicamente alla camera di sedimentazione, dove il processore ? configurato per controllare selettivamente il flusso nel canale secondario per immettere liquido nella camera di sedimentazione e/o per espellere liquido dalla camera di sedimentazione attraverso il canale secondario.
- 12. Metodo per la misura di almeno uno tra densit? di massa e peso di un corpuscolo, detto metodo comprendente: immettere un corpuscolo da analizzare in un una camera di sedimentazione di un dispositivo fluidico attraverso un canale d?ingresso immerso in un liquido; ottenere dati di corpuscolo, dove detti dati di corpuscolo sono relativi a un corpuscolo in almeno una regione della camera di sedimentazione, dove detto corpuscolo ? in movimento in un liquido a riposo nella camera di sedimentazione, e calcolare almeno una tra densit? di massa e peso del corpuscolo sulla base dei dati ricevuti.
- 13. Il metodo secondo la rivendicazione 12, comprendente inoltre: selezionare un corpuscolo sulla base di uno tra densit? di massa, peso, dimensione e forma; e raccogliere il corpuscolo selezionato in un contenitore predefinito sulla base di almeno uno tra densit? di massa, peso, dimensione e forma del corpuscolo.
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