CN103901629A - 一种实现远场超分辨成像的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种实现远场超分辨成像的方法和装置。该方法首先将激发光和STED光同时耦合进入单模光纤以实现合束效果，然后将经过合束的激发光和STED光依次通过起偏器和双波长波片，调制成偏振方向相互垂直的线偏振光，再采用液晶偏振转换器，将激发光和STED光分别转换为径向偏振光和角向偏振光。实现该方法的装置包括：激发光源、STED光源、准直透镜、起偏器、双波长波片、液晶偏振转换器、二向色镜、高数值孔径物镜、三维纳米位移台、聚焦透镜以及光强探测器。本发明通过单模光纤的耦合作用以及高数值孔径下径向偏振光和角向偏振光不同的聚焦特性，使得聚焦于样品表面的圆形激发光斑和环状STED光斑自动重合，从而有效降低STED超分辨成像的实现难度。

Description

一种实现远场超分辨成像的方法和装置

技术领域

本发明属于超分辨成像领域，具体涉及一种实现远场超分辨成像的方法和装置。

背景技术

衍射极限一直是超分辨成像领域无法回避的一个问题，由于衍射极限的存在，很长时间以来，传统超分辨显微成像技术的分辨力都被限制在200nm以上。随着科学技术的持续发展以及对微观世界认识的逐渐深入，人们对于超衍射极限的超分辨显微成像技术越发渴求。为了突破衍射极限的限制，研究人员沿着不同的途径展开了深入研究，在不懈努力之下，各种超分辨显微成像技术被相继提出，STED显微技术便是其中的典型代表之一。

STED显微技术由德国人Stefan Hell于1994年率先提出，其原理是在普通光学显微镜中引入一束STED光束，通过适当的位相调制使STED光束在荧光样品表面聚焦为环状光斑，调节环状光斑的位置使其与激发光斑重合，通过受激发射损耗过程，使激发光斑外缘区域的荧光分子不再发射荧光，从而有效减小激发光斑的面积，也即减小成像系统的点扩散函数，提高系统的成像分辨力。STED显微技术具有超高分辨力、远场成像、工作于可见光波段等显著特点，因此极其适用于生物活体成像。然而要想实现STED显微成像确并非易事，STED显微成像系统中，为了获得超高的分辨力，普遍选用数值孔径为1.4左右的高数值孔径物镜，因此聚焦于样品表面的激发光斑和STED光斑尺寸均在500nm以下，此时要调节两光斑位置重合对光路系统的调节精度要求非常高，此外，由于光斑尺寸都在亚波长量级，而普通的成像设备如CCD等都达不到如此高的分辨率，因此在调节过程中无法对两光斑的位置进行实时监控，这又从另一方面增加了光路调节的难度。

基于上述原因，我们提出一种实现远场超分辨成像的方法和装置，该方法和装置首先将激发光和STED光同时耦合进入单模光纤，然后再依次通过准直透镜、起偏器、双波长波片以及液晶偏振转换器，获得径向偏振的激发光和角向偏振的STED光，由于高数值孔径下径向偏振光和角向偏振光聚焦光斑存在巨大差异，因此最终在样品表面可以得到自然重合的圆形激发光斑和环形STED光斑，从而有效降低STED成像系统的光路调节难度，为快速、简便的实现STED超分辨成像提供有利保障。

发明内容

本发明解决的主要技术问题是：针对STED成像系统中，聚焦的激发光斑和STED光斑尺寸均为亚波长量级这一事实，以及由此带来的光路调节的技术难点，我们提出了一种实现远场超分辨成像的方法和装置，在降低系统光路调节难度的同时，可以保证成像的高分辨力。

本发明提供的实现远场超分辨成像的方法，包括以下步骤：

(1)将激发光和STED光同时耦合进入单模光纤，在光纤出射端形成双波长光束出射；

(2)采用消色差透镜使单模光纤出射的双波长光束同时准直；

(3)将准直光束依次通过起偏器和双波长波片，其中双波长波片对激发光为全波片，对STED光为半波片，通过调节双波长波片使其光轴与起偏器透光方向夹角为45°，可以得到偏振方向互相垂直的激发光束和STED光束；

(4)将所述偏振方向互相垂直的激发光束和STED光束通过液晶偏振转换器，调节偏振转换器，可以得到径向偏振的激发光束和角向偏振的STED光束；

(5)将所述径向偏振的激发光束和角向偏振的STED光束通过高数值孔径物镜聚焦，在样品表面分别聚焦为圆形光斑和环形光斑；

(6)调节STED光束光强，使STED光对激发光斑面积的压缩效果达到最佳状态，控制扫描台移动，采用光强探测器采集每一扫描点位的光强信息，通过后期数据处理，获得超分辨力的成像结果。

本发明提供的实现上述方法的装置，包括：用于产生激发光的激光光源；用于产生STED光的激光光源；用于耦合所述激发光和STED光的单模光纤；用于准直单模光纤出射光束的消色差透镜；用于将准直光束变为线偏振光的起偏器；用于将激发光和STED光调制为偏振方向相互垂直的线偏振光的双波长波片；用于将偏振方向相互垂直的激发光和STED光分别转换为径向偏振光和角向偏振光的液晶偏振转换器；用于透射激发光和STED光，且将信号光反射入光强探测器的二向色镜；用于聚焦激发光和STED光的数值孔径为1～1.4的物镜；用于固定样品以及对样品实现扫描成像的纳米位移台；用于将信号光聚焦于光强探测器的聚焦透镜；用于探测样品所发出信号光的光强探测器。

本发明与现有技术相比的优点：

(1)相对于现有技术需要调节激发光斑和STED光斑重合，本发明中两光斑在样品表面自然重合，因此系统光路调节难度低，也更利于STED超分辨成像的实现；

(2)现有技术中，受到外界机械振动，温度变化等影响，原本重合的激发光斑和STED光斑可能会出现相对位置偏移，而本发明中两光斑始终保持重合，因此抗外界干扰能力更强；

(3)本发明中采用的液晶偏振转换器可以宽波段工作，即使改变激发光和STED光波长也同样有效，因此系统灵活性很强，在改变工作波长的情况下无需更换偏振转换器。

附图说明

图1为本发明的实现远场超分辨成像的方法和装置的装置示意图。

图2是实施例中激发光束和STED光束经起偏器后的偏振状态示意图。

图3是实施例中经双波长波片进一步调制后激发光束和STED光束的偏振状态示意图。

图4是实施例中经液晶偏振转换器进一步调制后激发光束和STED光束的偏振状态示意图。

图5是高数值孔径下径向偏振光的聚焦光斑数值计算结果。

图6是高数值孔径下角向偏振光的聚焦光斑数值计算结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来详细说明本发明，但以下的实施例仅限于解释本发明，本发明的保护范围不限于此。

如图1所示的实现远场超分辨成像的方法和装置的装置包括：1.激发光源；2.STED光源；3.单模光纤；4.消色差准直透镜；5.起偏器；6.双波长波片；7.液晶偏振转换器；8.二向色镜；9.高数值孔径物镜；10.三维纳米位移台；11.聚焦透镜；12.光强探测器。

上述激发光源和STED光源根据荧光样品分别选用波长为λ₁和λ₂的激光器，并根据λ₁和λ₂的具体数值选择工作波段同时覆盖两种波长的单模光纤。将两光源发射的光束同时耦合进入单模光纤，单模光纤出射端将形成双波长光束出射。

上述消色差准直透镜选用消色差双胶合透镜，焦距选择依据为可以使单模光纤出射的光束准直为直径6～8毫米的平行光束。

上述起偏器选用薄膜偏光片，双波长平行光束通过薄膜偏光片以后变为偏振方向相同的线偏振光，偏振态如图2所示。

采用对λ₁为全波片对λ₂为半波片的双波长波片，调整其光轴使其光轴与薄膜偏光片透光轴夹角为45°，通过双波长波片后，激发光和STED光的偏振状态如图3所示。

上述液晶偏振转换器选用瑞士ARCoptix公司的产品，根据液晶偏振转换器的原理，偏振方向相互垂直的激发光束和STED光束可以被分别转换为径向偏振光和角向偏振光，偏振态如图4所示。

选用对λ1为50％透过50％反射，对λ2为99％透过的二向色镜，激发光束和STED光束通过二向色镜后，进入1.4NA的高数值孔径物镜，选用复消色差物镜以达到最佳的消色差效果。物镜对激发光束和STED光束的聚焦效果可以通过如下所示的Debye积分公式进行计算：

其中

是观察位置以焦点为原点的柱坐标，θ是聚焦光线与光轴的夹角，

是入射面处的方位角，C是归一化常数，A₁是入射光束的光场分布函数，A₂是聚焦物镜的结构函数， $\left[\begin{array}{c}{p}_x\\ p_y\\ p_z\end{array}\right]$ 表示入射光偏振态的单位向量，对径向偏振光有：

$\left[\begin{array}{c}{p}_x\\ p_y\\ p_z\end{array}\right]=\left[\begin{array}{c}\cos \mathrm{\θ}\\ \sin \mathrm{\θ}\\ 0\end{array}\right],$ 对角向偏振光有： $\left[\begin{array}{c}{p}_x\\ p_y\\ p_z\end{array}\right]=\left[\begin{array}{c}-\sin \mathrm{\θ}\\ \cos \mathrm{\θ}\\ 0\end{array}\right].$ 通过Debye积分公式计算可得：高数值孔径下径向偏振光聚焦为圆形光斑，如图5所示；角向偏振光聚焦为环形光斑，如图6所示。也即图1所示装置中，激发光束聚焦为圆形光斑，STED光束聚焦为环形光斑。

上述三维纳米位移台选用德国PI公司的高精度纳米位移台，调节位移台，使激发光斑和STED光斑聚焦于样品表面，调节激发光和STED光的光强，使STED光斑对激发光斑达到最佳的压缩效果。控制纳米位移台精确位移对样品实现光栅扫描。样品发出的荧光信号经二向色镜反射进入探测光路，通过透镜聚焦于光强探测器接收面。上述光强探测器选用光电倍增管，在保证高灵敏度的同时可以得到较高的信噪比。通过光电倍增管对每一扫描点位的荧光信号进行记录，通过后期的数据处理，得到高分辨力的成像结果。

Claims (12)

1.一种实现远场超分辨成像的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将激发光和STED光同时耦合进入单模光纤，在光纤出射端形成双波长光束出射；

(2)采用消色差透镜使单模光纤出射的双波长光束同时准直；

(3)将准直光束依次通过起偏器和双波长波片，其中双波长波片对激发光为全波片，对STED光为半波片，通过调节双波长波片使其光轴与起偏器透光方向夹角为45°，可以得到偏振方向互相垂直的激发光束和STED光束；

(4)将所述偏振方向互相垂直的激发光束和STED光束通过液晶偏振转换器，调节偏振转换器得到径向偏振的激发光束和角向偏振的STED光束；

(5)将所述径向偏振的激发光束和角向偏振的STED光束通过高数值孔径物镜聚焦，在样品表面分别聚焦为圆形光斑和环形光斑；

(6)调节STED光束光强，使STED光对激发光斑面积的压缩效果达到最佳状态，控制三维纳米位移台移动，采用光强探测器采集每一扫描点位的光强信息，通过后期数据处理，获得超分辨力的成像结果。

2.如权利要求1所述的实现远场超分辨成像的方法，其特征在于，步骤(1)将激发光和STED光同时耦合进入单模光纤，从单模光纤出射的两种波长的光束具有很高的重合度，可视为从同一激光器出射。

3.如权利要求1所述的实现远场超分辨成像的方法，其特征在于，经单模光纤出射的光束通过消色差透镜准直，对两种波长的光束都可以达到很高的准直度。

4.如权利要求1所述的实现远场超分辨成像的方法，其特征在于，步骤(3)中，采用起偏器和双波长波片，将激发光和STED光调制为偏振方向相互垂直的线偏振光。

5.如权利要求4所述的实现远场超分辨成像的方法，其特征在于，所述的双波长波片，对激发光为全波片，对STED光为半波片。

6.如权利要求1所述的实现远场超分辨成像的方法，其特征在于，步骤(4)中，通过液晶偏振转换器，将偏振方向相互垂直的激发光和STED光分别转换为径向偏振光和角向偏振光。

7.如权利要求1所述的实现远场超分辨成像的方法，其特征在于，步骤(5)采用数值孔径为1～1.4的高数值孔径物镜对激发光束和STED光束进行聚焦。

8.用于实现权利要求1～6任一项所述方法的装置，其特征在于包括：用于产生激发光的激光光源；用于产生STED光的激光光源；用于耦合所述激发光和STED光的单模光纤；用于准直单模光纤出射光束的消色差透镜；用于将准直光束变为线偏振光的起偏器；用于将激发光和STED光调制为偏振方向相互垂直的线偏振光的双波长波片；用于将偏振方向相互垂直的激发光和STED光分别转换为径向偏振光和角向偏振光的液晶偏振转换器；用于透射激发光和STED光，且将信号光反射入光强探测器的二向色镜；用于聚焦激发光和STED光的数值孔径为1～1.4的物镜；用于固定样品以及对样品实现扫描成像的三维纳米位移台；用于将信号光聚焦于光强探测器的聚焦透镜；用于探测样品所发出信号光的光强探测器。

9.如权利要求8所述装置，其特征在于，所述消色差准直透镜可以为双胶合透镜，也可以为集成式的准直器。

10.如权利要求8所述装置，其特征在于，所述起偏器包括但不限于薄膜偏振片。

11.如权利要求8所述装置，其特征在于，所述液晶偏振转换器是基于液晶材料的径向/角向偏振转换设备。

12.如权利要求8所述装置，其特征在于，所述高数值孔径物镜的数值孔径为1～1.4。

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