CN104515760A - 双色荧光定位超分辨率生物显微方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种双色荧光定位超分辨率生物显微方法和系统，所述方法包括有：使用Alexa647和Alexa750荧光分子，或Cy5和Cy7荧光分子对生物样品进行双色荧光标记，并将生物样品浸泡在成像缓冲液中；通过激光照射生物样品，分别产生与Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，以及与Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号；根据第一、第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一、第二生物结构超分辨率图像；将第一、第二生物结构超分辨率图像进行对准处理以构建出第三生物结构超分辨率图像。借此，本发明超分辨率生物显微成像技术不会产生通道串扰，并且可大幅降低背景噪音，从而提高了成像质量。
Description
技术领域
本发明涉及通信技术领域，尤其涉及一种双色荧光定位超分辨率生物显微方法及系统。
背景技术
自恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)于十八世纪七十年代提出光学成像分辨率极限的理论以来，人们一直在寻找各种各样的方法方式以求突破这一分辨率极限。目前，通过运用现代尖端技术，庄小威，埃里克·贝齐格(Eric Betzig)分别于2006年先后分别提出了随机光学重构显微技术(Stochastic Optical ReconstructionMicroscopy，SORM)和荧光定位显微技术(Photoactivation Laser Microscopy，PLM)，均实现了突破光学分辨率极限十倍的超分辨率成像。埃里克·贝齐格更是通过这一技术获得了2014年诺贝尔化学奖。目前荧光定位显微技术已经实现部分商业化，并且开始被用于基础生命科学，尤其是分子生物学以及生物化学的研究当中。通过这一技术，研究人员可以以10到20纳米的横向分辨率和50纳米的纵向分辨率研究生物样品的细节结构。与其他已有的超分辨率技术，如电子显微技术相比，荧光定位显微技术大大简化了样品的制备环节，并且可以实现活体细胞成像。更重要的是，荧光定位显微技术可以轻松的实现多通道共定位成像，从而得到蛋白质之间的相互作用关系，为大量分子生物研究课题提供最直接的证据。然而，现有技术在多色超分辨率成像方面的表现仍有不足之处。尼康(Nikon)N-STORM作为商业化荧光定位显微镜的代表，其多通道成像使用由两种不同激发波长荧光分子结合而成的“荧光开关”(例如，Alexa647-Alexa488分子对以及Alexa467-Alexa405分子对)作为标记物。这种方法可以实现不同成像通道的快速切换，但是这类荧光开关的标记物目前并无商业化，且实验室制备较为复杂。更重要的是，这种多色成像的方法会产生较严重的通道串扰(Channel Crosstalk)，产生错误的共定位信息。徕卡(Leica)SR GSD定位显微镜使用不同激发波长的普通荧光分子作为标记物(例如，Alexa647和Alexa532)，并使用滤镜系统来实现多通道成像。这一方法的局限性在于，短激发波长荧光分子极易被光漂白(Photo-bleach)，并且较短的激发波长会导致细胞的自发荧光背景，影响成像质量。
另外，样品漂移是一种普遍存在于超分辨率荧光定位显微镜的问题。这是指由于环境的不稳定，如气流、温度变化、噪音等等，会使样品在拍摄过程中发生几十至几百纳米的移动。尽管这一漂移现象普遍存在于显微系统中，由于一般显微镜的分辨率不足300纳米，漂移造成的现象并不明显。但是对于分辨率可达十几纳米的超分辨率显微镜而言，漂移会对成像造成严重的干扰。目前已有的解决方法大多为向样品中加入荧光颗粒，并在成像中记录这些颗粒的位移，随后从所得超分辨率图像中将这一位移减去。其缺陷是制备麻烦；而且荧光颗粒会占用一个成像通道；另外，由于光漂白，荧光颗粒的荧光会随成像时间衰减，因此漂移的修正精度也会随时间变差。
综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。
发明内容
针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种双色荧光定位超分辨率生物显微方法及系统，其不会产生通道串扰，并且可大幅降低背景噪音，从而提高了成像质量。
为了实现上述目的，本发明提供一种双色荧光定位超分辨率生物显微方法，包括有：
使用Alexa647和Alexa750荧光分子，或Cy5和Cy7荧光分子对生物样品进行双色荧光标记，并将所述生物样品浸泡在成像缓冲液中；
通过激光照射所述生物样品，分别产生与所述Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，以及与所述Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号；
根据所述第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像；
将所述第一生物结构超分辨率图像和所述第二生物结构超分辨率图像进行对准处理以构建出第三生物结构超分辨率图像。
根据本发明所述的方法，所述通过激光照射所述生物样品的步骤包括：
通过预定的激活激光照射所述生物样品以开启荧光信号，并通过预定的激发激光照射所述生物样品以关闭荧光信号，以产生闪烁荧光信号。
根据本发明所述的方法，所述激活激光具有紫色或紫外波长；所述激发激光具有Alexa647和Alexa750荧光分子激发波长，或者所述激发激光具有Cy5和Cy7荧光分子激发波长；使用预定的激发激光功率和激活激光功率，使同一时刻大部分的荧光分子关闭荧光信号，仅有小部分离散的荧光分子开启荧光信号。
根据本发明所述的方法，所述成像缓冲液包含有TCEP、环辛四烯、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸；或者
所述成像缓冲液包含有巯基物、环辛四烯、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸。
根据本发明所述的方法，所述TCEP或巯基物与荧光分子在所述激发激光的照射下结合形成加合物，所述加合物不会在所述激发激光的照射下发出荧光；所述加合物在所述激活激光的照射下重新分解为所述TCEP或巯基物和荧光分子，所述荧光分子发出荧光。
根据本发明所述的方法，所述环辛四烯包括环辛四烯的衍生物；所述除氧剂包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合，或者，所述除氧剂包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合。
根据本发明所述的方法，所述根据第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像的步骤之前还包括：
在数据采集之前，通过实时锁定系统将所述生物样品的位置实时锁定。
根据本发明所述的方法，所述实时锁定系统将所述生物样品的位置实时锁定的步骤包括：
为所述生物样品提供明场照明，所述生物样品的明场图像经过前成像透镜成像于锁定相机；
从所述锁定相机中抓取一张生物样品或参照体的明场图像作为锁定模板；
从所述锁定相机中实时抓取所述生物样品的当前明场图像，将所述当前明场图像与所述锁定模板进行对比；
计算所述当前明场图像与所述锁定模板之间的偏移量；
根据所述偏移量对所述当前明场图像进行偏移补偿处理。
根据本发明所述的方法，所述根据第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像的步骤还包括：
通过双色荧光定位超分辨率显微镜获取所述第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号；
通过所述双色荧光定位超分辨率显微镜的分光系统将所述第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号分离，并分别成像于相机的感光元件的不同区域；
获取所述相机采集的每一张图像，通过高斯拟合确定所述图像中每个荧光分子的爱里斑中心坐标并记录；
根据记录的所述爱里斑中心坐标分别构建所述第一通道闪烁荧光信号对应的所述第一生物结构超分辨率图像和所述第二通道闪烁荧光信号对应的所述第二生物结构超分辨率图像。
根据本发明所述的方法，所述双色荧光定位超分辨率显微镜为倒置的全反射荧光显微镜；
所述相机为EMCCD相机；和/或
所述分光系统包括矩形光阑、双色反射镜和两个滤镜。
本发明还提供一种双色荧光定位超分辨率生物显微系统，包括有：
样品标记模块，用于使用Alexa647和Alexa750荧光分子，或Cy5和Cy7荧光分子对生物样品进行双色荧光标记，并将所述生物样品浸泡在成像缓冲液中；
信号产生模块，用于通过激光照射所述生物样品，分别产生与所述Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，以及与所述Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号；
第一图像构建模块，用于根据所述第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像；
第二图像构建模块，用于将所述第一生物结构超分辨率图像和所述第二生物结构超分辨率图像进行对准处理以构建出第三生物结构超分辨率图像。
根据本发明所述的系统，所述信号产生模块用于通过预定的激活激光照射所述生物样品以开启荧光信号，并通过预定的激发激光照射所述生物样品以关闭荧光信号，以产生闪烁荧光信号。
根据本发明所述的系统，所述激活激光具有紫色或紫外波长；所述激发激光具有Alexa647和Alexa750荧光分子激发波长，或者所述激发激光具有Cy5和Cy7荧光分子激发波长；
所述信号产生模块用于使用预定的激发激光功率和激活激光功率，使同一时刻大部分的荧光分子关闭荧光信号，仅有小部分离散的荧光分子开启荧光信号。
根据本发明所述的系统，所述成像缓冲液包含有TCEP、环辛四烯、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸；或者
所述成像缓冲液包含有巯基物、环辛四烯、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸。
根据本发明所述的系统，所述TCEP或巯基物与荧光分子在所述激发激光的照射下结合形成加合物，所述加合物不会在所述激发激光的照射下发出荧光；所述加合物在所述激活激光的照射下重新分解为所述TCEP或巯基物和荧光分子，所述荧光分子发出荧光。
根据本发明所述的系统，所述环辛四烯包括环辛四烯的衍生物；所述除氧剂包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合，或者，所述除氧剂包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合。
根据本发明所述的系统，还包括：
实时锁定模块，用于在数据采集之前，通过实时锁定系统将所述生物样品的位置实时锁定。
根据本发明所述的系统，所述实时锁定模块包括：
明场照明子模块，用于为所述生物样品提供明场照明，所述生物样品的明场图像经过前成像透镜成像于锁定相机；
模块生成子模块，用于从所述锁定相机中抓取一张生物样品或参照体的明场图像作为锁定模板；
图像对比子模块，用于从所述锁定相机中实时抓取所述生物样品的当前明场图像，将所述当前明场图像与所述锁定模板进行对比；
偏移计算子模块，用于计算所述当前明场图像与所述锁定模板之间的偏移量；
偏移补偿子模块，用于根据所述偏移量对所述当前明场图像进行偏移补偿处理。
根据本发明所述的系统，所述第一图像构建模块还包括：
信号获取子模块，用于通过双色荧光定位超分辨率显微镜获取第一通道闪烁荧光信号和第二通道闪烁荧光信号；
信号分离子模块，用于通过双色荧光定位超分辨率显微镜的分光系统将第一通道闪烁荧光信号和第二通道闪烁荧光信号分离，并分别成像于相机的感光元件的不同区域；
位置记录子模块，用于获取相机采集的每一张图像，通过高斯拟合确定图像中每个荧光分子的爱里斑中心坐标并记录；
图像生成子模块，用于根据记录的爱里斑中心坐标分别构建第一通道闪烁荧光信号对应的第一生物结构超分辨率图像和第二通道闪烁荧光信号对应的第二生物结构超分辨率图像。
根据本发明所述的系统，所述双色荧光定位超分辨率显微镜为倒置的全反射荧光显微镜；
所述相机为EMCCD相机；和/或
所述分光系统包括矩形光阑、双色反射镜和两个滤镜。
本发明双色荧光定位超分辨率生物显微技术采用Alexa647和Alexa750荧光分子，或Cy5和Cy7荧光分子对生物样品进行双色荧光标记，所采用的荧光分子的发射光谱完全分离，因此理论上不会有通道串扰产生，并且荧光分子的激发波长不会使细胞产生自发荧光，从而大幅降低了背景噪音，从而提高了成像质量，且易于操作。优选的是，本发明采用优化的成像缓冲液使荧光分子在成像过程中的光漂白大大减少。更好的是，本发明通过实时锁定功能对样品进行锁定，以彻底消除以消除成像过程中的任何样品漂移。本发明可以广泛应用于生物光学超分辨率显微领域。
附图说明
图1是本发明双色荧光定位超分辨率生物显微系统的结构示意图；
图2是本发明TCEP的分子结构图；
图3是本发明实施例中荧光分子与成像缓冲液中TCEP成分作用原理图
图4是本发明实施例中荧光分子与成像缓冲液中Thiol成分作用原理图；
图5是本发明优选双色荧光定位超分辨率生物显微系统的结构示意图；
图6是本发明双色荧光定位超分辨率生物显微方法的流程图；
图7是本发明优选双色荧光定位超分辨率生物显微方法的流程图；
图8是本发明一实施例中双色荧光定位超分辨率生物显微系统的结构示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1是本发明双色荧光定位超分辨率生物显微系统的结构示意图，所述系统100包括有样品标记模块10、信号产生模块20、第一图像构建模块30以及第二图像构建模块40，其中：
样品标记模块10，用于使用Alexa647和Alexa750荧光分子，或Cy5和Cy7荧光分子对生物样品进行双色荧光标记，并将标记后的生物样品浸泡在成像缓冲液中。在一个实施例中，将Alexa647和Alexa750荧光分子通过免疫标记法分别结合在生物样品的不同结构蛋白上，将生物样品制作成封片，并且生物样品需浸泡在成像缓冲液中，再将侵泡有生物样品的成像缓冲液放在双色荧光定位超分辨率显微镜的载物台上。本发明的荧光分子优选采用Alexa647和Alexa750荧光分子，但Alexa647和Alexa750荧光分子亦可由相同激发波长的花青素染料分子如Cy5和Cy7来替代。
信号产生模块20，用于通过激光照射生物样品，分别产生与Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，以及与Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号。本发明如果使用Alexa647和Alexa750荧光分子，则产生与Alexa647荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号和与Alexa750荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号。本发明如果使用Cy5和Cy7荧光分子，则产生与Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号和与Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号。
第一图像构建模块30，用于根据第一通道闪烁荧光信号和第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像。
第二图像构建模块40，用于将第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像进行对准处理以构建出第三生物结构超分辨率图像。
优选的是，所述成像缓冲液的具体成分包含有TCEP(三(2-羧乙基)膦)、COT(环辛四烯)、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸；或者成像缓冲液的具体成分包含有巯基物(Thiol)、COT、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸。
所述成像缓冲液中的TCEP或Thiol成本与荧光分子在激发激光的照射下结合形成加合物，该加合物不会在激发激光的照射下发出荧光，荧光分子因此被关闭；且该加合物在激活激光的照射下重新分解为TCEP或Thiol和荧光分子，荧光分子发出荧光，荧光分子因此被开启。
图2示出了TCEP的分子结构，Alexa647荧光分子与成像缓冲液中TCEP成分作用后生成如图3所示的加合物，图3中的Alexa647荧光分子仅作为实施例具体说明，此原理适用于包括Alexa750，Cy5和Cy7等花青素荧光分子。
Alexa647荧光分子与成像缓冲液中Thiol成分作用后生成如图4所示的加合物，图4中的Alexa647荧光分子仅作为实施例具体说明，此原理适用于包括Alexa750，Cy5和Cy7等花青素荧光分子。
所述Thiol包括βME(2-巯基乙醇)，或MEA(乙醇胺)等，但是Thiol可能会减少Alexa750分子的光子数，且增加荧光分子被光漂白的概率，影响图像质量。
成像缓冲液中的COT包括COT的衍生物。本发明COT溶解于DMSO(Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜)。成像缓冲液中的COT可抑制荧光分子在缺少氧分子的环境中进入三重态，从而提高荧光分子在打开状态时产生的光子数，提高分辨率，同时减少荧光分子被光漂白的概率，提高成像质量。
所述除氧剂包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合；或者，除氧剂包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合。成像缓冲液中的葡萄糖氧化酶(或吡喃糖氧化酶)，葡萄糖和过氧化氢酶组合作为除氧剂可去除缓冲液中的氧气，大幅减少荧光分子被光漂白的概率，提高成像质量。本发明并不局限于使用葡萄糖氧化酶(或吡喃糖氧化酶)，葡萄糖和过氧化氢酶组合作为除氧剂。其他可行的除氧方案亦可应用于本发明。
成像缓冲液中的甲基紫精和抗坏血酸作为还原剂可抑止荧光分子的光漂白。
本发明使用经过优化的成像缓冲液配方使荧光分子在每次发光周期都会产生超过2000个光子，并且成像缓冲液中的除氧剂和COT成分大幅减少分子的光漂白，从而产生高质量的双色超分辨率图像。Alexa647通道的横向分辨率在理想条件下可达10纳米，Alexa750通道可达20纳米。
实施例1中成像缓冲液的具体配方为：200mM Tris磷酸缓冲液，pH9.0；并含有10％(w/v)葡萄糖,5U/ml吡喃糖氧化酶,57μg/ml过氧化氢酶,2mMCOT(溶于DMSO),25mM TCEP，1mM抗坏血酸和1mM甲基紫精。
实施例2中成像缓冲液的具体配方为：200mM Tris磷酸缓冲液，pH8.0；并含有10％(w/v)葡萄糖,560μg/ml葡萄糖氧化酶,57μg/ml过氧化氢酶,2mMCOT(溶于DMSO),25mM TCEP,1mM抗坏血酸和1mM甲基紫精。
优选的是，信号产生模块20用于通过预定的激活激光照射生物样品以开启荧光信号，并通过预定的激发激光照射生物样品以关闭荧光信号，以产生闪烁荧光信号。所述激活激光具有紫色或紫外波长。所述激发激光具有Alexa647和Alexa750荧光分子激发波长，或者激发激光具有Cy5和Cy7荧光分子激发波长。信号产生模块20用于使用预定的激发激光功率和激活激光功率，使同一时刻大部分的荧光分子关闭荧光信号，仅有小部分离散的荧光分子开启荧光信号。
在一个实施例中，将封装的生物样品放置在倒置显微镜的载物台上，并使用300mW输出功率的656.5纳米激光，和300mW输出功率的750纳米激光，以全内反射的模式对样品同时进行照射。
本发明由于使用的Alexa647和Alexa750荧光分子，或者Cy5和Cy7荧光分子的发射光谱完全分离，因此理论上不会有通道串扰产生。而且，本发明所用荧光分子的激发波长不会使细胞产生自发荧光，从而大幅降低了背景噪音。
图5是本发明优选双色荧光定位超分辨率生物显微系统的结构示意图，所述系统100包括有样品标记模块10、信号产生模块20、第一图像构建模块30、第二图像构建模块40以及实时锁定模块50，其中：
样品标记模块10，用于使用Alexa647和Alexa750荧光分子，或Cy5和Cy7荧光分子对生物样品进行双色荧光标记，并将标记后的生物样品浸泡在成像缓冲液中。
信号产生模块20，用于通过激光照射生物样品，分别产生与Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，以及与Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号。
通过预定的激活激光照射生物样品以开启荧光信号，并通过预定的激发激光照射生物样品以关闭荧光信号，以产生闪烁荧光信号。同时使用Alexa647和Alexa750的激发激光照射生物样品以产生荧光信号。在成像缓冲液的作用下，荧光分子在强激发激光的照射下被随机的开启(发出荧光)或关闭(不发出荧光)，产生闪烁。本发明荧光分子的开启速度可由一束毫瓦量级的激活激光控制，开启速度和激活激光功率成正比。荧光分子的关闭速度可由其激发激光强度来控制，关闭速度和激发激光强度成正比。所述激发激光为具有Alexa647分子激发波长的激光器生成，和具有Alexa750分子激发波长的激光器生成；所述激活激光为具有紫色或紫外波长的激光器生成。本发明使用适当的激发激光功率和激活激光功率，使同一时刻大部分的荧光分子处于关闭状态，仅有小部分离散的分子处于开启状态。这些开启的荧光分子所成像之间没有重合。
实时锁定模块50，用于在数据采集之前，通过实时锁定系统将生物样品的位置实时锁定，以彻底去除成像时的样品漂移。优选的是，实时锁定模块50包括：
明场照明子模块51，用于为生物样品提供明场照明，生物样品的明场图像经过前成像透镜成像于锁定相机。
模块生成子模块52，用于从锁定相机中抓取一张生物样品或参照体的明场图像作为锁定模板。
图像对比子模块53，用于从锁定相机中实时抓取生物样品的当前明场图像，将当前明场图像与锁定模板进行对比。
偏移计算子模块54，用于计算当前明场图像与锁定模板之间的偏移量。具体可使用相关度运算，或归一化互相关运算获取生物样品的偏移量。
偏移补偿子模块55，用于根据偏移量对当前明场图像进行偏移补偿处理，此过程循环至拍摄结束。
本发明所使用的实时样品锁定方法无需添加任何荧光标记物便可以纳米精度锁定生物样品位置，去除拍摄过程中的样品漂移，进一步提高系统的成像分辨率。由于使用生物样品本身的明场图像作为锁定参照，因此不同于荧光微粒，不会在长时间的数据采集过程发生光漂白，从而降低锁定精度。本发明所使用的实时样品锁定方法可将细胞长时间锁定。当所拍摄的生物样品过小或过薄无法产生较高信噪比的明场图像时，可向载玻片附着少许1.2微米直径的聚苯乙烯微球等参照体以产生明场图像代替生物样品作为锁定目标。
第一图像构建模块30，用于根据第一通道闪烁荧光信号和第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像。
第二图像构建模块40，用于将第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像进行对准处理以构建出第三生物结构超分辨率图像。
优选的是，第一图像构建模块30还包括：
信号获取子模块31，用于通过双色荧光定位超分辨率显微镜获取第一通道闪烁荧光信号和第二通道闪烁荧光信号。优选的，双色荧光定位超分辨率显微镜为倒置的全反射荧光显微镜(Total internal Reflection Fluorescence Microscope，TIRFM)。即通过倒置的全反射荧光显微镜接收闪烁荧光信号。
信号分离子模块32，用于通过双色荧光定位超分辨率显微镜的分光系统将第一通道闪烁荧光信号和第二通道闪烁荧光信号分离，并分别成像于相机的感光元件的不同区域。优选的，所述相机为EMCCD(Electron-MultiplyingCharge-coupled Devic，电子倍增电荷耦合元件)相机，所述分光系统包括矩形光阑、双色反射镜和两个滤镜。来自染料分子的荧光信号被显微镜接收后通过分光系统分离，并分别通过透镜成像于EMCCD相机的感光元件上的不同区域。使用适当的激发激光功率和激活激光功率，使同一时刻大部分的荧光分子处于关闭状态，仅有小部分离散的分子处于开启状态。这些开启的荧光分子所成像之间没有重合。
位置记录子模块33，用于获取相机采集的每一张图像，通过高斯拟合确定图像中每个荧光分子的爱里斑中心坐标并记录。由于光学分辨率极限，每个荧光分子所成的像都为一个爱里斑(Airy Disk)。定位软件获取EMCCD相机上的图像，通过高斯拟合确定每个爱里斑的中心坐标，这一坐标更精确的代表了荧光分子的实际位置，并被程序记录下来。EMCCD相机高速记录闪烁的荧光信号直至几乎所有荧光分子都被定位且记录。
图像生成子模块34，用于根据记录的爱里斑中心坐标分别构建第一通道闪烁荧光信号对应的第一生物结构超分辨率图像和第二通道闪烁荧光信号对应的第二生物结构超分辨率图像。程序通过高斯拟合出的爱里斑中心坐标分别重构出每个通道的超分辨率生物结构图样。
本发明提供了一种基于Alexa647和Alexa750荧光分子标记的超分辨率双色荧光定位显微系统。同时此显微系统具有实施细胞锁定功能以消除样品漂移。本显微系统结构简单易于操作。应用优化的成像缓冲液使荧光分子在成像过程中的光漂白大大减少，并且消除了通道串扰。利用细胞的明场图像对样品直接进行锁定以消除成像过程中的任何样品漂移。本发明可以广泛应用于生物光学超分辨率显微领域。
图6是本发明双色荧光定位超分辨率生物显微方法的流程图，其可通过如图1或图4所示的系统100是实现，包括有：
步骤S601，使用Alexa647和Alexa750荧光分子，或Cy5和Cy7荧光分子对生物样品进行双色荧光标记，并将生物样品浸泡在成像缓冲液中。
在一个实施例中，将Alexa647和Alexa750荧光分子通过免疫标记法分别结合在生物样品的不同结构蛋白上，将生物样品制作成封片，并且生物样品需浸泡在成像缓冲液中，再将侵泡有生物样品的成像缓冲液放在双色荧光定位超分辨率显微镜的载物台上。本发明的荧光分子优选采用Alexa647和Alexa750荧光分子，但Alexa647和Alexa750荧光分子亦可由相同激发波长的花青素染料分子如Cy5和Cy7来替代。
步骤S602，通过激光照射生物样品，分别产生与Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，以及与Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号。
本发明如果使用Alexa647和Alexa750荧光分子，则产生与Alexa647荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号和与Alexa750荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号。本发明如果使用Cy5和Cy7荧光分子，则产生与Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号和与Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号。
优选的是，通过预定的激活激光照射生物样品以开启荧光信号，并通过预定的激发激光照射生物样品以关闭荧光信号，以产生闪烁荧光信号。所述激活激光具有紫色或紫外波长。所述激发激光具有Alexa647和Alexa750荧光分子激发波长，或者激发激光具有Cy5和Cy7荧光分子激发波长。信号产生模块20用于使用预定的激发激光功率和激活激光功率，使同一时刻大部分的荧光分子关闭荧光信号，仅有小部分离散的荧光分子开启荧光信号。
步骤S603，根据第一通道闪烁荧光信号和第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像。
步骤S604，将第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像进行对准处理以构建出第三生物结构超分辨率图像。
优选的是，所述成像缓冲液的具体成分包含有TCEP(三(2-羧乙基)膦)、COT(环辛四烯)、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸；或者成像缓冲液的具体成分包含有巯基物(Thiol)、COT、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸。
所述成像缓冲液中的TCEP或Thiol成本与荧光分子在激发激光的照射下结合形成加合物，该加合物不会在激发激光的照射下发出荧光，荧光分子因此被关闭；且该加合物在激活激光的照射下重新分解为TCEP或Thiol和荧光分子，荧光分子发出荧光，荧光分子因此被开启。
图2示出了TCEP的分子结构，Alexa647荧光分子与成像缓冲液中TCEP成分作用后生成如图3所示的加合物，图3中的Alexa647荧光分子仅作为实施例具体说明，此原理适用于包括Alexa750，Cy5和Cy7等花青素荧光分子。
Alexa647荧光分子与成像缓冲液中Thiol成分作用后生成如图4所示的加合物，图4中的Alexa647荧光分子仅作为实施例具体说明，此原理适用于包括Alexa750，Cy5和Cy7等花青素荧光分子。
所述Thiol包括βME(2-巯基乙醇)，或MEA(乙醇胺)等，但是Thiol可能会减少Alexa750分子的光子数，且增加荧光分子被光漂白的概率，影响图像质量。
成像缓冲液中的COT包括COT的衍生物。本发明COT溶解于DMSO(Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜)。成像缓冲液中的COT可抑制荧光分子在缺少氧分子的环境中进入三重态，从而提高荧光分子在打开状态时产生的光子数，提高分辨率，同时减少荧光分子被光漂白的概率，提高成像质量。
所述除氧剂包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合；或者，除氧剂包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合。成像缓冲液中的葡萄糖氧化酶(或吡喃糖氧化酶)，葡萄糖和过氧化氢酶组合作为除氧剂可去除缓冲液中的氧气，大幅减少荧光分子被光漂白的概率，提高成像质量。本发明并不局限于使用葡萄糖氧化酶(或吡喃糖氧化酶)，葡萄糖和过氧化氢酶组合作为除氧剂。其他可行的除氧方案亦可应用于本发明。
成像缓冲液中的甲基紫精和抗坏血酸作为还原剂可抑止荧光分子的光漂白。
在一个实施例中，将封装的生物样品放置在倒置显微镜的载物台上，并使用300mW输出功率的656.5纳米激光，和300mW输出功率的750纳米激光，以全内反射的模式对样品同时进行照射。
图7是本发明优选双色荧光定位超分辨率生物显微方法的流程图，其可通过如图4所示的系统100是实现，包括有：
步骤S701，使用Alexa647和Alexa750荧光分子，或Cy5和Cy7荧光分子对生物样品进行双色荧光标记，并将生物样品浸泡在成像缓冲液中。
优选的是，本发明涉及的双色荧光超分辨率显微方法使用Alexa647和Alexa750荧光分子通过免疫反应标记生物样品的特定结构，并且将生物样品浸泡在含有TCEP的成像缓冲液。
步骤S702，通过激光照射生物样品，分别产生与Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，以及与Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号。
通过预定的激活激光照射生物样品以开启荧光信号，并通过预定的激发激光照射生物样品以关闭荧光信号，以产生闪烁荧光信号。本发明荧光分子的开启速度可由一束毫瓦量级的激活激光控制，开启速度和激活激光功率成正比。荧光分子的关闭速度可由其激发激光强度来控制，关闭速度和激发激光强度成正比。所述激发激光为具有Alexa647分子激发波长的激光器生成，和具有Alexa750分子激发波长的激光器生成；所述激活激光为具有紫色或紫外波长的激光器生成。本发明使用适当的激发激光功率和激活激光功率，使同一时刻大部分的荧光分子处于关闭状态，仅有小部分离散的分子处于开启状态。这些开启的荧光分子所成像之间没有重合。
步骤S703，在数据采集之前，通过实时锁定系统将生物样品的位置实时锁定。本步骤进一步包括：
为生物样品提供明场照明，生物样品的明场图像经过前成像透镜成像于锁定相机。
从锁定相机中抓取一张生物样品或参照体的明场图像作为锁定模板。
从锁定相机中实时抓取生物样品的当前明场图像，将当前明场图像与锁定模板进行对比。
计算当前明场图像与锁定模板之间的偏移量。
根据偏移量对当前明场图像进行偏移补偿处理，此过程循环至拍摄结束。
步骤S704，通过双色荧光定位超分辨率显微镜获取第一通道闪烁荧光信号和第二通道闪烁荧光信号。
优选的是，双色荧光定位超分辨率显微镜为倒置的全反射荧光显微镜。
步骤S705，通过双色荧光定位超分辨率显微镜的分光系统将第一通道闪烁荧光信号和第二通道闪烁荧光信号分离，并分别成像于相机的感光元件的不同区域。
优选的，所述相机为EMCCD(Electron-Multiplying Charge-coupled Devic，电子倍增电荷耦合元件)相机，所述分光系统包括矩形光阑、双色反射镜和两个滤镜。来自染料分子的荧光信号被显微镜接收后通过分光系统分离，并分别通过透镜成像于EMCCD相机的感光元件上的不同区域。使用适当的激发激光功率和激活激光功率，使同一时刻大部分的荧光分子处于关闭状态，仅有小部分离散的分子处于开启状态。这些开启的荧光分子所成像之间没有重合。
步骤S706，获取相机采集的每一张图像，通过高斯拟合确定图像中每个荧光分子的爱里斑中心坐标并记录。
由于光学分辨率极限，每个荧光分子所成的像都为一个爱里斑(Airy Disk)。定位软件获取EMCCD相机上的图像，通过高斯拟合确定每个爱里斑的中心坐标，这一坐标更精确的代表了荧光分子的实际位置，并被程序记录下来。EMCCD相机高速记录闪烁的荧光信号直至几乎所有荧光分子都被定位且记录。
步骤S707，根据记录的爱里斑中心坐标分别构建第一通道闪烁荧光信号对应的第一生物结构超分辨率图像和第二通道闪烁荧光信号对应的第二生物结构超分辨率图像。
程序通过高斯拟合出的爱里斑中心坐标分别重构出每个通道的超分辨率生物结构图样。
步骤S708，将第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像进行对准处理以构建出第三生物结构超分辨率图像。
图8是本发明一具体实施例中双色荧光定位超分辨率生物显微系统的结构示意图，包括实时细胞锁定系统的光学结构图。
首先，本发明使用了实时细胞锁定系统以彻底去除成像时的样品漂移。其原理为：1)利用图8中的发光二极管和滤镜1产生蓝光为样品提供明场照明。2)样品的明场图像经过前成像透镜成像于锁定相机。4)当计算机的锁定程序启动，程序会先从锁定相机中抓取一张样品的模板图像作为锁定模板。5)锁定程序随后从锁定相机中实时抓取样品的明场图像，并通过相关算法与锁定模板进行对比。6)相关算法会得到目前图像相对于锁定模板的偏移量。7)锁定程序随后通过驱动电路驱动压电陶瓷平台以补偿偏移。8)此过程循环至拍摄结束。
本发明采用的探测光路如图8所示。通过100倍物镜接收样品上荧光标记物发出的闪烁荧光信号。荧光信号包括：通道1：Alexa647分子发出的荧光；和通道2：Alexa758分子发出的荧光。使用由包含矩形光阑，双色反射镜2和滤镜3、滤镜4组成的分光系统将两个通道的信号分离，并分别成像于EMCCD相机感光元件的不同区域。EMCCD相机以录像模式同时记录来自两个通道的闪烁荧光点信号。定位软件获取EMCCD采集的每一副图像，并通过高斯拟合确定每幅图像中，每个通道上的每个爱里斑的中心坐标并记录。随后，程序将所记录的中心坐标以点的形式绘出，以此分别重构出Alexa647和Alexa750通道的超分辨率生物结构图样。最后通过算法将两个通道的图像精确对准，得到所标记样品的双色荧光超分辨率显微图。
综上所述，本发明双色荧光定位超分辨率生物显微技术采用Alexa647和Alexa750荧光分子，或Cy5和Cy7荧光分子对生物样品进行双色荧光标记，所采用的荧光分子的发射光谱完全分离，因此理论上不会有通道串扰产生，并且荧光分子的激发波长不会使细胞产生自发荧光，从而大幅降低了背景噪音，从而提高了成像质量，且易于操作。优选的是，本发明采用优化的成像缓冲液使荧光分子在成像过程中的光漂白大大减少。更好的是，本发明通过实时锁定功能对样品进行锁定，以彻底消除以消除成像过程中的任何样品漂移。本发明可以广泛应用于生物光学超分辨率显微领域。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (20)
1.一种双色荧光定位超分辨率生物显微方法，其特征在于，包括有：
使用Alexa647和Alexa750荧光分子，或Cy5和Cy7荧光分子对生物样品进行双色荧光标记，并将所述生物样品浸泡在成像缓冲液中；
通过激光照射所述生物样品，分别产生与所述Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，以及与所述Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号；
根据所述第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像；
将所述第一生物结构超分辨率图像和所述第二生物结构超分辨率图像进行对准处理以构建出第三生物结构超分辨率图像。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通过激光照射所述生物样品的步骤包括：
通过预定的激活激光照射所述生物样品以开启荧光信号，并通过预定的激发激光照射所述生物样品以关闭荧光信号，以产生闪烁荧光信号。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述激活激光具有紫色或紫外波长；所述激发激光具有Alexa647和Alexa750荧光分子激发波长，或者所述激发激光具有Cy5和Cy7荧光分子激发波长；使用预定的激发激光功率和激活激光功率，使同一时刻大部分的荧光分子关闭荧光信号，仅有小部分离散的荧光分子开启荧光信号。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成像缓冲液包含有TCEP、环辛四烯、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸；或者
所述成像缓冲液包含有巯基物、环辛四烯、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述TCEP或巯基物与荧光分子在所述激发激光的照射下结合形成加合物，所述加合物不会在所述激发激光的照射下发出荧光；所述加合物在所述激活激光的照射下重新分解为所述TCEP或巯基物和荧光分子，所述荧光分子发出荧光。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述环辛四烯包括环辛四烯的衍生物；所述除氧剂包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合，或者，所述除氧剂包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根据第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像的步骤之前还包括：
在数据采集之前，通过实时锁定系统将所述生物样品的位置实时锁定。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时锁定系统将所述生物样品的位置实时锁定的步骤包括：
为所述生物样品提供明场照明，所述生物样品的明场图像经过前成像透镜成像于锁定相机；
从所述锁定相机中抓取一张生物样品或参照体的明场图像作为锁定模板；
从所述锁定相机中实时抓取所述生物样品的当前明场图像，将所述当前明场图像与所述锁定模板进行对比；
计算所述当前明场图像与所述锁定模板之间的偏移量；
根据所述偏移量对所述当前明场图像进行偏移补偿处理。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，所述根据第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像的步骤还包括：
通过双色荧光定位超分辨率显微镜获取所述第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号；
通过所述双色荧光定位超分辨率显微镜的分光系统将所述第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号分离，并分别成像于相机的感光元件的不同区域；
获取所述相机采集的每一张图像，通过高斯拟合确定所述图像中每个荧光分子的爱里斑中心坐标并记录；
根据记录的所述爱里斑中心坐标分别构建所述第一通道闪烁荧光信号对应的所述第一生物结构超分辨率图像和所述第二通道闪烁荧光信号对应的所述第二生物结构超分辨率图像。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述双色荧光定位超分辨率显微镜为倒置的全反射荧光显微镜；
所述相机为EMCCD相机；和/或
所述分光系统包括矩形光阑、双色反射镜和两个滤镜。
11.一种双色荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于，包括有：
样品标记模块，用于使用Alexa647和Alexa750荧光分子，或Cy5和Cy7荧光分子对生物样品进行双色荧光标记，并将所述生物样品浸泡在成像缓冲液中；
信号产生模块，用于通过激光照射所述生物样品，分别产生与所述Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，以及与所述Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号；
第一图像构建模块，用于根据所述第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像；
第二图像构建模块，用于将所述第一生物结构超分辨率图像和所述第二生物结构超分辨率图像进行对准处理以构建出第三生物结构超分辨率图像。
12.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，所述信号产生模块用于通过预定的激活激光照射所述生物样品以开启荧光信号，并通过预定的激发激光照射所述生物样品以关闭荧光信号，以产生闪烁荧光信号。
13.根据权利要求12所述的系统，其特征在于，所述激活激光具有紫色或紫外波长；所述激发激光具有Alexa647和Alexa750荧光分子激发波长，或者所述激发激光具有Cy5和Cy7荧光分子激发波长；
所述信号产生模块用于使用预定的激发激光功率和激活激光功率，使同一时刻大部分的荧光分子关闭荧光信号，仅有小部分离散的荧光分子开启荧光信号。
14.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，所述成像缓冲液包含有TCEP、环辛四烯、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸；或者
所述成像缓冲液包含有巯基物、环辛四烯、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸。
15.根据权利要求14所述的系统，其特征在于，所述TCEP或巯基物与荧光分子在所述激发激光的照射下结合形成加合物，所述加合物不会在所述激发激光的照射下发出荧光；所述加合物在所述激活激光的照射下重新分解为所述TCEP或巯基物和荧光分子，所述荧光分子发出荧光。
16.根据权利要求14所述的系统，其特征在于，所述环辛四烯包括环辛四烯的衍生物；所述除氧剂包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合，或者，所述除氧剂包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合。
17.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，还包括：
实时锁定模块，用于在数据采集之前，通过实时锁定系统将所述生物样品的位置实时锁定。
18.根据权利要求17所述的系统，其特征在于，所述实时锁定模块包括：
明场照明子模块，用于为所述生物样品提供明场照明，所述生物样品的明场图像经过前成像透镜成像于锁定相机；
模块生成子模块，用于从所述锁定相机中抓取一张生物样品或参照体的明场图像作为锁定模板；
图像对比子模块，用于从所述锁定相机中实时抓取所述生物样品的当前明场图像，将所述当前明场图像与所述锁定模板进行对比；
偏移计算子模块，用于计算所述当前明场图像与所述锁定模板之间的偏移量；
偏移补偿子模块，用于根据所述偏移量对所述当前明场图像进行偏移补偿处理。
19.根据权利要求11～18任一项所述的系统，其特征在于，所述第一图像构建模块还包括：
信号获取子模块，用于通过双色荧光定位超分辨率显微镜获取第一通道闪烁荧光信号和第二通道闪烁荧光信号；
信号分离子模块，用于通过双色荧光定位超分辨率显微镜的分光系统将第一通道闪烁荧光信号和第二通道闪烁荧光信号分离，并分别成像于相机的感光元件的不同区域；
位置记录子模块，用于获取相机采集的每一张图像，通过高斯拟合确定图像中每个荧光分子的爱里斑中心坐标并记录；
图像生成子模块，用于根据记录的爱里斑中心坐标分别构建第一通道闪烁荧光信号对应的第一生物结构超分辨率图像和第二通道闪烁荧光信号对应的第二生物结构超分辨率图像。
20.根据权利要求19所述的系统，其特征在于，所述双色荧光定位超分辨率显微镜为倒置的全反射荧光显微镜；
所述相机为EMCCD相机；和/或
所述分光系统包括矩形光阑、双色反射镜和两个滤镜。
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