CN102589428A

CN102589428A - 基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正的方法和装置

Info

Publication number: CN102589428A
Application number: CN2012100142658A
Authority: CN
Inventors: 匡翠方; 李帅; 罗丁; 刘旭
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-01-17
Filing date: 2012-01-17
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-01-17
Also published as: CN102589428B

Abstract

本发明公开了一种基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正的方法和装置。装置包括：激光器、单模光纤、准直透镜、起偏器、偏振转换器、0/π位相板、空间滤波组件、3/4遮挡板、分光棱镜、显微物镜、监控光束聚焦透镜、光电感应器件、计算机和三维纳米扫描平台。方法包括：将准直光束转换为横截面上各点的偏振方向同时关于两条互相垂直的对称轴对称的第二切向偏振光，并形成非对称入射光束聚焦后投射到样品上；同时收集样品反射的光束作为监控光束，根据监控光束的聚焦光斑的重心偏移量来监控样品轴向位置漂移并跟踪校正样品轴向位置。本发明可用于高精度超分辨显微镜系统中样品轴向位置的实时监控和校正。

Description

基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正的方法和装置

技术领域

本发明属于高精度、超分辨显微领域，特别涉及一种基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正的方法和装置。

背景技术

在超分辨显微系统当中，待测样品需要放置在显微物镜的焦平面处。然而，在扫描过程中，由于热漂移和应力漂移等因素的影响，待测样品不可避免地会随时间发生轴向漂移，偏离焦平面，从而严重影响显微系统的成像精度。特别是对于需要多次对同一像素点进行重复扫描的显微方法来说，这种轴向漂移所带来的影响将更为明显，这是因为轴向漂移可能导致多次重复扫描的并非为同一像素点。因此，为了提高显微系统的测量精度，必须在系统中实时地跟踪待测样品的轴向位置，并对产生的轴向漂移进行校正，以保证待测样品的轴向位置一直处于显微物镜的焦平面处。

随着科学技术的发展，科研工作者们针对显微系统中的样品跟踪方法进行了大量的研究。2004年，专利号为ZL200410006359.6的中国发明专利提出了一种具有高空间分辨力的差分共焦扫描检测方法，该方法虽然部分解决了显微样品轴向位置的跟踪问题，可以较好地提高显微系统的测量精度，并且有效地了避免系统中所用激光的能量漂移对跟踪效果的影响，但是该方法的测量范围较小，从而使得其在使用上仍然具有较大的局限性。

发明内容

本发明提供了一种对显微样品轴向位置进行跟踪校正的方法和装置，不但使用方便，而且跟踪范围大，灵敏度高，校正准确，其中，跟踪灵敏度达到2nm，跟踪范围达到±1μm。该种方法和装置可以广泛应用于共聚焦显微镜(Confocal Microscopy)，受激发射损耗显微镜(STED：StimulatedEmission Depletion Microscopy)等高精度超分辨显微设备当中，用以保证待测样品一直位于显微物镜的焦平面处。

一种基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正的方法，包括以下步骤：

(1)由激光器发出的激光光束经过单模光纤和准直透镜进行准直；

(2)经过准直后的光线通过起偏器转换为线偏振光，再经过偏振转换器转变为第一切向偏振光，所述第一切向偏振光横截面上各点的偏振方向呈轴对称分布，对称轴方向与所述起偏器的透光轴平行；

(3)所述第一切向偏振光通过一个0/π位相分割线与所述起偏器的透光轴方向垂直的0/π位相板(即所述0/π位相板的0/π位相分割线与所述第一切线偏振光对称轴方向垂直)形成第二切向偏振光，所述第二切向偏振光横截面上各点的偏振方向不仅关于原对称轴(即步骤(2)中第一切向偏振光的对称轴)对称，而且关于所述0/π位相板的位相分割线对称；

换言之，所述第二切向偏振光横截面上各点的偏振方向同时关于两条对称轴对称，其中一条对称轴的方向与起偏器的透光轴方向平行，另外一条对称轴的方向与0/π位相板的0/π位相分割线平行，由于0/π位相板的0/π位相分割线与所述起偏器的透光轴方向垂直，因此两条对称轴互相垂直；

(4)所述第二切向偏振光经空间滤波组件滤去光束中的杂散光后，再通过3/4遮挡板，使得只有1/4的光束透过形成非对称入射光束；

(5)所述非对称入射光束经过分光棱镜后，透射光线经显微物镜聚焦后投射到位于三维纳米扫描平台的待测样品上，同时经待测样品反射的光束沿原光路逆向返回，由所述显微物镜收集后，经所述分光棱镜分解得到反射光线并作为监控光束；

(6)所述监控光束经监控光束聚焦透镜聚焦后，由光电感应器件接收，根据所接收到的监控光束聚焦光斑的信息得到监控光束聚焦光斑的重心偏移量(即监控光束聚焦光斑的重心相对于光电感应器件感应面中心的漂移量)，并标定监控光束聚焦光斑的重心偏移量与待测样品的轴向位置漂移量的关系，把这个关系式作为系统标定函数输入计算机，完成系统的标定；

(7)当待测样品发生轴向位置漂移时，计算机根据所测得的监控光束聚焦光斑的重心偏移量在标定好的系统内跟踪查询到相应的待测样品的轴向位置漂移量，并据此发出指令调整三维纳米扫描平台的轴向位置，实现对待测样品的轴向位置的校正。

所述的光电感应器件为高速电荷耦合器件(CCD：Charge CoupleDevice)或者四象限探测器(QD：Quadrant Detector)。

当使用CCD作为光电感应器件时，所述的监控光束聚焦光斑的信息为监控光束在CCD上所成光斑的重心坐标，通过与光电感应器件感应面中心坐标的比较，可得到监控光束聚焦光斑的重心偏移量。

当使用QD作为光电感应器件时，所述的监控光束聚焦光斑的信息为光束在QD四象限上的输出电流，通过计算四象限电流差分值，来表征监控光束聚焦光斑重心偏移量。

本发明还提供了一种基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正的装置，包括：

激光器；

在所述激光器的出射光光路的光轴上依次设置的单模光纤、准直透镜、起偏器、偏振转换器、0/π位相板、空间滤波组件、3/4遮挡板、分光棱镜、显微物镜和用于放置待测样品的三维纳米扫描平台；

在监控光束光路的光轴上依次设置的监控光束聚焦透镜和光电感应器件，所述监控光束光路的光轴与所述激光器的出射光光路的光轴垂直，所述监控光束为待测样品反射回来的光束经所述分光棱镜分光后的反射光线；

以及同时与所述三维纳米扫描平台和光电感应器件均相连的计算机；

其中，所述单模光纤的出射端面位于所述准直透镜的物方焦点处，所述0/π位相板的0/π位相分割线与所述起偏器的透光轴方向垂直，所述光电感应器件位于所述监控光束聚焦透镜的像方焦点处。

本发明装置中，所述激光器用于发出激光光束，所述单模光纤和准直透镜用于对所述激光光束进行准直，所述偏振起偏器用于将所述准直后的光束转换为线偏振光，所述偏振转换器用于将所述线偏振光转换为第一切向偏振光，所述第一切向偏振光横截面上各点的偏振方向呈轴对称分布，对称轴方向与所述起偏器的透光轴平行；所述0/π位相板用于对所述第一切向偏振光进行相位调制得到第二切向偏振光，所述第二切向偏振光横截面上各点的偏振方向不仅关于原对称轴(即第一切向偏振光的对称轴)对称，而且关于所述0/π位相板的位相分割线对称；所述空间滤波组件用于滤去所述第二切向偏振光中的杂散光，所述3/4遮挡板用于对滤波后的第二切向偏振光进行遮挡，使只有1/4的光束透过形成非对称入射光束；所述分光棱镜用于分光；所述显微物镜，用于将非对称入射光束聚焦到位于三维纳米扫描平台的待测样品上，并用于收集经待测样品表面反射的光束；所述监控光束聚焦透镜用于将监控光束聚焦到光电感应器件的感应面上；所述光电感应器件用于接收监控光束并提供监控光束聚焦光斑的信息来表征监控光束聚焦光斑的重心偏移量；所述计算机用于接收光电感应器件反馈的监控信息并进行分析处理，实现待测样品的轴向漂移量的监控并发出调整控制信号；所述三维纳米扫描平台用于根据所述计算机发出的调整控制信号来调整扫描平台上待测样品的轴向位置。

优选的技术方案，所述偏振转换器为瑞典(ARCoptix)公司的偏振转换器Radial-Azimuthal Polarization Converter。

优选的技术方案中，所述光电感应器件为高速电荷耦合器件(CCD：Charge Couple Device)或者四象限探测器(QD：Quadrant Detector)。

优选的技术方案中，所述空间滤波组件由聚焦透镜、空间滤波器和第二准直透镜构成。其中，优选所述空间滤波器采用针孔。

本发明原理如下：

第二切向偏振光横截面上各点的偏振方向同时关于两条相互垂直的对称轴对称，该切向偏振光横截面将会被两条相互垂直的暗线分割成四个部分。因此，当所述第二切向偏振光通过3/4遮挡板的时候，遮挡板的边缘将正好对应该切向偏振光横截面上的暗线，这样就避免了边缘光线的衍射对跟踪结果的影响。

通过3/4遮挡板形成的非对称入射光束经显微物镜聚焦后在焦点附近的光场分布可由德拜积分确定，具体如下：

式中，

是以理想焦点位置为原点的柱坐标系，

代表了处的电矢量强度，i为虚数单位，C为归一化常数，θ为光束孔径角，

为光束垂直Z轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，是入射光的振幅分布，

表征了显微物镜的结构，则表示了入射光的偏振信息，k＝2π/λ，n为介质折射率。

根据上式计算可以发现，只有在显微物镜的像方焦平面上，聚焦所成光斑的重心才会位于光轴上。因此，当待测样品的轴向位置偏离像方焦平面时，非对称入射光束在待测样品上所成光斑的重心将偏离显微物镜的光轴。

当非对称入射光束在待测样品上所成光斑的重心偏离显微物镜的光轴时，监控光束经监控光束聚焦透镜聚焦后在光电感应器件上所成光斑的重心也将偏离监控光束聚焦透镜的像方焦点，即光电感应器件感应面的中心。因此，通过对监控光束聚焦光斑重心相对于光电感应器件感应面中心的漂移量进行监控，可以确定待测样品轴向位置的漂移量。

通过控制三维纳米扫描平台，使待测样品的轴向位置向漂移量减小的方向进行调整，当监控光束聚焦光斑重心最终与监控光束聚焦透镜的像方焦点即光电感应器件感应面的中心重合时，即完成了对待测样品轴向位置漂移的校正。

本发明基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正装置可以作为一个独立的模块应用于高精度超分辨显微镜的测量光路中，实时地对待测样品的轴向位置进行监控和校正。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)跟踪灵敏度高，最小可分辨的轴向位置漂移量为2nm；

(2)跟踪范围大，可以达到±1μm；

(3)跟踪校正过程不受激光能量漂移的影响；

(4)装置结构简洁，方便调整，且调整过程快速准确，应用在高精度超分辨显微镜系统中不会对显微镜工作光路形成干扰。

附图说明

图1为本发明的基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正装置的示意图；

图2为本发明的基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正装置作为一个独立模块应用于显微镜工作光路中的示意图；

图3(a)为本发明中第一切向偏振光某一时刻横截面上各点偏振方向示意图；

图3(b)为本发明中第二切向偏振光某一时刻横截面上各点偏振方向示意图；

图4为本发明中3/4遮挡板的示意图；

图5为本发明采用CCD作为光电感应器件时，聚焦光斑重心偏移量与待测样品轴向位置漂移量的对应曲线；

图6为本发明采用QD作为光电感应器件时，四象限电流差分值与待测样品轴向位置漂移量的对应曲线；

图7为采用CCD作为光电感应器件的本发明装置中不同时刻的待测样品的轴向位置漂移量变化曲线。

图8为采用CCD作为光电感应器件的本发明装置中待测样品发生图7所示的轴向位置漂移时监控光束聚焦光斑重心偏移量变化曲线。

图9为采用QD作为光电感应器件的本发明装置中不同时刻的待测样品的轴向位置漂移量变化曲线。

图10为采用QD作为光电感应器件的本发明装置中待测样品发生图9所示的轴向位置漂移时四象限电流差分值变化曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示，一种基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正装置，包括：激光器1，单模光纤2，准直透镜3，起偏器4，偏振转换器5，0/π位相板6，聚焦透镜7，空间滤波器8，第二准直透镜9，3/4遮挡板10，分光棱镜11，显微物镜12，监控光束聚焦透镜13，光电感应器件14，计算机15，三维纳米扫描平台16。

其中，单模光纤2，准直透镜3，起偏器4，偏振转换器5，0/π位相板6，聚焦透镜7，空间滤波器8，第二准直透镜9，3/4遮挡板10，分光棱镜11、显微物镜12和三维纳米扫描平台16依次位于激光器1的出射光光路的光轴上，显微物镜12将光线聚焦到位于三维纳米扫描平台16的待测样品上。

监控光束聚焦透镜13和光电感应器件14依次位于监控光束光路的光轴上，监控光束光路的光轴与激光器1的出射光光路的光轴垂直，监控光束为待测样品反射回来的光束经分光棱镜11分光后的反射光线。

计算机15同时连接光电感应器件14和三维纳米扫描平台16。

其中，单模光纤2的出射端面位于准直透镜3的物方焦点处，0/π位相板6的0/π位相分割线与起偏器4的透光轴方向垂直，光电感应器件14位于监控光束聚焦透镜13的像方焦点处。

上述装置中，偏振转换器5采用瑞典(ARCoptix)公司的偏振转换器Radial-Azimuthal Polarization Converter。光电感应器件14选用高速电荷耦合器件(CCD：Charge Couple Device)或者四象限探测器(QD：QuadrantDetector)。空间滤波器8采用针孔，与聚焦透镜7和第二准直透镜9构成空间滤波组件滤去光束中的杂散光。

采用图1所示的装置进行基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正方法如下：

从激光器1发出的激光光束，首先被导入单模光纤2，从单模光纤2出射的激光光束，经过准直透镜3完成准直。

经过准直的激光光束通过起偏器4转换为线偏振光，其偏振方向为起偏器4的透光轴方向。该线偏振光经过偏振转换器5作用后转变为第一切向偏振光，图3(a)为第一切向偏振光的示意图，其横截面上各点的偏振方向呈轴对称分布，对称轴方向与线偏振光的偏振方向平行。

第一切向偏振光再通过0/π位相板6形成第二切向偏振光，由于0/π位相板6的0/π位相分割线与起偏器4的透光轴方向垂直(也即是0/π位相分割线与第一切向偏振光对称轴垂直)，因此所形成的第二切向偏振光横截面上各点的偏振方向不仅关于原对称轴(即第一切向偏振光的对称轴)对称，而且关于0/π位相板6的位相分割线对称，如图3(b)所示。

第二切向偏振光经过由聚焦透镜7、空间滤波器8和第二准直透镜9构成的空间滤波组件滤去光束中的杂散光后，再通过如图4所示的3/4遮挡板10，使得只有1/4的光束透过，形成非对称入射光束R1。

非对称入射光束R1经过分光棱镜11后，透射光线经显微物镜12聚焦后投射到位于三维纳米扫描平台16上的待测样品之上，同时经待测样品反射的光束沿原光路逆向返回，由显微物镜12收集后，经分光棱镜11分解成透射光线和反射光线，其中反射光线作为监控光束R2。

监控光束R2经监控光束聚焦透镜13聚焦后，由光电感应器件14接收，根据所接收到的监控光束聚焦光斑的重心偏移量(即监控光束聚焦光斑的重心相对于光电感应器件14感应面中心的漂移量)，标定监控光束聚焦光斑的重心偏移量与待测样品的轴向位置漂移量的关系，把这个关系式作为系统标定函数输入计算机15，完成系统的标定。

当待测样品发生轴向位置漂移时，计算机15根据所测得的监控光束聚焦光斑的重心偏移量在标定好的系统内跟踪查询到相应的待测样品的轴向位置漂移量，并据此发出指令调整三维纳米扫描平台16的轴向位置，实现对待测样品的轴向位置的校正。

具体来说：

当使用CCD作为光电感应器件14时，可以直接得到监控光束聚焦光斑重心的坐标。将待测样品放在三维纳米扫描平台16上，通过调整三维纳米扫描平台16的轴向位置，并实时记录CCD上监控光束聚焦光斑重心的坐标，计算出监控光束聚焦光斑的重心相对于CCD感应面中心的漂移量，从而得到监控光束聚焦光斑的重心偏移量与待测样品的轴向位置漂移量的关系，曲线如图5所示，把这个关系式作为系统标定函数输入计算机15，完成系统的标定。

当待测样品发生轴向位置漂移时，CCD将监控光束聚焦光斑重心偏移量传送给计算机15，计算机15在标定好的系统内跟踪查询到相应的待测样品的轴向位置漂移量，并据此发出指令调整三维纳米扫描平台16的轴向位置，即可实现待测样品轴向位置的校正。当聚焦光斑重心最终与透镜的像方焦点即光电感应器件感应面的中心重合时，即完成了对待测样品轴向位置漂移的校正。

为了进一步检验上述装置和方法的实际效果，本实施例还分别记载了不同时刻的待测样品的轴向位置漂移量和相应的监控光束聚焦光斑重心偏移量，其变化曲线分别如图7和图8所示，由图7和图8可知，待测样品的轴向位置漂移量为±40nm时，有非常好的跟踪灵敏度。

当使用QD作为光电感应器件14时，根据QD的探测原理，其四象限上的输出电流分别与照射在各个象限上的光斑能量呈线性关系，因此，可以通过对各象限输出的电流进行差分运算来表征监控光束聚焦光斑重心的偏离程度，具体公式如下：

Δr = \frac{I_{a} + I_{d} - I_{b} - I_{c}}{I_{a} + I_{b} + I_{c} + I_{d}}

其中，I_a、I_b、I_c、I_d分别为光束在QD四象限上的输出电流，Δr为四象限电流差分值，用以表征监控光束聚焦光斑重心偏移量。

同样，将待测样品放在三维纳米扫描平台16上，通过调整三维纳米扫描平台16的轴向位置，并实时记录QD四象限上的输出电流，并计算四象限电流差分值Δr，从而得到监控光束聚焦光斑的重心偏移量(以四象限电流差分值Δr表征)与待测样品的轴向位置漂移量的关系，曲线如图6所示，把这个关系式作为系统标定函数输入计算机15，完成系统的标定。

当待测样品发生轴向位置漂移时，QD将计算得到的四象限电流差分值Δr传送给计算机15，计算机15在标定好的系统内跟踪查询到相应的待测样品的轴向位置漂移量，并据此发出指令调整三维纳米扫描平台16的轴向位置，即可实现待测样品轴向位置的校正。当聚焦光斑重心最终与透镜的像方焦点即光电感应器件感应面的中心重合时，即完成了对待测样品轴向位置漂移的校正。

为了进一步检验上述装置和方法的实际效果，本实施例还分别记载了不同时刻的待测样品的轴向位置漂移量和相应的四象限电流差分值Δr，其变化曲线分别如图9和图10所示，由图9和图10可知，待测样品的轴向位置漂移量为±2nm时，有非常好的跟踪灵敏度。

图1中黑框内结构可以构成一个独立的样品轴向位置跟踪校正模块应用于高精度超分辨显微镜的测量光路中，实时地对待测样品的轴向位置进行监控和校正。具体工作光路如图2所示。

即，采用了本发明样品轴向位置跟踪校正模块的高精度超分辨显微镜系统，包括：显微物镜12，计算机15，三维纳米扫描平台16，二向色镜17、18，基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正模块19，工作光束聚焦透镜20，工作光束探测器21。

其中基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正模块19的内部具体结构如图1中黑框内部结构所示，包括：激光器1，单模光纤2，准直透镜3，起偏器4，偏振转换器5，0/π位相板6，聚焦透镜7，空间滤波器8，第二准直透镜9，3/4遮挡板10，分光棱镜11，监控光束聚焦透镜13和光电感应器件14。

将本发明基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正模块19应用于高精度超分辨显微镜系统中对样品轴向位置进行跟踪校正方法如下：

由基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正模块19发出的非对称入射光束R1，经过二向色镜18后形成反射，反射光束和显微镜工作光束R3经显微物镜12聚焦后投射到待测样品上。经待测样品反射的非对称入射光束和显微镜工作光束在经过二向色镜18时形成分离，其中经待测样品反射的非对称入射光束被二向色镜18反射后，作为监控光束R2被基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正模块19接收；而经待测样品反射的显微镜工作光束则透过二向色镜18，之后再透过二向色镜17与入射的工作光束分离，作为成像光束R4在经过工作光束聚焦透镜20聚焦后被工作光束探测器21接收，用于显微成像。

基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正模块19接收监控光束R2后，将监控得到的待测样品轴向位置漂移量信号传送给计算机15，经过计算机15处理后转变为相应的控制信号调整三维纳米扫描平台16的轴向位置，即可实现待测样品轴向位置的校正。

在实际操作中，整个过程实时监控并不断循环进行，从而完成对待测样品轴向位置漂移的实时跟踪校正。

Claims

1.一种基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)所述第一切向偏振光通过一个0/π位相分割线与所述起偏器的透光轴方向垂直的0/π位相板形成第二切向偏振光；

(6)所述监控光束经监控光束聚焦透镜聚焦后，由光电感应器件接收，根据所接收到的监控光束聚焦光斑的信息得到监控光束聚焦光斑的重心偏移量，并标定监控光束聚焦光斑的重心偏移量与待测样品的轴向位置漂移量的关系，把这个关系式作为系统标定函数输入计算机，完成系统的标定；

2.如权利要求1所述的基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正的方法，其特征在于，所述的光电感应器件为高速电荷耦合器件或者四象限探测器。

3.一种基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正的装置，包括：

激光器；

在所述激光器的出射光光路的光轴上依次设置的单模光纤、准直透镜、起偏器、偏振转换器、0/π位相板、空间滤波组件、3/4遮挡板、分光棱镜、显微物镜和用于放置待测样品的三维纳米扫描平台；所述偏振转换器用于将所述线偏振光转换为第一切向偏振光，所述第一切向偏振光横截面上各点的偏振方向呈轴对称分布，对称轴方向与所述起偏器的透光轴平行；

4.如权利要求3所述的基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正的装置，其特征在于，所述的光电感应器件为高速电荷耦合器件或者四象限探测器。

5.如权利要求3所述的基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正的装置，其特征在于，所述空间滤波组件由聚焦透镜、空间滤波器和第二准直透镜构成。

6.如权利要求3所述的基于非对称入射的样品轴向位置跟踪校正的装置，其特征在于，所述空间滤波器采用针孔。