WO2012099234A1 - 単一発光粒子からの光の検出を用いた光分析方法及び光分析装置 - Google Patents

単一発光粒子からの光の検出を用いた光分析方法及び光分析装置 Download PDF

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WO2012099234A1 PCT/JP2012/051175 JP2012051175W WO2012099234A1 WO 2012099234 A1 WO2012099234 A1 WO 2012099234A1 JP 2012051175 W JP2012051175 W JP 2012051175W WO 2012099234 A1 WO2012099234 A1 WO 2012099234A1
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light detection
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田邊哲也
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オリンパス株式会社
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    • G01J1/00—Photometry, e.g. photographic exposure meter
    • G01J1/42—Photometry, e.g. photographic exposure meter using electric radiation detectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
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    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes

Definitions

  • the present invention uses an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, and uses atoms, molecules or aggregates thereof dispersed or dissolved in a solution ( These are hereinafter referred to as “particles”), for example, biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, particulate objects such as viruses and cells, or non- Optical analysis method and optical analysis apparatus capable of detecting light from biological particles and obtaining information useful in analysis or analysis of their states (interaction, binding / dissociation state, etc.) More particularly, the present invention relates to a method and apparatus that enables various optical analyzes by individually detecting light from a single light emitting particle using the optical system as described above.
  • a particle that emits light is either a particle that emits light itself, or a particle to which an arbitrary luminescent label or luminescent probe is added.
  • the light emitted from the luminescent particles may be fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, scattered light, or the like.
  • the average residence time (translational diffusion time) of the fluorescent molecules and the like in the minute region determined from the value of the autocorrelation function of the measured fluorescence intensity, and the average number of staying molecules Based on this, acquisition of information such as the speed or size of movement of fluorescent molecules, concentration, concentration, molecular structure or size change, molecular binding / dissociation reaction, dispersion / aggregation, etc.
  • the detection of various phenomena made.
  • the fluorescence intensity distribution analysis Fluorescence-Intensity Distribution Analysis: FIDA.
  • Patent Document 4 Non-Patent Document 4 and the Photon Counting Histogram (PCH.
  • Patent Document 5 are measured in the same manner as FCS.
  • a histogram of the fluorescence intensity of the fluorescent molecules entering and exiting the confocal volume generated is generated, and by fitting a statistical model formula to the distribution of the histogram, the average of the intrinsic brightness of the fluorescent molecules etc.
  • the average value of the value and the number of molecules staying in the confocal volume is calculated, and based on this information, changes in the structure or size of the molecule, binding / dissociation state, dispersion / aggregation state, etc. are estimated. It will be.
  • Patent Documents 6 and 7 propose a method for detecting a fluorescent substance based on the passage of time of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • Patent Document 8 describes the presence of fluorescent fine particles in a flow or on a substrate by measuring weak light from fluorescent fine particles circulated in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate using a photon counting technique. A signal arithmetic processing technique for detecting the signal is proposed.
  • the sample required for measurement has an extremely low concentration compared with the conventional method.
  • the measurement time is also greatly shortened (measurement of time on the order of seconds is repeated several times in one measurement). . Therefore, these technologies are particularly useful for analyzing rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development, for clinical diagnosis of diseases, screening for physiologically active substances, etc.
  • the number is large, it is expected to be a powerful tool capable of performing experiments or inspections at a lower cost or faster than conventional biochemical methods.
  • the light to be measured is light emitted from one or several fluorescent molecules.
  • statistical processing such as calculation of fluctuation of fluorescence intensity such as calculation of autocorrelation function of fluorescence intensity data measured in time series or fitting to histogram is executed, and light signals from individual fluorescent molecules etc. are processed. It is not individually referenced or analyzed. That is, in these photoanalysis techniques, light signals from a plurality of fluorescent molecules and the like are statistically processed, and statistical average characteristics of the fluorescent molecules and the like are detected.
  • the concentration or number density of the fluorescent molecules or the like to be observed in the sample solution is equal to one second in the equilibrium state.
  • the concentration of fluorescent molecules or the like in the sample solution used in the above optical analysis technique is typically about 1 nM or more.
  • the applicant of the present application deals with the optical analysis technique including the statistical processing such as FCS, FIDA, etc. in the concentration or number density of the luminescent particles to be observed in Japanese Patent Application No. 2010-044714 and PCT / JP2011 / 53481.
  • An optical analysis technique based on a novel principle that makes it possible to quantitatively observe the state or characteristics of luminescent particles in a sample solution below a certain level is proposed.
  • an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, like FCS, FIDA and the like.
  • the photodetection region When used, while moving the position of a minute region (hereinafter referred to as “light detection region”) that is a light detection region in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region,
  • the photodetection region includes luminescent particles that are dispersed in the sample solution and move randomly, the light emitted from the luminescent particles is detected, and each luminescent particle in the sample solution is individually detected
  • the sample required for measurement is a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L) as in the optical analysis techniques such as FCS and FIDA.
  • the measurement time is short, and the presence of luminescent particles having a lower concentration or number density is detected as compared with the case of optical analysis techniques such as FCS and FIDA, and the concentration, number density or Other characteristics can be detected quantitatively.
  • the above-mentioned “scanning molecule counting method” is used to individually detect luminescent particles in a sample solution and determine the concentration or other characteristics, the number of luminescent particles that achieve the accuracy required for the result. Is preferably detected. For example, when the concentration of the luminescent particles in the sample solution is determined by the scanning molecule counting method, the number of luminescent particles detected individually is counted, and the counted number is measured during the measurement time (time for detecting light). Processing such as dividing by the total volume of the passage area of the light detection area is performed.
  • the count of the luminescent particles is set to a sufficient number so that the variation is small. It is necessary to have reached.
  • the count of the luminescent particles increases in a shorter time as the concentration of the luminescent particles in the sample solution increases, so the measurement time to achieve the detection of the number of luminescent particles that gives the required accuracy is the luminescent particle The higher the concentration, the shorter.
  • the required measurement time varies depending on the concentration of the luminescent particles.
  • the measurement time required to detect the number of luminescent particles that gives the required accuracy is unknown. Even when the concentration is low, the number of luminescent particles that give the required accuracy will be detected. In that case, for a sample solution having a high concentration of luminescent particles, the measurement time may be longer than necessary.
  • the luminescent particles are detected at the same measurement time regardless of the concentration of the luminescent particles, when the concentration of the luminescent particles is high, the variation in the results is small, but when the concentration of the luminescent particles is low, It can happen that the variation in results is large.
  • one object of the present invention is to provide a novel method in the above-mentioned “scanning molecule counting method” that enables the detection of the number of luminescent particles that achieve the accuracy required for the results to be completed in the shortest possible time. And providing an apparatus.
  • Another object of the present invention is to provide a novel method and apparatus capable of suppressing variation in results in the above-mentioned “scanning molecule counting method” regardless of the concentration of the luminescent particles to be observed. Is to provide.
  • Another object of the present invention is to provide a novel method and apparatus that makes it possible to optimize the measurement time in accordance with the concentration of the luminescent particles to be observed in the “scanning molecule counting method” described above. Is to provide.
  • the above problem is a method for detecting and analyzing light from luminous particles dispersed and moving randomly in a sample solution using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, While changing the optical path of the microscope's optical system, the process of moving the light detection area in the sample solution moves the position of the light detection area of the optical system, while moving the position of the light detection area in the sample solution.
  • a light detection process for detecting light from the light detection region, and a light emission particle detection process for individually detecting a signal from each light emitting particle from the detected light, and the above three processes are signals from the light emission particle.
  • the concentration of the luminescent particles in the sample solution is determined based on the time required for the number of signals from the luminescent particles to reach the predetermined number. And reach by the way It is.
  • the light-emitting particles “dispersed and randomly moved in the sample solution” are particles that emit light, such as atoms, molecules or aggregates thereof dispersed or dissolved in the sample solution.
  • any particle may be used as long as it is not fixed to the substrate or the like and freely moves in the solution in Brownian motion.
  • the luminescent particles are typically fluorescent particles, but may be particles that emit light by phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, or the like.
  • the “light detection area” of the optical system of a confocal microscope or multiphoton microscope is a minute area in which light is detected in those microscopes.
  • the illumination light is Corresponds to the focused region (in the confocal microscope, it is determined in particular by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the luminescent particles emit light without illumination light, for example, chemiluminescence or biological In the case of particles that emit light by light emission, illumination light is not required in the microscope.
  • the term “signal” refers to a signal representing light from the luminescent particles unless otherwise specified.
  • the scanning molecule counting method which is the basic configuration of the present invention, first, the position of the photodetection region is moved in the sample solution, that is, the light is passed through the sample solution. Light is sequentially detected while scanning with the detection region. Then, when the moving light detection region includes light emitting particles moving at random, it is expected that light from the light emitting particles is detected, and thereby the presence of one light emitting particle is detected. Therefore, the light signals from the luminescent particles are detected individually in the sequentially detected light, thereby detecting the presence of the particles individually one by one, and in the solution of particles. Various information regarding the state is acquired.
  • the light detection region moving process, the light detection process, and the luminescent particle detection process are not performed over a fixed measurement time, but as described above, Iterate until the number of signals from reaches a predetermined number. Then, the time required for detecting a predetermined number of luminescent particles is measured, and the sample solution is based on the time required for the number of signals from the luminescent particles to reach a predetermined number. The concentration of the luminescent particles therein is determined. According to such a configuration, the higher the concentration of the luminescent particles, the more the number of detected luminescent particles reaches a predetermined number in a shorter time.
  • the measurement time is optimized according to the concentration of the luminescent particles. Further, if the predetermined number is set to a number that achieves the accuracy required for the result, the time required for detecting the predetermined number of luminescent particles in the low concentration sample solution of luminescent particles or Variations in an arbitrary result derived therefrom are suppressed to a small level, and the accuracy of the result can be satisfied.
  • the concentration of the luminescent particles is reflected in the time required for the number of signals from the luminescent particles to reach a predetermined number. It should be understood that the number of signals can be determined based on the time taken to reach a predetermined number. Specifically, the concentration of the luminescent particles may be calculated using an arbitrary function of the time required for the number of signals from the luminescent particles to reach a predetermined number.
  • the number of detected luminescent particles that is, a predetermined number
  • the detection speed of the luminescent particles determined based on the time required for the number of signals from the luminescent particles to reach a predetermined number ( The number of detections per unit time) is proportional to the concentration of the luminescent particles and is therefore advantageously used.
  • the light from the sample solution is detected in the light detection region moving process and the light detection process, and the light emitting particles are detected in the light emitting particle detection process from the obtained data.
  • This process is a method in which when the detection of light is performed over a fixed measurement time, after the detection of light over the fixed measurement time is completed, the obtained data is analyzed collectively. Achievable.
  • the light detection region moving process, the light detection process, and the light emitting particle detection process are performed during a period until the number of signals from the light emitting particles reaches a predetermined number. And may be repeated at predetermined time intervals.
  • the predetermined time interval may be fixed, and is corrected based on the number of detected luminescent particles so far in a period until the number of signals from the luminescent particles reaches a predetermined number. May be. In particular, in the latter case, it is possible to adjust a predetermined time interval when repeating the above series of processes according to the detection state of the luminescent particles in the sample solution after actually starting the measurement. Optimization can be further improved.
  • the process of estimating the time required for the number of signals from the luminescent particles to reach a predetermined number may be performed. Specifically, for example, after the start of detection, the detection speed of the luminescent particles is determined based on the elapsed time after the start of detection and the number of detected luminescent particles so far, and from the detection speed of the luminescent particles, It is possible to estimate the time required for the number of signals to reach a predetermined number. According to such a configuration, it is possible to predict when the measurement time will end, which is useful information for the experimenter.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is appropriately changed based on the characteristics of the luminescent particles or the concentration in the sample solution. May be.
  • the moving speed of the light detection region is increased, the amount of light obtained from one light emitting particle is reduced, so that light from one light emitting particle can be measured with high accuracy or sensitivity.
  • the moving speed is preferably changed as appropriate.
  • the movement speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably based on the diffusion movement speed of the luminescent particles (average movement speed of the particles due to Brownian motion). Is also set high.
  • the luminescent particles are individually detected.
  • a signal (representing its presence) is detected multiple times from one luminescent particle. It is difficult to make the detected signal correspond to the presence of one luminescent particle.
  • the moving speed of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles, so that one luminescent particle can correspond to one signal. Since the diffusion movement speed varies depending on the luminescent particles, it is preferable that the movement speed of the light detection region is appropriately changed according to the characteristics of the luminescent particles as described above.
  • the change of the optical path of the optical system for moving the position of the light detection area may be performed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path using a galvanometer mirror employed in a laser scanning optical microscope.
  • the movement path of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the optical path of the optical system since the optical path of the optical system is changed to move the position of the light detection region, the light detection region can be moved quickly and in the sample solution.
  • the luminescent particles in the sample solution are not affected by the mechanical action (in the absence of artifacts) Measurement is possible (for example, when a flow is generated in a sample, it is difficult to always provide a uniform flow rate, the apparatus configuration is complicated, and the amount of sample required is greatly increased. The hydrodynamic action of the flow can alter or denature luminescent particles or other materials in the solution.) Further, since a configuration in which the sample solution is circulated is not necessary, measurement and analysis can be performed with a very small amount of sample solution (about 1 to several tens of ⁇ L) as in the case of FCS or the like.
  • the object of the present invention described above is to provide light from luminous particles that are dispersed and randomly moved in a sample solution using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • a light detection region moving unit that moves the position of the light detection region of the optical system in the sample solution by changing the optical path of the optical system of the microscope, and a light detection region from the light detection region
  • a light detection unit that detects light
  • a signal processing unit that individually detects a signal from each of the luminescent particles detected by the light detection unit while moving the position of the light detection region in the sample solution.
  • the movement of the position of the light detection region of the optical system by the light detection region moving unit and the light detection region by the light detection unit Light detection and signal processing
  • the detection of signals from the luminescent particles is repeated, and the concentration of the luminescent particles in the sample solution is determined based on the time required for the number of signals from the luminescent particles to reach a predetermined number. Achieved by the device.
  • the concentration of the luminescent particles is based on the detection speed of the luminescent particles determined based on the time required for the number of signals from the luminescent particles to reach a predetermined number. May be determined. Further, in the apparatus of the present invention described above, in the period until the number of signals from the luminescent particles reaches a predetermined number, the position of the light detection region of the optical system is moved by the light detection region moving unit, The detection of the light from the light detection region by the light detection unit and the detection of the signal from the luminescent particles by the signal processing unit may be configured to repeat at predetermined time intervals.
  • the predetermined time interval may be an arbitrarily fixed time interval, or in the period until the number of signals from the luminescent particles reaches a predetermined number, detection of the luminescent particles so far Means for correcting the predetermined time interval based on the number may be provided to improve the optimization of the predetermined time interval and measurement time. Furthermore, in the above-described apparatus of the present invention, in the period until the number of signals from the luminescent particles reaches a predetermined number, based on the number of detected luminescent particles so far, Means for estimating the time required for the number of signals to reach a predetermined number may be provided so that the experimenter can know the end time of detection of the luminescent particles.
  • the number of signals from the luminescent particles estimated based on the number of signals from the luminescent particles detected by the signal processing unit after the start of detection of the signal from the luminescent particles is calculated.
  • Luminescent particle detection that displays the number of signals from the luminescent particles detected by the signal processing unit after the start of detection of the signal from the measurement end time display unit and / or luminescent particles that displays the time until a predetermined number is reached
  • a number display section may be provided, and this configuration is advantageous because the experimenter can predict the time until the end of detection of the luminescent particles.
  • the movement of the position of the light detection region by the light detection region moving unit is performed at a predetermined speed or a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent particles.
  • the movement speed of the position of the light detection region may be arbitrarily set.
  • the optical analysis technique according to the present invention is typically used for biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, and particulate biological objects such as viruses and cells. Used for analysis or analysis of conditions in solution, but may be used for analysis or analysis of conditions in solution of non-biological particles (eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.) It should be understood that such a case also belongs to the scope of the present invention.
  • non-biological particles eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.
  • the measurement time can be optimized according to the concentration of the luminescent particles in the sample solution.
  • the concentration of the luminescent particles is unknown by setting the predetermined number that the number of signals from the luminescent particles should reach to a number that achieves the accuracy required for the results for any experiment or measurement. Even in this case, it is expected that an accurate detection result can be obtained regardless of the actual concentration.
  • the concentration of the luminescent particles is individually detected and determined, the luminescent particles have a relatively low concentration in the sample solution, and the light is emitted by the conventional method. Even luminescent particles buried in light from other luminescent particles can be detected and their presence can be observed. Such characteristics are expected to be applied to detection of reaction products having a relatively low reaction rate and relatively few intermediate products.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer that realizes the optical analysis technique of the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (observation region of a confocal microscope).
  • FIG. 1C is a schematic diagram of a mechanism for changing the direction of the mirror 7 to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • FIGS. 2A and 2B are a schematic diagram for explaining the principle of light detection in the scanning molecule counting method constituting a part of the photoanalysis technique of the present invention, and time variation of measured light intensity, respectively.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the principle of the present invention, and shows time-series light intensity data (time change of light intensity) obtained by a scanning molecule counting method for a certain sample solution.
  • A schematically shows light intensity data when the concentration of the luminescent particles in the sample solution is low
  • B shows light intensity data when the concentration of the luminescent particles in the sample solution is high. Is schematically shown.
  • FIG. 3C is a diagram schematically showing the passage area of the light detection area CV.
  • FIG. 4 is a flowchart showing one embodiment of a processing procedure in the optical analysis technique of the present invention in the form of a flowchart.
  • FIG. 5 is a flowchart showing an example of a processing procedure executed at every analysis time interval t according to the scanning molecule counting method executed at step 30 in the flowchart of FIG. 4 or FIG.
  • FIGS. 6A and 6B show the case where the luminescent particles traverse the light detection region while performing Brownian motion and the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent particles. It is a model figure showing the mode of movement of particles when luminous particles cross a photodetection region by moving.
  • FIG. 6C shows a detection signal in the processing procedure shown in FIG. 5 for detecting the presence of luminescent particles from the measured time-series light intensity data (time change of photon count) according to the scanning molecule counting method.
  • FIG. 7 shows an actual measurement example (bar graph) of measured photon count data, a curve (dotted line) obtained by smoothing the data, and a Gaussian function (solid line) fitted in the pulse existence region.
  • a signal labeled “noise” is ignored as it is a signal due to noise or foreign matter.
  • FIG. 8A is a flowchart showing another embodiment of the processing procedure in the optical analysis technique of the present invention.
  • FIG. 8B is a diagram showing an example of setting and correction processing of the analysis time interval t executed in step 20 ′ in FIG. 8A in the form of a flowchart.
  • FIG. 8B is a diagram showing an example of setting and correction processing of the analysis time interval t executed in step 20 ′ in FIG. 8A in the form of a flowchart.
  • FIG. 9A shows the number of luminescent particles detected in five trials performed according to the scanning molecule counting method for each of the sample solutions containing the fluorescent dye ATTO633 at 100 fM, 1 pM and 10 pM, respectively.
  • the time change of variation (CV value) is shown.
  • FIG. 9B shows variation in measurement time (CV value of particle detection time) required for detection for each number of detected luminescent particles in five trials for each sample solution in FIG. 9A. Shows the change with respect to the number of detected luminescent particles.
  • FIG. 10 shows an experimental example of changes in the detection speed of the luminescent particles detected by the scanning molecule counting method with respect to the concentration of the luminescent particles (fluorescent dye ATTO633) in the sample solution.
  • FIG. 11 is an example of the time change of the photon count (light intensity) obtained in the conventional optical analysis technique for calculating the fluctuation of the fluorescence intensity.
  • FIG. 11A shows that the concentration of particles in the sample is sufficient. This is a case where measurement accuracy is given, and (B) is a case where the concentration of particles in the sample is significantly lower than in (A).
  • the optical analysis technique according to the present invention has a basic configuration in which an optical system of a confocal microscope capable of executing FCS, FIDA, etc., as schematically illustrated in FIG. It can be realized by an optical analysis device that combines a light detector and a photodetector.
  • an optical analyzer 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the optical analyzer 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope, in which the laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagated through the single mode fiber 3 is a fiber.
  • the light is emitted as a divergent light at an angle determined by a specific NA at the outgoing end of the light, becomes parallel light by the collimator 4, is reflected by the dichroic mirror 5, the reflection mirrors 6, 7, and the objective lens 8. Is incident on.
  • a microplate 9 in which a sample container or well 10 into which a sample solution of 1 to several tens of ⁇ L is dispensed is typically arranged is emitted from the objective lens 8.
  • the laser light is focused in the sample solution in the sample container or well 10 to form a region with high light intensity (excitation region).
  • luminescent particles that are the object of observation typically molecules to which a luminescent label such as a fluorescent dye has been added are dispersed or dissolved, and when the luminescent particles enter the excitation region, they emit light during that time. The particles are excited and light is emitted.
  • the emitted light (Em) passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, is collected by the condenser lens 12, and passes through the pinhole 13.
  • the pinhole 13 is disposed at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8, and is schematically shown in FIG.
  • the focal region of the laser light illustrated in FIG. 1B is a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 to 10 fL, and is referred to as a confocal volume.
  • the light intensity is typically a Gaussian or Lorentzian distribution with the center of the region at the apex, and the effective volume is bounded by the surface where the light intensity is 1 / e 2.
  • the light passing through the pinhole 13 passes through the barrier filter 14 via the dichroic mirror 14a (here, only the light component in a specific wavelength band is selected) and is introduced into the multimode fiber 15.
  • the light reaches the corresponding photodetector 16 and is converted into a time-series electrical signal, which is then input to the computer 18 and processed for optical analysis in a manner described later.
  • the photodetector 16 an ultrasensitive photodetector that can be used for photon counting is preferably used, so that light from one luminescent particle, for example, one or several fluorescent dye molecules can be used. The weak light can be detected.
  • the optical path of the optical system is further changed, and the sample solution is scanned by the light detection region, that is, the focal region (ie, the light detection in the sample solution).
  • a mechanism is provided for moving the position of the region.
  • a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed as schematically illustrated in FIG.
  • Such a mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope.
  • the mirror deflector 17 is driven in cooperation with light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof (so that various movement patterns can be selected by the program in the computer 18). It may be.)
  • the position of the light detection region may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 up and down.
  • mechanical vibrations and hydrodynamic actions are substantially caused in the sample solution. It is possible to eliminate the influence of mechanical action on the observation object, and to achieve stable measurement.
  • a stage (not shown) of the microscope is provided with a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 in order to change the well 10 to be observed. Good.
  • the operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed.
  • the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • the optical systems 2 to 5 for generating excitation light may be omitted.
  • a plurality of excitation light sources 2 may be provided, and the wavelength of the excitation light can be appropriately selected according to the wavelength of the light for exciting the luminescent particles. Good.
  • a plurality of photodetectors 16 may be provided, and when a plurality of types of luminescent particles having different wavelengths are included in the sample, light from them can be detected separately according to the wavelength. It's okay.
  • the method of the present invention can be simply described as one light from a luminescent particle by a confocal microscope (or multiphoton microscope) as described above.
  • the “scanning molecule counting method” in which detection is performed one by one, the movement of the light detection region, detection of light, and detection of the luminescent particles are repeated until the number of signals from the luminescent particles reaches a predetermined number.
  • the concentration of the luminescent particles in the sample solution is determined based on the time required for the number of signals to reach a predetermined number.
  • the principle of the scanning molecule counting method and the determination of the luminescent particle concentration according to the present invention will be described.
  • the spectroscopic analysis technology such as FCS and FIDA is superior to the conventional biochemical analysis technology in that it requires a very small amount of sample and can perform inspection quickly. ing.
  • the concentration and characteristics of the luminescent particles are calculated based on fluctuations in fluorescence intensity. As shown schematically in FIG. 11A, the concentration or number density of the luminescent particles is a level at which about one luminescent particle is always present in the light detection region CV during the measurement of the fluorescence intensity. As shown on the right side of the figure, it is required that a significant light intensity (photon count) is always detected during the measurement time.
  • the concentration or number density of the luminescent particles is lower than that, for example, as shown in FIG. 11B, the luminescent particles are at a level that only occasionally enters the light detection region CV. As illustrated on the right side of the figure, a signal with a significant light intensity (photon count) appears only during a part of the measurement time, making it difficult to accurately calculate the fluctuation of the light intensity. Also, if the concentration of the luminescent particles is significantly lower than the level at which about one luminescent particle is always present in the light detection area during the measurement, the light intensity fluctuation is affected by the background. The measurement time is long to easily obtain significant light intensity data sufficient for calculation.
  • a mechanism for moving the position of the light detection region is driven to change the optical path, and the pattern is schematically shown in FIG.
  • FIG. 17 As shown in the drawing, while moving the position of the light detection region CV in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region CV, light detection, that is, measurement of light intensity. Is executed. Then, for example, as shown in FIG.
  • the concentration of the luminescent particles in the sample solution the smaller the number of detected luminescent particles that can be obtained during a given measurement time, and thus the greater the variation and the acceptable or satisfactory accuracy achieved. In order to do so, a longer measurement time is required.
  • the luminescent particles of a solution (A) having a relatively low concentration of luminescent particles and a solution (B) having a relatively high concentration of luminescent particles are scanned by a scanning molecule counting method over a certain measurement time ⁇ .
  • the measurement time is It will be set long enough. In that case, when the concentration of the luminescent particles in the sample solution is high, the measurement of the light intensity is continued for more than the time necessary to determine the characteristics such as the concentration with an acceptable or satisfactory accuracy. Become. In addition, if the concentration of the luminescent particles in the sample solution is lower than the concentration assumed by the experimenter and the set measurement time is insufficient, the error in the result becomes large.
  • the number of luminescent particles is not detected from light intensity data obtained by executing light intensity measurement (that is, light detection) over a fixed measurement time. Without repeating the measurement of the light intensity while moving the light detection region and the detection of the signal of the luminescent particles until the number of signals from the luminescent particles reaches a predetermined number, the number of signals from the luminescent particles is determined in advance. The time required to reach the predetermined number is measured, and the concentration of the luminescent particles is determined based on the time required for the number of signals from the luminescent particles to reach a predetermined number.
  • the concentration of the luminescent particles in the sample solution is high, the time required for measuring the light intensity is shortened, and when the concentration of the luminescent particles in the sample solution is low, the result (that is, the concentration of the luminescent particles). It is possible to continue the measurement of the light intensity until the number of luminescent particles that achieves the accuracy required for the above is obtained. Then, the number of signals from the luminescent particles is determined in advance by setting the predetermined number that the number of signals from the luminescent particles should reach to the number of luminescent particles that achieves the accuracy required for the result. The time taken to reach the number reflects the number of luminescent particles that achieve the required accuracy in the results, so the concentration value of the luminescent particles determined based on that time is acceptable. Or it is expected to have satisfactory accuracy.
  • N A is Avogadro's number.
  • the particle detection speed V per unit time is defined as the time T required for the number of signals from the luminescent particles to reach a predetermined number XE and the number of detected luminescent particles XE.
  • V XE / T
  • the concentration C of the luminescent particles is linearly proportional to the detection speed V, and the correspondence between the concentration C of the luminescent particles and the detection speed V is easy to understand.
  • the concentration C of the luminescent particles may be determined using the detection speed V. (See examples below)
  • the particles to be observed are particles such as dissolved molecules that are dispersed in the sample solution and move randomly in the solution.
  • it may be a biomolecule such as protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid or aggregate thereof, virus, cell, metal colloid, other non-biological particles, etc.
  • the sample solution is typically an aqueous solution, but is not limited thereto, and may be an organic solvent or any other liquid).
  • the particles to be observed may be particles that emit light themselves, or particles to which a light-emitting label (fluorescent molecule, phosphorescent molecule, chemical / bioluminescent molecule) is added in any manner. It may be.
  • the concentration of the luminescent particles in the sample solution can be determined, for example, a solution containing a component with an unknown concentration, the concentration of the luminescent particles before and after the bond dissociation reaction and the intermolecular interaction, and the like.
  • a solution having a varying concentration may be used as the sample solution, and the concentration of the components in the solution, the presence or absence of reaction or interaction, and the degree of progress may be detected.
  • FIG. 4 shows the light intensity of the sample solution in the present embodiment, which is executed using the optical analyzer 1 illustrated in FIG.
  • FIG. 4 is a flowchart showing one example of measurement and emission particle detection / counting processing.
  • a series of movement of the position of the light detection region, detection of light from the light detection region, detection of signals from the luminescent particles and counting of signals of the detected luminescent particles Is repeated at every analysis time interval t (predetermined time interval) until the detected number X of luminescent particles reaches the end particle number XE (a predetermined number that the number of luminescent particles should reach).
  • (I) Initial setting
  • the computer 18 sets an end particle number XE (step 10) and an analysis time interval t (step 20) as initial settings. I do.
  • the number of end particles XE and the analysis time interval t may be arbitrarily set by the user.
  • the number XE of end particles can be appropriately determined with reference to the result of a preliminary experiment using a solution having a known concentration of luminescent particles so that the accuracy required for the result value of the concentration of luminescent particles can be achieved (described later). See Examples).
  • the analysis time interval t is an arbitrary time interval that is sufficiently shorter than the time from the start of processing until the number of luminescent particles (X) reaches the number of end particles (XE). 5 may be set as appropriate in consideration of the processing speed of 5.
  • the end particle number XE and the analysis time interval t values determined in advance with reference to the result of a preliminary experiment using a solution having a known concentration of luminescent particles are stored in the apparatus 1, respectively. Such stored values may be used automatically or by user selection.
  • FIG. 5 shows an example of the processing process in step 30 in the form of a flowchart.
  • the mirror deflector 17 is driven to move the position of the light detection region in the sample solution (scanning in the sample solution). While performing, the light intensity is measured over the analysis time interval t (FIG. 5-step 100).
  • a program stored in a storage device not shown (a procedure for changing the optical path to move the position of the light detection region in the sample solution, excitation light into the light detection region).
  • the photodetector 16 is driven to move the position of the light detection region in the well 10, and at the same time, the photodetector 16 sequentially converts the received light into an electrical signal to convert the computer 18
  • the computer 18 generates and stores time-series light intensity data from the transmitted signal in an arbitrary manner.
  • the photodetector 16 is an ultra-sensitive photodetector that can detect the arrival of one photon, so that the detection of light is performed sequentially at predetermined unit times (BIN TIME), for example,
  • BIN TIME predetermined unit times
  • the photon counting is performed in such a manner that the number of photons arriving at the photodetector every 10 ⁇ s is measured, and the time-series light intensity data may be time-series photon count data.
  • the moving speed of the position of the light detection region in order to carry out the individual detection of the luminescent particles from the measured time-series light intensity data quantitatively and accurately in the scanning molecule counting method, preferably
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity is set to a value faster than the random movement of the luminescent particles, that is, the moving speed due to the Brownian movement.
  • the moving speed of the position of the light detection region is slower than the movement of the particle due to Brownian motion, the particle moves randomly within the region as schematically illustrated in FIG.
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to 10 times or more, for example, 15 mm / s.
  • various movement speeds of the position of the light detection region are set, and the profile of the change in light intensity is expected to be expected (typically, the excitation light intensity distribution and Preliminary experiments for finding conditions that are substantially the same) may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the time-series light intensity data when the locus of one luminescent particle passing through the light detection region is substantially linear as shown in FIG. 6B, a signal corresponding to the particle.
  • the change in the light intensity in FIG. 6 has a substantially bell-shaped profile reflecting the light intensity distribution in the light detection region (determined by the optical system) (see the top row in FIG. 6C). Therefore, in the scanning molecule counting method, basically, when the time duration in which the light intensity exceeds an appropriately set threshold value is within a predetermined range, a signal having the light intensity profile is detected as one particle. It may be determined that it corresponds to having passed through the region, and one luminescent particle may be detected.
  • a signal whose duration of light intensity exceeding the threshold is not within a predetermined range is determined as a noise or foreign matter signal.
  • Expression (8) Can be assumed that the intensity A and the width a calculated by fitting Expression (8) to a significant light intensity profile (a profile that can be clearly determined not to be background) are within a predetermined range.
  • a signal whose intensity A and width a are outside the predetermined range is determined as a noise or foreign object signal and may be ignored in the subsequent analysis or the like.
  • time-series light intensity data (FIG. 6 (C), uppermost “detection result (unprocessed) ”) Is subjected to smoothing (smoothing) processing (step 110 in FIG. 5 and“ smoothing ”in the upper part of FIG. 6C).
  • smoothing smoothing
  • the smoothing process may be performed by, for example, a moving average method.
  • the parameters for executing the smoothing process are the moving speed (scanning of the position of the light detection region at the time of acquiring the light intensity data).
  • Speed scanning of the position of the light detection region at the time of acquiring the light intensity data.
  • BIN TIME may be set as appropriate.
  • a smoothing process is performed in order to detect a time region (pulse existing region) where a significant pulse-like signal (hereinafter referred to as “pulse signal”) exists.
  • a first derivative value with respect to time of the subsequent time-series light intensity data is calculated (step 120).
  • the time differential value of the time-series light intensity data has a large change in the value at the time of change of the signal value, as illustrated in the lower “time differential” in FIG. By reference, significant signal start and end points can be advantageously determined.
  • a significant pulse signal is sequentially detected on the time-series light intensity data, and it is determined whether or not the detected signal is a signal corresponding to the luminescent particles. Specifically, first, on the time-series time differential value data of the time-series light intensity data, with reference to the time differential value sequentially, the start point and the end point of one pulse signal are searched and determined, A pulse presence region is identified (step 130). When one pulse existence region is specified, a bell-shaped function fitting is performed on the smoothed time-series light intensity data in the pulse existence region (see FIG. 6C, “bottom-shaped function fitting”).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function as shown in Expression (8), but may be a Lorentz-type function. Whether or not the calculated bell-shaped function parameter is within a range assumed for the bell-shaped profile parameter drawn by the pulse signal detected when one luminescent particle passes through the light detection region, That is, it is determined whether or not the peak intensity, pulse width, and correlation coefficient of the pulse are within predetermined ranges (step 150). Thus, as shown in the left of FIG.
  • the signal determined that the calculated bell-shaped function parameter is within the range assumed in the signal corresponding to one luminescent particle is one luminescent particle.
  • one luminescent particle is detected and counted as one luminescent particle (the number of particles x is incremented by one, step 160).
  • a pulse signal whose calculated bell-shaped function parameter is not within the assumed range is ignored as noise.
  • step 170 The search, determination and counting of the pulse signal in the processing of the above steps 130 to 160 are repeatedly executed over the entire area of the time series light intensity data over the analysis time interval t (step 170).
  • the process which detects the signal of a luminescent particle separately from time series light intensity data is not restricted to said procedure, You may perform by arbitrary methods.
  • step 30 ends and step 40 is executed.
  • Steps 30 to 40 are performed until the total number of detected luminescent particles X (tn) reaches the number XE of end particles, that is, X (t n ) ⁇ XE (10) Is repeated at each analysis time interval t until the above is established (step 50).
  • the equation (10) is satisfied while the steps 30 to 50 are repeated, the processing of the measurement of the light intensity of the sample solution and the detection / counting of the luminescent particles is completed.
  • the end time TE may be stored (step 60).
  • each process indicated by a dotted line in the drawing is executed. Specifically, first, the latest detected total number X (tn) of the luminescent particles calculated in step 40 is displayed on the display (step 52). If the repeated execution of steps 30 to 50 has already been performed, the value of the total number of detected luminescent particles X (tn) is updated. Next, in order to calculate the measurement end time TE or the measurement remaining time Tr, the detection speed v of the luminescent particles after the start of the processing of Steps 30 to 50 is calculated (Step 54).
  • Tp is the current time.
  • Tr the remaining measurement time Tr (the time until the processing of steps 30 to 50 is finished)
  • Tr (XE ⁇ X (t n )) / v (12)
  • steps 30 to 50 in FIG. 4 and steps 100 to 170 in FIG. 5 are repeated at every analysis time interval t.
  • the measurement of the light intensity in step 100 of FIG. 5 may be continuously performed from the start to the end of the measurement even during the execution of signal processing steps other than step 100. That is, in the processing cycle of FIGS. 4 to 5, when the measurement of the light intensity in step 100 over the analysis time interval t of one cycle is completed, the measurement of step 100 over the analysis time interval t of the next cycle is completed.
  • the computer 18 detects and counts the signal of the luminescent particles from the light intensity data acquired over the analysis time interval t of the completed cycle. Will be executed. Thereby, detection / counting of luminescent particles is achieved in real time.
  • the concentration of the luminescent particles is calculated by calculating the particle detection speed V from the time T until reaching the number of end particles and the number of end particles XE using the equation (3), and detecting the particle detection speed. From V, it is determined using the relationship of equation (4).
  • the cross-sectional area S of the passage region of the light detection region in the equations (1) to (4) is theoretically calculated based on the wavelength of the excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system.
  • control solution the measurement of light intensity and luminescence described above under the same conditions as the measurement of the sample solution to be examined. It may be determined from the number of luminescent particles detected by detecting and counting particles and the concentration of luminescent particles in the control solution.
  • the number of detected luminescent particles is N in the measurement of light intensity performed for a certain time ⁇ o at a moving speed uo for a control solution having a concentration C of luminescent particles.
  • a control solution a plurality of solutions having different concentrations of luminescent particles are prepared, measurement is performed on each, and the calculated average value of S is adopted as the cross-sectional area S of the light detection region. It's okay.
  • the cross-sectional area S of the light detection region may be given by any method, for example, using FCS or FIDA, without depending on the above method.
  • the relationship between the concentration C of various standard luminescent particles and the number N of luminescent particles (formula (14)) regarding the assumed movement pattern of the light detection region. ) May be stored in advance in the storage device of the computer 18 so that the user can use the information stored as appropriate when the user of the device performs optical analysis.
  • FIG. 8A shows the measurement of the light intensity of the sample solution configured to include the process (step 20 ′) for correcting the analysis time interval t according to the detection state of the luminescent particles, and the process of detecting and counting the luminescent particles. Is represented in the form of a flowchart, and FIG. 8B represents the calculation processing of the analysis time interval t in step 20 ′ in the form of a flowchart.
  • the same step number is assigned to the same process as in FIG.
  • the analysis time interval t is corrected every time the measurement of the light intensity over the analysis time interval t is completed (step 20 ′). Further, the processing of the example shown in the drawing is a predetermined number of times N (hereinafter referred to as “scheduled number of updates”) in one measurement from the start until the number of luminescent particles reaches the end particle number XE. .) Only, the light intensity measurement and luminous particle detection / counting processing cycles are configured to be executed. Specifically, as an initial setting, first, after setting the number XE of end particles (step 10) and storing the start time Ts (step 25), first the measurement of light intensity and the detection / counting of luminescent particles are performed.
  • the total number of detected luminescent particles X (t n ) and / or the measurement end time TE or the remaining measurement time Tr are displayed on a display device such as the monitor of the computer 18. (Steps 52 and 58). Further, when the number of luminescent particles reaches the end particle number XE in the first processing cycle, the process of measuring the light intensity and detecting / counting the luminescent particles is finished as it is (step 50).
  • the analysis time interval t is determined by using the remaining measurement time Tr, the scheduled update count N, and the execution count k of the processing cycle.
  • Tr Tr / (N ⁇ k) (15) (Step 240).
  • a lower limit may be set for the calculated analysis time interval t, and when the analysis time interval t falls below the lower limit value tmin, the analysis time interval t may be set to the lower limit value tmin (step 250, 260).
  • the measurement remaining time Tr reflects the detection state of the luminescent particles in the sample solution to be observed. However, it is optimized according to the detection situation of such luminescent particles.
  • the measurement of the light intensity and the detection / counting of the luminescent particles are performed.
  • the time required for measuring the light intensity and detecting / counting the luminescent particles according to the concentration of the luminescent particles in the sample solution Will increase or decrease.
  • the predetermined number that the number of signals from the luminescent particles should reach to a number that can achieve the accuracy required for the result, it is acceptable without requiring more measurement time than necessary. It is possible to obtain a satisfactory or satisfactory result.
  • the detection and counting of the luminescent particles are performed by the scanning molecule counting method, and the characteristics of the variation in the number of detected luminescent particles are confirmed. It was verified that the concentration of the luminescent particles can be detected as accurately as possible in the shortest possible time, while minimizing the dispersion of the results, regardless of the particle concentration.
  • ATTO633 (Sigma-Aldrich, Cat. No. 18620) was dissolved in a PBS buffer containing 0.05% Tween 20 so as to have concentrations of 100 pM, 10 pM, 1 pM, and 100 fM.
  • a solution was prepared.
  • a single molecule fluorescence measurement device MF-20 (Olympus Corporation) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system is used as an optical analysis device.
  • time-series light intensity data photon count data
  • smoothing processing is performed on the time-series light intensity data obtained above according to the processing procedure described in “(2) (ii) (b) Detection of signal corresponding to luminescent particles” above.
  • the start point and end point of the pulse signal are determined, and a Gaussian function is fitted to each pulse signal by the least square method to obtain the peak intensity (in the Gaussian function) and the pulse width (in the Gaussian function). Full width at half maximum), the correlation coefficient was determined.
  • FIG. 9 (A) shows a change in the variation in the number of detected luminescent particles with respect to the length of the measurement time in the scanning molecule counting method.
  • the horizontal axis is the length of measurement time
  • the CV value in the corresponding measurement time length is shown.
  • the CV value of the sample solutions of 10 pM, 1 pM, and 100 fM was decreased as the measurement time was increased. Further, as apparent from the comparison of the values of the three sample solutions, it was confirmed that the lower the concentration, the longer it takes for the CV value to become sufficiently small.
  • the measurement time required until the variation in the number of detected luminescent particles falls within an allowable range depending on the concentration of the luminescent particles in the sample solution.
  • FIG. 9B shows a change in variation in measurement time (particle detection time) required to obtain the number of detections with respect to the number of detections of luminescent particles in the scanning molecule counting method.
  • the CV value of the particle detection time hardly depended on the luminescent particle concentration.
  • the measurement time is 14 seconds or more, whereas in the case of a solution of 10 pM, It was shown that the measurement time may be about 0.18 seconds. This indicates that, in the scanning molecule counting method, the measurement time required to obtain a result with high accuracy while suppressing variation is different depending on the concentration of the luminescent particles.
  • the light intensity is measured in the measurement time according to the concentration of the luminescent particles by the aspect of performing the light intensity measurement up to the predetermined number of the detected luminescent particles according to the present invention, and more than necessary. It was shown that it was possible to avoid spending time on measurement. In particular, it should be understood that the measurement time can be significantly reduced when the concentration of the luminescent particles is high.
  • FIG. 10 shows a diagram in which the particle detection speed calculated from the measurement time up to 150 detections for each sample solution is plotted against each concentration.
  • the particle detection speed is proportional to the dye concentration, which suggests that the relationship of the above formula (4) is established. Therefore, it has been shown that the concentration of the luminescent particles in the sample solution can be determined based on the particle detection speed or the measurement time required to detect a predetermined number of luminescent particles.
  • the light intensity measurement and the detection of the luminescent particles while moving the light detection region are performed.
  • the measurement time is optimized while minimizing the dispersion of the results by performing until the number of signals from the luminescent particles reaches a predetermined number. It is possible to complete the measurement for detecting the number of luminescent particles that achieve the required accuracy in as short a time as possible.
  • the present invention individually detects the signal of the luminescent particles, the luminescent particles can be detected even if the concentration of the luminescent particles in the sample solution is lower than the concentration range required by optical analysis technology such as FCS.
  • Such a feature would be advantageous when analyzing rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development.
  • the concentration of the luminescent particles in the sample solution is unknown, the labor, time or cost for trial and error for the measurement time is reduced, so that the application range of the scanning molecule counting method is expanded. It is expected. For example, since the concentration of the luminescent particles in the sample solution is unknown, it is not necessary to set a measurement time longer than necessary when the concentration of the luminescent particles is extremely low.

Abstract

共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光測定を用いた走査分子計数法に於いて、発光粒子の濃度に依らず、結果のばらつきを小さく抑えつつ、測定時間が最適化される。本発明の発光粒子からの光を検出し分析する技術は、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動させながら、光検出領域からの光の強度を検出して、発光粒子の光の信号を個別に検出する処理を発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまで繰り返し発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の発光粒子の濃度を決定する。

Description

単一発光粒子からの光の検出を用いた光分析方法及び光分析装置
　本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析方法及び光分析装置に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする方法及び装置に係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。
　近年の光測定技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の測定技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１－３、非特許文献１－３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域－コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity　Distribution　Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon　Counting　Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に測定されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて測定される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて測定してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。
　特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の測定が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
特開２００５－０９８８７６ 特開２００８－２９２３７１ 特開２００９－２８１８３１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８－０８０４１７ 特開２００７－２０５６５ 特開２００８－１１６４４０ 特開平４－３３７４４６号公報
金城政孝、蛋白質　核酸　酵素　Vol.４４、No.９、１４３１－１４３８頁　１９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４－２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１－２７７頁 カスク他３名、米国科学アカデミー紀要　１９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P.　Kask,　K.　Palo,　D.　Ullmann,　K.　Gall　PNAS　96,　13756-13761　(1999)）
　上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、測定される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの測定時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６～８に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が１ｎＭ未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。
　そこで、本願出願人は、特願２０１０－０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。
　ところで、上記の「走査分子計数法」によって、試料溶液中の発光粒子を個別に検出して、濃度又はその他の特性の決定を行う場合、その結果に要求される精度を達成する数の発光粒子を検出することが好ましい。例えば、走査分子計数法により試料溶液中の発光粒子の濃度を決定するときには、個別に検出された発光粒子の数をカウントし、そのカウント数を測定時間（光の検出を実行する時間）中の光検出領域の通過領域の総体積で割るといった処理が為される。その場合、発光粒子は、試料溶液中にランダムに分散しているので、高精度にて濃度を決定するためには、発光粒子のカウント数が、そのばらつきが小さくなるように、十分な数に達していることが必要となる。発光粒子のカウント数は、試料溶液中の発光粒子の濃度が高いほど、より短時間の間に多くなるので、要求される精度を与える数の発光粒子の検出を達成する測定時間は、発光粒子の濃度が高いほど、より短くなる。換言すれば、「走査分子計数法」により試料溶液中の発光粒子の濃度又はその他の特性の決定を行う場合、発光粒子の濃度に依存して必要な測定時間が異なることとなる。
　しかしながら、観測対象となる発光粒子の試料溶液中での濃度が未知である場合、要求される精度を与える数の発光粒子の検出に要する測定時間が不明であるため、測定時間は、発光粒子の濃度が低い場合でも要求される精度を与える数の発光粒子の検出が為されるように設定されることとなろう。その場合、発光粒子の濃度が高い試料溶液については、測定時間が必要以上に長くなってしまう場合がある。また、発光粒子の濃度によらず、同じ測定時間にて発光粒子の検出を行うと、発光粒子の濃度が高い場合には、結果のばらつきが小さいが、発光粒子の濃度が低い場合には、結果のばらつきが大きくなるといったことが起き得る。
　かくして、本発明の一つの課題は、上記の「走査分子計数法」に於いて、結果に要求される精度を達成する数の発光粒子の検出をできるだけ短期間に終了できるようにする新規な方法及び装置を提供することである。
　また、本発明のもう一つの課題は、上記の「走査分子計数法」に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度に依らず、結果のばらつきを小さく抑えられるようにする新規な方法及び装置を提供することである。
　更に、本発明のもう一つの課題は、上記の「走査分子計数法」に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度に応じて、測定時間を最適化できるようにする新規な方法及び装置を提供することである。
　本発明によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する方法であって、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出する光検出過程と、検出された光から個々の発光粒子からの信号を個別に検出する発光粒子検出過程とを含み、前記の三つの過程を発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまで繰り返し、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の発光粒子の濃度を決定することを特徴とする方法によって達成される。
　かかる本発明の構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する」発光粒子とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。なお、本明細書に於いて、「信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。
　上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることが期待される。従って、逐次的に検出された光に於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。かかる一連の過程、即ち、光検出領域移動過程、光検出過程及び発光粒子検出過程を、試料溶液中の発光粒子の濃度に依らず、或る固定された測定時間に亘って実行する場合、上記の如く、発光粒子の濃度によって、発光粒子の検出数のばらつきが異なるとともに、発光粒子の濃度が高いときには、測定時間が必要以上に長くなってしまう可能性があり、発光粒子の濃度が低いときには、測定に要求される精度を達成する数の発光粒子の検出が達成されない可能性がある。
　そこで、本発明の方法に於いては、光検出領域移動過程、光検出過程及び発光粒子検出過程が、或る固定された測定時間に亘って実行されるのではなく、上記の如く、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまで、繰り返される。そして、予め定められた数の発光粒子が検出されるまでに要した時間を計測して、かかる発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の発光粒子の濃度が決定される。かかる構成によれば、発光粒子の濃度が高いほど、発光粒子の検出数は、より短期間に予め定められた数に達することとなるので、発光粒子の高濃度の試料溶液についての測定時間の短縮が期待され、発光粒子の低濃度の試料溶液についての測定は、十分な時間を費やして実行されることとなる。即ち、上記の構成によれば、発光粒子の濃度に応じて測定時間が最適化される。また、予め定められた数を結果に要求される精度を達成する数に設定しておけば、発光粒子の低濃度の試料溶液についての予め定められた数の発光粒子の検出に要した時間又はそれから導出される任意の結果に於けるばらつきは、小さく抑制され、結果の精度を満足するものとすることが可能となる。
　上記の本発明の方法の構成に於いて、発光粒子の濃度は、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に反映されているので、かかる発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて決定可能であることは理解されるべきである。具体的には、発光粒子の濃度は、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間の任意の関数を用いて算出されてよい。例えば、発光粒子の検出数（つまり、予め定められた数）と、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて決定される発光粒子の検出速度（単位時間当たりの検出数）は、発光粒子の濃度に比例するので、有利に用いられる。
　また、後述の実施形態の欄の説明から理解される如く、光検出領域移動過程及び光検出過程にて試料溶液からの光を検出し、得られたデータから発光粒子検出過程にて発光粒子の存在を検出する上記の一連の過程に於いては、得られたデータの中からノイズを排除して発光粒子の信号を特定する処理が必要となる。かかる処理は、或る固定された測定時間に亘って光の検出が為されるときには、かかる固定された測定時間に亘る光の検出が完了した後に、得られたデータをまとめて分析する手法で達成可能である。しかしながら、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまで発光粒子の検出を実行する場合には、発光粒子からの信号を、光検出領域移動過程及び光検出過程の途中に於いて検出する必要がある。そこで、上記の本発明の方法の構成に於いて、光検出領域移動過程、光検出過程及び発光粒子検出過程は、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて所定の時間間隔毎に繰り返されてよい。かかる所定の時間間隔は、固定されていてもよく、また、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、それまでの発光粒子の検出数に基づいて修正されてもよい。特に、後者の場合、実際に測定を開始した後に試料溶液中の発光粒子の検出状況に応じて、上記の一連の過程を繰り返す際の所定の時間間隔を調整することが可能となり、測定時間の最適化をより向上させることが可能となる。
　更に、上記の本発明の方法の実施の態様の一つとして、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、それまでの発光粒子の検出数に基づいて、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要する時間を推定する過程が実行されてよい。具体的には、例えば、検出開始後に、検出開始後の経過時間とそれまでの発光粒子の検出数とに基づいて、発光粒子の検出速度を決定し、かかる発光粒子の検出速度から発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要する時間を推定することが可能となる。かかる構成によれば、測定時間が何時終了するのかが予測可能となり、実験者にとって便利な情報となる。
　ところで、上記の本発明の構成に於ける光検出領域の位置の移動に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の濃度に基づいて適宜変更されてよい。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、１つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく測定できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。
　更に、上記の光検出領域の位置の移動に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の方法では、光検出領域が包含した１つの発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（その存在を表す）信号が検出されてしまう可能性があり、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を、１つの信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。
　光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動経路は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。なお、本発明に於いては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、試料溶液中の発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく（アーティファクトの無い状態で）安定した状態にて、光の測定が可能である（例えば、試料に流れを発生させる場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の発光粒子又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ等の場合と同様に微量（１～数十μＬ程度）の試料溶液にて測定及び分析が可能である。
　上記の本発明の方法は、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら、個々の発光粒子の光の検出が可能な新規な光分析装置により実現される。かくして、本発明のもう一つの態様に於いて、上記の本発明の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された発光粒子の各々からの信号を個別に検出する信号処理部とを含み、信号処理部が検出した発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域移動部による光学系の光検出領域の位置の移動と、光検出部による光検出領域からの光の検出と、信号処理部による前記発光粒子からの信号の検出とを繰り返し、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の発光粒子の濃度を決定することを特徴とする装置によって達成される。
　上記の本発明の装置に於いても、発光粒子の濃度は、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて決定される発光粒子の検出速度に基づいて決定されてよい。また、上記の本発明の装置は、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、光検出領域移動部による光学系の光検出領域の位置の移動と、光検出部による光検出領域からの光の検出と、信号処理部による発光粒子のからの信号の検出とは、所定の時間間隔毎に繰り返すよう構成されてよい。所定の時間間隔は、任意に固定された時間間隔であってもよく、或いは、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、それまでの発光粒子の検出数に基づいて所定の時間間隔を修正する手段が設けられ、所定の時間間隔及び測定時間の最適化が向上されるようになっていてよい。更に、上記の本発明の装置に於いて、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、それまでの発光粒子の検出数に基づいて、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要する時間を推定する手段が設けられ、実験者が発光粒子の検出の終了時間を知ることができるようになっていてよい。特に、そのために、本発明の装置に於いて、発光粒子からの信号の検出の開始後に信号処理部が検出した発光粒子からの信号の数に基づいて推定される発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの時間を表示する測定終了時間表示部及び／又は発光粒子からの信号の検出の開始後に信号処理部が検出した発光粒子からの信号の数を表示する発光粒子検出数表示部が設けられていてよく、かかる構成によれば、実験者は、発光粒子の検出の終了までの時間を予想できるので、有利である。なお、本発明の上記の装置に於いても、好適には、光検出領域移動部による光検出領域の位置の移動は、所定の速度にて或いは発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて為されてよく、光検出領域の位置の移動速度は、任意に設定されるようになっていてよい。
　本発明による光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
　総じて、本発明によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡に於いて、その光検出領域により試料溶液中を走査することにより、発光粒子の存在を個別に検出する走査分子計数法に於いて、試料溶液中の発光粒子の濃度に応じて測定時間の最適化が可能となる。特に、発光粒子からの信号の数が達するべき予め定められた数を、任意の実験又は計測に合わせてその結果に要求される精度を達成する数に設定することにより、発光粒子の濃度が未知の場合でも、実際の濃度によらず、精度の良い検出結果が得られることが期待される。また、かかる特徴によれば、或る固定された測定時間に亘って光の検出及び発光粒子の検出をする場合に比して、より少ない試行錯誤によって、精度の良い結果が得られることが期待され、実験又は計測に要する手間、労力、時間及び／又は費用の低減が期待される。なお、本発明では、発光粒子を個別に検出しその濃度が決定されるようになっていることから、試料溶液中で相対的に濃度が低い発光粒子であって、その光が従前の方法ではその他の発光粒子からの光に埋没してしまう発光粒子であっても、検出可能であり、その存在が観測可能となる。かかる特徴は、反応率の比較的低い反応の生成物や相対的に数の少ない中間生成物の検出への応用も期待される。
　本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
図１（Ａ）は、本発明の光分析技術を実現する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明の光分析技術の一部を構成する走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び測定される光強度の時間変化の模式図である。 図３は、本発明の原理を説明する図であり、或る試料溶液について走査分子計数法により得られる時系列の光強度データ（光強度の時間変化）を示している。（Ａ）は、試料溶液中の発光粒子の濃度が低い場合の光強度データを模式的に示したものであり、（Ｂ）は、試料溶液中の発光粒子の濃度が高い場合の光強度データを模式的に示したものである。図３（Ｃ）は、光検出領域ＣＶの通過領域を模式的に表した図である。 図４は、本発明の光分析技術に於ける処理手順の一つの実施形態をフローチャートの形式で表した図である。 図５は、図４又は図８のフローチャートに於けるステップ３０にて実行される走査分子計数法に従って解析時間間隔ｔ毎に実行される処理手順の例をフローチャートの形式で表した図である。 図６（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図６（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、測定された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための図５に記載の処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図７は、測定されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 図８（Ａ）は、本発明の光分析技術に於ける処理手順のもう一つの実施形態をフローチャートの形式で表した図である。図８（Ｂ）は、図８（Ａ）のステップ２０’にて実行される解析時間間隔ｔの設定及び修正処理の例をフローチャートの形式で表した図である。 図９（Ａ）は、蛍光色素ＡＴＴＯ６３３を、１００ｆＭ、１ｐＭ、１０ｐＭにてそれぞれ含む試料溶液の各々について走査分子計数法に従って実行された５回の試行実験に於いて検出された発光粒子の数のばらつき（ＣＶ値）の時間変化を示している。図９（Ｂ）は、図９（Ａ）の各試料溶液についての５回の試行実験に於ける、発光粒子の検出数毎に検出に要した測定時間のばらつき（粒子検出時間のＣＶ値）の、発光粒子の検出数に対する変化を示している。 図１０は、試料溶液中の発光粒子（蛍光色素ＡＴＴＯ６３３）の濃度に対する走査分子計数法により検出された発光粒子の検出速度の変化の実験例を示している。 図１１は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な測定精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…検出光用ダイクロイックミラー
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
　以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
光分析装置の構成
　本発明による光分析技術は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図１（Ａ）を参照して、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過する。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。コンフォーカル・ボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、その実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。かくして、ピンホール１３を通過した光は、ダイクロイックミラー１４ａを経て、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、対応する光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、１つの発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。
　また、上記の光分析装置の光学系に於いて、更に、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な測定が達成される。
　なお、追加的な構成として、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。
　発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。また、発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子を励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出できるようになっていてよい。
本発明の原理
　「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の方法は、端的に述べれば、上記の如き共焦点顕微鏡（又は多光子顕微鏡）により発光粒子からの光を一つずつ検出する「走査分子計数法」に於いて、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域の移動、光の検出及び発光粒子の検出を繰り返し、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の発光粒子の濃度を決定するというものである。以下、走査分子計数法及び本発明による発光粒子濃度決定の原理について説明する。
１.走査分子計数法の原理
　ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図１１（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の測定中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、測定時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図１１（Ｂ）に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号（フォトンカウント）が、測定時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、測定中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために測定時間が長くなる。
　そこで、本願出願人は、特願２０１０－０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。
　走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出、即ち、光強度の測定が実行される。そうすると、例えば、図２（Ａ）の如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ～ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、測定された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
２．本発明による発光粒子濃度決定の原理
　上記の如き走査分子計数法に於いて、観測対象である発光粒子は、試料溶液中にランダムに分散しているので、或る測定時間に亘る光検出に於いて得られる発光粒子の検出数には、ばらつきがある（測定を実行する度に検出数が異なる。）。従って、発光粒子の検出数を測定時間中の光検出領域の通過領域の体積で割ることによって得られる発光粒子の濃度など、発光粒子の検出数を用いて導出される任意の特性を許容可能な又は満足する精度にて決定するには、かかる精度を達成するのに要求される数の発光粒子を検出するのに必要な時間に亘って光強度の測定を実行する必要がある。この点に関し、試料溶液中の発光粒子の濃度が低いほど、或る測定時間中に得られる発光粒子の検出数は当然に少なくなるので、ばらつきが大きくなり、許容可能な又は満足する精度を達成するために、より長い測定時間が必要となる。例えば、図３を参照して、発光粒子濃度の比較的低い溶液（Ａ）と発光粒子濃度の比較的高い溶液（Ｂ）とについて、或る測定時間αに亘って走査分子計数法により発光粒子の検出を行う場合、図３（Ａ）、（Ｂ）を比較して理解される如く、図３（Ｂ）に例示されている如き発光粒子濃度の比較的高い溶液について得られた時系列の光強度データに於いては、図３（Ａ）に例示されている如き発光粒子濃度の比較的低い溶液の場合よりも多数の発光粒子の信号が検出されることとなる。従って、例えば、濃度等の特性の決定に許容可能な精度を達成するのに要求される発光粒子の検出数を得るための測定時間が、図３（Ａ）の溶液については時間αが必要だった場合、図３（Ｂ）の溶液については、時間βで十分であるということになる。そして、仮に、図３（Ａ）の溶液について測定を時間βのみしか実行しない場合には、発光粒子の検出数のばらつきが大きくなり、濃度等の結果の誤差が許容可能でない程度に大きくなり得る。
　しかしながら、試料溶液中の発光粒子濃度が未知であるとき、或る固定された測定時間に亘って光強度の測定を行う場合には、発光粒子の濃度が低い場合に備えて、測定時間は、十分に長く設定されることとなる。その場合、試料溶液中の発光粒子の濃度が高い場合には、濃度等の特性を許容可能な又は満足する精度にて決定するのに必要な時間以上に光強度の測定が継続されることとなる。また、試料溶液中の発光粒子濃度が実験者の想定した濃度よりも低く、設定された測定時間が足りない場合には、結果の誤差が大きくなってしまう。
　そこで、本発明に於いては、或る固定された測定時間に亘って光強度の測定（即ち、光の検出）を実行して得られた光強度データから発光粒子数の検出をするのではなく、光検出領域を移動しながらの光強度の測定と発光粒子の信号の検出とを発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまで繰り返し、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間が計測され、かかる発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて、発光粒子の濃度が決定される。かかる構成によれば、試料溶液中の発光粒子濃度が高い場合には、光強度の測定に要する時間は短縮され、試料溶液中の発光粒子濃度が低い場合には、結果（即ち、発光粒子濃度）に要求される精度を達成する発光粒子数が得られるまで光強度の測定を継続させることが可能となる。そして、発光粒子からの信号の数が達するべき予め定められた数を結果に要求される精度を達成する発光粒子数に設定しておくことにより、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間には、結果に要求される精度を達成する発光粒子数が反映されることとなるので、その時間に基づいて決定される発光粒子の濃度値は、許容可能な又は満足する精度を有していることが期待される。
　本発明に従って決定される発光粒子の濃度値は、具体的には、以下の如く、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に関係づけられる。即ち、或る発光粒子の濃度Ｃの試料溶液中に於いて、時間τに亘って、光検出領域を走査速度ｕにて移動させた場合、光検出領域の断面積をＳとすると（図３（Ｃ）参照）、検出される光の信号の数Ｘは、
　　Ｘ＝ＣＳｕτＮＡ　　　…（１）
となる。ここで、ＮＡは、アボガドロ数である。従って、発光粒子からの信号の数が予め定められた数ＸＥに達するのに時間Ｔを要したとすると、発光粒子の濃度Ｃは、
　　Ｃ＝ＸＥ／（ＳＴｕＮＡ）　　　…（２）
により、時間Ｔの関数として与えられる。なお、式（２）に於いて、単位時間当たりの粒子の検出速度Ｖは、発光粒子からの信号の数が予め定められた数ＸＥに達するのに要した時間Ｔと発光粒子検出数ＸＥとに基づいて
　　Ｖ＝ＸＥ／Ｔ　　　…（３）
により与えられるので、発光粒子の濃度Ｃは、
　　Ｃ＝Ｖ／（ＳｕＮＡ）…（４）
と表される。この式（４）に於いては、発光粒子の濃度Ｃが、検出速度Ｖに一次に比例し、発光粒子の濃度Ｃと検出速度Ｖとの対応関係がわかり易いので、実際の実験に於いては、発光粒子の濃度Ｃは、検出速度Ｖを用いて決定されてよい。（下記の実施例参照）
処理操作過程
　図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明による光分析の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定及び発光粒子の検出・計数処理、及び（３）濃度算出等の分析が実行される。
（１）試料溶液の調製
　本発明の光分析技術に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい（試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。）。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が任意の態様にて付加された粒子であってよい。
　なお、本実施形態に於いては、試料溶液中の発光粒子濃度が決定可能であるので、例えば、濃度が未知の成分を含む溶液、結合解離反応や分子間相互作用の前後での発光粒子の濃度が変化する溶液などが試料溶液として用いられ、溶液中の成分の濃度の決定、反応や相互作用の有無、進行の程度が検出されてよい。
（２）試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出・計数
　図４は、図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いて実行される本実施形態に於ける試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理の一つの例をフローチャートの形式にて表したものである。同図の例に於いては、端的に述べれば、光検出領域の位置の移動、光検出領域からの光の検出、発光粒子からの信号の検出及び検出された発光粒子の信号の計数の一連の処理が、解析時間間隔ｔ（所定の時間間隔）毎に、検出された発光粒子数Ｘが終了粒子数ＸＥ（発光粒子数が到達すべき予め定められた数）に到達するまで反復して実行される。なお、以下に述べる一連の処理及び構成は、コンピュータ１８の処理作動により実現されることは理解されるべきである。［（３）濃度算出等の分析、（４）試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理の修正例に於いて同様。］
（ｉ）初期設定
　操作処理に於いて、具体的には、まず、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、初期設定として、終了粒子数ＸＥの設定（ステップ１０）及び解析時間間隔ｔの設定（ステップ２０）を行う。終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔとは、使用者により任意に設定されてよい。終了粒子数ＸＥは、発光粒子の濃度の結果値に要求される精度を達成できるように発光粒子の濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして適宜決定可能である（後述の実施例参照）。解析時間間隔ｔとしては、処理の開始後から発光粒子数（Ｘ）が終了粒子数（ＸＥ）に到達するまでの時間よりも十分に短い任意の時間間隔が、装置１に於ける後述の図５の処理速度等を考慮して適宜設定されてよい。また、終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔとは、それぞれ、発光粒子の濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして予め決定された値が、装置１に於いて記憶され、かかる記憶された値が自動的に又は使用者の選択により使用されるようになっていてもよい。
（ii）発光粒子数の検出
　かくして、終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔの設定が為されると、以下の如く、解析時間間隔ｔ毎に、解析時間間隔ｔに亘る走査分子計数法による光強度の測定処理及び測定された光強度データからの発光粒子の信号の検出並びに発光粒子数ｘの検出（ステップ３０）と、ステップ３０にて検出された発光粒子数ｘを累積して発光粒子の総数Ｘ（ｔｎ）を算定する処理（ステップ４０）とが発光粒子の総数Ｘ（ｔｎ）が終了粒子数ＸＥに到達するまで（ステップ５０）、反復して実行される。なお、ステップ３０～５０の処理の反復実行に先だって、一連の処理の開始時間Ｔｓが記憶されてよい（ステップ２５）。以下、ステップ３０～５０の処理について詳細に説明する。
（ａ）光強度の測定
　図５は、ステップ３０に於ける処理過程の例をフローチャートの形式にて表したものである。同図を参照して、ステップ３０に於ける処理過程に於いては、まず、ミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が解析時間間隔ｔに亘って為される（図５－ステップ１００）。かかる処理では、典型的には、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順、励起光を光検出領域に照射する手順（必要な場合のみ）及び光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射（必要な場合のみ）及び光強度の測定が開始される。測定が開始されると、まず、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、光源２から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器１７がミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に受光した光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を測定する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
　光検出領域の位置の移動速度に関して、走査分子計数法に於いて、測定された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出を、定量的に精度よく実行するために、好適には、光強度の測定中の光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定される。光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図６（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化（発光粒子からの光を表す信号）を特定することが困難となる。そこで、好適には、図６（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域ＣＶを略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが、図６（Ｃ）最上段に例示されている如く励起光強度分布と略同様の略釣鐘状となって、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径ｒの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δτは、平均二乗変位の関係式
　　（２ｒ）２＝６Ｄ・Δτ　　　…（５）
から、
　　Δτ＝（２ｒ）２／６Ｄ　　　…（６）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
　　Ｖdif＝２ｒ／Δτ＝３Ｄ／ｒ　　　…（７）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、ｒが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の、例えば、１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
（ｂ）発光粒子に対応する信号の検出
　上記の処理により解析時間間隔ｔに於ける試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出が実行される。
　時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図６（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する（図６（Ｃ）最上段参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
　　Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２／ａ２）　　　…（８）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（８）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
　時系列光強度データからの発光粒子の検出を行う処理のより具体的な手法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図６（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図５－ステップ１１０、図６（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法等により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ　ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
　次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図６（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
　しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が発光粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図６（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、式（８）の如きガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図７左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなり、一つの発光粒子としてカウントされる（粒子数ｘが１つカウントアップされる。ステップ１６０）。一方、図７右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。
　上記のステップ１３０～１６０の処理に於けるパルス信号の探索、判定及び計数は、解析時間間隔ｔに亘る時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行される（ステップ１７０）。なお、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。解析時間間隔ｔに亘る時系列光強度データの全てに於いてパルス信号の探索が終了すると、ステップ３０は終了し、ステップ４０が実行される。
（ｃ）発光粒子の検出総数の算出
　かくして、解析時間間隔ｔに亘る時系列光強度データに於ける発光粒子数ｘが検出されると、発光粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が
　　Ｘ（ｔｎ）＝Ｘ（ｔｎ－１）＋ｘ　　　…（９）
により算出される（図４－ステップ４０）。なお、Ｘ（ｔｎ－１）は、前回の解析時間間隔ｔまでに検出された粒子の検出総数であり、その初期値は０である。そして、ステップ３０～４０は、発光粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が終了粒子数ＸＥに到達するまで、即ち、
　　Ｘ（ｔｎ）≧ＸＥ　　　…（１０）
が成立するまで（ステップ５０）、解析時間間隔ｔ毎に繰り返される。かくして、ステップ３０～５０を反復しているうちに、式（１０）が成立すると、試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出・計数との処理が終了する。ステップ３０～５０の反復処理が終了すると、終了時間ＴＥが記憶されてよい（ステップ６０）。
（ｄ）発光粒子数と測定終了時間の表示
　解析時間間隔ｔ毎にステップ３０～５０の反復実行期間に於いて（式（１０）が成立するまで）、コンピュータ１８のモニター上などの表示器に、発光粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）及び／又は測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示されるようになっていてよい。かかる構成によれば、使用者は、それらの表示を見ることによって、実行中の測定がいつ頃終了するのかを予測することができる点で有利である。
　上記の如き表示を実行する場合には、図４のステップ５０の判定に於いて、式（１０）が成立しなかった場合に、図中、点線にて示された各処理が実行される。具体的には、まず、ステップ４０に於いて算定された最新の発光粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が表示器上に表示される（ステップ５２）。なお、既にステップ３０～５０の反復実行が為されている場合には、それまでの発光粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）の値が更新される。次いで、測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒを算出するために、ステップ３０～５０の処理の開始後からの発光粒子の検出速度ｖが算出される（ステップ５４）。現在までの発光粒子の検出速度ｖは、
　　ｖ＝Ｘ（ｔｎ）／（Ｔｐ－Ｔｓ）　　　…（１１）
により与えられてよい。ここで、Ｔｐは、現在の時刻である。かくして、発光粒子の検出速度ｖを用いて、測定残り時間Ｔｒ（ステップ３０～５０の処理終了までの時間）が、
　　Ｔｒ＝（ＸＥ－Ｘ（ｔｎ））／ｖ　　　…（１２）
により推定され、また、測定終了時間ＴＥ（ステップ３０～５０の処理が終了する時間）が、
　　ＴＥ＝Ｔｐ＋Ｔｒ　　　…（１３）
により推定される（ステップ５６）。そして、推定された測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示器上に表示される（ステップ５８）。なお、既にステップ３０～５０の反復実行が為されている場合には、既に表示されている値が更新される。また、Ｘ（ｔｎ）＝０のときは、式（１２）又は（１３）は、演算されずに、Ｔｒ及びＴＥは、不明であると表示されてよい。
　なお、既に述べた如く、上記の図４のステップ３０～５０、図５のステップ１００～１７０の処理は、解析時間間隔ｔ毎に繰り返される。この点に関し、図５のステップ１００の光強度の測定は、測定の開始から終了まで、ステップ１００以外の信号処理ステップの実行中も連続的に実行されてよい。即ち、図４～５の処理サイクルに於いては、一つのサイクルの解析時間間隔ｔに亘るステップ１００の光強度の測定が完了されると、次のサイクルの解析時間間隔ｔに亘るステップ１００の光強度の測定がそのまま連続して実行されると同時に、コンピュータ１８に於いて、完了したサイクルの解析時間間隔ｔに亘って取得された光強度データからの発光粒子の信号の検出・計数の処理が実行されることとなる。これにより、リアルタイムに発光粒子の検出・計数が達成されることとなる。
（３）濃度算出等の分析
　かくして、発光粒子数が終了粒子数に到達すると、発光粒子数が終了粒子数に到達するまでの時間Ｔ（＝ＴＥ－Ｔｓ）或いは検出された発光粒子の信号から得られるその他の情報を用いて、濃度算出等の分析が実行されてよい（ステップ７０）。
　発光粒子の濃度は、既に述べた如く、式（３）を用いて、終了粒子数に到達するまでの時間Ｔと終了粒子数ＸＥとから、粒子の検出速度Ｖを算出し、粒子の検出速度Ｖから、式（４）の関係を用いて決定される。
　なお、式（１）～（４）中の光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出・計数を行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、移動速度ｕｏにて或る時間τｏに亘って実行された光強度の測定に於ける発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、
　　　Ｓ＝Ｎ／（Ｃ・ＮＡ・ｕｏ・τｏ）　　　…（１４）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＳの平均値が光検出領域の断面積Ｓとして採用されるようになっていてよい。なお、光検出領域の断面積Ｓは、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（１４））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
（４）試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理の修正例
　上記の試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理に於いて、別の態様として、解析時間間隔ｔは、固定値ではなく、発光粒子の検出状況に応じて修正されるようになっていてもよい。図８（Ａ）は、解析時間間隔ｔを発光粒子の検出状況に応じて修正する処理（ステップ２０’）を含むよう構成された試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理をフローチャートの形式で表したものであり、図８（Ｂ）は、ステップ２０’に於ける解析時間間隔ｔの演算処理をフローチャートの形式で表したものである。なお、図８（Ａ）に於いて、図４と同一の処理には、同一のステップ番号が付されている。
　同図を参照して、図８の処理では、解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定が完了する毎に解析時間間隔ｔが修正される（ステップ２０’）。また、図示の例の処理は、特に、開始から発光粒子数が終了粒子数ＸＥに到達するまでの一回の測定に於いて、予め定められた回数Ｎ（以下、「更新予定回数」と称する。）だけ、光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理サイクルが実行されるよう構成される。具体的には、まず、初期設定として、終了粒子数ＸＥの設定（ステップ１０）及び開始時間Ｔｓの記憶（ステップ２５）の後、最初に光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理を実行する際、即ち、光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理サイクルの実行回数ｋが０のとき、解析時間間隔ｔに、任意に設定されてよい初期値ｔｏが与えられる（図８（Ｂ）ステップ２００、２１０参照）。そして、処理サイクルの実行回数ｋが１増大され（ステップ２７０）、図４に記載の処理と同様に解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定及び発光粒子の検出・計数の処理が実行される（ステップ３０～５０）。かくして、最初のサイクルの発光粒子数ｘ（＝Ｘ（ｔ１））が得られると、粒子検出速度ｖ（ステップ５４）、測定残り時間Ｔｒ（ステップ５６）が順に算定される。なお、図４の場合と同様に、コンピュータ１８のモニター上などの表示器に、発光粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）及び／又は測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示されるようになっていてよい（ステップ５２、５８）。また、最初の処理サイクルで発光粒子数が終了粒子数ＸＥに到達していたときには、そのまま、光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理が終了する（ステップ５０）
　最初の処理サイクルの後、解析時間間隔ｔの修正と、図４の場合と同様の光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理サイクル（ステップ２０’、３０～５８）が、発光粒子数が終了粒子数ＸＥに到達するまで反復される。その際、解析時間間隔ｔの修正を行うステップ２０’に於いては、まず、そのときまでに検出されている発光粒子数Ｘ（ｔｎ）が０であるか否かが判定される（ステップ２２０）。Ｘ（ｔｎ）＝０のときは、直前のサイクルに於ける解析時間間隔ｔがｍ倍されてよい（ｍは、１以上の正数）。Ｘ（ｔｎ）＞０であるときには、測定残り時間Ｔｒと更新予定回数Ｎと処理サイクルの実行回数ｋとを用いて、解析時間間隔ｔが、
　　ｔ＝Ｔｒ／（Ｎ－ｋ）　　　…（１５）
により算定される（ステップ２４０）。なお、算定される解析時間間隔ｔには、下限が設定されていてよく、解析時間間隔ｔが下限値ｔｍｉｎを下回るときには、解析時間間隔ｔは、下限値ｔｍｉｎに設定されてよい（ステップ２５０、２６０）。
　上記の如く、解析時間間隔ｔが修正される態様によれば、測定残り時間Ｔｒには、観測対象となっている試料溶液中の発光粒子の検出状況が反映されているので、解析時間間隔ｔがかかる発光粒子の検出状況に応じて最適化されることとなる。
　かくして、上記の本発明によれば、光検出領域により試料溶液中にて走査して発光粒子を個別に検出する走査分子計数法に於いて、光強度の測定と発光粒子の検出・計数を、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまで繰り返すという態様により、試料溶液中の発光粒子の濃度に応じて、光強度の測定と発光粒子の検出・計数に要する時間（測定時間）が増減することとなる。そして、発光粒子からの信号の数が達するべき予め定められた数を、結果に要求される精度を達成可能な数に設定しておくことにより、必要以上の測定時間を要することなく、許容可能な又は満足する結果を得ることが可能となる。
　上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
　蛍光色素分子が溶解された溶液を試料溶液として、走査分子計数法により発光粒子の検出及び計数を行い、検出される発光粒子の数のばらつきの特徴を確認すると共に、本発明の構成により、発光粒子の濃度に依らず、結果のばらつきを小さく抑えつつ、できるだけ短期間に精度よく発光粒子の濃度を検出できることを検証した。
　試料溶液として、ＡＴＴＯ６３３（シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich）社、Cat.No.18620）を、濃度が１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、１００ｆＭとなるように０．０５％　Tween　２０を含むＰＢＳ緩衝液に溶解した溶液を調製した。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ－２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）（ii）（ａ）光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の各々の試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、６３３ｎｍのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、６６０－７１０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域は、３０ｍｍ／秒の移動速度にて移動させた。また、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定は、各溶液について５回行った。なお、本実験は、発光粒子の数のばらつきの特徴を確認するための実験であるので、光強度の測定は、解析時間間隔毎に実行するのではなく、発光粒子の数のばらつきの特徴を捉えられるのに十分な時間に亘って行った。（実際には、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭの溶液については、測定時間は、２秒間、１００ｆＭの溶液については、２０秒間とした。）
　上記の光強度の測定後、上記の「（２）（ii）（ｂ）発光粒子に対応する信号の検出」に記載された処理手順に従って、上記で得られた時系列光強度データにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小二乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。そして、下記の条件:
　　　２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
　　　ピーク強度＞１．０［ｐｃ／１０μｓ］　　　　…（Ａ）
　　　相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを発光粒子に対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視した。
　図９（Ａ）は、走査分子計数法に於いて、測定時間の長さに対する検出された発光粒子数のばらつきの変化を示している。図中、横軸は、測定時間の長さであり、縦軸は、５回の測定で検出された発光粒子数のＣＶ値（＝標準偏差／平均×１００％）であり、各点は、対応する測定時間の長さに於けるＣＶ値を示している。同図から理解される如く、上記の１０ｐＭ、１ｐＭ、１００ｆＭの試料溶液について、いずれも、ＣＶ値は、測定時間が長くなるほど低減した。また、３つの試料溶液の値を比較して明らかな如く、濃度が低くなるほど、ＣＶ値が十分に小さくなるのに時間がかかることが確認された。これにより、試料溶液中の発光粒子の濃度に応じて、発光粒子検出数のばらつきが許容可能な範囲に収まるまでにようする測定時間が異なることが示された。
　一方、図９（Ｂ）は、走査分子計数法に於いて、発光粒子の検出数に対するそれぞれの検出数を取得するのに要した測定時間（粒子検出時間）のばらつきの変化を示している。図中、横軸は、検出された発光粒子数であり、各点は、５回の測定に於ける対応する発光粒子数を検出するのに要した測定時間（粒子検出時間）のＣＶ値（＝標準偏差／平均×１００％）を示している。同図から理解される如く、上記の３つの試料溶液について、発光粒子数が３０を超えると、粒子検出時間のＣＶ値の発光粒子濃度による依存性が殆どなく無くなった。このことは、走査分子計数法に於いて、発光粒子からの信号の数が、結果に要求される精度を達成可能な数になるまで光強度の測定を行い、そこに於ける発光粒子検出数を取得するのに要した測定時間に基づいて、濃度等の分析を実行することにより、ばらつきの少ない結果が得られることを示唆している。
　また、図９（Ｂ）の結果を参照して、色素分子濃度が、１００ｆＭの溶液と１０ｐＭの溶液について得られた光強度データに於いて、発光粒子検出数が１３０個になるまでの測定時間と粒子検出速度とを比較した。結果は、以下の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　上記の表から理解される如く、結果のばらつきを許容可能な程度に収めるには、１００ｆＭの溶液の場合、測定時間は、１４秒以上必要であるのに対し、１０ｐＭの溶液の場合には、測定時間は、０．１８秒程度で良いことが示された。このことは、走査分子計数法に於いて、ばらつきを小さく抑えつつ精度良く結果を得るための必要な測定時間が発光粒子濃度に応じて異なることを示している。そして、本発明に従った発光粒子の検出数が予め定められた数まで光強度の測定を実行するという態様により、発光粒子濃度に応じた測定時間にて光強度の測定が為され、必要以上に測定に時間を費やすことが回避できることが示された。特に、発光粒子濃度が高い場合に、測定時間が大幅に短縮可能であることは理解されるべきである。
　更に、図１０は、上記の各試料溶液についての検出数１５０個までの測定時間から算出された粒子検出速度を各濃度に対してプロットした図を示している。同図から理解される如く、粒子検出速度は、色素濃度に比例しており、上記の式（４）の関係が成立していることを示唆している。従って、粒子検出速度又は予め定められた数の発光粒子を検出するのに要した測定時間に基づいて、試料溶液中の発光粒子の濃度が決定可能であることが示された。
　かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、上記の本発明によれば、走査分子計数法に於いて、光検出領域を移動しながらの光強度の測定及び発光粒子の検出を或る固定された測定時間に亘って実行するのではなく、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまで実行するという態様により、結果のばらつきを小さく抑えつつ測定時間を最適化し、結果に要求される精度を達成する数の発光粒子の検出のための測定をできるだけ短期間に終了させることが可能となる。特に、本発明は、発光粒子の信号を個別に検出するので、試料溶液中の発光粒子濃度が、ＦＣＳ等の光分析技術で要求される濃度域よりも低くても、発光粒子の検出が可能であり、かかる特徴は、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合に有利であろう。また、本発明により、試料溶液中の発光粒子濃度が未知の場合でも、測定時間についての試行錯誤のための労力、時間又は費用が低減されるので、走査分子計数法の応用範囲が拡大されることが期待される。例えば、試料溶液中に発光粒子濃度が未知であるために、発光粒子濃度が極端に低い場合に備えた必要以上に長い測定時間の設定は不要となる。

Claims (14)

  1. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する方法であって、
    　前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動過程と、
    　前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出する光検出過程と、
    　前記検出された光から個々の発光粒子からの信号を個別に検出する発光粒子検出過程と
    を、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまで繰り返し、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度を決定することを特徴とする方法。
  2. 　請求項１の方法であって、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、前記光検出領域移動過程、前記光検出過程及び前記発光粒子検出過程を所定の時間間隔毎に繰り返すことを特徴とする方法。
  3. 　請求項１の方法であって、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて決定される前記発光粒子の検出速度に基づいて前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度を決定することを特徴とする方法。
  4. 　請求項１の方法であって、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、それまでの前記発光粒子の検出数に基づいて、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要する時間を推定する過程を含むことを特徴とする方法。
  5. 　請求項１の方法であって、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、前記光検出領域移動過程、前記光検出過程及び前記発光粒子検出過程を所定の時間間隔毎に繰り返すことと、それまでの前記発光粒子の検出数に基づいて、前記所定の時間間隔を修正する過程を含むことを特徴とする方法。
  6. 　請求項１乃至５のいずれかの方法であって、前記光検出領域移動過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
  7. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
    　前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
    　前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
    　前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記発光粒子の各々からの信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
    　前記信号処理部が検出した前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまで、前記光検出領域移動部による前記光学系の光検出領域の位置の移動と、前記光検出部による前記光検出領域からの光の検出と、前記信号処理部による前記発光粒子からの信号の検出とを繰り返し、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度を決定することを特徴とする装置。
  8. 　請求項７の装置であって、前記光検出領域移動部による前記光学系の光検出領域の位置の移動と、前記光検出部による前記光検出領域からの光の検出と、前記信号処理部による前記発光粒子のからの信号の検出とを所定の時間間隔毎に繰り返すことを特徴とする装置。
  9. 　請求項７の装置であって、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて決定される前記発光粒子の検出速度に基づいて前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度を決定することを特徴とする装置。
  10. 　請求項７の装置であって、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、それまでの前記発光粒子の検出数に基づいて、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要する時間を推定する手段を含むことを特徴とする装置。
  11. 　請求項７の装置であって、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、前記光検出領域移動部による前記光学系の光検出領域の位置の移動と、前記光検出部による前記光検出領域からの光の検出と、前記信号処理部による前記発光粒子のからの信号の検出とを所定の時間間隔毎に繰り返すことと、それまでの前記発光粒子の検出数に基づいて、前記所定の時間間隔を修正する手段を含むことを特徴とする装置。
  12. 　請求項７の装置であって、前記発光粒子からの信号の検出の開始後に前記信号処理部が検出した前記発光粒子からの信号の数を表示する発光粒子検出数表示部を有することを特徴とする装置。
  13. 　請求項７の装置であって、前記発光粒子からの信号の検出の開始後に前記信号処理部が検出した前記発光粒子からの信号の数に基づいて推定される前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの時間を表示する測定終了時間表示部を有することを特徴とする装置。
  14. 　請求項７乃至１３のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
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