JP2015094625A - 光検出を用いた単一発光粒子検出方法 - Google Patents
光検出を用いた単一発光粒子検出方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
r2<(kB・T/3πη)(τ/a2)
を満たす粒子であってよい。一方、周期信号に対応する第一の発光粒子として検出される粒子は、光検出領域が数回に亘って経路を周回しても光検出領域の経路から逸脱しない粒子であるところ、より確実に周期的に検出可能とする場合、粒子は、好適には、光検出領域の移動周期τの間にその位置が殆ど動かない粒子、即ち、拡散による移動距離が自身の半径よりも小さい粒子である。かくして、例えば、粒子が半径r1の球状体に近似でき、拡散係数が、kB・T/6πηr1[kB:ボルツマン定数、T:絶対温度、η:溶媒粘性度]で与えられる場合、粒子は、
r1>[(kB・T/3πη)・τ]1/3
を満たす粒子であってよい。
2…光源
3…シングルモードオプティカルファイバー
4…コリメータレンズ
5…ダイクロイックミラー
6、7、11…反射ミラー
8…対物レンズ
9…マイクロプレート
10…ウェル(試料溶液容器)
12…コンデンサーレンズ
13…ピンホール
14…バリアフィルター
14a…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
15…マルチモードオプティカルファイバー
16…光検出器
17…ミラー偏向器
17a…ステージ位置変更装置
18…コンピュータ
本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図1(A)に模式的に例示されている如き、特許文献4〜9に記載の走査分子計数法又はFCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置1は、光学系2〜17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。光分析装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザー光(Ex)が、ファイバーの出射端に於いて固有のNAにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1〜数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されており、対物レンズ8から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域(励起領域)が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光(Em)は、対物レンズ8、ダイクロイックミラー5を通過し、ミラー11にて反射してコンデンサーレンズ12にて集光され、ピンホール13を通過し、バリアフィルター14を透過して(ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。)、マルチモードファイバー15に導入されて、光検出器16に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ18へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール13は、対物レンズ8の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図1(B)に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図1(B)に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、1〜10fL程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり(典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が中心光強度の1/e2となる面を境界とする略楕円球体の体積である。)、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、1つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器16としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、計測単位時間(BIN TIME)毎に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ(図示せず)には、観察するべきウェル10を変更するべく、マイクロプレート9の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置17aが設けられていてよい。ステージ位置変更装置17aの作動は、コンピュータ18により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、時系列光強度データに於いて検出される発光粒子の信号が周期信号であるか否かを判定して、周期信号と非周期信号とを別々の種類の発光粒子に対応するものとして計数し又は種々の分析に用いる。以下、走査分子計数法及び周期信号と非周期信号とを識別して種々の分析に利用可能とする本発明の原理について説明する。
「走査分子計数法」(特許文献4〜9)では、基本的には、光検出領域の位置を移動するための機構(ミラー偏向器17)を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器10(マイクロプレート9)の水平方向の位置を移動して、図2(A)にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域CVの位置を移動しながら、即ち、光検出領域CVにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域CVが移動する間(図中、時間t0〜t2)に於いて1つの発光粒子の存在する領域を通過する際(t1)には、発光粒子から光が放出され、図2(B)に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度(Em)のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域CVの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図2(B)に例示されている如きパルス状の信号(有意な光強度)を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。なお、発光粒子の光の検出は、例えば、時系列の光強度データに於いて光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を一つの発光粒子の信号として個別に検出することにより為されてよい。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、FCS、FIDA等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
既に述べた如く、上記の光検出領域CVを、図2(C)に例示されている如く、或る経路に沿って循環させる場合に於いて、並進拡散の速い粒子βであって、該粒子が光検出領域CVに一度包含された後、光検出領域CVが経路を一周して戻ってくるまでの時間τに、図中の矢印の如く、光検出領域CVの通過領域から逸脱しているほど、その移動速度が高い粒子の場合、それらの信号は、時系列光強度データ上に於いて、各粒子について一度のみ検出され、図2(D)にて白抜きのパルス信号βにて示されている如く、ランダムに出現することとなる。一方、並進拡散が遅い粒子αであって、該粒子が光検出領域CVに一度包含された後、光検出領域CVが経路を数回に亘って循環する間、略同じ位置又は領域に留まるほど、その移動速度が低い粒子の場合、それらの信号αは、図2(D)にて黒塗りのパルス信号αにて示されている如く、光検出領域CVの移動周期τに略等しい周期にて周期的に数回(最初の場所から大きく移動するまでの間)に亘って出現する群となる。即ち、周期的に発生する一群の信号は、同一の発光粒子の信号であると考えられる。(図2(D)は、二組の周期信号の群α、α2が発生している。)
<x(t)>2=2Dt …(1)
により与えられるので、光検出領域CVの移動周期τに於ける並進拡散が遅い粒子(拡散係数Dα)と並進拡散が速い粒子(拡散係数Dβ)の変位xは、それぞれ、
<x>2=2Dατ …(2)
<x>2=2Dβτ …(3)
[なお、Dα<Dβ]
となる。ここに於いて、まず、並進拡散が速い粒子の信号の発生が非周期的であるとき、その移動距離は光検出領域CVの寸法(半径=a)より大きいこととなるので、
<a>2<2Dβτ …(4)
が満たされる。即ち、光検出領域CVの移動周期τは、
τ><a>2/2Dβ …(5)
を満たすべきである。なお、粒子の形状が球状とみなすことができ、拡散係数Dβが
Dβ=kB・T/6π・η・r2 …(6)
で表されるとき(ここで、kB:ボルツマン定数、T:絶対温度、η:溶媒粘性度、r2:粒子半径)、粒子半径r2は、
r2<(kB・T/3πη)(τ/a2) …(7)
の条件を満たすこととなる。一方、並進拡散が遅い粒子の信号の発生が周期的であるとき、その位置が、殆ど動かないこと、即ち、拡散による移動距離が、自身の寸法(半径r1)を超えないことが好ましい。その場合、式(2)から、
<r1>2>2Dατ …(8)
の条件が満たされるので、光検出領域CVの移動周期τは、
τ><r1>2/2Dα …(9)
を満たすべきである。なお、粒子の形状が球状とみなすことができ、拡散係数Dαが
Dα=kB・T/6π・η・r1 …(10)
で表されるとき、粒子半径r1は、
r1>[(kB・T/3πη)・τ]1/3 …(11)
の条件を満たすこととなる。
上記の光検出領域CVを所定の経路に沿って循環させて得られた発光粒子の信号について、「周期信号」であるか「非周期信号」であるかを判断することによって、粒子の種類を区別する手法の利用に於いて、例えば、並進拡散が遅い粒子として、ポリスチレンビーズや磁気ビーズなどのこの分野でしばしば利用される固相担体粒子や細胞等が採用され、並進拡散が速い粒子として、生体分子や色素分子などが採用されてよい。図3(A)〜(B)は、本発明の方法の利用例の態様の例に於ける粒子のモデルを模式的に描いた図である。
図1(A)に例示の光分析装置1を用いた本発明による光分析の実施形態に於いては、具体的には、(1)発光粒子を含む試料溶液の調製、(2)試料溶液の光強度の測定及び発光粒子の検出・計数処理、及び(3)濃度の算出等の分析が実行される。
本発明の光分析技術に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい(試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。)。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識(蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子)が任意の態様にて付加された粒子であってよい。また、特に、本発明に於いては、上記の如く、並進拡散が遅い粒子と並進拡散が速い粒子との信号を一つの時系列光強度データから抽出することが可能であるので、試料溶液に並進拡散が遅い粒子と並進拡散が速い粒子とが混在していてよい。既に触れた如く、並進拡散が遅い粒子は、やや大きめの粒子、例えば、ポリスチレンビーズや磁気ビーズなどのこの分野でしばしば利用される固相担体粒子や細胞等であってよく、並進拡散が速い粒子は、生体分子及びその他の任意の分子であってよい。更に、上記の「3.本発明の利用例の原理」に於いても触れたように、本発明によれば、或る分子の任意の処理前後の変化を検出可能である。従って、試料溶液は、任意の処理前の溶液及び/又は任意の処理後の溶液であってよい。
図4は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。本実施形態の走査分子計数法による光強度の測定処理過程では、ミラー偏向器17又はステージ位置変更装置17aを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動(試料溶液内の走査)を行いながら、光強度の測定が為される(図4−ステップ100)。操作処理に於いて、典型的には、記憶装置(図示せず)に記憶されたプログラム(試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順、励起光を光検出領域に照射する手順(必要な場合のみ)及び光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順)に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射(必要な場合のみ)及び光強度の測定が開始される。測定が開始されると、まず、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、光源2から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器17によるミラー7(ガルバノミラー)の駆動又はステージ位置変更装置17aによるステージの駆動によって、ウェル10内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器16は、逐次的に受光した光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信し、コンピュータ18は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器16は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、逐次的に、所定の単位時間毎(BIN TIME)に、例えば、10μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を測定する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
(2a)2=6D・Δτ …(12)
から、
Δτ=(2a)2/6D …(13)
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度(拡散移動速度)Vdifは、概ね、
Vdif=2a/Δτ=3D/a …(14)
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、D=2.0×10−10m2/s程度であると予想される場合には、aが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10−3m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その略10倍の15mm/sと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル(典型的には、励起光強度分布と略同様)となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
上記の処理により時系列の光強度データが得られると、コンピュータ18に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出、周期信号及び非周期信号の抽出、濃度の算出等の分析が実行される。
時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図5(B)に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、(光学系により決定される)光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する(図5(C)参照)。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、即ち、例えば、時系列の光強度データに於いて光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定される光強度の時間変化プロファイルを有するとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布:
I=A・exp(−2t2/a2) …(15)
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル(バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル)に対して式(15)をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。(強度A及び幅aが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。)
時系列光強度データ上に於ける発光粒子のパルス信号の検出が為されると、それらのパルス信号のうちから、周期信号・非周期信号の抽出が為される。上記までの説明から理解される如く、並進拡散の遅い粒子の信号は、光検出領域の移動周期に(完全に一致しないが)概ね等しい周期にて連続的に出現する。そこで、並進拡散の遅い粒子の信号の抽出は、光検出領域の移動周期に概ね等しい周期にて連続的に出現する信号を任意の手法又はアルゴリズムにより選択することにより為されてよい。具体的な周期信号の抽出の処理は、例えば、特許文献6、9等に記載された方法によって達成されてよい。具体的には、例えば、時系列光強度データに於いて、まず、最初の信号の発生時間から光検出領域の移動周期の略整数倍の時間に於いて発生した信号が存在するか否かが探索される。もし最初の信号に、光検出領域の移動周期の略整数倍の時間に於いて発生した別の信号が無ければ、その最初の信号は、非周期信号であると判定される。一方、最初の信号の発生時間から光検出領域の移動周期の略整数倍の時間に於いて発生した信号が存在した場合には、それらの信号は、同一の発光粒子の信号の群、即ち、一つの周期信号の群に属する信号として選択される。次いで、上記の周期信号の群として選択されなかった信号のうちの最初の信号について、その信号の発生時間から光検出領域の移動周期の略整数倍の時間に於いて発生した周期的な信号が存在するか否かが探索され、そのような周期的な信号が存在すれば、一つの周期信号の群に属する信号として選択される。以上の操作を繰り返すことにより、一回の光計測にて得られた時系列光強度データに於いて、周期信号の群が複数個検出されることとなる。そして、かかる過程に於いて、或る信号について、その発生時間から光検出領域の移動周期の略整数倍の時間に於いて発生した信号が無いときには、その信号は、非周期信号であると判定される。
上記の一連の処理によって非周期信号と周期信号との判別が為されると、それぞれの信号数を計数することにより、非周期信号に対応する並進拡散の速い発光粒子と周期信号に対応する並進拡散の遅い発光粒子の濃度値の算出が可能となる。非周期信号の場合、その数は、並進拡散の速い発光粒子の検出数となり、周期信号の場合、その群の数が、並進拡散の遅い発光粒子の検出数となる。そして、発光粒子の濃度は、それぞれ、発光粒子の検出数を光検出領域の通過した領域の体積で除した値により与えられる。
c=N/nV …(16)
により与えられる。ここで、光検出領域の通過した領域の延べ体積nVは、光検出領域の半径a(球形として近似した場合である。)、移動速度u及び計測時間tを用いて、
nV=πa2ut …(17)
となるので、発光粒子濃度cは、
c=N/πa2ut …(18)
により算出される。一方、並進拡散の遅い発光粒子の場合、一つの周期信号の群の信号数がk個だったとすると、光検出領域が所定の経路をk回循環すると、空間に存在する粒子が入れ替わると考えることができる(実際の計測に於いて、一つの周期信号の群の信号数には、ばらつきがあるので、kの値は、一群当たりの信号数の平均値であると考えてよい。)。従って、光検出領域が体積Vの経路をn回循環したときに通過した領域の正味の体積Uは、
U=nV/k …(19)
であると考えられる。従って、光検出領域が体積Vの経路をn回循環したときの周期信号の群の数がJであるとき、発光粒子濃度cは、
c=J/(nV/k) …(20)
により与えられる。ところで、周期信号の総数Mは、J×kであるので、結局、発光粒子濃度cは、
c=M/nV …(21)
となり、周期信号の総数Mを光検出領域の通過した領域の延べ体積nVで除した値により算出できることとなる。なお、上記の濃度の算出に於いて、光検出領域が循環する経路の体積の決定は、特許文献4〜9に記載されている方法と同様の方法によって理論的に又は実験的に為されてよい。
標的DNA(T):GACTGAATATAAACTTGTGGAGCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT
擬標的DNA(Tx):AGACTGAATATAAACTTGTGGAGCATGGGAAAGTCCCCTCAACT
プローブDNA(P):AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC
プローブDNA(R):
ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG
そして、これらのDNAを、それぞれ、10nMとなるように反応溶液(10mM Tris-HCl, 400mM NaCl, 0.05% Triton X-100)に溶解して、標的DNA(T)とプローブDNA(P)とプローブDNA(R)を含む試料溶液(A)と、擬標的DNA(Tx)とプローブDNA(P)とプローブDNA(R)を含む試料溶液(B)とを調製した。これらの溶液は、サーマルサイクラーを用いて95℃で5分インキュベート後、25℃まで温度を落とし30分インキュベートした。その後、200μLのこれらの溶液に対して2μg(16amol相当)の磁気ビーズ(estapor(登録商標)BE-M08/0,3:millipore)を添加し、室温で5分間振とうさせて、アビジン−ビオチン結合によりDNAをビーズに結合させた。なお、磁気ビーズは、洗浄溶液(10mM Tris-HCl, 400mM NaCl, 0.05% Triton
X-100)にて3回洗浄したものを用いた。しかる後、DNAの結合したビーズを、それぞれ、100μLの洗浄溶液で5回洗浄した後、0.25Uの制限酵素ScrF1(Newengland Biolabs:R0110S)を含む反応溶液20μLを加えて37℃にて1分間の加熱処理を行った。
20μ秒<パルス幅<200μ秒
ピーク強度>1(フォトン/10μ秒)
相関係数>0.95
を満たすパルス状信号を、発光粒子の信号の特徴を有する信号として判別した。そして、各信号について、光検出領域の移動周期6666μ秒(光検出領域の移動周期)の整数倍±50μ秒に信号が存在する信号を周期信号として抽出し、単発の信号を非周期信号として抽出した。
Claims (6)
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動する過程と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する過程と、
前記時系列の光強度データ上に於いて発光粒子の信号の各々を個別に検出する過程と、
前記検出された発光粒子の信号のうち、前記時系列の光強度データの時間に沿って前記光検出領域の移動周期と略同じ周期にて複数回発生した信号の群を前記発光粒子のうちの第一の発光粒子の信号として識別し、前記時系列の光強度データの時間に於いてランダムな時間に発生した信号を前記発光粒子のうちの第二の発光粒子の信号として識別する過程と
を含む方法。 - 請求項1の方法であって、前記光検出領域の移動周期と略同じ周期にて複数回発生した信号の群の数とランダムな時間に発生した信号の数とをそれぞれ別々に計数して、前記第一の発光粒子の濃度と前記第二の発光粒子の濃度とを決定する過程を含む方法。
- 請求項2の方法であって、前記第一の発光粒子の濃度が、前記光検出領域の移動周期と略同じ周期にて複数回発生した信号の数を前記光検出領域の通過した延べ体積で除した値として算定される方法。
- 請求項1又は2の方法であって、前記第一の発光粒子が、ボルツマン定数kBと、絶対温度Tと、溶媒粘性度ηと、光検出領域の移動周期τとを用いた条件:
r1>[(kB・T/3πη)・τ]1/3
を満たす半径r1の粒子であり、前記第二の発光粒子が、ボルツマン定数kBと、絶対温度Tと、溶媒粘性度ηと、光検出領域の半径aとその移動周期τとを用いた条件:
r2<(kB・T/3πη)(τ/a2)
を満たす半径r2の粒子である方法。 - 請求項1乃至4のいずれかの方法であって、前記第二の発光粒子が前記第一の発光粒子の一部が遊離した粒子であり、前記第一の発光粒子の信号の検出数と前記第二の発光粒子の検出数とに基づいて前記第一の発光粒子の一部を解離させる反応の進行の度合いを判定する過程を含む方法。
- 請求項1乃至4のいずれかの方法であって、前記第一の発光粒子が前記第二の発光粒子が第三の粒子に結合して形成される粒子であり、前記第一の発光粒子の信号の検出数と前記第二の発光粒子の検出数とに基づいて前記第二の発光粒子が第三の粒子に結合する反応の進行の度合いを判定する過程を含む方法。
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