JPWO2015015951A1 - 単一発光粒子検出技術を用いた光学顕微鏡装置、顕微鏡観察法及び顕微鏡観察のためのコンピュータプログラム - Google Patents
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Abstract
Description
2…光源
3…シングルモードオプティカルファイバー
4…コリメータレンズ
5…ダイクロイックミラー
6、7…ガルバノミラー
8…対物レンズ
9…マイクロプレート
10…ウェル(試料容器)
11…反射ミラー
12…コンデンサーレンズ
13…ピンホール
14…バリアフィルター
14a…ダイクロイックミラー
15…マルチモードオプティカルファイバー
16、17…ミラー偏向器
18…光検出器
19…ステージ位置変更装置
20…コンピュータ
本発明による顕微鏡観察技術を実現する顕微鏡装置は、基本的な構成に於いて、図1(A)に模式的に例示されている如き、レーザー走査による顕微鏡観察が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、顕微鏡装置1は、光学系2〜18と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ20とから構成される。顕微鏡装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源2から放射されたレーザー光(Ex)が、コリメーター2aによって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー(ガルバノミラー)6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1〜数十μLの試料(溶液、細胞など)が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されており、対物レンズ8から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル10内の試料液体中で焦点を結び、光強度の強い領域(励起領域)が形成される。試料中に於いては、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光(Em)は、対物レンズ8、ダイクロイックミラー5を通過し、ミラー11にて反射してコンデンサーレンズ12にて集光され、ピンホール13を通過し、バリアフィルター14を透過して(ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。)、マルチモードファイバー15に導入されて、光検出器18に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ20へ入力され、後に説明される態様にて、発光粒子の信号の検出、発光粒子の位置の決定、その他の光分析の処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール13は、対物レンズ8の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図1(B)に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図1(B)に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、1〜10fL程度の実効体積を有する本顕微鏡装置に於ける光検出領域であり(典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が中心光強度の1/e2となる面を境界とする略楕円球体の体積である。)、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、1つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器18としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、計測単位時間(BIN TIME)毎に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列光強度のデータは、時系列フォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ(図示せず)には、観察するべきウェル10を変更するべく、マイクロプレート9の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置19が設けられていてよい。ステージ位置変更装置19の作動は、コンピュータ20により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の顕微鏡観察技術に於いては、端的に述べれば、走査型光学顕微鏡観察に於いて、観察対象領域を複数の観察小領域に分割し、観察小領域毎に走査分子計数法の要領にて観察小領域を複数回走査し、発光粒子の有無及びその位置を決定する。そして、観察対象領域内での発光粒子の位置が決定されることから、発光粒子の存在分布が画像として表現される(画像化される)こととなる。以下、走査分子計数法と本発明の顕微鏡観察技術の原理について説明する。
「走査分子計数法」(特許文献3〜8)では、基本的には、光検出領域の位置を移動するための機構(ミラー偏向器17)を駆動して光路を変更し、或いは、試料が注入されている容器10(マイクロプレート9)の水平方向の位置を移動して、図2(A)にて模式的に描かれているように、試料内に於いて光検出領域CVの位置を移動しながら、即ち、光検出領域CVにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域CVが移動する間(図中、時間t0〜t2)に於いて1つの発光粒子の存在する領域を通過する際(t1)には、発光粒子から光が放出され、図2(B)に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度(Em)のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域CVの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図2(B)に例示されている如きパルス状の信号(有意な光強度変化)を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、蛍光相関分光分析(FCS)、蛍光強度分布分析(FIDA)等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。時系列光強度データから発光粒子の信号を検出する具体的な手法の例は、後述される。
(i)概要
「発明の概要」の欄にて触れた如く、通常のレーザー走査型共焦点顕微鏡装置の場合、観察対象領域ObRに於ける光検出領域CVの走査は、典型的には、ラスタスキャン方式であり、図9(A)に模式的に描かれている如く、光検出領域CVの位置は、観察対象領域ObR全体に亘って順次移動されていく。観察対象領域、即ち、走査領域の位置は、光の収差の影響が許容される範囲で、視野VF内の任意の位置、光軸方向の高さに設定することが可能である。そして、検出される光強度が微弱である場合など、光強度の積算を行うときには、光検出領域CVが同じ走査経路に沿って繰り返し移動される。しかしながら、この構成の場合、最初の走査に於いて検出された発光粒子の位置が二回目以降の走査時に移動してしまうと、有意な光強度の積算の効果は得られないこととなる。一方、エバネッセント光を用いた顕微鏡装置の場合、微小な光検出領域CVによる走査により光を検出するのではなく、一度に視野又は観察対象領域内の像をカメラ等の光検出器に撮り込むことが可能であり、その場合、カメラ等の光検出器に於いて、連続的に光強度又は光量の積算が可能であるので、位置の変化する発光粒子の像の場合でも有意な光強度の積算の効果が得られる。しかしながら、エバネッセント光を用いた顕微鏡装置の場合、図9(B)に模式的に描かれている如く、試料に於いて観察可能な範囲は、エバネッセント光の届くカバーガラス表面近傍に限定されてしまう。
「発明の概要」の欄にて触れた如く、観察小領域の寸法は、光検出領域が観察小領域を走査するのに要する時間を決定するので、典型的には、光検出領域の寸法に基づいて決定される。この点に関し、もし光検出領域の寸法よりも観察小領域の寸法が大きい場合には、光検出領域による観察小領域の一回の通過で観察小領域の全域が網羅できないこととなり、その場合、光検出領域に、観察小領域のうち、最初に光検出領域に含まれなかった部分を含めて、再度、観察小領域を通過させる必要が生じ、その分、走査時間が延長されることとなる。従って、観察小領域の寸法について、好適には、図3(C)及び図4(A)〜(C)に模式的に描かれている如く、その一辺が光検出領域の直径2Wと等しくなるよう設定される。なお、観察小領域の形状は、好適には、立方体であるが、光検出領域の走査方向に長い直方体であってもよいことは理解されるべきである(特に、一方向にしか走査をしない場合)。
上記の如く、観察小領域毎に発光粒子の検出処理を実行した場合、観察対象領域内での観察小領域の位置は、その設定時に予め分かっているので、各観察小領域内に於いて検出された発光粒子の位置は、観察小領域の寸法の分解能で決定されることとなる。また、更に、既に述べた如く、各観察小領域内に於いて発光粒子の信号の検出を、釣鐘型のパルス状の光強度の時間変化(発光粒子の信号)の検出によって行う場合には、時系列光強度データ上に於いて、発光粒子の信号のピークの位置(時点)が特定される。かかる発光粒子の信号のピークの位置に於いて、発光粒子が光検出領域の、進行方向に垂直な方向の中心軸線上に存在することとなるので、発光粒子の信号のピークの位置を検出することによって、観察小領域内に於ける発光粒子の位置も特定できることとなる。具体的には、図4(C)に模式的に描かれている如く、光検出領域の走査がX方向に実行されている際の時系列光強度データ上に於いて、発光粒子の信号のピークの位置を特定すると、観察小領域の中心位置(又は辺の位置であってもよい。)からピークの位置のずれΔXによって、発光粒子のX方向の座標が決定される。同様に、光検出領域の走査がY方向に実行されている際の時系列光強度データ上に於いて、発光粒子の信号のピークの位置を特定すると、観察小領域の中心位置(又は辺の位置であってもよい。)からピークの位置のずれΔYによって、発光粒子のY方向の座標が決定される。そして、観察対象領域内での発光粒子の位置は、観察小領域の位置座標とΔX、ΔYとによって決定されることとなる。(図示はしていないが、Z方向に於いても同様に、観察小領域の特定の位置からピークの位置のずれΔZによって、発光粒子のZ方向の座標が決定されてよい。)
図1(A)に例示の顕微鏡装置1を用いた本発明に従った顕微鏡観察の実施形態に於いては、具体的には、(1)発光粒子を含む試料の調製、(2)試料の光強度の測定処理、及び、(3)測定された光強度の分析処理が実行される。図5は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。
本発明の顕微鏡観察技術の観測対象物となる粒子は、任意の液体中に存在する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象物となる粒子が光を発する粒子でない場合には、発光標識(蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子)が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。試料は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。また、観測対象物となる粒子は、細胞や細胞小器官の中に存在し拡散又はその他の要因で運動する(位置の変化する)粒子であってよい。即ち、通常の細胞や細胞小器官の顕微鏡観察に利用される試料液体であってよい。
本実施形態の顕微鏡観察に於いては、上記の如く、観察対象領域内の各観察小領域に於いて光検出領域の位置を移動しながら、光強度の測定が実行される。光検出領域の位置の移動は、ガルバノミラー装置16、17又はステージ位置変更装置19を駆動して為される。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート9のウェル10に試料を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ20に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ20は、記憶装置(図示せず)に記憶されたプログラム(試料内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順)に従って、試料内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、ガルバノミラー装置16、17又はステージ位置変更装置19は、コンピュータ20のプログラムに従った処理動作の制御下、ガルバノミラー6、7又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート9を駆動して、ウェル10内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器18は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ20へ送信し、コンピュータ20では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器16は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
(2W)2=6D・Δt …(1)
から、
Δt=(2W)2/6D …(2)
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度(拡散移動速度)Vdifは、概ね、
Vdif=2W/Δt=3D/W …(3)
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、D=2.0×10−1 0m2/s程度であると予想される場合には、Wが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10−3m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その10倍以上の15mm/sなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル(典型的には、励起光強度分布と略同様)となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
ΔT=4W・k/v …(4)
で与えられる。一方、走査時間ΔTに於ける拡散による発光粒子の移動距離xは、式(1)と同様に、
<x>2=2DΔT …(5)
にて与えられる。ここで、x2≦W2の条件が成立すべきであるので、結局、
v≧8D・k/W …(6)
が成立するように、走査速度が設定されることが好ましい。
各観察小領域の走査によって時系列光強度データの生成が為されると、時系列光強度データの光強度値を用いて、下記の如く、発光粒子の信号の検出、発光粒子のカウンティング、発光粒子の位置の決定、その他の各種分析(濃度算出等)が実行されてよい。
既に触れた如く、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図6(B)に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度データ上での光強度の変化は、光学系により決定される光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、走査分子計数法では、基本的には、光強度データ上で、適宜設定される閾値Ithを超える光強度値が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、光強度が閾値Ithを超えないか、時間幅Δτが所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布:
I=A・exp(−2t2/a2) …(7)
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル(バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル)に対して式(7)をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。一方、強度A及び幅aが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。)
ところで、本実施形態の顕微鏡観察技術に於いては、各観察小領域に於いて、同一の方向に複数回の走査が実行されている場合には、時系列光検出データ上には、同一の発光粒子の信号が反復して出現していることが期待される。その場合、時系列光検出データ上のデータ値又は発光粒子の信号として検出された領域のデータ値を、走査経路に沿って、走査経路上の位置が互いに一致するように積算することにより、発光粒子の信号の精度の向上が期待される。かかる積算の具体的な態様の一つに於いては、上記の如く、各観察小領域に於いて、時系列光検出データ上に於ける発光粒子の信号を個別に検出した後、検出された発光粒子の信号の光強度値を積算し、その総和又は平均値等が発光粒子の信号の光強度値として用いられるようになっていてよい。かかる光強度値の積算の際に、同一の発光粒子の信号を抽出する処理は、例えば、特許文献6〜7に記載されている要領にて実行されてよい。
既に触れた如く、各観察小領域に於いて発光粒子の信号が検出されると、観察対象領域ObR内の各観察小領域OsRの位置(座標)が既知であるので、観察小領域の寸法の分解能にて発光粒子の位置が決定される。更に、発光粒子の信号のピークの出現位置と観察小領域の特定の位置(中心又は縁など)との距離から発光粒子の位置(座標)がより詳細に決定できることとなる(図4(C)参照)。かくして、発光粒子の位置が決定されると、その情報を用いて、観察対象領域ObR内に於ける発光粒子の存在分布を画像として表現することが可能となる。また、発光粒子の存在分布画像は、観察対象領域ObRを別の任意の顕微鏡観察法(位相差顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、落射蛍光顕微鏡法など)によって得られた顕微鏡像に重ね合わせてコンピュータ20のディスプレイに表示されるようになっていてよい。具体的には、任意の顕微鏡観察法によって得られた顕微鏡像に於いて発光粒子の位置をプロットして得られるプロット画像が生成されるようになっていてよい。
検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されている場合、更に、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料中の発光粒子の濃度が決定可能となる。光検出領域の通過した領域の総体積は、例えば、特許文献1に記載されている要領にて決定されてよい。
走査分子計数法に於いて、特許文献6に記載されている如く、同一の発光粒子の信号を複数回検出した場合には、それらの信号の発生時点(ピークの時点)を用いて走査周期に於ける発光粒子の変位が検出され、かかる変位から発光粒子の並進拡散特性(例えば、拡散定数)を見積もることができる。並進拡散特性は、発光粒子の大きさの関数であるから、これにより、検出された発光粒子の大きさの推定が可能となる。そこで、本発明の顕微鏡観察技術に於いても、各観察小領域内にて検出された発光粒子の信号の発生時点を用いて、発光粒子の並進拡散特性及び発光粒子の大きさの推定が為されてよい。具体的な処理は、特許文献6に記載されている要領にて実行されてよい。また、図8の例の如く、発光粒子の信号の検出の前に光強度の積算を行った場合には、積算された発光粒子の信号の幅dを参照することにより、並進拡散特性を見積もることが可能である(拡散定数が大きいほど、走査時間内での発光粒子の変位が大きくなり、積算信号の幅dは増大する。)。
Claims (30)
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料液体中の発光粒子からの光を検出し発光粒子を検出する光学顕微鏡装置であって、
前記顕微鏡の視野内に於ける観察対象領域を複数に分割して得られる観察小領域毎に該観察小領域内にて前記光検出領域の位置を連続して複数回移動する光検出領域移動部と、
前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
前記観察小領域の各々に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて前記検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出し、前記検出された信号に対応する発光粒子の各々の前記観察対象領域内に於ける位置を決定する信号処理部と
を含む装置。 - 請求項1の装置であって、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の移動が前記観察小領域毎に少なくとも二つの方向に連続して実行される装置。
- 請求項1又は2の装置であって、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の移動が前記観察小領域毎に同一の方向に連続して複数回実行される装置。
- 請求項1乃至3のいずれかの装置であって、前記観察小領域の寸法が前記光検出領域の寸法に基づいて決定される装置。
- 請求項1乃至4のいずれかの装置であって、前記観察小領域に於いて前記光検出領域の位置を移動させる時間内に於ける検出されるべき発光粒子の移動距離が前記観察小領域の寸法よりも小さくなるよう前記観察小領域の寸法が設定される装置。
- 請求項1乃至5のいずれかの装置であって、前記観察小領域の一辺の長さが前記光検出領域の直径に略等しくなるよう設定され、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の一回の移動が、前記光検出領域のその進行方向の前縁が前記観察小領域の一方の縁を通過し、前記光検出領域のその進行方向の後縁が前記観察小領域の他方の縁に到達するまで実行される装置。
- 請求項1乃至6のいずれかの装置であって、前記観察対象領域内に於ける位置の決定された前記発光粒子の位置を、任意の手法にて生成された前記観察対象領域の顕微鏡画像に於いて、プロットして得られるプロット画像を生成する装置。
- 請求項1乃至7のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記観察小領域毎の前記複数回の前記光検出領域の移動によって得られた同一の発光粒子の信号の特性を用いて前記発光粒子の大きさに関する情報を決定する装置。
- 請求項8の装置であって、前記発光粒子の大きさに関する情報の決定に用いられる前記発光粒子の信号の特性が、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値又は前記発光粒子の回転拡散特性を表す指標値である装置。
- 請求項1乃至9のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記観察対象領域中の前記発光粒子の数又は前記液体中の発光粒子の濃度を決定する装置。
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料液体中の発光粒子からの光を検出し発光粒子を検出する光学的顕微鏡観察方法であって、
前記顕微鏡の視野内に於ける観察対象領域を複数に分割して得られる観察小領域毎に該観察小領域内にて前記光検出領域の位置を連続して複数回移動する過程と、
前記光検出領域からの光を検出する過程と、
前記観察小領域の各々に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出し、前記検出された信号に対応する発光粒子の各々の前記観察対象領域内に於ける位置を決定する過程と
を含む方法。 - 請求項11の方法であって、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の移動が前記観察小領域毎に少なくとも二つの方向に連続して実行される方法。
- 請求項11又は12の方法であって、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の移動が前記観察小領域毎に同一の方向に連続して複数回実行される方法。
- 請求項11乃至13のいずれかの方法であって、前記観察小領域の寸法が前記光検出領域の寸法に基づいて決定される方法。
- 請求項11乃至14のいずれかの方法であって、前記観察小領域に於いて前記光検出領域の位置を移動させる時間内に於ける検出されるべき発光粒子の移動距離が前記観察小領域の寸法よりも小さくなるよう前記観察小領域の寸法が設定される方法。
- 請求項11乃至15のいずれかの方法であって、前記観察小領域の一辺の長さが前記光検出領域の直径に略等しくなるよう設定され、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の一回の移動が、前記光検出領域のその進行方向の前縁が前記観察小領域の一方の縁を通過し、前記光検出領域のその進行方向の後縁が前記観察小領域の他方の縁に到達するまで実行される方法。
- 請求項11乃至16のいずれかの方法であって、更に、前記観察対象領域内に於ける位置の決定された前記発光粒子の位置を、任意の手法にて生成された前記観察対象領域の顕微鏡画像に於いて、プロットして得られるプロット画像を生成する過程を含む方法。
- 請求項13及び請求項13を引用する請求項14乃至17のいずれかの方法であって、更に、前記観察小領域毎の前記複数回の前記光検出領域の移動によって得られた同一の発光粒子の信号の特性を用いて前記発光粒子の大きさに関する情報を決定する過程を含む方法。
- 請求項18の方法であって、前記発光粒子の大きさに関する情報の決定に用いられる前記発光粒子の信号の特性が、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値又は前記発光粒子の回転拡散特性を表す指標値である方法。
- 請求項11乃至19のいずれかの方法であって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記観察対象領域中の前記発光粒子の数又は前記液体中の発光粒子の濃度を決定する過程を含む方法。
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料液体中の発光粒子からの光を検出し発光粒子を検出するための光学顕微鏡観察用コンピュータプログラムであって、
前記顕微鏡の視野内に於ける観察対象領域を複数に分割して得られる観察小領域毎に該観察小領域内にて前記光検出領域の位置を連続して複数回移動する手順と、
前記光検出領域からの光を検出する手順と、
前記観察小領域の各々に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出し、前記検出された信号に対応する発光粒子の各々の前記観察対象領域内に於ける位置を決定する手順と
をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。 - 請求項21のコンピュータプログラムであって、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の移動が前記観察小領域毎に少なくとも二つの方向に連続して実行されるコンピュータプログラム。
- 請求項21又は22のコンピュータプログラムであって、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の移動が前記観察小領域毎に同一の方向に連続して複数回実行されるコンピュータプログラム。
- 請求項21乃至23のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記観察小領域の寸法が前記光検出領域の寸法に基づいて決定されるコンピュータプログラム。
- 請求項21乃至24のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記観察小領域に於いて前記光検出領域の位置を移動させる時間内に於ける検出されるべき発光粒子の移動距離が前記観察小領域の寸法よりも小さくなるよう前記観察小領域の寸法が設定されるコンピュータプログラム。
- 請求項21乃至25のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記観察小領域の一辺の長さが前記光検出領域の直径に略等しくなるよう設定され、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の一回の移動が、前記光検出領域のその進行方向の前縁が前記観察小領域の一方の縁を通過し、前記光検出領域のその進行方向の後縁が前記観察小領域の他方の縁に到達するまで実行されるコンピュータプログラム。
- 請求項21乃至26のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記観察対象領域内に於ける位置の決定された前記発光粒子の位置を、任意の手法にて生成された前記観察対象領域の顕微鏡画像に於いて、プロットして得られるプロット画像を生成する手順を含むコンピュータプログラム。
- 請求項23及び請求項23を引用する請求項24乃至27のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記観察小領域毎の前記複数回の前記光検出領域の移動によって得られた同一の発光粒子の信号の特性を用いて前記発光粒子の大きさに関する情報を決定する手順を含むコンピュータプログラム。
- 請求項28のコンピュータプログラムであって、前記発光粒子の大きさに関する情報の決定に用いられる前記発光粒子の信号の特性が、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値又は前記発光粒子の回転拡散特性を表す指標値であるコンピュータプログラム。
- 請求項21乃至29のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記観察対象領域中の前記発光粒子の数又は前記液体中の発光粒子の濃度を決定する手順を含むコンピュータプログラム。
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