JPWO2012099234A1 - 単一発光粒子からの光の検出を用いた光分析方法及び光分析装置 - Google Patents
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Abstract
Description
2…光源
3…シングルモードオプティカルファイバー
4…コリメータレンズ
5…ダイクロイックミラー
6、7、11…反射ミラー
8…対物レンズ
9…マイクロプレート
10…ウェル(試料溶液容器)
12…コンデンサーレンズ
13…ピンホール
14…バリアフィルター
14a…検出光用ダイクロイックミラー
15…マルチモードオプティカルファイバー
16…光検出器
17…ミラー偏向器
17a…ステージ位置変更装置
18…コンピュータ
本発明による光分析技術は、基本的な構成に於いて、図1(A)に模式的に例示されている如き、FCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図1(A)を参照して、光分析装置1は、光学系2〜17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。光分析装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザー光(Ex)が、ファイバーの出射端に於いて固有のNAにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1〜数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されており、対物レンズ8から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域(励起領域)が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光(Em)は、対物レンズ8、ダイクロイックミラー5を通過し、ミラー11にて反射してコンデンサーレンズ12にて集光され、ピンホール13を通過する。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール13は、対物レンズ8の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図1(B)に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図1(B)に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、1〜10fL程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。コンフォーカル・ボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、その実効体積は、光強度が1/e2となる面を境界とする略楕円球体の体積である。かくして、ピンホール13を通過した光は、ダイクロイックミラー14aを経て、バリアフィルター14を透過して(ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。)、マルチモードファイバー15に導入されて、対応する光検出器16に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ18へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器16としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、1つの発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の方法は、端的に述べれば、上記の如き共焦点顕微鏡(又は多光子顕微鏡)により発光粒子からの光を一つずつ検出する「走査分子計数法」に於いて、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域の移動、光の検出及び発光粒子の検出を繰り返し、発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の発光粒子の濃度を決定するというものである。以下、走査分子計数法及び本発明による発光粒子濃度決定の原理について説明する。
FCS、FIDA等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、FCS、FIDA等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図11(A)に模式的に描かれているように、蛍光強度の測定中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域CV内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、測定時間中に常に有意な光強度(フォトンカウント)が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図11(B)に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域CV内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号(フォトンカウント)が、測定時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、測定中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために測定時間が長くなる。
上記の如き走査分子計数法に於いて、観測対象である発光粒子は、試料溶液中にランダムに分散しているので、或る測定時間に亘る光検出に於いて得られる発光粒子の検出数には、ばらつきがある(測定を実行する度に検出数が異なる。)。従って、発光粒子の検出数を測定時間中の光検出領域の通過領域の体積で割ることによって得られる発光粒子の濃度など、発光粒子の検出数を用いて導出される任意の特性を許容可能な又は満足する精度にて決定するには、かかる精度を達成するのに要求される数の発光粒子を検出するのに必要な時間に亘って光強度の測定を実行する必要がある。この点に関し、試料溶液中の発光粒子の濃度が低いほど、或る測定時間中に得られる発光粒子の検出数は当然に少なくなるので、ばらつきが大きくなり、許容可能な又は満足する精度を達成するために、より長い測定時間が必要となる。例えば、図3を参照して、発光粒子濃度の比較的低い溶液(A)と発光粒子濃度の比較的高い溶液(B)とについて、或る測定時間αに亘って走査分子計数法により発光粒子の検出を行う場合、図3(A)、(B)を比較して理解される如く、図3(B)に例示されている如き発光粒子濃度の比較的高い溶液について得られた時系列の光強度データに於いては、図3(A)に例示されている如き発光粒子濃度の比較的低い溶液の場合よりも多数の発光粒子の信号が検出されることとなる。従って、例えば、濃度等の特性の決定に許容可能な精度を達成するのに要求される発光粒子の検出数を得るための測定時間が、図3(A)の溶液については時間αが必要だった場合、図3(B)の溶液については、時間βで十分であるということになる。そして、仮に、図3(A)の溶液について測定を時間βのみしか実行しない場合には、発光粒子の検出数のばらつきが大きくなり、濃度等の結果の誤差が許容可能でない程度に大きくなり得る。
X=CSuτNA …(1)
となる。ここで、NAは、アボガドロ数である。従って、発光粒子からの信号の数が予め定められた数XEに達するのに時間Tを要したとすると、発光粒子の濃度Cは、
C=XE/(STuNA) …(2)
により、時間Tの関数として与えられる。なお、式(2)に於いて、単位時間当たりの粒子の検出速度Vは、発光粒子からの信号の数が予め定められた数XEに達するのに要した時間Tと発光粒子検出数XEとに基づいて
V=XE/T …(3)
により与えられるので、発光粒子の濃度Cは、
C=V/(SuNA)…(4)
と表される。この式(4)に於いては、発光粒子の濃度Cが、検出速度Vに一次に比例し、発光粒子の濃度Cと検出速度Vとの対応関係がわかり易いので、実際の実験に於いては、発光粒子の濃度Cは、検出速度Vを用いて決定されてよい。(下記の実施例参照)
図1(A)に例示の光分析装置1を用いた本発明による光分析の実施形態に於いては、具体的には、(1)発光粒子を含む試料溶液の調製、(2)試料溶液の光強度の測定及び発光粒子の検出・計数処理、及び(3)濃度算出等の分析が実行される。
本発明の光分析技術に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい(試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。)。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識(蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子)が任意の態様にて付加された粒子であってよい。
図4は、図1(A)に例示の光分析装置1を用いて実行される本実施形態に於ける試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理の一つの例をフローチャートの形式にて表したものである。同図の例に於いては、端的に述べれば、光検出領域の位置の移動、光検出領域からの光の検出、発光粒子からの信号の検出及び検出された発光粒子の信号の計数の一連の処理が、解析時間間隔t(所定の時間間隔)毎に、検出された発光粒子数Xが終了粒子数XE(発光粒子数が到達すべき予め定められた数)に到達するまで反復して実行される。なお、以下に述べる一連の処理及び構成は、コンピュータ18の処理作動により実現されることは理解されるべきである。[(3)濃度算出等の分析、(4)試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理の修正例に於いて同様。]
操作処理に於いて、具体的には、まず、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、初期設定として、終了粒子数XEの設定(ステップ10)及び解析時間間隔tの設定(ステップ20)を行う。終了粒子数XEと解析時間間隔tとは、使用者により任意に設定されてよい。終了粒子数XEは、発光粒子の濃度の結果値に要求される精度を達成できるように発光粒子の濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして適宜決定可能である(後述の実施例参照)。解析時間間隔tとしては、処理の開始後から発光粒子数(X)が終了粒子数(XE)に到達するまでの時間よりも十分に短い任意の時間間隔が、装置1に於ける後述の図5の処理速度等を考慮して適宜設定されてよい。また、終了粒子数XEと解析時間間隔tとは、それぞれ、発光粒子の濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして予め決定された値が、装置1に於いて記憶され、かかる記憶された値が自動的に又は使用者の選択により使用されるようになっていてもよい。
かくして、終了粒子数XEと解析時間間隔tの設定が為されると、以下の如く、解析時間間隔t毎に、解析時間間隔tに亘る走査分子計数法による光強度の測定処理及び測定された光強度データからの発光粒子の信号の検出並びに発光粒子数xの検出(ステップ30)と、ステップ30にて検出された発光粒子数xを累積して発光粒子の総数X(tn)を算定する処理(ステップ40)とが発光粒子の総数X(tn)が終了粒子数XEに到達するまで(ステップ50)、反復して実行される。なお、ステップ30〜50の処理の反復実行に先だって、一連の処理の開始時間Tsが記憶されてよい(ステップ25)。以下、ステップ30〜50の処理について詳細に説明する。
図5は、ステップ30に於ける処理過程の例をフローチャートの形式にて表したものである。同図を参照して、ステップ30に於ける処理過程に於いては、まず、ミラー偏向器17を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動(試料溶液内の走査)を行いながら、光強度の測定が解析時間間隔tに亘って為される(図5−ステップ100)。かかる処理では、典型的には、記憶装置(図示せず)に記憶されたプログラム(試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順、励起光を光検出領域に照射する手順(必要な場合のみ)及び光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順)に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射(必要な場合のみ)及び光強度の測定が開始される。測定が開始されると、まず、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、光源2から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器17がミラー7(ガルバノミラー)を駆動して、ウェル10内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器16は、逐次的に受光した光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信し、コンピュータ18は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器16は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、逐次的に、所定の単位時間毎(BIN TIME)に、例えば、10μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を測定する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
(2r)2=6D・Δτ …(5)
から、
Δτ=(2r)2/6D …(6)
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度(拡散移動速度)Vdifは、概ね、
Vdif=2r/Δτ=3D/r …(7)
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、D=2.0×10−10m2/s程度であると予想される場合には、rが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10−3m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その10倍以上の、例えば、15mm/sと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル(典型的には、励起光強度分布と略同様)となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
上記の処理により解析時間間隔tに於ける試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ18に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出が実行される。
I=A・exp(−2t2/a2) …(8)
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル(バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル)に対して式(8)をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。(強度A及び幅aが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。)
かくして、解析時間間隔tに亘る時系列光強度データに於ける発光粒子数xが検出されると、発光粒子の検出総数X(tn)が
X(tn)=X(tn−1)+x …(9)
により算出される(図4−ステップ40)。なお、X(tn−1)は、前回の解析時間間隔tまでに検出された粒子の検出総数であり、その初期値は0である。そして、ステップ30〜40は、発光粒子の検出総数X(tn)が終了粒子数XEに到達するまで、即ち、
X(tn)≧XE …(10)
が成立するまで(ステップ50)、解析時間間隔t毎に繰り返される。かくして、ステップ30〜50を反復しているうちに、式(10)が成立すると、試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出・計数との処理が終了する。ステップ30〜50の反復処理が終了すると、終了時間TEが記憶されてよい(ステップ60)。
解析時間間隔t毎にステップ30〜50の反復実行期間に於いて(式(10)が成立するまで)、コンピュータ18のモニター上などの表示器に、発光粒子の検出総数X(tn)及び/又は測定終了時間TE若しくは測定残り時間Trが表示されるようになっていてよい。かかる構成によれば、使用者は、それらの表示を見ることによって、実行中の測定がいつ頃終了するのかを予測することができる点で有利である。
v=X(tn)/(Tp−Ts) …(11)
により与えられてよい。ここで、Tpは、現在の時刻である。かくして、発光粒子の検出速度vを用いて、測定残り時間Tr(ステップ30〜50の処理終了までの時間)が、
Tr=(XE−X(tn))/v …(12)
により推定され、また、測定終了時間TE(ステップ30〜50の処理が終了する時間)が、
TE=Tp+Tr …(13)
により推定される(ステップ56)。そして、推定された測定終了時間TE若しくは測定残り時間Trが表示器上に表示される(ステップ58)。なお、既にステップ30〜50の反復実行が為されている場合には、既に表示されている値が更新される。また、X(tn)=0のときは、式(12)又は(13)は、演算されずに、Tr及びTEは、不明であると表示されてよい。
かくして、発光粒子数が終了粒子数に到達すると、発光粒子数が終了粒子数に到達するまでの時間T(=TE−Ts)或いは検出された発光粒子の信号から得られるその他の情報を用いて、濃度算出等の分析が実行されてよい(ステップ70)。
S=N/(C・NA・uo・τo) …(14)
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたSの平均値が光検出領域の断面積Sとして採用されるようになっていてよい。なお、光検出領域の断面積Sは、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、FCS、FIDAを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Cと発光粒子の数Nとの関係(式(14))の情報をコンピュータ18の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
上記の試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理に於いて、別の態様として、解析時間間隔tは、固定値ではなく、発光粒子の検出状況に応じて修正されるようになっていてもよい。図8(A)は、解析時間間隔tを発光粒子の検出状況に応じて修正する処理(ステップ20’)を含むよう構成された試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出・計数の処理をフローチャートの形式で表したものであり、図8(B)は、ステップ20’に於ける解析時間間隔tの演算処理をフローチャートの形式で表したものである。なお、図8(A)に於いて、図4と同一の処理には、同一のステップ番号が付されている。
t=Tr/(N−k) …(15)
により算定される(ステップ240)。なお、算定される解析時間間隔tには、下限が設定されていてよく、解析時間間隔tが下限値tminを下回るときには、解析時間間隔tは、下限値tminに設定されてよい(ステップ250、260)。
20μ秒<パルス幅<400μ秒
ピーク強度>1.0[pc/10μs] …(A)
相関係数>0.95
を満たすパルス信号のみを発光粒子に対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視した。
Claims (14)
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する方法であって、
前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動過程と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出する光検出過程と、
前記検出された光から個々の発光粒子からの信号を個別に検出する発光粒子検出過程と
を、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまで繰り返し、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度を決定することを特徴とする方法。 - 請求項1の方法であって、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、前記光検出領域移動過程、前記光検出過程及び前記発光粒子検出過程を所定の時間間隔毎に繰り返すことを特徴とする方法。
- 請求項1の方法であって、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて決定される前記発光粒子の検出速度に基づいて前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度を決定することを特徴とする方法。
- 請求項1の方法であって、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、それまでの前記発光粒子の検出数に基づいて、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要する時間を推定する過程を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1の方法であって、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、前記光検出領域移動過程、前記光検出過程及び前記発光粒子検出過程を所定の時間間隔毎に繰り返すことと、それまでの前記発光粒子の検出数に基づいて、前記所定の時間間隔を修正する過程を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1乃至5のいずれかの方法であって、前記光検出領域移動過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記発光粒子の各々からの信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
前記信号処理部が検出した前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまで、前記光検出領域移動部による前記光学系の光検出領域の位置の移動と、前記光検出部による前記光検出領域からの光の検出と、前記信号処理部による前記発光粒子からの信号の検出とを繰り返し、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度を決定することを特徴とする装置。 - 請求項7の装置であって、前記光検出領域移動部による前記光学系の光検出領域の位置の移動と、前記光検出部による前記光検出領域からの光の検出と、前記信号処理部による前記発光粒子のからの信号の検出とを所定の時間間隔毎に繰り返すことを特徴とする装置。
- 請求項7の装置であって、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて決定される前記発光粒子の検出速度に基づいて前記試料溶液中の前記発光粒子の濃度を決定することを特徴とする装置。
- 請求項7の装置であって、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、それまでの前記発光粒子の検出数に基づいて、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するのに要する時間を推定する手段を含むことを特徴とする装置。
- 請求項7の装置であって、前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの期間に於いて、前記光検出領域移動部による前記光学系の光検出領域の位置の移動と、前記光検出部による前記光検出領域からの光の検出と、前記信号処理部による前記発光粒子のからの信号の検出とを所定の時間間隔毎に繰り返すことと、それまでの前記発光粒子の検出数に基づいて、前記所定の時間間隔を修正する手段を含むことを特徴とする装置。
- 請求項7の装置であって、前記発光粒子からの信号の検出の開始後に前記信号処理部が検出した前記発光粒子からの信号の数を表示する発光粒子検出数表示部を有することを特徴とする装置。
- 請求項7の装置であって、前記発光粒子からの信号の検出の開始後に前記信号処理部が検出した前記発光粒子からの信号の数に基づいて推定される前記発光粒子からの信号の数が予め定められた数に達するまでの時間を表示する測定終了時間表示部を有することを特徴とする装置。
- 請求項7乃至13のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
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