WO2015022146A1 - Hochauflösende 3d-fluoreszenzmikroskopie - Google Patents

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WO2015022146A1
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illumination
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Thomas Kalkbrenner
Ingo Kleppe
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Carl Zeiss Microscopy Gmbh
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Definitions

  • the invention relates to a microscopy method or a microscope for generating a highly resolved in the depth direction image of a fluorescent sample.
  • microscopy methods For resolutions beyond the diffraction limit given by the laws of physics, various approaches have been developed over time. These microscopy methods are characterized in that they provide the user with a higher lateral optical resolution compared to the conventional microscope. In this specification, such microscopy methods are referred to as high-resolution microscopy methods, since they achieve a resolution beyond the optical diffraction limit. Diffraction-limited microscopes, on the other hand, are called classical microscopes. From the publication T. Dertinger et al., "Fast, background-free, 3D super-resolution optica! fluctuation imaging (SOFI) ", PNAS (2009), pp.
  • SOFI super-resolution optica! fluctuation imaging
  • Geissbuehler et al., Biomed., Opt., Express 2, 408-420 (201) discloses a high resolution, far field microscopy method If the fluorophores of a sample flash statistically independently of one another, a sample of the sample can be achieved by suitable filtering with a so-called cumulant function a significant increase in resolution beyond the physically prescribed optical resolution limit
  • a sequence of individual images is recorded and then combined with the cumulant function to a single image, which then di e has higher resolution.
  • This method is referred to by abbreviation of the term "Super-Resoiution Optical Fluctuation Imaging" as the SOFI method.
  • the SOFI method In the SOFI method, a sequence of biases with as many flashes as possible of the fluorophores subsequently added to the sample or inherently present in the sample is required. At the same time, the camera must be able to record this flashing in time and at the same time to offer a high spatial resolution.
  • the SOFI method When realizing the SOFI principle, it must be ensured that as few fluorophores change their fluorescence state during the recording of a single image, and that the fluctuations of individual fluorophores (ie the change in the fluorescence state) can be detected from frame to frame.
  • the SOFI method has therefore been used in the past particularly with regard to thin samples that have virtually no depth extension along the optical axis of the image with respect to the fluorescent material.
  • the invention has for its object to provide a high-resolution microscopy method according to the SOFI principle, with which even thick samples can be analyzed, d. H. the restrictions on the possible samples are lifted.
  • a microscopy method for producing a high-resolution image of a sample comprising the following steps: a) providing the sample with a substance which emits certain fluorescent fluorescence statistically flashing after excitation, or using a sample containing such a substance contains b) irradiation of illumination radiation on the sample and thereby exciting the sample to emit fluorescence radiation.
  • the irradiation of the illumination radiation takes place in such a way that the illumination radiation excites the sample along the optical axis only in a limited depth range for emitting the fluorescence radiation.
  • the SOFI principle is combined with optical cutting methods in order to achieve a high-resolution imaging of the fluorescent sample in the depth direction as well. This avoids both extra-focal background contributions during image generation and also a load on the sample due to fluorescence excitation in depth sections that are not even imaged.
  • the optical cutting can be done in various ways. In one embodiment, a so-called temporal focusing is used, as described for example in DE 102009060793 A1 of the applicant. In another embodiment, a light blue transverse to the optical axis of the image is irradiated. Another embodiment uses multiphoton processes to generate the flashing states in the sample.
  • the sample will fluoresce flatly only in the depth ranges previously selected by the rasterized multiphoton action.
  • the switching radiation is rasterized introduced, preferably with a Mehrphotonenske, since that allows a particularly narrow defined depth range to define.
  • the Umschaitstrahlung can also be introduced by means of temporal focusing, to make the multi-photon excitation without scanning scanning depth-selective.
  • the subsequent excitation of the specimen is carried out without further structuring since the specimen was only switched over in the previously prepared depth ranges and thus can only show the blinking behavior required for the SOFI principle.
  • the aforementioned sample preparation by means of the switching radiation ensures that only a selected depth range shows a specific flashing behavior, which is then evaluated in the SOFI process.
  • one or more of the following variables are possible as blinking parameters: dark time duration, transition probability between dark and bright state of the flashing, light / dark time ratio of the flashing.
  • a flashing parameter of the marker or of the sample can be adjusted by the mentioned illumination parameters, which influences the dark time duration and / or a transition probability between dark and bright state of the BSinking; both with the goal of achieving the optimal ratio of 1: 1 or to approach him.
  • a manipulation of the substance can also be achieved by means of chemical control of a lifetime of the responsible molecules in which fluorescence radiation is emitted (bright state) or no fluorescence radiation is emitted (dark state). In this case, an occupation number of the states is sought, which achieve a transition probability between bright and dark of 0.5 with equal lifetimes of light and dark state.
  • FIG. 1 shows a block diagram of an embodiment of a microscopy method for generating a high-resolution image also in depth orientation
  • FIG. 2 is a schematic representation of a microscope for carrying out the method of FIG.
  • Fig. 3 is a schematic representation of another microscope for performing the method.
  • Fig. 4 is a block diagram similar to Fig. 1 for a further embodiment of the method, which can be carried out with modified constructions of the microscope of Fig. 2 or 3.
  • Figure 1 shows as a block diagram of a first embodiment of a microscopy method for generating a high-resolution image in the depth direction.
  • a sample is provided with a marker, which eats the substance mentioned in the beginning, which emits statistically flashing certain fluorescence radiation after excitation.
  • a sample is selected which already contains the substance.
  • a subsequent step S2 illumination radiation is irradiated onto the sample and thus the emission of the determined fluorescence radiation from the substance in the sample is excited.
  • the illumination radiation is irradiated by means of an optical cutting method so that it excites the sample along the optical axis of a subsequent image only in a limited depth range for emitting the fluorescence radiation. This limited depth range determines the resolution in the depth direction.
  • step S3 the sample is repeatedly imaged in a step S3, wherein due to the flashing behavior in each image, a different flashing state of the sample is present.
  • the repeated image thus generates a sequence of images In.
  • this image sequence In is processed by means of a cumulant function, which evaluates intensity fluctuations caused by the flashing in the image sequence.
  • an image If is generated that has a spatial resolution that exceeds the optical resolution of the image.
  • the method of steps S3 and S4 corresponds to the known SOFI principle, for example according to the publication by Dertinger et al. The difference, however, is that due to the embodiment of step S2, the sample emits flashing fluorescence radiation only in a narrowly defined depth range.
  • FIG. 2 shows a microscope 1 which can be used to carry out the method of FIG.
  • FIG. 2 two different embodiments for the microscopy method are entered.
  • the elements 17 to 19 and the punctured beam path in the image of Figure 2 do not affect the embodiment of the method according to Figure 1. These components of Figure 2 will therefore be explained later and should not play any role for the time being.
  • a sample 2 is located behind a cover glass not specified. It is imaged with the microscope 1 via an objective 3 and a tube lens 4 onto a detector 5. This corresponds to a known microscope structure.
  • a beam splitter 7 via which an illumination beam path 8 is coupled, which has a beam shaping device 1 1, which introduces the radiation via the microscope 3 in the sample 2.
  • the illumination beam path 8 comprises an illumination source 9, which emits the illumination radiation 10.
  • the illumination radiation 10 is pulsed and is irradiated by temporal focusing so that it has a certain pulsed time behavior only in a limited depth range. Only in a limited depth range of the sample, the pulse duration is minimized.
  • the illumination source 9 outputs the pulsed illumination radiation 10. It is deflected via a scattering element, which is formed in the embodiment shown in Figure 2 as a grid 12. Instead of the grid 12, other scattering elements can be used, for. As a DMD, LDC filter, LCoS or a dispersive element.
  • a scattering element which is formed in the embodiment shown in Figure 2 as a grid 12.
  • other scattering elements can be used, for.
  • a DMD LDC filter, LCoS or a dispersive element.
  • the illumination source 9 thus emits a pulsed raw beam, which is modified via the scattering element and the optics so that only in the image plane 15, which lies in the sample 2, the minimum pulse length is given after the scattering element. Above and below the image plane 15, the pulse length is greater.
  • the beam path of the illumination beam path 8 is shown drawn through.
  • the radiation from one element of the grating 12 is shown in dashed lines.
  • the radiation incident on the grating elements of the grating 12 is spectrally decomposed.
  • the spectral components of the radiation have the same running time only for the image plane 5, so that only in the image plane 15 the pulses of the raw beam, as it comes from the illumination source 9, are reconstructed into pulses with a minimum pulse length. This applies in the entire image plane 15, as the solid illumination beam path shows.
  • FIG. 3 shows a further embodiment of the method of FIG. 1 in the form of a schematically illustrated microscope 1. Elements that correspond functionally or structurally to those of FIG. 2 have the same reference numerals in order to dispense with repeated descriptions.
  • the microscope 1 of Figure 3 differs from the microscope of Figure 2 essentially by the illumination beam path 8.
  • the illumination source 9 is here from a light beam, which is also modified by a beam shaping device 11. 2
  • the beam shaping device 1 was still formed by the grating 12 and the optics 13 and 14 for optical cutting by temporal focusing
  • the beam shaping device 11 of FIG. 3 effects the irradiation of the illumination radiation in the form of a light sheet 16 transverse to the optical axis 6 of the microscope 1
  • the sample 2 is thus irradiated only in the region of the light sheet 16, which consequently determines the depth plane.
  • FIG. 4 schematically shows a further embodiment of the microscopy method.
  • steps S3 and S4 it corresponds to that of FIG. 1, so that the repetition of the description of these steps can be dispensed with.
  • the differences lie in the embodiment of step S2, which is formed in two parts in the embodiment of FIG. It consists of two steps S2a and S2b.
  • the step S1 is modified to a step S1 '.
  • a sample is provided whose substance is separated by a Multiphoton effect is switched to a fluorescence state in which it emits the SOFi-compatible fluorescence radiation with the statistical Bünk . In other words, it is only after switching on a switching radiation that the sample (ie its fluorescent molecules) can be excited.
  • the step SV therefore comprises the marking of a sample with a substance or the selection of a sample inherently suitable substances, which can be set by means of Umschaitstrahlung in a state in which it can then be excited by irradiation of an excitation radiation for emitting fluorescence radiation.
  • the illumination radiation which was irradiated in step S2 of the embodiment of FIG. 1 thus comprises in the embodiment of FIG. 4 two components, a switching radiation and an excitation radiation. Accordingly, the step S2 is divided into two steps S2a and S2b.
  • step S2a the switching radiation is radiated. This is done so that the desired depth range is selected.
  • step S2b the excitation radiation is then irradiated onto the sample. In this case, depth depth selection no longer has to take place, since the sample can only emit fluorescence radiation in those areas which were previously switched over by the irradiation in step S2a.
  • the bipartite provision of the illumination radiation has a significant advantage.
  • the sample is scanned, if in step SV a corresponding substance was used, which is switched over a multi-photon effect.
  • step S2a temporal focusing may be considered in step S2a.
  • the microscope of Figure 2 is therefore structured for an alternative embodiment of the method in contrast to the previously described structure so that the illumination source 9 provides the switching radiation pulsed.
  • the pulse length and thus the intensity required for the multiphoton process is present exclusively in the image plane 15.
  • a beam splitter 17 is additionally provided, which couples light from a beam source, which then acts as excitation radiation 19, into the beam path of the microscope 1, the sample being illuminated in the wide field. Only the previously prepared areas in the image plane 15 then emit the statistically flashing fluorescence radiation.
  • the illumination radiation is realized by the combination of the illumination beam path 8 and the excitation beam path ⁇ realized by the elements 17 to 19).
  • Scanning Umschaltstrahiung is not mandatory in this embodiment, since the temporal focus already realizes the depth selection.
  • FIG. 3 shows a microscope for the embodiment of the method according to FIG. 4 - here for a scanned sample preparation by multiphoton process.
  • the elements 9 to 1 1 are modified (not shown) so that they cause a far-field illumination of the sample 2 with excitation radiation.
  • This excitation can take place transversely to the optical axis 6 but alternatively also along the optical axis 6.
  • a beam splitter 20 is provided, which is fed with radiation from a scanner 21, which deflects a raw beam from a switching beam source 22 by scanning.
  • a switching beam 23 which is scanned over the sample 2. It causes by means of Mehrphotonen bin switching the substance sample 2 in a state in which it can then excite the excitation radiation.
  • step S2a is thus carried out by suitable control of the scanner 21 and the switching beam source 22, the step S2b by suitable control of the beam source.
  • a (not shown) control device which controls the components of the microscope for carrying out the method of Figure 1 or Figure 4 suitable.
  • the image sequence In from individual images is converted into the high-resolution image If in the SOFI processing S4.
  • SOFI processing S4 for example, by Dertinger et al. described principle used. Likewise, the principle of Dertinger et al. Further developed concept according to WO 2010/141608 A1 can be used. This publication is also fully included in this regard.
  • the florescence of the fluorophores required for the SOFI principle is defined by a transition from a first, fluorescent to a second, non-fluorescent state.
  • a non-fluorescent state is understood to be any state in which the fluorescence radiation which is evaluated for the image is not emitted.
  • the non-fluorescent state can thus definitely be a state in which a fluorophore shines in another fluorescence spectral range.
  • transition probabilities from the first to the second state can be modified, as is known, for example, from the publication Heilemann et al., Angewandte Chemie 121, p. 7036, 2009, for example by chemical influences, temperature influences or lighting influences.
  • the SOFI principle is particularly efficient when the proportion between luminous and non-luminous fluorophores for the respective image acquisition or image integration time is 1: 1.
  • the transition probability between the first and second states and between the second and first states should ideally be 0.5. This can be achieved by appropriate manipulation of the sample by means of chemical action, temperature action or illumination. In this case, by optimizing the incident spectral distribution, the transition probability can be optimized with the aim of achieving the mentioned opiate ratio 1: 1.
  • the SOFI principle therefore requires transition probabilities that are significantly different from other microscopy techniques.
  • the PALM principle also referred to as dSTORM
  • dSTORM calls for states where the vast majority of fluorophores are in a dark state.
  • the dark time period must be taken into account in addition to the transition probability. Even if the transition probability from light to dark is 0.5, with a much longer life of the dark states, the optimal ratio of 1: 1 would be missed.
  • the means for modifying the transition probability and dark time duration used in the prior art are therefore particularly preferably used (and regardless of the imaging of an image field which can be smaller than a sample field), the ratio of luminous to non-luminous fluorophores in the direction Optimize 1: 1 optimally by adjusting transition probability and / or dark life (or helix duration) appropriately and adjusting to the image acquisition rate or integration time. Conversely, it is possible to adapt the absorption rate to the lifetimes.

Abstract

Ein Mikroskopieverfahren zum Erzeugen eines hochaufgelösten Bildes (/f) einer Probe (2) weist folgende Schritte auf: a) Versehen der Probe (2) mit einer Substanz, die nach Anregung statistisch blinkend bestimmte Fluoreszenzstrahiung abgibt, oder Verwenden einer Probe (2), die eine solche Substanz enthält, b) Einstrahlen von Beleuchtungsstrahlung (10) auf die Probe (2) und dadurch Anregen der Probe (2) zur Abgabe der Fluoreszenzstrahiung, c) wiederholtes Abbilden der die Fluoreszenzstrahiung abgebenden Probe (2) längs einer optischen Achse (OA) auf einen ortsauflösenden Detektor (5), so dass eine Bildfolge (In) erhalten wird, d) Bearbeiten der Bildfolge (In) mittels einer Kumulantenfunktion, welche durch das Blinken verursachte Intensitätsfluktuationen in der Bildfolge (In) auswertet, und dadurch Erzeugen eines Bildes (If) einer lokalen Verteilung der Substanz in der Probe (2), das eine über die optische Auflösung der Abbildung hinaus gesteigerte Ortsauflösung aufweist, wobei e) das Einstrahlen der Beleuchtungsstrahlung (10) so erfolgt, dass die Beleuchtungsstrahlung (10) die Probe (2) längs der optischen Achse (OA) nur in einem begrenzten Tiefenbereich zur Abgabe der Fluoreszenzstrahiung anregt.

Description

Hochauflösende 3D-Fluoreszenzmikroskopie
Die Erfindung bezieht sich auf ein Mikroskopieverfahren bzw. ein Mikroskop zum Erzeugen eines auch in Tiefenrichtung hochaufgelösten Bildes einer fluoreszierenden Probe.
Die Untersuchung von Proben mittels Mikroskopie ist ein weites technisches Gebiet, für das es vielfältige technische Lösungen gibt. Ausgehend von der klassischen Lichtmikroskopie haben sich verschiedenste Mikroskopieverfahren entwickelt. Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten ist die Fluoreszenzmikroskopie. Hierbei werden bestimmte Farbstoffe (sogenannte Fluorophore) zur spezifischen Markierung von Proben, z. B. von Zellteilen, verwendet. Die Probe wird, wie erwähnt, mit Anregungsstrahlung beleuchtet und die dadurch angeregte Fluoreszenzstrahlung mit geeigneten Detektoren erfasst. Üblicherweise ist dazu im Lichtmikroskop ein dichroitischer Strahlteiler in Kombination mit Blockfiltern vorgesehen, die die Fluoreszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung abspalten und eine getrennte Beobachtung ermöglichen. Durch dieses Vorgehen ist die Darstellung einzelner, verschieden gefärbter Zellteile im Lichtmikroskop möglich. Natürlich können auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen, sich spezifisch an unterschiedliche Strukturen des Präparates anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden. Dieses Verfahren bezeichnet man als Mehrfachlumineszenz. Auch kann man Proben vermessen, die per se, also ohne Markierungsstoffzugabe lumineszieren.
Für Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze, die durch die physikalischen Gesetze gegeben ist, wurden in der ietzen Zeit verschiedene Ansätze entwickelt. Diese Mikroskopieverfahren zeichnen sich dadurch aus, dass sie im Vergleich zum klassischen Mikroskop dem Anwender eine höhere laterale optische Auflösung zur Verfügung stellen. In dieser Beschreibung werden solche Mikroskopieverfahren als hochauflösende Mikroskopieverfahren bezeichnet, da sie eine Auflösung jenseits der optischen Beugungsgrenze erreichen. Beugungsbegrenzte Mikroskope werden hingegen als klassische Mikroskope bezeichnet. Aus der Veröffentlichung T. Dertinger et al.,„Fast, background-free, 3D super-resolution optica! fluctuation imaging (SOFI)", PNAS (2009), S. 22287-22292 sowie „Achieving increased resolution and more pixels with Superresolution Optical Fluctuation Imaging (SOFI)", Opt. Express, 30.08.2010, 18(18): 18875-85, doi: 10.1364/IE.18.018875 und S. Geissbuehler et al., „Comparison between SOFI and STORM", Biomed. Opt. Express 2, 408-420 (201 ) ist ein hochaufiösendes Verfahren der Weitfeldmikroskopie bekannt. Dieses Verfahren nutzt die Blinkeigenschaften eines Fluorophors. Blinken die Fluorophore einer Probe statistisch unabhängig voneinander, kann eine Abbildung der Probe durch geeignete Filterung mit einer sogenannten Kumulantenfunktion eine erhebliche Auflösungserhöhung über die physikalisch vorgegebene optische Auflösungsgrenze hinaus erreicht werden. Zur Erzeugung eines hochaufgelösten Bildes wird eine Probe im Weitfeld angeregt und abgebildet. Dabei wird eine Folge von Einzelbildern aufgenommen und dann mit der Kumulantenfunktion zu einem Einzelbild vereinigt, das dann die höhere Auflösung hat. Dieses Verfahren wird in Abkürzung des Begriffes„Super-Resoiution Optical Fluctuation Imaging" als SOFI-Verfahren bezeichnet.
Beim SOFI-Verfahren benötigt man eine Biidfolge mit möglichst verschiedenen Blinkzusiänden der nachträglich der Probe hinzugefügten oder inhärent in der Probe vorhandenen Fluorophore. Gleichzeitig muss die Kamera in der Lage sein, dieses Blinken zeitlich zu erfassen und zugleich eine hohe Ortsaufiösung zu bieten. Bei der Realisierung des SOFI-Prinzipes muss dafür gesorgt werden, dass während der Aufnahme eines Einzelbildes möglichst wenige Fluorophore ihren Fluoreszenzzustand wechseln, und dass die Fluktuationen einzelner Fluorophore (also das Wechseln des Fluoreszenzzustands) von Einzelbild zu Einzelbild detektierbar sind. Das SOFI-Verfahren ist deshalb in der Vergangenheit besonders in Hinblick auf dünne Proben, die hinsichtlich des fluoreszierenden Materials quasi keine Tiefenerstreckung längs der optischen Achse der Abbildung haben, angewendet worden. So könnte man daran denken, eine TIRF- Beleuchtung der Probe durchzuführen, um sicherzustellen, dass keine hintereinander liegenden Fluorophore ihren Fluoreszenzzustand während der Aufnahme eines Einzelbildes wechseln. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein hochauflösendes Mikroskopieverfahren nach dem SOFI-Prinzip anzugeben, mit dem auch dicke Proben analysiert werden können, d. h. die Beschränkungen hinsichtlich der möglichen Proben aufgehoben ist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Mikroskopieverfahren zum Erzeugen eines hochaufgelösten Bildes einer Probe, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a) Versehen der Probe mit einer Substanz, die nach Anregung statistisch blinkend bestimmte Fluoreszenzstrahlung abgibt, oder Verwenden einer Probe, die eine solche Substanz enthält, b) Einstrahlen von Beleuchtungsstrahlung auf die Probe und dadurch Anregen der Probe zur Abgabe der Fluoreszenzstrahlung.
c) wiederholtes Abbilden der die Fluoreszenzstrahlung abgebenden Probe längs einer optischen Achse auf einen ortsauflösenden Detektor, so dass eine Bildfolge erhalten wird, d) Bearbeiten der Bildfolge mittels einer Kumulantenfunktion, welche durch das Blinken verursachte Intensitätsfluktuationen in der Bildfolge auswertet, und dadurch Erzeugen eines Bildes einer lokalen Verteilung der Substanz in der Probe, das eine über die optische Auflösung der Abbildung hinaus gesteigerte Ortsauflösung aufweist,
wobei
e) das Einstrahlen der Beleuchtungsstrahlung so erfolgt, dass die Beleuchtungsstrahlung die Probe längs der optischen Achse nur in einem begrenzten Tiefenbereich zur Abgabe der Fluoreszenzstrahlung anregt.
Erfindungsgemäß wird das SOFI-Prinzip mit optischen Schnittmethoden kombiniert, um auch in Tiefenrichtung eine hochauflösende Abbildung der fluoreszierenden Probe zu erreichen. Damit werden sowohl außerfokale Hintergrundbeiträge bei der Bilderzeugung vermieden, als auch eine Belastung der Probe durch Fluoreszenzanregung in Tiefenabschnitten, die gar nicht abgebildet werden. Das optische Schneiden kann auf verschiedene Art und Weisen erfolgen. In einer Ausführungsform wird ein sogenanntes temporal Fokussing verwendet, wie es beispielsweise in der DE 102009060793 A1 der Anmelderin beschrieben ist. In einer anderen Ausführungsform wird ein quer zur optischen Achse der Abbildung liegendes Lichtblau eingestrahlt. Eine weitere Ausführungsform verwendet Mehrphotonenprozesse zum Erzeugen der Blinkzustände in der Probe. Dies ist insofern überraschend, als eine direkte Mehrphotonenanregung einen Punktscanner erfordert, der sich für das SOFI-Prinzip a priori nicht verwenden lässt, da das einen gerasterten Bildaufbau erfordern würde. Das SOFI-Prinzip erzwingt aber die Gleichzeitigkeit der Abbildung der gesamten Probe in verschiedenen Blinkzuständen und ist m it einem gerasterten Bildaufbau nicht vereinbar. Dennoch kann ein Mehrphotoneneffeki zum optischen Schneiden für das SOFI-Prinzip eingesetzt werden, indem eine Substanz verwendet wird, die durch Einstrahlung optischer Umschaltstrahlung zwischen einem ersten und einem zweiten Zustand umschaltbar ist. Die Substanz ist nur im zweiten Zustand zur Abgabe der Fluoreszenzstrahlung anregbar. Man kann dadurch mit einem gerasterten Umschalten die Probe so präparieren, dass nur ganz ausgewählte Tiefenbereiche in einem nachfolgenden Fluoreszenzanregungsschritt zum Blinken gebracht werden können. Dann fluoresziert die Probe flächig jedoch nur in den Tiefenbereichen, die vorher durch die gerasterte Mehrphotoneneinwirkung ausgewählt wurden . Die Umschaltstrahlung wird gerastert eingebracht, bevorzugt mit einem Mehrphotonenprozess, da das einen besonders eng umgrenzten Tiefenbereich zu definieren erlaubt. Die Umschaitstrahlung kann natürlich auch mittels temporal Fokussing eingebracht werden, um die Mehrphotonenanregung ohne rasterndes Scannen tiefenselektiv vorzunehmen.
Hai man die Probe mit Umschaltstrahlung tiefenselektiv präpariert, erfolgt die anschließende Anregung der Probe ohne weitere Strukturierung, da die Probe nur in den zuvor präparierten Tiefenbereichen umgeschaltet wurde und so nur dort das für das SOFI-Prinzip erforderliche Blinkverhalten zeigen kann.
Die genannte Probenpräparation mittels der Umschaltstrahlung sorgt dafür, dass nur ein ausgewählter Tiefenbereich ein bestimmtes Blinkverhalten zeigt, das dann im SOFI-Prozess ausgewertet wird. Als Blinkparameter kommen dabei eine oder mehrere der folgenden Größen in Frage: Dunkelzeitdauer, Übergangswahrscheinlichkeit zwischen Dunkel- und Hellzustand des Blinkens, Hell/Dunkel-Zeitverhältnis des Blinkens.
Es ist für das SOFI-Prinzip anzustreben, das Verhältnis aus Dunkel- und Heil-Zeit des Blinkens und der Blinkwahrscheinlichkeit der Fluorophore zu optimieren. Ein Verhältnis von hellen zu dunklen Fluorophoren von 1 :1 ist optimal, da dann im Mittel in jedem Einzelbild die Hälfte aller Fluorophore leuchten. Erreicht man dies, ist die Zahl der benötigten Einzelbilder minimiert.
Es ist deshalb im Hinblick auf eine möglichst schnelle Bildaufnahme zu bevorzugen, durch geeignete Einstellung der Umschaltstrahlung ein Hell/Dunkel-Zeitverhältnis des Blinkens einzustellen und bevorzugt dieses Verhältnis an die Einzelbildaufnahmerate des Detektors anzupassen. Weiter kann durch die genannten Beleuchtungsparameter ein Blinkparameter des Markers bzw. der Probe angepasst werden, der die Dunkelzeiidauer und/oder eine Übergangswahrscheinlichkeit zwischen Dunkel- und Hellzustand des BSinkens beeinflusst; beides mit dem Ziel das Optimalverhältnis von 1 :1 zu erreichen oder sich ihm zu nähern. Zusätzlich zur Beeinflussung durch Beleuchtungsstrahlung kann auch eine Manipulation der Substanz mitteis chemischer Steuerung einer Lebensdauer der zuständigen Moleküle, in denen Fluoreszenzstrahlung abgegeben wird (Hellzustand) bzw. keine Fluoreszenzstrahlung abgegeben wird (Dunkelzustand) erreicht werden. Hierbei wird eine Besetzungszahl der Zustände angestrebt, die bei gleichen Lebensdauern von Hell- und Dunkelzustand eine Übergangswahrscheinlichkeit zwischen Hell und Dunkel von 0,5 erreichen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen: Fig. 1 ein Blockschaltbild einer Ausführungsform eines Mikroskopieverfahrens zum Erzeugen eines auch in Tiefenausrichtung hochaufgelösten Bildes;
Fig. 2 eine Schemadarstellung eines Mikroskops zum Durchführen des Verfahrens der Fig.
1 ,
Fig. 3 eine Schemadarstellung eines weiteren Mikroskops zur Durchführung des Verfahrens und
Fig. 4 ein Blockschaltbild ähnlich der Fig. 1 für eine weitere Ausführungsform des Verfahrens, das mit abgewandelten Bauweisen des Mikroskops der Fig. 2 oder 3 ausgeführt werden kann.
Figur 1 zeigt als ein Blockschaltbild einer ersten Ausführungsform eines Mikroskopieverfahrens zum Erzeugen eines auch in Tiefenrichtung hochaufgelösten Bildes.
In einem Schritt S1 wird eine Probe mit einem Marker versehen, der die eingangs genannte Substanz äst, welche nach Anregung statistisch blinkend bestimmte Fluoreszenzstrahlung abgibt. Alternativ wird eine Probe ausgewählt, die die Substanz bereits enthält.
In einem anschließenden Schritt S2 wird Beleuchtungsstrahlung auf die Probe eingestrahlt und so die Abgabe der bestimmten Fluoreszenzstrahlung von der Substanz in der Probe angeregt. Die Beleuchtungsstrahlung wird dabei mittels eines optischen Schneideverfahrens so eingestrahlt, dass sie die Probe längs der optischen Achse einer nachfolgenden Abbildung nur in einem begrenzten Tiefenbereich zur Abgabe der Fluoreszenzstrahlung anregt. Dieser begrenzte Tiefenbereich legt die Auflösung in Tiefenrichtung fest.
Anschließend wird in einem Schritt S3 die Probe wiederholt abgebildet, wobei aufgrund des Blinkverhaltens in jeder Abbildung ein anderer Blinkzustand der Probe vorliegt. Die wiederholte Abbildung erzeugt damit eine Bildfolge In. In einem anschließenden Schritt S4 wird diese Bildfolge In mittels einer Kumulantenfunktion bearbeitet, welche durch das Blinken verursachte Intensitätsfluktuationen in der Bildfolge auswertet. Dadurch wird ein Bild If erzeugt, das eine über die optische Auflösung der Abbildung hinausgesteigerte Ortsauflösung aufweist. Das Verfahren der Schritte S3 und S4 entspricht dem bekannten SOFI-Prinzip, beispielsweise gemäß der eingangs erwähnten Veröffentlichung von Dertinger et al. Der Unterschied besteht allerdings darin, dass durch die Ausgestaltung des Schrittes S2 die Probe nur in einem eng begrenzten Tiefenbereich blinkend Fluoreszenzstrahlung abgibt. Das Bild //"gibt damit die Probe ausschließlich in diesen Tiefenbereich wieder. Figur 2 zeigt ein Mikroskop 1 , das zur Ausführung des Verfahrens der Figur 1 verwendet werden kann. In der Figur 2 sind dabei zwei verschiedene Ausführungsformen für das Mikroskopieverfahren eingetragen. Die Elemente 17 bis 19 sowie der punktierte Strahlengang im Bild der Figur 2 betreffen dabei nicht die Ausführungsform des Verfahrens gemäß Figur 1. Diese Bestandteile der Figur 2 werden deshalb erst später erläutert werden und sollen vorerst keine Rolle spielen.
Eine Probe 2 befindet sich hinter einem nicht näher bezeichneten Deckglas. Sie wird mit dem Mikroskop 1 über ein Objektiv 3 und eine Tubuslinse 4 auf einen Detektor 5 abgebildet. Dies entspricht insofern einem bekannte Mikroskopaufbau. Im Strahlengang der Abbildung befindet sich ein Strahlteiler 7, über den ein Beleuchtungsstrahlengang 8 eingekoppelt ist, der eine Strahlformungseinrichtung 1 1 aufweist, welche die Strahlung über das Mikroskop 3 in die Probe 2 einbringt. Der Beleuchtungsstrahlengang 8 umfasst eine Beleuchtungsquelle 9, welche die Beleuchtungsstrahlung 10 abgibt. Die Beleuchtungsstrahlung 10 ist gepulst und wird mittels temporal Fokussing so eingestrahlt, dass sie nur in einem begrenzten Tiefenbereich ein bestimmtes gepulstes Zeitverhalten hat. Nur in einem begrenzten Tiefenbereich der Probe wird die Pulsdauer minimiert. Ein derartiges temporal Fokussing ist beispielsweise aus der DE 1020090600793 A1 der Anmelderin bekannt. Das Prinzip ist beispielsweise aus den Veröffentlichungen Oron et al., Optics Express 13, 1468 (2005) oder Vaziri et al„ PNAS 105- 20221 (2008) bekannt. Bezüglich des Funktionsprinzips und der Ausgestaltung der Elemente des Beleuchtungsstrahlengangs 8 wird deshalb ausdrücklich auf diese Druckschriften verwiesen und deren Offenbarungsgehalt hier vollständig eingebunden.
Die Beleuchtungsquelle 9 gibt die gepulste Beleuchtungsstrahlung 10 ab. Sie wird über ein Streuelement, das in der in Figur 2 gezeigten Ausführungsform als Gitter 12 ausgebildet ist, umgelenkt. Anstelle des Gitters 12 können auch andere Streuelemente verwendet werden, z. B. ein DMD, LDC-Filter, LCoS oder ein dispersives Element. Mittels Optiken 13 und 14 sowie über den Strahlteiler 7 und das Objektiv 3 wird die Strahlung so abgebildet, dass erst in einer Bildebene 15 die gepulste Strahlung wieder die Pulslänge hat, mit der sie die Beleuchtungsquelle abgegeben hat. Dass in der Bildebene 15 exakt dieselbe Pulslänge wieder vorliegt, ist der Idealfall. Durch dispersive Elemente im Strahlengang nach dem Streuelement liegt in der Realität in der Bildebene 15 eine etwas längere Pulslänge vor; dennoch ist in der Bildebene 15 die kürzeste Pulslänge im Strahlengang nach dem Streuelement vorhanden. Die Beleuchtungsquelle 9 gibt also einen gepulsten Rohstrahl ab, der über das Streuelement und die Optik so modifiziert wird, dass erst wieder in der Bildebene 15, welche in der Probe 2 liegt, die minimale Pulslänge nach dem Streuelement gegeben ist. Oberhalb und unterhalb der Bildebene 15 ist die Pulslänge größer.
In Figur 2 ist der Strahlengang des Beleuchtungsstrahlengangs 8 durchgezogen eingetragen. Die Strahlung von einem Element des Gitters 12 ist gestrichelt gezeichnet. Wie zu sehen ist, wird die Strahlung, die auf die Gitterelemente des Gitters 12 fällt, spektral zerlegt. Die spektralen Komponenten der Strahlung haben nur für die Bildebene 5 die gleiche Laufdauer, so dass nur in der Bildebene 15 die Pulse des Rohstrahls, wie er von der Beleuchtungsquelle 9 kommt, zu Pulsen mit minimaler Pulslänge rekonstruiert werden. Dies gilt in der gesamten Bildebene 15, wie der durchgezogene Beleuchtungsstrahlengang zeigt. Durch Wahl der Substanz derart, dass sie nur durch gepulste Strahlung mit der Pulslänge des Rohstrahls angeregt wird, um SOFI-tauglich blinkende Fluoreszenzstrahlung abzugeben, kann somit durch das Mikroskop der Figur 2 die gewünschte Tiefenauswahl bei der Einstrahlung der Beleuchtungsstrahlung 0 realisiert werden. Dies geschieht im Weitfeld, wie der durchgezogen gezeichnete Strahlengang verdeutlicht.
Figur 3 zeigt eine weitere Ausführungsform des Verfahrens der Figur 1 in Form eines schematisch dargestellten Mikroskops 1. Elemente, die funktionell oder strukturell denen der Figur 2 entsprechen, tragen dasselbe Bezugszeichen, um auf Beschreibungswiederholungen zu verzichten.
In Figur 3 ist ebenfalls mit den Elemente 17 bis 19 und dem punktierten Strahlengang eine Variante eingetragen, die erst später anhand der Figur 4 erläutert werden wird. Das Mikroskop 1 der Figur 3 unterscheidet sich vom Mikroskop der Figur 2 im wesentlichen durch den Beleuchtungsstrahlengang 8. Die Beleuchtungsquelle 9 gibt hier einen Lichtstrahl ab, der ebenfalls von einer Strahlformungseinrichtung 11 modifiziert wird. War in Figur 2 die Strahlformungseinrichtung 1 noch durch das Gitter 12 und die Optiken 13 und 14 zum optischen Schneiden durch temporal Fokussing ausgebildet, bewirkt die Strahlformungseinrichtung 11 der Figur 3 die Einstrahlung der Beleuchtungsstrahlung in Form eines Lichtblattes 16 quer zur optischen Achse 6 des Mikroskops 1. Die Probe 2 wird damit nur im Bereich des Lichtblattes 16 bestrahlt, das folglich die Tiefenebene festlegt.
Figur 4 zeigt schematisch eine weitere Ausführungsform des Mikroskopieverfahrens. Es entspricht hinsichtlich der Schritte S3 und S4 dem der Figur 1 , so dass auf die Wiederholung der Beschreibung dieser Schritte verzichtet werden kann. Die Unterschiede liegen in der Ausgestaltung des Schrittes S2, der in der Ausführungsform der Figur 4 zweiteilig ausgebildet ist. Er besteht aus zwei Schritten S2a und S2b. Auch ist der Schritt S1 zu einem Schritt S1 ' abgewandelt. In diesem Schritt S1 ' wird eine Probe bereitgestellt, deren Substanz durch einen Multiphotonen-Effekt in einen Fluoreszenzzustand geschaltet wird, in dem sie die SOFi- taugliche Fluoreszenzstrahlung mit dem statistischen Bünkverhalten abgibt. Mit anderen Worten, erst nach Einschalung einer Umschaltstrahlung kann die Probe (d. h. deren fluoreszierende Moleküle) angeregt werden. In Bereichen, in denen die Umschaltstrahlung nicht eingestrahlt wurde, zeigt die Probe, auch wenn die Anregungsstrahlung eingestrahlt wird, nicht das SOFl-taugliche Fluoreszenzverhalten, im Idealfall überhaupt keine Fluoreszenz. Der Schritt SV umfasst deshalb das Markieren einer Probe mit einer Substanz bzw. das Auswählen einer inhärent geeignete Substanzen enthaltenden Probe, die mittels Umschaitstrahlung in einen Zustand versetzt werden kann, in dem sie dann durch Einstrahlung einer Anregungsstrahlung zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt werden kann.
Die Beleuchtungsstrahlung, die im Schritt S2 der Ausführungsform der Figur 1 eingestrahlt wurde, umfasst also in der Ausführungsform der Figur 4 zwei Komponenten, eine Umschaltstrahlung und eine Anregungsstrahlung. Dementsprechend ist der Schritt S2 in zwei Schritte S2a und S2b aufgeteilt. Im Schritt S2a wird die Umschaltstrahlung eingestrahlt. Dies erfolgt so, dass damit der gewünschte Tiefenbereich ausgewählt wird. Im Schritt S2b wird dann die Anregungsstrahlung auf die Probe eingestrahlt. Hierbei muss keine Tiefenselektion mehr erfolgen, da die Probe ja nur in den Bereichen, die vorher durch die Einstrahlung im Schritt S2a umgeschaltet wurden, die Fluoreszenzstrahlung abgeben kann.
Die Zweiteiligkeit der Bereitstellung der Beleuchtungsstrahlung hat einen wesentlichen Vorteil. Man kann ein rasterndes oder scannendes Verfahren für das Einbringen der Umschaltstrahlung einsetzen. Rasternde oder scannende Ansätze sind an und für sich mit dem SOFI-Prinzip unvereinbar, da dort die Probe in ihrer Gänze gleichzeitig abgebildet werden muss, um die unterschiedlichen Blinkzustände in der Bildfolge In zu haben. Eine rasternde Bsidaufnahme, die verschiedene Bereiche des Bildes nacheinander erfasst, scheidet damit aus. Im Verfahren der Figur 4 kann dennoch die Umschaltstrahlung rasternd, d. h. einzelne Probenabschnitte nacheinander abtastend, aufgebracht werden, da die Anregung der Fluoreszenzstrahlung erst später im Schritt S2b erfolgt - dort natürlich im Weitfeld, wie auch die Abbildung (Schritt S3).
Somit wird die Probe abgerastert, wenn im Schritt SV eine entsprechende Substanz verwendet wurde, die über einen Mehrphotoneneffekt umgeschaltet wird.
Alternativ kommt im Schritt S2a beispielsweise das temporal Fokussing in Frage. Das Mikroskop der Figur 2 ist deshalb für eine alternative Ausführungsform des Verfahrens im Unterschied zum bisher beschriebenen Aufbau so strukturiert, dass die Beleuchtungsquelle 9 die Umschaltstrahlung gepulst bereitstellt. Die Pulslänge und damit die Intensität, die für den Mehrphotonenprozess erforderlich ist, ist ausschließlich in der Bildebene 15 vorhanden. Der Schritt S2a wird also durch den Beleuchtungsstrahlengang 8 und den entsprechenden Betrieb der Beleuchtungsquelle 9 realisiert. Für die Ausführung des Schrittes S2b ist zusätzlich ein Strahiteiler 17 vorgesehen, der Licht aus einer Strahlquelle, die dann als Anregungsstrahlung 19 fungiert, in den Strahlengang des Mikroskops 1 einkoppelt, wobei die Probe im Weitfeld beleuchtet wird. Ausschließlich die vorher präparierten Bereiche in der Bildebene 15 geben dann die statistisch blinkende Fluoreszenzstrahlung ab. In der abgewandelten Bauweise ist also die Beleuchtungsstrahlung durch die Kombination aus dem Beleuchtungsstrahlengang 8 und dem Anregungsstrahlengang {realisiert durch die Elemente 17 bis 19) verwirklicht. Ein Scannen der Umschaltstrahiung ist in dieser Ausführungsform nicht zwingend erforderlich, da das temporal Fokussing bereits die Tiefenauswahl realisiert.
Figur 3 zeigt für die Ausführungsform des Verfahrens gemäß Figur 4 ein Mikroskop - hier für eine gescannte Probenpräparation durch Mehrphotonenprozess. In dieser Ausführungsform sind die Elemente 9 bis 1 1 so abgewandelt (nicht dargestellt), dass sie eine Weitfeldbeleuchtung der Probe 2 mit Anregungsstrahlung bewirken. Diese Anregung kann quer zur optischen Achse 6 aber alternativ auch längs der optischen Achse 6 erfolgen. Zusätzlich ist ein Strahlteiler 20 vorgesehen, der mit Strahlung aus einem Scanner 21 gespeist wird, welcher einen Rohstrahl aus einer Umschaltstrahlquelle 22 scannend ablenkt. Somit ist ein Umschaltstrahl 23 vorhanden, der über die Probe 2 gerastert wird. Er bewirkt mittels Mehrphotoneneffekt ein Umschalten der Substanzprobe 2 in einen Zustand, in dem sie die Anregungsstrahlung dann anregen kann. Aufgrund des Mehrphotonenprozesses ist die notwendige Intensität zum Umschalten der Substanz nur in einem eng begrenzten Tiefenbereich der Probe 2 vorhanden. Der Schritt S2a wird somit durch geeignete Ansteuerung des Scanners 21 und der Umschaltstrahlquelle 22 ausgeführt, der Schritt S2b durch geeignete Ansteuerung der Strahlquelle 9.
In allen Ausführungsformen der Mikroskope ist ein (nicht eingezeichnetes) Steuergerät vorgesehen, das die Komponenten des Mikroskops zum Ausführen des Verfahrens der Figur 1 oder Figur 4 geeignet ansteuert.
Die Bildfolge In aus Einzelbildern wird in der SOFI-Verarbeitung S4 in das hochaufgelöste Bild If umgesetzt. Dabei wird beispielsweise das von Dertinger et al. beschriebene Prinzip verwendet. Gleichermaßen kann auch das gegenüber dem Prinzip von Dertinger et al. weitergebildete Konzept gemäß WO 2010/141608 A1 verwendet werden. Auch diese Publikation sei in dieser Hinsicht vollumfänglich hier einbezogen.
Das für das SOFI-Prinzip erforderliche Blinken der Fluorophore wird durch einen Übergang von einem ersten, fluoreszierenden in einen zweiten, nicht-fluoreszierenden Zustand definiert. Unter einem nicht-fluoreszierenden Zustand wird dabei jeder Zustand verstanden, in dem die Fluoreszenzstrahlung, welche für das Bild ausgewertet wird, nicht abgegeben wird. Der ntcht- fluoreszierende Zustand kann somit durchaus ein Zustand sein, in dem ein Fluorophor in einem anderen Fluoreszenzspektralbereich leuchtet.
Die Übergangswahrscheinlichkeiten von dem ersten in den zweiten Zustand können, wie beispielsweise aus der Veröffentlichung Heilemann et aL, Angewandte Chemie 121 , S. 7036, 2009, bekannt ist, modifiziert werden, beispielsweise durch chemische Einflüsse, Temperatureinflüsse oder Beleuchtungseinflüsse.
Das SOFI-Prinzip ist besonders effizient, wenn der Anteil zwischen leuchtenden und nicht leuchtenden Fluorophoren für die jeweilige Bildaufnahmerate bzw. Bildintegrationszeit 1 :1 beträgt. Bei gleichen Lebensdauern dieser beiden Zustände sollte die Übergangswahrscheinlichkeit zwischen dem ersten und dem zweiten Zustand sowie zwischen dem zweiten und dem ersten Zustand idealerweise 0,5 sein. Dies kann durch entsprechende Manipulation der Probe mittels chemischer Einwirkung, Temperatureinwirkung oder Beleuchtungseinwirkung erreicht werden. Dabei kann durch Optimieren der eingestrahlten Spektralverteilung die Übergangswahrscheinlichkeit optimiert werden mit dem Ziel, das genannte Opiimalverhältnis 1 :1 zu erreichen. Das SOFI-Prinzip fordert deshalb Übergangswahrscheinlichkeiten, die sich wesentlich von anderen Mikroskopieverfahren unterscheiden. Das PALM-Prinzip beispielsweise (auch als dSTORM bezeichnet) fordert Zustände, bei denen der weit überwiegende Anteil der Fluorophore in einem Dunkelzustand ist.
Um zu erreichen, dass möglichst die Hälfte der Fluorophore in einem Hellzustand ist, muß neben der Übergangswahrscheinlichkeit auch die Dunkelzeitdauer berücksichtigt werden. Selbst wenn die Übergangswahrscheinlichkeit von hell zu dunkel 0,5 ist, wäre bei einer sehr viel längeren Lebensdauer der dunklen Zustände das Optimalverhäitnis von 1 :1 verfehlt. Die im Stand der Technik eingesetzten Mittel zur Modifikation der Übergangswahrscheinlichkeit und Dunkelzeitdauer werden deshalb besonders bevorzugt (und ganz unabhängig von der Abbildung eines Bildfeldes, das kleiner sein kann als ein Probenfeld) dazu eingesetzt, das Verhältnis von leuchtenden zu nicht leuchtenden Fluorophoren in Richtung auf den Optimalwert 1 :1 zu optimieren, indem Übergangswahrscheinlichkeit und/oder Dunkellebensdauer (oder Heliebensdauer) geeignet eingestellt und an die Bildaufnahmerate oder -integrationszeit angepasst werden. Umgekehrt ist es möglich, die Aufnahmerate an die Lebensdauern anzupassen.

Claims

Patentansprüche
1 . Mikroskopieverfahren zum Erzeugen eines hochaufgelösten Bildes (//) einer Probe (2), wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
a) Versehen der Probe (2) mit einer Substanz, die nach Anregung statistisch blinkend bestimm te Fluoreszenzstrahlung abgibt, oder Verwenden einer Probe (2), die eine solche Substanz enthält,
b) Einstrahlen von Beleuchtungsstrahlung (10) auf die Probe (2) und dadurch Anregen der Probe (2) zur Abgabe der Fluoreszenzstrahlung,
c) wiederholtes Abbilden der die Fiuoreszenzstrahlung abgebenden Probe (2) längs einer optischen Achse (OA) auf einen ortsauflösenden Detektor (5), so dass eine Biidfolge (In) erhalten wird,
d) Bearbeiten der Bildfolge (In) mittels einer Kumulantenfunktion, welche durch das Blinken verursachte Intensitätsfiuktuationen in der Bildfolge (In) auswertet, und dadurch Erzeugen eines
Bildes (If) einer lokalen Verteilung der Substanz in der Probe (2), das eine über die optische Auflösung der Abbildung hinaus gesteigerte Ortsauflösung aufweist,
dadurch gekennzeichnet, dass
e} das Einstrahlen der Beleuchtungsstrahlung (10) so erfolgt, dass die Beleuchtungsstrahlung (10) die Probe (2) längs der optischen Achse (OA) nur in einem begrenzten Tiefenbereich zur Abgabe der Fluoreszenzstrahlung anregt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Einstrahlen der Beleuchtungsstrahlung (10) m ittels temporal Fokussing (1 2-14) auf den begrenzten Tiefenbereich beschränkt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass für die Beleuchtungsstrahlung ein gepulster Rohstrahl, der eine Pulslänge hat, bereitgestellt u nd auf ein Streuelement (12) gerichtet wird, das in einer Ebene liegt, die m ittels einer Optik ( 1 3, 14, 3) in eine Bildebene (15) abgebildet wird, die in der Probe (2) liegt, wodurch innerhalb der Probe (2) nur in dieser Bildebene (15) die Beleuchtungsstrahlung eine minimale Pulslänge hat und zwischen der Bildebene (15) und dem Streuelement (12) eine Pulslänge hat, die größer als die minimale Pulslänge und als die Pulslänge des Rohsirahls ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsstrahlung (10) nur ein einem quer zur optischen Achse (6) liegenden Lichtblatt (16) eingestrahlt wird und so auf den begrenzten Tiefenbereich beschränkt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz durch Einstrahlung optischer Umschaltstrahlung zwischen einem ersten und einem zweiten Zustand umschaltbar ist, wobei die Substanz im ersten Zustand nicht zur Abgabe der Fluoreszenzstrahlung anregbar ist und im zweiten Zustand zur Abgabe der Fluoreszenzstrahlung anregbar ist, und dass in Schritt b) das Einstrahlen der Beleuchtungsstrahlung ein Einstrahlen der optischen Umschaltstrahlung (10) umfasst, wobei die optische Umschaltstrahlung (10) einen Blinkparameier der bestimmten Fluoreszenzstrahlung einstellt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Umschaltstrahlung (10) ein Umschalten der Substanz durch einen Zwei-Photonen-Effekt bewirkt und die Probe (2) mit der optischen Umschaltstrahlung (10) abgerastert wird, wobei eine Fokalebene in der Probe (2) abgerastert wird, die den Tiefenbereich definiert.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass Einstrahlen der optischen Umschaltstrahlung (10) mittels temporal Fokussing auf den begrenzten Tiefenbereich beschränkt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass für die optische Umschaltstrahlung (10) ein gepulster Rohstrahl, der eine Pulslänge hat, bereitgesteilt und auf ein Streuelement (12) gerichtet wird, das in einer Streuebene (15) liegt, die mittels einer Optik (13, 14, 3) in eine Bildebene (15) abgebildet wird, die in der Probe (2) liegt, wodurch innerhalb der Probe (2) nur in dieser Bildebene (15) die optische Umschaltstrahlung (10) wieder die Pulslänge des Rohstrahls hat.
9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Umschaltstrahlung (10) nur ein einem quer zur optischen Achse (6) liegenden Lichtblatt (16) eingestrahlt wird und so auf den begrenzten Tiefenbereich beschränkt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Blinkparameter umfasst: eine Dunkelzeitdauer und/oder eine Übergangswahrscheinlichkeit zwischen Dunkel- und HeKzustand des Blinkens und/oder ein Hell/Dunkel-Zeitverhältnis des Blinkens.
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