CN105452931A - 高分辨率3d荧光显微术 - Google Patents
高分辨率3d荧光显微术 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105452931A CN105452931A CN201480043416.XA CN201480043416A CN105452931A CN 105452931 A CN105452931 A CN 105452931A CN 201480043416 A CN201480043416 A CN 201480043416A CN 105452931 A CN105452931 A CN 105452931A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ray
- sample
- plane
- fluorescent
- optical
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 title description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 64
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 39
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 36
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 13
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 8
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 abstract description 14
- 230000004397 blinking Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000005855 radiation Effects 0.000 abstract 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 68
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000005293 physical law Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/06—Means for illuminating specimens
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
- G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
- G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
- G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
- G02B27/58—Optics for apodization or superresolution; Optical synthetic aperture systems
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Multimedia (AREA)
- Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microscoopes, Condenser (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于产生样本(2)的高分辨率图像(If)的显微术方法，所述方法具有以下步骤：a)为样本(2)配设在激励之后可统计闪烁地发出特定的荧光射线的物质，或者使用含有这种物质的样本(2)，b)使照明射线(10)入射到样本(2)上并且由此激励样本(2)以发出荧光射线，c)沿光轴(OA)将发出荧光射线的样本(2)重复地成像在分辨位置的探测器(5)上，从而得到图像序列(In)，d)借助累加功能对图像序列(In)进行处理，所述累加功能分析图像序列(In)内由于闪烁引起的强度波动，并且由此产生所述物质在样本(2)内的局部分布的图像(If)，所述图像具有比成像的光学分辨率更高的位置分辨率，其中，e)照明射线(10)这样入射，使得照明射线(10)沿光轴(OA)只在有限的深度区域内激励样本(2)以发出荧光射线。
Description
本发明涉及一种用于产生沿深度方向也具有高分辨率的荧光样本图像的显微术方法或显微镜。
借助显微术研究样本是一个较广的技术领域，针对其存在多样的技术解决方案。由经典的光显微镜出发，开发出了各种不同的显微术方法。
用于研究生物标本的光显微镜的典型应用领域是荧光显微术。在此，将特定的色素(所谓的荧光基团)用于对样本、例如细胞部分进行特殊的标记。如上所述，样本被激励射线照明并且由此被激励产生的荧光射线用适当的探测器检测。为此，通常在光显微镜中设置与单元滤波器(Block滤波器)结合的二色性分束器，其将荧光射线与激励射线分开并且实现单独的观察。通过这种方式，能够在光显微镜中显示各个不同地染色的细胞部分。当然也可以同时通过特定地累积在标本的不同结构上的不同色素对标本的多个部分进行染色。这种方法称为多重发光术。也可以测量本身发光、也就是不具有标记添加剂的样本。
为了实现超越通过物理定律规定的衍射极限的分辨率，在近些年来开发出了不同的方法。这些显微术方法的特征在于，它们相比经典显微镜能够为使用者提供更高的侧向光学分辨率。在该描述中，这些显微术方法称为高分辨率显微术方法，因为它们实现了超越光学衍射极限的分辨率。而衍射受限的显微镜称为经典显微镜。
由T.Dertinger等人的公开出版物“Fast,background-free,3Dsuper-resolutionopticalfluctuationimaging(SOFI)”，PNAS(2009),S.22287-22292以及“AchievingincreasedresolutionandmorepixelswithSuperresolutionOpticalFluctuationImaging(SOFI)”，Opt.Express,30.08.2010,18(18):18875-85,doi:10.1364/IE.18.018875和S.Geissbuehler等人的“ComparisonbetweenSOFIandSTORM”，Biomed.Opt.Express2,408-420(2011)已知一种高分辨率的远场显微术方法。该方法利用荧光基团的闪烁特性。如果样本的荧光基团彼此独立地可统计地闪烁，则对样本的成像可以通过适当滤波与所谓累加功能的结合而实现超越物理规定的光学分辨率极限的显著的分辨率提高。为了产生高分辨率图像，在远场内激励样本并且使其成像。在此，拍摄一系列单独图像并且随即通过累加功能组合为一个具有更高分辨率的单独图像。作为对术语“Super-ResoiutionOpticalFluctuationImaging”的简称，这种方法称为SOFI方法。
在SOFI方法中需要图像序列，其具有在样本之后加入的或者样本中固有的荧光基团的尽可能不同的闪烁状态。同时，摄影机必须能够随时检测闪烁并且同时提供较高的位置分辨率。在实现SOFI原理时，必须考虑到在拍摄单个图像期间尽可能少的荧光基团转换其荧光状态，并且单个荧光基团的波动(也就是荧光状态的转换)能够针对单个图像进行检测。因此，SOFI方法在以前特别用于较薄的样本，这些样本在荧光材料方面基本不具有沿成像光轴的深度延伸。因此可以考虑对样本进行TIRF照明，以便确保在拍摄单个图像期间没有依次设置的荧光基团转换其荧光状态。
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种按照SOFI原理的高分辨率显微术方法，通过所述方法也可以分析较厚的样本，也就是说消除了对可能样本的限制。
该技术问题按本发明通过一种用于产生样本的高分辨率图像的显微术方法解决，其中，所述方法具有以下步骤：
a)为样本配设在激励之后(可)统计闪烁地发出特定的荧光射线的物质，或者使用含有这种物质的样本，
b)使照明射线入射到样本上并且由此激励样本以发出荧光射线，
c)沿光轴将发出荧光射线的样本重复地成像在分辨位置的探测器上，从而得到图像序列，
d)借助累加功能对图像序列进行处理，所述累加功能分析图像序列内由于闪烁引起的强度波动，并且由此产生所述物质在样本内的局部分布的图像，所述图像具有比成像的光学分辨率更高的位置分辨率，
其中，
e)照明射线这样入射，使得照明射线沿光轴只在有限的深度区域内激励样本以发出荧光射线。
按照本发明将SOFI原理与光学剖面方法进行结合，以便也能够在深度方向上对荧光样板进行高分辨率的成像。由此不只避免了成像时焦点外背景所带来的影响，也避免了由于样本在完全未被成像的深度区段内被激励荧光所带来的负载。
光学切割能够以不同的方式方法进行。在一种实施形式中，使用所谓的临时聚焦，其例如在本申请人的专利文献DE102009060793A1中描述。在另一种实施形式中，入射横向于成像光轴的光片。
另一种实施形式使用多光子过程，以便在样本中产生闪烁状态。这是令人惊讶的，因为直接的多光子激励需要点扫描仪，所述点扫描仪优选不能用于SOFI原理，因为其可能要求图像具有格栅结构。但是SOFI原理要求整个样本在不同闪烁状态下成像的同时性，并且不能与格栅状的图像结构协调。尽管如此，多光子效应仍能用于SOFI原理的光学切割，方法是使用一种物质，其可通过光学变换射线的入射在第一与第二状态之间进行变换。这种物质只能在第二状态下被激励用于发出荧光射线。由此可以通过格栅式变换这样制备样本，使得只有被选择的深度区域能够在接下来的荧光激励步骤中进行闪烁。然而样本只在事先通过格栅式多光子作用选出的深度区域内平面地发荧光。所述变换射线优选通过多光子过程格栅式地置入，因为所述多光子过程允许定义出特别紧密限定的深度区域。所述变换射线当然也可以借助临时聚焦置入，以便在不进行格栅式扫描的情况下选择深度地进行多光子激励。
如果通过变换射线选择深度地制备了样本，则接下来对样本的激励可以在不进一步结构化的情况下进行，因为样本只在之前制备的深度区域内进行变换并且因此只能在该处显示SOFI原理所需的闪烁特性。
所述借助变换射线进行样本制备的过程使得只有选出的深度区域显示出特定的闪烁特性，随即在SOFI过程中分析这种闪烁特性。在此，作为闪烁参数可以考虑一个或多个以下参量：黑暗时长、在闪烁的黑暗状态与明亮状态之间的过渡概率、闪烁的明亮/黑暗时间比。
针对SOFI原理，力求优化闪烁的黑暗和明亮时间与荧光基团的闪烁概率之比。亮与暗的荧光基团的比例最佳是1:1，因为这样平均在每个单独图像中有全部荧光基团的一半发光。如果实现了这点，则所需的单独图像的数量被最小化。
因此优选尽可能快地拍摄图像，通过适当地调节变换射线来调节闪烁的亮/暗时间比并且优选使亮/暗时间比与探测器的单个图像拍摄率适配。此外，可以通过所述照明参数使标记或样本的闪烁参数适配，所述闪烁参数影响黑暗时长和/或在闪烁的黑暗状态与明亮状态之间的过渡概率；两者均用于达到或者接近最佳比例1:1。
作为对通过照明射线进行影响的补充，也可以借助对相关分子的周期进行化学控制来实现对物质的处理，在所述分子中发出荧光射线(明亮状态)或者不发出荧光射线(黑暗状态)。在此所力求的状态占有数在亮暗状态的周期相同的情况下实现了亮暗之间为0.5的过渡概率。
以下例如根据也披露了本发明的主要特征的附图进一步阐述本发明。在附图中：
图1示出用于产生在深度定向上也具有高分辨率的图像的显微术方法的一个实施形式的框图；
图2示出用于执行按照图1的方法的显微镜的示意图；
图3示出用于执行所述方法的另一显微镜的示意图并且。
图4示出所述方法的另一实施形式的类似于图1的框图，所述方法能够通过图2或图3的显微镜的变型构造方式执行。
图1示出用于产生在深度方向上也具有高分辨率的图像的显微术方法的第一实施形式的框图。
在步骤S1中，为样本配设标记，所述标记是本文开头所述的物质，其在激励之后发出特定的、可统计闪烁的荧光射线。备选地，选择已经含有这种物质的样本。
在接下来的步骤S2中，照明射线入射到样本上并且由此激励从样本中的物质内发出特定的荧光射线。在此，照明射线借助光学切割方法这样入射，使得照明射线沿之后成像的光轴只在有限的深度区域内激励样本以发出荧光射线。所述有限的深度区域确定沿深度方向的分辨率。
接着在步骤S3中对样本进行重复成像，其中，基于闪烁特性，在每个成像中存在样本的另一闪烁状态。因此，重复的成像产生图像序列In。在接下来的步骤S4中，借助累加功能处理图像序列In，所述累加功能分析图像序列内由于闪烁引起的强度波动。由此产生图像If，其具有比成像的光学分辨率更高的位置分辨率。步骤S3和S4的方法相应于已知的例如按照本文开头提到的Dertinger等人的公开出版物所述的SOFI原理。然而区别在于，通过步骤S2的设计，样本只在紧密限定的深度区域内闪烁地发出荧光射线。因此图像If只呈现样本的这个深度区域。
图2示出能够用于实施图1的方法的显微镜1。在此，在图2中画出了用于显微术方法的两个不同的实施形式。在图2的图像中的元件17和19以及打点线表示的光路在此不涉及按照图1的方法的实施形式。因此，图2的这个组成部分在之后才进行阐述并且首先并不重要。
样本2处于未进一步画出的盖玻片之后。样本通过显微镜1经由镜头3和管状透镜4成像在探测器5上。这相当于已知的显微镜结构。在成像的光路中具有分束器7，通过分束器耦合照明光路8，所述照明光路具有射线成型装置11，其通过显微镜3将射线引入样本2内。
照明光路8包括发出照明射线10的照明光源9。照明射线10是脉冲式的并且借助临时聚焦这样入射，使得其只在有限的深度区域内具有特定的脉冲式时间特性。只在有限的样本深度区域内将脉冲时长最小化。这种临时聚焦例如由本申请人的专利文献DE1020090600793A1已知。所述原理例如由Oron等人的公开出版物OpticsExpress13,1468(2005)或者Vaziri等人的PNAS105-20221(2008)已知。因此，关于照明光路8的元件的设计方案和功能原理可以明确地参考这些专利文献并且它们的公开内容在此完全包含在内。
照明光源9发出脉冲式的照明射线10。所述照明射线通过散射元件转向，所述散射元件在图2所示的实施形式中设计为光栅12。取代光栅12也可以使用其它的散射元件，如DMD、LDC滤波器、LCoS或者分散元件。借助光学器件13和14以及通过分束器7和镜头3将射线这样成像，使得脉冲式射线首先在图像平面15中再次具有照明光源所发出的脉冲长度。理想情况是在图像平面15中再次具有完全相同的脉冲长度。通过散射元件之后的光路中的分散元件，在现实中存在于图像平面15内的脉冲长度略微更长；尽管如此存在于图像平面15内的脉冲长度仍是散射元件之后的光路中最短的脉冲长度。照明光源9发出脉冲式的原始射线，所述原始射线通过散射元件和光学器件这样修改，使得首先再次在样本2所处的图像平面15内产生散射元件之后的最小脉冲长度。图像平面15上方和下方的脉冲长度更大。
在图2中，照明光路8的光路用实线画出。光栅12的元件的射线用虚线画出。如图所示，到达光栅12的光栅元件上的射线被光谱式地分开。射线的光谱成分只针对图像平面15具有相同的运行时长，因此来自照明光源9的原始射线的脉冲只在图像平面15内重建为具有最小脉冲长度的脉冲。这适用于整个图像平面15，如实线的照明光路所示。因此通过这样选择物质，使得其只通过具有原始射线的脉冲长度的脉冲式射线激励以发出适用于SOFI的闪烁的荧光射线，可以通过图2的显微镜在照明射线10入射时选择期望的深度。这发生在远场中，如实线的光路所示。
图3以示意性示出的显微镜1的形式示出图1的方法的另一实施形式。功能或结构与图2相应的元件具有相同的附图标记，因此不再赘述。
在图3中同样用元件17至19和用打点线表示的光路画出了变型方案，其在之后才根据图4进行阐述。图3的显微镜1与图2的显微镜的区别主要在于照明光路8。照明光源9在此发出光束，其同样由射线成型装置11修改。在图2中，射线成型装置11仍通过光栅12和光学器件13和14设计用于通过临时聚焦进行光学切割，而图3的射线成型装置11使得形式为光片16的照明射线横向于显微镜1的光轴6入射。因此，样本2只在光片16的区域内被照射，其由此确定深度平面。
图4示意性示出显微术方法的另一实施形式。步骤S3和S4与图1一致，因此对这些步骤不再赘述。区别在于步骤S2的设计，其在图4的实施形式中设计为两部分。所述步骤S2由两个步骤S2a和S2b组成。步骤S1也变为步骤S1’。在该步骤S1’中提供样本，所述样本的物质通过多光子效应转换为荧光状态，在该状态下其发出适用于SOFI的具有统计闪烁特性的荧光射线。换而言之，在变换射线入射之后才能激励样本(也就是其荧光分子)。在变换射线没有入射的区域中，即使激励射线入射，样本也不会显示出适用于SOFI的荧光特性，在理想情况下完全不发荧光。因此步骤S1’包括用物质标记样本或者选择含有适当物质的样本，其可借助变换射线进入这样的状态，在所述状态中样本可通过激励射线的入射被激励，以发出荧光射线。
在图1的实施形式的步骤S2中入射的照明射线在图4的实施形式中包括两个部分，即变换射线和激励射线。步骤S2相应地分为两个步骤S2a和S2b。在步骤S2a中入射变换射线。这样入射变换射线，以由此选择期望的深度区域。在步骤S2b中，使激励射线入射到样本上。在此不再需要进行深度选择，因为样本只能在之前通过步骤S2a中的入射进行了变换的区域内发出荧光射线。
将提供照明射线的过程分为两部分具有显著的优点。可以用扫描方法引入变换射线。扫描方法本身不能与SOFI原理协调，因为样本在该处必须同时整体成像，以便在图像序列In内具有不同的闪烁状态。因此排除了依次检测图像的不同区域的扫描式图像拍摄。尽管如此仍可以在图4的方法中扫描式地、也就是依次扫描单个样本区段地施加变换射线，因为荧光射线的激励在之后的步骤S2b中才进行—在那儿当然按广视场也进行成像(步骤S3)。
因此，当在步骤S1’中使用了通过多光子效应进行变换的相应物质时，对样本进行扫描。
备选地可以在步骤S2a中考虑临时聚焦。因此，针对方法的备选实施形式，图2的显微镜可以与迄今描述的结构不同地这样设计，使得照明光源9脉冲式地提供变换射线。多光子过程所需的脉冲长度和强度只存在于图像平面15内。步骤S2a通过照明光路8和照明光源9的相应运行实现。为了实施步骤S2b，附加地设置分束器7，其将来自用作激励射线19的射线源的光线耦合到显微镜1的光路中，其中，在远场中对样本进行照明。只有之前在图像平面15内制备过的区域发出(可)统计闪烁的荧光射线。在变型构造方式中，照明射线通过照明光路8与激励光路(通过元件17至19实现)的结合实现。在这种实施形式中，变换射线的扫描不是必须的，因为临时聚焦已经实现了深度选择。
图3针对按照图4的方法的实施形式示出了显微镜，在此用于通过多光子过程的扫描的样本制备。在这个实施形式中，元件9至11这样变型(未示出)，使得它们实现了通过激励射线对样本2的远场照明。所述激励可以横向于光轴6进行，但备选地也可以沿着光轴6进行。附加地设置分束器20，其由来自扫描仪21的射线供给，所述扫描仪扫描地使来自变换射线源22的原始射线转向。因此存在扫描经过样本2的变换射线23。所述变换射线借助多光子效应使得物质样本2变换到能够被激励射线激励的状态。基于多光子过程，变换物质所需的强度只存在于样本2的紧密限定的深度区域内。因此，步骤S2a通过适当地控制扫描仪21和变换射线源22进行，步骤S2b通过适当地控制射线源9进行。
在显微镜的所有实施形式中，设有(未示出的)控制设备，其适当地控制显微镜的部件以实施按照图1或者图4的方法。
由单个图像组成的图像序列In在SOFI处理步骤S4中转换为高分辨率图像If。在此例如应用由Dertinger等人描述的原理。同样也可以应用相对于Dertinger等人的原理进行了扩展设计的按照WO2010/141608A1的方案。在此，这些公开出版物也在这方面完全包含在本发明中。
SOFI原理所需的荧光基团的闪烁通过从发荧光的第一状态向不发荧光的第二状态的过渡定义。在此，不发荧光的状态理解为不发出针对图像被分析的荧光射线的状态。因此，不发荧光的状态是荧光基团在另一荧光光谱范围内发光的状态。
从第一状态向第二状态的过渡概率可以如由Heilemann等人的公开出版物AngewandteChemie121,S.7036,2009已知的那样进行修改，例如通过化学影响、温度影响或者照明影响修改。
如果用于相应的图像拍摄率或图像整合时间的发光和不发光的荧光基团之间的比例是1:1，则SOFI原理是特别有效的。在这两种状态的周期相同的情况下，第一和第二状态之间以及第二和第一状态之间的过渡概率在理想情况下是0.5。这可以通过借助化学作用、温度作用或者照明作用相应地处理样本来实现。在此，可以通过优化入射的光谱分布来优化过渡概率，以便达到所述的最佳比例1:1。因此，SOFI原理所要求的过渡概率与其它显微术方法明显不同。在PALM原理例如(也称为dSTORM)要求的状态中，荧光基团在很大比例下处于黑暗状态。
为了实现尽可能有一半的荧光基团处于明亮状态，除了过渡概率还必须考虑黑暗时长。即使从亮至暗的过渡概率为0.5，如果黑暗状态的周期非常长，也不能达到1:1的最佳比例。因此，在现有技术中使用的用于修改过渡概率和黑暗时长的方法特别优选地(并且与可小于样本场的像场的成像完全无关地)用于将发光与不发光的荧光基团的比例朝最佳值1:1的方向进行优化，方法是对过渡概率和/或黑暗周期(或者明亮周期)进行适当调节并且与图像拍摄率或整合时间适配。相反地也可以使拍摄率与周期适配。
Claims (10)
1.一种用于产生样本(2)的高分辨率的图像(If)的显微术方法，其中，所述方法具有以下步骤：
a)为样本(2)配设在激励之后可统计闪烁地发出特定的荧光射线的物质，或者使用含有这种物质的样本(2)，
b)使照明射线(10)入射到样本(2)上并且由此激励样本(2)以发出荧光射线，
c)沿光轴(OA)将发出荧光射线的样本(2)重复地成像在分辨位置的探测器(5)上，从而得到图像序列(In)，
d)借助累加功能对图像序列(In)进行处理，所述累加功能分析图像序列(In)内由于闪烁引起的强度波动，并且由此产生所述物质在样本(2)内的局部分布的图像(If)，所述图像具有比成像的光学分辨率更高的位置分辨率，
其特征在于，
e)照明射线(10)这样入射，使得照明射线(10)沿光轴(OA)只在有限的深度区域内激励样本(2)以发出荧光射线。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，借助暂时地聚焦(12-14)在有限的深度区域上来限制照明射线(10)的入射。
3.按权利要求2所述的方法，其特征在于，为照明射线提供具有脉冲长度的脉冲的原始射线并且指向散射元件(12)，所述散射元件处于借助光学器件(13、14、3)成像在图像平面(15)内的平面中，所述图像平面处于样本(2)内，由此照明射线在样本(2)内只在该图像平面(15)中具有最小脉冲长度，并且在图像平面(15)与散射元件(12)之间的脉冲长度大于最小脉冲长度和原始射线的脉冲长度。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述照明射线(10)只入射到横向于光轴(6)的光片(16)内并且由此被限制在有限的深度区域上。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述物质能够通过光学变换射线的入射在第一和第二状态之间变换，其中，所述物质在第一状态下不能被激励用于发出荧光射线，并且在第二状态下能够被激励用于发出荧光射线，并且在步骤b)中，照明射线的入射包括光学变换射线(10)的入射，其中，所述光学变换射线(10)调节所述特定的荧光射线的闪烁参数。
6.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述光学变换射线(10)通过双光子效应进行物质的变换，并且通过所述光学变换射线(10)扫描样本(2)，其中，扫描样本(2)中的定义深度区域的聚焦平面。
7.按权利要求5所述的方法，其特征在于，借助暂时地聚焦在有限的深度区域上来限制光学变换射线(10)的入射。
8.按权利要求2所述的方法，其特征在于，为了光学变换射线(10)提供具有脉冲长度的脉冲的原始射线并且指向散射元件(12)，所述散射元件处于借助光学器件(13、14、3)成像在图像平面(15)内的散射平面(15)中，所述图像平面处于样本(2)内，由此光学变换射线(10)在样本(2)内只在该图像平面(15)中再次具有原始射线的脉冲长度。
9.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述光学变换射线(10)只入射到横向于光轴(6)的光片(16)内并且由此被限制在有限的深度区域上。
10.按权利要求5至9之一所述的方法，其特征在于，所述闪烁参数包括：黑暗时长和/或在闪烁的黑暗状态与明亮状态之间的过渡概率和/或闪烁的明亮/黑暗时间比。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102013216124.7 | 2013-08-14 | ||
| DE201310216124 DE102013216124A1 (de) | 2013-08-14 | 2013-08-14 | Hochauflösende 3D-Fluoreszenzmikroskopie |
| PCT/EP2014/065501 WO2015022146A1 (de) | 2013-08-14 | 2014-07-18 | Hochauflösende 3d-fluoreszenzmikroskopie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105452931A true CN105452931A (zh) | 2016-03-30 |
| CN105452931B CN105452931B (zh) | 2018-09-11 |
Family
ID=51210493
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201480043416.XA Active CN105452931B (zh) | 2013-08-14 | 2014-07-18 | 高分辨率3d荧光显微术 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20160195704A1 (zh) |
| EP (1) | EP3033647A1 (zh) |
| JP (1) | JP2016534395A (zh) |
| CN (1) | CN105452931B (zh) |
| DE (1) | DE102013216124A1 (zh) |
| WO (1) | WO2015022146A1 (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109313328A (zh) * | 2016-06-21 | 2019-02-05 | 伊鲁米那股份有限公司 | 超分辨率显微术 |
| CN110998406A (zh) * | 2017-07-12 | 2020-04-10 | 卡尔蔡司显微镜有限责任公司 | 角度可变的照明时的闪烁 |
| CN111189807A (zh) * | 2018-11-14 | 2020-05-22 | 卡尔蔡司显微镜有限责任公司 | 基于波动的荧光显微术 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6507582B2 (ja) * | 2014-11-13 | 2019-05-08 | セイコーエプソン株式会社 | 印刷装置 |
| DE102015121920A1 (de) | 2015-12-16 | 2017-06-22 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Hochauflösendes Kurzzeit-Mikroskopieverfahren und hochauflösendes Kurzzeit-Mikroskop |
| PL3623798T3 (pl) * | 2018-09-13 | 2022-03-28 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag | Sposób i urządzenie do wykrywania i przedstawiania obrazu immunofluorescencyjnego próbki biologicznej |
| DE102018215831B4 (de) * | 2018-09-18 | 2020-04-02 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Optische Anordnung für fluoreszenzmikroskopische Anwendungen |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1953701A (zh) * | 2004-03-11 | 2007-04-25 | 通用医院有限公司 | 使用荧光蛋白进行断层摄影成像的方法和系统 |
| CN101124461A (zh) * | 2004-06-30 | 2008-02-13 | 凯米映像公司 | 暗场化学成像的方法和设备 |
| DE102010044013A1 (de) * | 2010-11-16 | 2012-05-16 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Tiefenauflösungsgesteigerte Mikroskopie |
| US20130010098A1 (en) * | 2009-12-22 | 2013-01-10 | Kalkbrenner Thomas | High-Resolution Microscope and Method for Determining the Two- or Three-Dimensional Positions of Objects |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102008009216A1 (de) * | 2008-02-13 | 2009-08-20 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer Struktur einer Probe |
| EP2438555B1 (en) | 2009-06-02 | 2017-03-08 | Sofast GmbH | Superresolution optical fluctuation imaging (sofi) |
| DE102009060079A1 (de) | 2009-11-19 | 2011-05-26 | Liebherr-Hausgeräte Ochsenhausen GmbH | Kühl- und/oder Gefriergerät |
| EP2535755A1 (en) * | 2011-06-14 | 2012-12-19 | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) | Cumulant microscopy |
| WO2014018805A2 (en) * | 2012-07-25 | 2014-01-30 | Theranos,Inc. | Image analysis and measurement of biological samples |
-
2013
- 2013-08-14 DE DE201310216124 patent/DE102013216124A1/de active Pending
-
2014
- 2014-07-18 EP EP14739846.5A patent/EP3033647A1/de not_active Withdrawn
- 2014-07-18 US US14/911,819 patent/US20160195704A1/en not_active Abandoned
- 2014-07-18 CN CN201480043416.XA patent/CN105452931B/zh active Active
- 2014-07-18 JP JP2016533861A patent/JP2016534395A/ja active Pending
- 2014-07-18 WO PCT/EP2014/065501 patent/WO2015022146A1/de active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1953701A (zh) * | 2004-03-11 | 2007-04-25 | 通用医院有限公司 | 使用荧光蛋白进行断层摄影成像的方法和系统 |
| CN101124461A (zh) * | 2004-06-30 | 2008-02-13 | 凯米映像公司 | 暗场化学成像的方法和设备 |
| US20130010098A1 (en) * | 2009-12-22 | 2013-01-10 | Kalkbrenner Thomas | High-Resolution Microscope and Method for Determining the Two- or Three-Dimensional Positions of Objects |
| DE102010044013A1 (de) * | 2010-11-16 | 2012-05-16 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Tiefenauflösungsgesteigerte Mikroskopie |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| STEFAN GEISSBUEHLER ET AL: "Mapping molecular statistics with balanced super-resolution optical fluctuation imaging (bSOFI)", 《OPTICAL NANOSCOPY》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109313328A (zh) * | 2016-06-21 | 2019-02-05 | 伊鲁米那股份有限公司 | 超分辨率显微术 |
| CN110998406A (zh) * | 2017-07-12 | 2020-04-10 | 卡尔蔡司显微镜有限责任公司 | 角度可变的照明时的闪烁 |
| CN110998406B (zh) * | 2017-07-12 | 2023-03-24 | 卡尔蔡司显微镜有限责任公司 | 角度可变的照明时的闪烁 |
| CN111189807A (zh) * | 2018-11-14 | 2020-05-22 | 卡尔蔡司显微镜有限责任公司 | 基于波动的荧光显微术 |
| CN111189807B (zh) * | 2018-11-14 | 2024-04-12 | 卡尔蔡司显微镜有限责任公司 | 基于波动的荧光显微术 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3033647A1 (de) | 2016-06-22 |
| WO2015022146A1 (de) | 2015-02-19 |
| US20160195704A1 (en) | 2016-07-07 |
| DE102013216124A1 (de) | 2015-02-19 |
| JP2016534395A (ja) | 2016-11-04 |
| CN105452931B (zh) | 2018-09-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105452931A (zh) | 高分辨率3d荧光显微术 | |
| US10394008B2 (en) | Hyperspectral multiphoton microscope for biomedical applications | |
| JP5392406B2 (ja) | 顕微鏡装置、観察方法 | |
| JP5776992B2 (ja) | 自然放出蛍光をパルス励起、連続脱励起、およびゲート記録するｓｔｅｄ顕微鏡法、ｓｔｅｄ蛍光相関分光法、およびｓｔｅｄ蛍光顕微鏡 | |
| JP5623278B2 (ja) | 顕微鏡および顕微鏡の操作方法 | |
| US9804376B2 (en) | Scanner with increased dynamic range | |
| US8263946B2 (en) | Method and apparatus for high-resolution optical scanning of a sample | |
| JP6596001B2 (ja) | 多焦点多光子イメージングシステム及び方法 | |
| JP2018517171A (ja) | 共焦点レーザ走査顕微鏡を使用した蛍光走査顕微鏡法の信号の評価 | |
| JP5381984B2 (ja) | 顕微鏡装置および顕微鏡装置制御プログラム | |
| US8822956B2 (en) | High-resolution fluorescence microscopy | |
| JP2008216996A (ja) | 走査型レーザ顕微鏡および観察方法 | |
| US10605733B1 (en) | Light sheet imaging flow cytometer | |
| JP2018120224A (ja) | 装置、システム、方法、及びプログラム | |
| JP2015082088A (ja) | レーザ走査型顕微鏡システムおよびレーザ光強度設定方法 | |
| JP2022177011A (ja) | 高速高分解能の顕微鏡検査方法、および高速高分解能の顕微鏡 | |
| EP2407781A1 (en) | Cell observation apparatus and observation method | |
| CN110114709A (zh) | 确定荧光强度的方法和显微镜 | |
| Chen et al. | Spatial resolution enhancement in photon-starved STED imaging using deep learning-based fluorescence lifetime analysis | |
| JP6393451B2 (ja) | Ｒｅｓｏｌｆｔ顕微鏡法における照明および検出用の方法および装置 | |
| JP2009288321A (ja) | 顕微鏡 | |
| JP2022519038A (ja) | スペクトル分離 | |
| JP2014170105A (ja) | 顕微鏡装置 | |
| JP6764469B2 (ja) | 生体試料を生存状態で観察する顕微鏡および方法 | |
| WO2013005765A1 (ja) | 顕微鏡装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |