CN104568857A - 一种新型二维光散射静态细胞仪方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型二维光散射静态细胞仪方法及装置，包括激光光源，所述激光光源依次与中性密度滤光片及光学透镜及光纤耦合系统相连，光学透镜及光纤耦合系统调整激光，使光纤作为激发静态细胞及微粒样品安放装置上静态细胞及微粒的探针，静态细胞及微粒样品安放装置与二维光散射图样探测记录系统相连，二维光散射图样探测记录系统记录被测细胞及微粒的二维光散射图样并将该图样传送至分析系统。发明可实现细胞及微粒的高精度分析，克服了传统光学显微镜以及流式细胞仪在高精度分析方面操作复杂、仪器昂贵的问题，可广泛适用于大部分实验室。

Description

一种新型二维光散射静态细胞仪方法及装置

技术领域

本发明涉及生物技术、生物医药、医疗器械以及环境与安全等领域。具体说来，本发明利用免标记、免微流控的一种易普及、高性能的二维光散射静态细胞仪实现对单细胞或者微粒的高精度分析，预期在生物医药以及环境与安全等领域有重要应用。

背景技术

众所周知，光学显微镜在细胞以及微粒分析方面具有广泛应用。对于常规光学显微镜，其放大倍数主要取决于所配置的物镜。一般说来，物镜可放大4，10，20，40，60以及100倍，而要实现高分辨率测量，比如亚微米以及纳米尺度测量，通常需要使用较大倍数的光学物镜，但较大的放大倍数又会限制该物镜相应的工作距离以及视场面积，造成聚焦操作以及样本观测等方面的局限性。而且，由于光学衍射极限的限制，常规光学显微镜的最高分辨率约为300纳米。近年研究开发的近场光学显微镜以及随机光学重建显微镜，可实现数十纳米精度的光学分辨率，但其与常规光学显微镜存在很大差别，且仪器价格昂贵、操作复杂，一定程度了限制了该类技术的推广与应用。

流式细胞术利用激光光束激发处于流动状态中的单列细胞或微粒，然后对其散射光或荧光进行探测，可实现单细胞或微粒的逐个、多参数、快速定性以及定量分析。已知散射光不依赖于细胞样品的制备技术，可反映细胞的物理参数；前向小角度的光散射信号(forwardscatter,FSC)能够反映细胞体积的大小，而侧向90°方向的光散射信号(side scatter,SSC)对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，反映了细胞内精细结构和颗粒性质的信息。流式细胞仪主要由四大模块组成：流动室与液流系统、光源与光学系统、信号收集与信号转换系统、计算机与分析系统；具有分选功能的流式细胞仪还包括分选系统。细胞仪操作过程中，需将待测细胞经特殊染料进行荧光染色并制成细胞悬液，之后在液流压力的作用下从样品管射出，同时鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周，从而使细胞悬液在鞘液流的包裹下形成单行排列，且依次通过流动室的检测区域。另外，以激光作为激发光源，使其垂直照射在检测区域的样品流上，当携带荧光素的细胞与激光正交时，就产生了散射光和激发荧光，它们同时被前向探测器和侧向90°方向的探测器接收。这些光信号转化成电信号，由放大器放大后，被传送到计算机，经A/D转换器传输到微机处理器形成数据文件，然后进行相应的数据处理和分析，最终达到对细胞分类识别的目的。

若要完成细胞分选，需事先选定某个参数，用于判断该细胞是否被分选:由喷嘴射出的液柱在压电晶体几十千赫兹的电信号作用下发生振动而均匀断裂，形成了一连串的小水滴，根据选定的参数由逻辑电路判断是否将被分选，而后由充电电路对选定的细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，从而落入不同的收集容器中，完成细胞的分选。

以上方法与装置的问题在于：

(1)由于衍射极限的限制，传统的光学显微镜用于细胞及微粒分析时的最高分辨率约在300nm，而此时其对物镜的数值孔径有较高的要求，如需使用100倍的油浸式物镜；

(2)传统的细胞分析装置如流式细胞仪，通过前向散射光信息来分析细胞尺寸，但存在其分析精度低、不能明确的识别细胞尺寸的问题；

(3)由于流式细胞仪的激发光路是固定的，一般与细胞悬液的轴心正交，这就要求细胞必须在流经激光聚焦区时不能偏离其轴心，且不能聚集成团、阻塞管路，否则光束无法准确照射细胞中心，造成信号不稳定，影响测量结果的准确性。这需要复杂、昂贵的流体控制技术，如水动力聚焦技术，不太适用于大部分的实验室；

(4)使用不同孔径的喷孔及改变液流速度都会影响细胞分析和分选效果，并且从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，延迟时间的精确测定也是影响分选质量的关键，这造成了流式细胞仪操作使用的复杂性；

(5)传统扫描流式细胞仪只测量方位角一维光散射，由于存在细胞形状任意性和细胞轴向问题，在固定角度得到的一维散射光谱会丢失很多信息；

(6)流式细胞仪检测需要对被测细胞进行特殊染料的荧光染色或标记，这些标记会对细胞产生一定的损伤，影响细胞活性；

(7)传统流式细胞仪的电磁场细胞分选对生物活体会产生一定影响。

折射率是一个表征物质光学性质的基本物理量，对其进行测量对于我们理解生物细胞等的光学性质具有重要意义。目前通常利用折射率定律进行折射率的测量，即折射角的正弦与入射角的正弦之比等于入射光所在介质的折射率与折射光所在介质的折射率之比，主要方法包括精密测角仪法、V棱镜折射仪法、阿贝折射仪法和浸液法。这些测量方法通常需要复杂的光路系统，且对被测样品的大小及形状有较高的要求，这在一定程度上限制了其应用，特别是在细胞及微粒折射率测量上的应用。

总之，现有的细胞仪器存在一定的局限性，亟需一种新型的二维光散射静态细胞仪方法及装置。

发明内容

为解决现有技术存在的不足，本发明公开了一种新型二维光散射静态细胞仪方法及装置，可实现对细胞以及微粒的高精度分析，达到亚微米以及纳米精度，以及进行折射率的测量。该发明具备操作简单、易普及等特性，具有重要的实际应用价值。

为实现上述目的，本发明的具体方案如下：

一种新型二维光散射静态细胞仪装置，包括激光光源，所述激光光源依次与中性密度滤光片及光学透镜及光纤耦合系统相连，光学透镜及光纤耦合系统调整激光，使光纤作为激发静态细胞样品安放装置上静态细胞的探针，静态细胞样品安放装置与二维光散射图样探测记录系统相连，二维光散射图样探测记录系统记录被测细胞的二维光散射图样并将该图样传送至分析系统。

所述光学透镜及光纤耦合系统包括第一物镜，第一物镜与光纤耦合器相连，所述光纤耦合器与第一三维位移台相连，所述第一三维位移台通过光纤与第二三维位移台相连。

所述激光光源发出的光依次穿过中性密度滤光片及第一物镜。

所述静态细胞样品安放装置，用于固定被测细胞样品，形成单细胞薄层，包括两片载玻片、两片盖玻片和显微镜三维载物台，其中一个载玻片两端分别放置一片盖玻片，中间滴入样品，之后在上面盖上另一片载玻片，构成微通道，控制好样本单细胞浓度，形成单细胞薄层。

所述二维光散射图样探测记录系统，用于记录被测细胞的二维光散射图样，包括第二物镜和CMOS探测器，通过第二物镜监测光纤探针的移动，移动光纤探针定位芯片中的细胞，保证激光垂直照射细胞，被测细胞被激光激发，形成分布于三维空间的散射光，散射光经过第二物镜后，被CMOS探测器探测并收集。

所述激光光源采用二极管泵浦固体激光器，用于提供静态细胞样品安放装置上静态细胞的激发光源。

所述光纤为直径125um、数值孔径0.22的光纤。

所述激光光源产生的直径为1.0mm的激光光束。

第一物镜：数值孔径为0.1的四倍物镜。第二物镜：数值孔径为0.25的十倍物镜。

一种新型二维光散射静态细胞仪方法，包括以下步骤：

步骤一：制作与待测物品相对应的液基芯片；

步骤二：打开激光光源，来自二极管泵浦固体激光器的准直光束，经过中性密度滤光片降低功率后由第一物镜汇聚，调整第一三维位移台，使其耦合进入光纤的一端；

步骤三：光纤的另一端作为探针插入静态细胞样品安放装置的微通道中，液基芯片被固定在显微镜平台上，通过第二三维位移台的控制，光纤探针对静态的待测物品进行二维扫描；

步骤四：通过第二物镜监测光纤探针的移动，移动光纤探针定位溶液中的待测物品，保证激光垂直照射待测物品，待测物品被激光激发，形成分布于三维空间的散射光，散射光经过第二物镜后，被CMOS探测器探测并收集；

步骤五：将CMOS探测器探测并收集的二维光散射图样传送至计算机进行待测物品的显示及参数鉴别。

所述步骤四中，待测物品位于聚焦平面上时，CMOS探测器探测并收集的是待测物品图像；如果待测物品偏离焦平面，即“去焦”，那么观察到的就是待测物品的二维光散射图样。

所述步骤五中，首先模拟得到大量已知直径的待测物品模型的二维光散射图样，然后将模拟得到的二维光散射图样及经过步骤四得到的二维光散射图样的灰度值进行水平扫描，得到灰度图像的变化曲线；对扫描得到的灰度曲线进行快速行傅立叶变换(FFT)，FFT曲线中会出现典型主波峰(FFT曲线中频率由高至低沿横向轴的第一个波峰)，这个典型主波峰的位置作为特征值来表示待测物品的尺寸；对大量模拟二维光散射图样的处理结果进行统计分析，由线性拟合得到波峰频率值随直径变化的直线方程；利用该直线方程，根据待测物品的波峰频率值，即可快速得到待测物品的直径及折射率的大小。本方法中模拟结果亦可由实验结果代替。

所述待测物品为酵母细胞或微球，待测物品为酵母细胞时，由线性拟合得到波峰频率值随直径变化的直线方程；待测物品为微球时，由线性拟合得到波峰频率值随直径变化的直线方程。

本发明的有益效果：

(1)本发明提出的基于细胞涂片光纤扫描的细胞分析仪器装置，即把细胞固定在常见的载玻片上、移动光纤探头来激发细胞，在去焦模式下获得被测细胞二维光散射图样的静态细胞分析仪，克服了传统流式细胞仪复杂、昂贵的微流体控制，具有广泛的适用性。

(2)传统流式细胞仪通常采用一维曲线表征细胞的散射光或荧光强度，相比于一维方法，本发明采用的二维光散射法同时包含极角和方位角两个变量，能够在二维平面将大量的信息图形化，通过对图像信息的分析与检测，可以为我们提供更多关于生物细胞的信息。二维光散射法具有更高的分辨率，能够更清晰的反应出相关变化，对分析复杂的细胞结构具有重要的应用价值及优势。

(3)本发明采用的无标记技术，克服了传统流式细胞仪需要对被测细胞经特殊染料或纳米颗粒进行标记从而损伤细胞的问题；也避免了免疫磁珠技术中抗原-抗体反应引起不同程度细胞活化的问题。

(4)本发明提供的高分辨率单细胞及微粒分析的二维光散射静态细胞仪，操作简单、成本低，克服了传统流式细胞仪操作复杂的问题。

(5)本发明提供的高分辨率单细胞及微粒分析的二维光散射静态细胞仪，将原来显微镜微米级的分辨率提高到了亚微米以及纳米层次，克服了传统光学显微镜分辨率低的问题，对于无标记的细胞诊断具有重大的潜力，比如癌症的前期筛查。

(6)本发明提供的高分辨率细胞及微粒分析的新方法，克服了传统细胞分析装置如流式细胞仪分析精度低的问题。

(7)本发明提供了一种新型的折射率判定方法。

附图说明

图1为本发明装置的结构及原理图；

图2为二维光散射图样探测记录系统示意图；

图3(a)-图3(j)为不同尺寸的酵母细胞模型的二维光散射图样；

图4(a)-图4(j)为不同酵母细胞的二维光散射实验图样；

图5为不同尺寸的酵母细胞模型散射光强的FFT曲线示意图；

图6为不同尺寸的酵母细胞散射光强的FFT曲线示意图；

图7为二维光散射静态细胞仪应用于细胞尺寸纳米分辨率鉴别结果示意图；

图8(a)-图8(f)为平均直径3.87μm和4.19μm微球的二维光散射图样FFT处理结果示意图；

图9为二维光散射静态细胞仪应用于颗粒尺寸亚微米分辨率鉴别结果示意图；

图中，1、激光光源，2、中性密度滤光片，3、四倍物镜，4、光纤耦合器，5、三维位移台，6、光纤，7、静态细胞样品安放装置，7-1、载玻片，8、被测细胞，9、十倍物镜，10、二维CMOS探测器，11、二维光散射图样，12、分析系统。

具体实施方式：

下面结合附图对本发明进行详细说明：

新型二维光散射静态细胞仪装置，融合了光学显微镜的高分辨率与流式细胞仪的高通量，系统集成了包括激光光源1、光学透镜及光纤耦合系统、静态细胞样品安放装置7、二维光散射图样探测记录系统、以及分析系统，可用于细胞以及微粒的高精度分析。

激光光源1：用于提供样品安放装置上静态细胞的激发光源，本发明中选择单频激光而不是宽频带激光，是为了避免光在入射过程中的波长发生变化，进而引起散射光谱的变化。波长为532nm的绿色激光具有穿透力较强的特点，符合大多数细胞实验要求。本发明中使用二极管泵浦固体激光器(DPSS)，该激光器利用输出固定波长的半导体激光器代替了传统的氪灯或氙灯来对激光晶体进行泵浦，具有工作时间长、效率高、体积小等优势；出于对操作人员的安全考虑，同时也为了降低激发细胞样本的能量，延长样本的使用时间，选择了中性密度滤光片2来降低激光的功率。

光学透镜及光纤耦合系统：用于调整激光，使其适合作为激发样品安放装置上静态细胞的探针。为了保证直径为1.0mm的激光光束能最大限度的耦合入直径125um、数值孔径0.22的光纤6中，四倍物镜3与光纤耦合器4相连，本发明中选择数值孔径0.1的四倍物镜3对激光光束进行汇聚，之后移动固定有光纤6的三维位移台5，使光纤6的一端端点处于该四倍物镜3的焦点，以保证最佳激光-光纤耦合状态；光纤6的另一端作为探针用于激发芯片上的单细胞或微粒。

静态细胞样品安放装置7：用于固定被测细胞8样品，包括两片载玻片7-1、两片盖玻片和显微镜三维载物台。载玻片7-1两端分别放置一片盖玻片，中间滴入样品，之后在上面盖上另一片载玻片7-1，构成微通道，控制好样本溶液的浓度，可形成单细胞薄层；另外，该上层载玻片7-1可用于固定插入溶液中的光纤探针。通过三维位移台5的控制，光纤探针可以很好的对静态的细胞样品进行二维扫描。

二维光散射图样探测记录系统：用于记录被测细胞8的二维光散射图样11，包括十倍物镜9和互补金属氧化物半导体(CMOS)探测器。通过显微镜物镜可以监测光纤探针的移动，移动光纤探针定位芯片上的细胞，保证激光垂直照射细胞。被测细胞8被激光激发，可形成分布于三维空间的散射光，散射光经过十倍物镜9后，被二维CMOS探测器10探测并收集。当细胞样品位于该十倍物镜9聚焦平面上时，二维CMOS探测器10探测并收集的是被测细胞8图像；如果被测细胞8偏离焦平面，即“去焦”，那么观察到的就是被测细胞8的二维光散射图样11。因为散射光的波长与背景噪音的波长相等，在二维光散射图样11探测过程中很容易受到噪声干扰，故选择数值孔径为0.25的十倍物镜9，该物镜不仅用于样品中细胞的定位，也同时用于提高散射光探测过程中的信噪比，提高图像质量。由公式NA＝nsinα，其中n是折射率，α为孔径角，可知孔径角为14.5度，这就意味着该十倍物镜9收集角度为75.5-104.5度，另外，散射光从样本溶液中经过两次折射进入空气中，如图2，根据折射定理，最终物镜能够探测到的角度范围为79.2-100.8度，近似为79-101度。

分析系统12：包括微型计算机及相关软件，用于实现对被测细胞8的二维散射图样的观测以及后续的数据分析、处理。

本装置可以用于纳米分辨率细胞及微粒分析。通过二维光散射静态细胞仪装置，获得被测细胞8的二维光散射图样11；根据米氏散射理论、结合算法，模拟得到已知直径的细胞模型的二维光散射图样11；对实验和模拟二维光散射图样11的灰度值进行水平扫描，得到灰度图像的变化曲线；对扫描得到的灰度曲线进行快速行傅立叶变换,FFT曲线中会出现典型主波峰，该典型主波峰的频率值可作为特征值来表示被测细胞8的尺寸；对大量模拟二维光散射图样11的处理结果进行统计分析，由线性拟合可以得到波峰频率值随直径变化的直线方程；利用该直线方程，根据被测细胞8的波峰频率值，即可快速得到被测细胞8的直径大小并可以进行细胞及微粒折射率分析,可达到纳米级的分辨率。

本装置可以用于亚微米分辨率细胞及微粒分析。通过二维光散射静态细胞仪装置，分别获得被测微粒的二维光散射图样11；根据米氏散射理论、结合算法，模拟得到已知尺寸微粒模型的二维光散射图样11；对实验和模拟二维光散射图样11的灰度值进行水平扫描，得到灰度图像的变化曲线；对扫描得到的灰度曲线进行快速行傅立叶变换,FFT曲线中会出现典型主波峰，该典型主波峰的频率值可作为特征值来表示被测微粒的尺寸；对大量模拟二维光散射图样11的处理结果进行统计分析，由线性拟合可以得到波峰频率值随直径变化的直线方程；利用该直线方程，根据被测微粒的波峰频率值，可快速得到被测颗粒的直径大小并可以进行细胞及微粒折射率分析,实现直径相差亚微米级微粒的尺寸鉴别与分类。

实施例1

本发明装置的结构原理如图1所示，选择酵母细胞作为被测样品进行细胞尺寸的纳米水平分析。

根据米氏散射理论，酵母细胞被假定为具有不同直径的球形颗粒，细胞折射率为1.42，入射光波长532nm，周围媒介及水溶液的折射率为1.334，本发明提供的纳米分辨率单细胞及微粒分析的二维光散射静态细胞仪装置中探测到散射图样的角度范围是79-101度，所以理论模拟也选取相同的角度范围，之后模拟得到大量已知直径的酵母细胞模型的二维光散射图样11，如图3(a)-图3(j)所示。

被测样品单细胞薄层的制备：酵母细胞属于单细胞真菌，一般认为其直径大小约为3-6μm，为了减少实验中细胞图像重叠以便观察，需要将细胞溶液进行稀释，一般要求溶液细胞溶度为10000个/ml左右，这可保证在十倍物镜9观察视野中有少量游离细胞。利用移液器每次汲取少量酵母单细胞溶液，滴在两端各放置有一片盖玻片的载玻片7-1中央，之后轻轻盖上另一片载玻片7-1，形成微通道，制成液基芯片，此过程要注意避免芯片中产生气泡和杂质。

打开激光器，来自二极管泵浦固体激光器的准直光束，经过中性密度滤波降低功率后由透镜(四倍物镜)汇聚，调整三维位移台5，使其耦合进入光纤。光线的另一端作为探针插入液基芯片的微通道中，液基芯片被固定在显微镜平台上，通过三维位移台5的控制，光纤探针可以很好的对静态的酵母细胞进行二维扫描；通过显微镜物镜可以监测光纤探针的移动，移动光纤探针定位芯片中的细胞，保证激光垂直照射细胞，酵母细胞被激光激发，可形成分布于三维空间的散射光，散射光经过十倍物镜9后，被CMOS探测器探测并收集。当酵母细胞位于聚焦平面上时，CMOS探测器探测并收集的是酵母细胞图像；如果酵母细胞偏离焦平面，即“去焦”，那么观察到的就是酵母细胞的二维光散射图样11，如图4(a)-图4(j)。

此时，被测酵母细胞和基于米氏散射理论的模拟酵母细胞的二维光散射图样11均采集完成。随后将其传输入计算机以便进行观测及后续的分析处理。

对实验和模拟二维光散射图样11进行水平扫描，得到灰度图像的变化曲线；对扫描得到的灰度曲线进行快速行傅立叶变换，FFT曲线中会出现典型主波峰，如图5和图6，这个特殊波峰的位置可作为特征值来表示酵母细胞的尺寸；对大量模拟二维光散射图样11的处理结果进行统计分析，由线性拟合得到波峰频率值随直径变化的直线方程；利用该直线方程，根据被测酵母细胞的波峰频率值，即可快速得到被测酵母细胞的直径大小。图7鉴别了图4(a)、图4(b)、图4(c)、图4(d)、图4(e)、图4(f)、图4(g)、图4(h)、图4(i)、图4(j)中所对应酵母细胞的尺寸分别为3.66、3.57、3.40、3.22、3.31、4.27、4.54、4.45、4.80、4.62±0.04μm，实现了纳米分辨率的细胞尺寸鉴别。

实施例2

本发明装置的结构原理如图1所示，选择平均直径分别为3.87μm(标准误差0.25μm)和4.19μm(标准误差0.27μm)的微球作为被测样品进行微粒尺寸的亚微米水平分析。

理论模拟微球的折射率为1.42，入射光波长532um，周围媒介及水溶液的折射率为1.334，角度范围是79-101度，由米氏散射理论模拟得到大量已知直径的微球模型的二维光散射图样11。

对被测微球溶液进行稀释，保证在十倍物镜9观察视野中有少量游离微球。利用移液器每次汲取少量微球溶液，滴在两端各放置有一片盖玻片的载玻片7-1中央，之后轻轻盖上另一片载玻片7-1，形成微通道，制成液基芯片，此过程要注意避免芯片中产生气泡和杂质。

打开激光器，来自二极管泵浦固体激光器的准直光束，经过中性密度滤波降低功率后由透镜(四倍物镜3)汇聚，调整三维位移台5，使其耦合进入光纤。光线的另一端作为探针插入液基芯片的微通道中，通过三维位移台5的控制，移动光纤探针定位溶液中的微球，保证激光垂直照射微球，微球被激光激发，在聚焦模式下获得微球原图，如图8(a)、(b)所示分别为平均直径3.87μm和4.19μm微球原图；在去焦模式下获得被测微球的二维光散射图样11，如图8(c)、图8(d)所示，分别为平均直径3.87μm和4.19μm微球的二维光散射图。

此时，被测微球和基于米氏散射理论的模拟微球的二维光散射图样11均采集完成。随后将其传输入计算机以便进行观测及后续的分析处理。

对随机选取的37个平均直径为3.87μm和23个平均直径为4.19μm微球的实验散射图样，及45个模拟微球散射图样(直径从2.8μm到7.2μm，步长为0.1μm)进行水平扫描，得到灰度图像的变化曲线；对扫描得到的灰度曲线进行FFT，FFT曲线中会出现典型主波峰，平均直径为3.87μm和4.19μm微球的处理结果如图8(e)和图8(f)所示；对45个模拟微球散射图样处理结果进行统计分析，由线性拟合得到波峰频率值随直径变化的直线方程；利用该直线方程，根据被测微球的波峰频率值，得到平均直径为3.87μm微球的理论平均直径为3.91±0.04μm，平均直径为4.19μm微球的理论平均直径为4.16±0.04μm，如图9，理论值与实际值高度吻合。本实施例中，成功鉴别了3.87μm和4.19μm的微球，实现了亚微米分辨率的微粒尺寸鉴别。

实施例3

本发明装置的结构原理如图1所示，选择折射率为1.42(入射波长为589nm)的酵母细胞和折射率为1.59(入射波长为589nm)的微球作为被测样品进行折射率分析。

根据米氏散射理论，模拟得到细胞折射率为1.42、入射光波长532nm、周围媒介及水溶液的折射率为1.334且直径不同的酵母模型的45个二维光散射图样11(直径从2.8μm到7.2μm，步长为0.1μm)，对这45个散射图样进行水平扫描，得到灰度图像的变化曲线；对扫描得到的灰度曲线进行FFT，FFT曲线中会出现典型主波峰，对其进行统计分析，由线性拟合得到折射率为1.42的酵母细胞波峰频率值随直径变化的直线方程，如图7。采用相同的方法，线性拟合得到折射率为1.59的微球波峰频率值随直径变化的直线方程，如图9。

两条直线的斜率有明显的差异，利用这两条直线方程，根据被测样品的直径与波峰频率值，可快速确定其折射率的大小，实现被测样品的折射率分析。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种新型二维光散射静态细胞仪装置，其特征是，包括激光光源，所述激光光源依次与中性密度滤光片及光学透镜及光纤耦合系统相连，光学透镜及光纤耦合系统调整激光，使光纤作为激发静态细胞样品安放装置上静态细胞的探针，静态细胞样品安放装置与二维光散射图样探测记录系统相连，二维光散射图样探测记录系统记录被测细胞的二维光散射图样并将该图样传送至分析系统。

2.如权利要求1所述的一种新型二维光散射静态细胞仪装置，其特征是，所述光学透镜及光纤耦合系统包括第一物镜，第一物镜与光纤耦合器相连，所述光纤耦合器与第一三维位移台相连，所述第一三维位移台通过光纤与第二三维位移台相连。

3.如权利要求1所述的一种新型二维光散射静态细胞仪装置，其特征是，所述激光光源发出的光依次穿过中性密度滤光片及第一物镜。

4.如权利要求1所述的一种新型二维光散射静态细胞仪装置，其特征是，所述静态细胞样品安放装置用于固定被测细胞样品，形成单层细胞悬液，包括两片载玻片、两片盖玻片和显微镜三维载物台，其中一个载玻片两端分别放置一片盖玻片，中间滴入样品，之后在上面盖上另一片载玻片，构成微通道，控制好样本浓度，形成单细胞薄层。

5.如权利要求1所述的一种新型二维光散射静态细胞仪装置，其特征是，所述二维光散射图样探测记录系统，用于记录被测细胞的二维光散射图样，包括第二物镜和CMOS探测器，通过第二物镜监测光纤探针的移动，移动光纤探针定位溶液中的细胞，保证激光垂直照射细胞，被测细胞被激光激发，形成分布于三维空间的散射光，散射光经过第二物镜后，被CMOS探测器探测并收集。

6.如权利要求1或3所述的一种新型二维光散射静态细胞仪装置，其特征是，所述激光光源采用二极管泵浦固体激光器，用于提供静态细胞样品安放装置上静态细胞的激发光源。

7.如权利要求2所述的一种新型二维光散射静态细胞仪装置，其特征是，所述光纤为直径125um、数值孔径0.22的光纤；所述激光光源产生的直径为1.0mm的激光光束；第一物镜：数值孔径为0.1的四倍物镜，第二物镜：数值孔径为0.25的十倍物镜。

8.如权利要求1-7任一所述的一种新型二维光散射静态细胞仪方法，其特征是，包括以下步骤：

步骤一：制作与待测物品相对应的液基芯片；

步骤二：打开激光光源，来自二极管泵浦固体激光器的准直光束，经过中性密度滤光片降低功率后由第一物镜汇聚，调整第一三维位移台，使其耦合进入光纤的一端；

步骤三：光纤的另一端作为探针插入静态细胞样品安放装置的微通道中，液基芯片被固定在显微镜平台上，通过第二三维位移台的控制，光纤探针对静态的待测物品进行二维扫描；

步骤四：通过第二物镜监测光纤探针的移动，移动光纤探针定位溶液中的待测物品，保证激光垂直照射待测物品，待测物品被激光激发，形成分布于三维空间的散射光，散射光经过第二物镜后，被CMOS探测器探测并收集；

步骤五：将CMOS探测器探测并收集的二维光散射图样传送至分析系统进行显示及分析。

9.如权利要求8所述的一种新型二维光散射静态细胞仪方法，其特征是，所述步骤四中，待测物品位于聚焦平面上时，CMOS探测器探测并收集的是待测物品图像；如果待测物品偏离焦平面，即“去焦”，那么观察到的就是待测物品的二维光散射图样。

10.如权利要求8所述的一种新型二维光散射静态细胞仪方法，其特征是，步骤五中首先模拟得到大量已知直径的待测样品模型的二维光散射图样，然后将模拟得到的二维光散射图样及经过步骤四得到的二维光散射图样进行水平扫描，得到灰度图像的变化曲线；对扫描得到的灰度曲线进行快速行傅立叶变换，FFT曲线中会出现典型主波峰，该典型主波峰为FFT曲线频率值由高到低沿横向轴的第一个波峰，这个典型主波峰的位置作为特征值来表示待测物品的尺寸；对大量模拟二维光散射图样的处理结果进行统计分析，由线性拟合得到波峰频率值随直径变化的直线方程；利用该直线方程，根据待测物品的波峰频率值，即可快速得到待测物品的直径及折射率的大小。