CN103424859A - 基于柱矢量光束的受激发射损耗显微成像方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于柱矢量光束的超分辨受激发射损耗显微成像方法，包括如下步骤：对发出激发光束的第一激光器发出的激光束进行准直，获得第一平行光束；将第一平行光束转换为径向偏振光；通过透镜将调制后的第一径向偏振光聚焦在焦平面的样品上，得到聚焦实心光斑；对发出抑制光束的第二激光器发出的激光束进行准直，获得第二平行光束；将第二平行光束转换为切向偏振光；通过透镜将调制后的切向偏振光束聚焦在焦平面的样品上，得到聚焦中空光斑，该聚焦中空光斑与上述聚焦实心光斑中心重叠，使得只有中间位置处、尺寸小于衍射极限的中间点发出荧光；通过探测器探测上述中间点所发出的荧光。

Description

基于柱矢量光束的受激发射损耗显微成像方法及装置

技术领域

本发明涉及受激发射损耗显微成像技术，具体涉及一种利用柱矢量光束的超分辨受激发射损耗显微成像方法及装置。

背景技术

现代生物学和材料科学的发展对微观结构的研究提出了越来越高的分辨率需求，希望从分子水平揭示生命过程和材料性能的物理本质。但受到光学衍射极限的限制，普通光学显微镜的横向分辨率一般只能达到200nm，纵向分辨率约500nm，这对于研究亚细胞结构和分子结构已无能为力。虽然电子显微镜（Electron Microscopy）、原子力显微镜（AtomForce Microscopy）、近场扫描光学显微镜（Near-field Scanning OpticalMicroscope,NSOM）等技术可以获得很高的分辨率，但是由于缺乏特异性的探针标记，不适合定位单个蛋白质分子，而且也不适合观察活细胞和细胞膜的动态变化过程。因此，如何利用光学方法突破传统光学显微镜的分辨率极限，使其既具有纳米尺度的光学分辨本领又可以连续监测生物大分子和细胞器微小结构的演化，成为光学显微成像技术的一个重要挑战和机遇。

近年来，随着新型荧光分子探针的出现和成像方法的改进，远场光学显微成像的分辨率已经突破了衍射极限的限制，发展了多种超分辨荧光显微成像技术，如激活定位显微技术（Photoactivated LocalizationMicroscopy,PALM）、随机光学重构显微技术（Stochastic OpticalReconstruction Microscopy,STORM）、受激发射损耗显微技术（Stimulated Emission Depletion,STED）和结构照明显微技术（Structured Illumination Microscopy,SIM）等。其中，STED显微成像技术受到了特别关注，基于该技术极大改进了远场光学显微成像的分辨率，可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质，而且它是一种从物理上打破衍射光学极限的远场荧光显微技术。STED显微成像技术的原理是：首先，使用一束激光在样品表面聚焦产生一个实心小光斑，仅激发一个点的荧光基团使其发荧光；然后，再用另一束激光在样品表面相同位置区域聚焦产生一个面包圈样的空心光斑抑制那个点周围的荧光强度，这样就只有中间一个小于衍射极限的点发光并被观察到。接下来，收集发光点发出的荧光，探测处理后得到超分辨的显微图像。最后，连续移动三维平移台改变探测位置，最终得到整个物体的三维显微成像。

实现超分辨STED显微成像的关键是如何形成具有超小尺寸的激发光斑和抑制光斑，其中激发光斑是一个聚焦的实心光斑，而抑制光斑是一个聚焦的空心光斑。STED显微镜的分辨率主要是由有效荧光光斑的大小及损耗效果决定的。可以通过各种措施改善STED光在焦平面相干形成的抑制光斑的干涉对比度及中心强度分布,通过改善影响相干的条件,压缩荧光光斑的大小,尽可能提高横向和轴向抑制比。

近年来，提出了多种实现激发光斑和抑制光斑的方法和实验装置，例如S W Hell等人提出了一种基于0～2π涡旋位相板，使用圆偏光形成面包圈样的空心聚焦光斑的方法，见文献“S W Hell.Far-fieldoptical nanoscopy,Single Molecule Spectroscopy in Chemistry,Physics and Biology.Springer Series in Chemical Physics96:365-398，2010”。作为一种经典的光斑形成方法，它被广泛应用于目前的多种STED显微镜产品中。但这种技术的缺点在于圆偏振激发光难以聚焦到衍射极限以下，另外如果利用圆偏振光通过涡旋位相板形成面包圈光斑来抑制激发光斑周围的荧光，其抑制效果的提高只能靠增加STED激光功率，而高光强会对生物样品造成损伤。随后，又提出了诸如基于0/π圆形相位板、切向偏振涡旋光束等获得抑制光斑的方法。

如何通过对激发光束和受激发射损耗光束进行合理的偏振、相位及振幅调制以获得满足要求的超小聚焦光斑，这成为目前STED显微成像技术一个重要的技术关键。

发明内容

本发明提出了一种基于柱矢量光束的超分辨STED显微成像方法及装置，利用该方法可获得物体的三维超分辨显微成像。

本发明提供一种基于柱矢量光束的超分辨受激发射损耗显微成像方法，包括如下步骤：对发出激发光束的第一激光器发出的激光束进行准直，获得第一平行光束；通过第一偏振转换器将所述第一平行光束转换为径向偏振光；通过第一光瞳滤波器调制所述径向偏振光，并通过透镜将调制后的第一径向偏振光聚焦在焦平面的样品上，得到聚焦实心光斑；对发出抑制光束的第二激光器发出的激光束进行准直，获得第二平行光束；通过第二偏振转换器将所述第二平行光束转换为切向偏振光；通过第二光瞳滤波器调制所述切向偏振光束，并通过所述透镜将调制后的切向偏振光束聚焦在所述焦平面的样品上，得到聚焦中空光斑，该聚焦中空光斑与上述聚焦实心光斑中心重叠，使得只有中间位置处、尺寸小于衍射极限的中间点发出荧光；通过探测器探测上述中间点所发出的荧光。

本发明提供一种基于径向偏振光束的超分辨受激发射损耗显微成像装置，包括：对发出激发光束的第一激光器发出的激光束进行准直并获得第一平行光束的第一准直装置；将所述激发用平行光束转换为激发用径向偏振光的第一偏振转换器；调制所述激发用径向偏振光的第一光瞳滤波器；对发出抑制光束的第二激光器发出的激光束进行准直并获得第二平行光束的第二准直装置；将所述第二平行光束转换为切向偏振光的第二偏振转换器；调制所述切向偏振光束的第二光瞳滤波器；透镜，将调制后的径向偏振光聚焦在焦平面的样品上并得到聚焦实心光斑，以及将调制后的切向偏振光束聚焦在焦平面的样品上并得到聚焦中空光斑，该聚焦中空光斑与上述聚焦实心光斑中心重叠，使得只有中间位置处、尺寸小于衍射极限的中间点发出荧光；探测上述中间点所激发的荧光的探测器。

附图说明

图1(a)是柱矢量光束横截面上的偏振分布特性，图1(b)是径向偏振光束横截面上的偏振分布特性，图1(c)是切向偏振光束横截面上的偏振分布特性。

图2(a)是STED显微成像系统的结构示意图，图2(b)是差动共焦检测系统的结构示意图，图2(c)是实现柱矢量光束偏振旋转的偏振转换装置的示意图。

图3是圆环形结构的光瞳滤波器示意图。

图4(a)-图4(d)是一种滤波函数下获得的径向偏振光束聚焦场在焦平面上（图4(a)）及沿着x轴（图4(b)）的强度分布，以及切向偏振光束聚焦场在焦平面上（图4(c)）及沿着x轴（图4(d)）的强度分布。

图5(a)-图5(d)是在另一种滤波函数所获得的径向偏振光束聚焦场在焦平面上（图5(a)）及沿着x轴（图5(b)）的强度分布，以及切向偏振光束聚焦场在焦平面上（图5(c)）及沿着x轴（图5(d)）的强度分布。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

柱矢量光束因其独特的偏振分布而表现出很多独特的聚焦特性，如径向偏振光在高数值孔径聚焦的情况下可以获得超小聚焦光斑，而切向偏振光则可以获得超小的空心聚焦光斑。如果对柱矢量光束进行相位及振幅调制，还可以获得一些独特的聚焦场分布。

如图1(a)所示，柱矢量光束是一种在光束横截面上偏振态关于光束传播轴具有柱对称特性的偏振光束。柱矢量光束在光束横截面上的局部，光束的偏振态都为线偏振，但其偏振方向则呈空间变化。当光束的初始偏振方位角φ0分别为0和π/2时，则得到两种典型的柱矢量光束，即径向偏振光束（见图1(b)）和切向偏振光束（见图1(c)）。将柱矢量光束应用于STED显微成像技术中，可以进一步提高系统的成像性能，获得更高的分辨率。

建立STED显微成像系统，如图2(a)上部所示，激光器1发出一连续或脉冲激光束，用作激发激光光束。该光束经过显微物镜和针孔组成的针孔滤波器2消除了杂散光，被透镜3准直获得一平行光束。该平行光束经过偏振片4获得一竖直偏振的线偏振光，该线偏振光被偏振转换器5转换为径向偏振光。所获得的径向偏振光进一步被光瞳滤波器7调制，得到合适的振幅和相位分布，然后被二向色分束镜8反射，并经过透镜9聚焦在焦平面10上，得到一聚焦实心光斑。

在另一路，如图2(a)下部所示，激光器1′发出一连续或脉冲激光束，用于受激发射损耗光束。该激光束经过透镜和针孔组成的针孔滤波器2′、准直透镜3′后获得一强度较为均匀的准直光束，该光束经过偏振片4′获得一竖直偏振的线偏振光，该线偏振光被偏振转换器5′转换为切向偏振光，所获得的切向偏振光进一步被光瞳滤波器7′调制，得到合适的振幅和相位分布，该光束进一步被二向色分束镜8′反射并被透镜9聚焦在焦平面10上，得到一聚焦中空光斑，用作受激发射损耗光斑。

该聚焦中空光斑与上述聚焦实心光斑重叠，聚焦实心光斑所激发的样品上的荧光基团发出荧光，而聚焦中空光斑抑制了该荧光基团外围所发出的荧光，这样就只有中间一个小于衍射极限的点发光并被观察到。激发的荧光经过滤光片11滤波后被透镜12聚焦，该聚焦光斑被APD探测器14探测。

可在探测器前放置一探测针孔，利用共聚焦成像原理提高荧光信号探测的分辨率。也可在此基础上，引入差动共焦检测系统，提高信号轴向探测的灵敏度和分辨率，如图2(b)所示。

可选的，在图2(a)所示系统的偏振转换器5和5′后面，放置如图2(c)所示的偏振转换装置，可获得任意初始偏振方位角的柱矢量光束，即可在径向偏振光和切向偏振光之间来回转换。该偏振转换装置由两个级联的1/2波片实现，两波片的快轴夹角为

系统的Jones矩阵为，

即，该偏振转换装置产生的偏振旋转与入射光的偏振态分布无关，无论入射光是何种形式的偏振光，该系统都将光束不同位置处的偏振方向旋转

角。通过调整快轴夹角

可灵活实现任意角度的偏振旋转。

在以上所述的STED系统中，激发光、STED光以及荧光物质都有非常苛刻的要求，三者的相关能级一定要吻合。激发光的波长低于STED光的波长，而且通常需要采用超连续、高能量的激发激光和STED光，激发脉冲宽度一般在几十皮秒，STED光一般在200ps左右，脉冲重复间隔要小于1MHz，具体要求则根据不同的实验要求设定。偏振转换器1和2可采用瑞士Arcoptix公司的径向偏振转换器，见网页ttp://www.arcoptix.com/radial_polarization_converter.htm，该器件可在较宽波段内将线偏振光转换为径向偏振光或切向偏振光。光瞳滤波器7和7′是一类可对入射光束的振幅和相位进行调制的衍射光学元件。所用的聚焦透镜8是一种高数值孔径的消复色差透镜，例如奥林巴斯公司生产的APON60xO TIRF油浸物镜，数值孔径为1.49，其中油的折射率为1.518。

根据矢量衍射理论，柱矢量光束经过高数值孔径物镜聚焦后在焦平面附近某一点S(rS,φS,zS)的聚焦场满足如下关系，

$\stackrel{\→}{E}(r_S,{\mathrm{\φ}}_S,z_S)=\left[\begin{array}{c}{E}_r^{\left(S\right)}\\ E_{\mathrm{\φ}}^{\left(S\right)}\\ E_z^{\left(S\right)}\end{array}\right]=-2A\underset{0}{\overset{\mathrm{\α}}{\∫}}P\left(\mathrm{\θ}\right)A\left(\mathrm{\θ}\right)T\left(\mathrm{\θ}\right)\sin \mathrm{\θexp}\left({\mathrm{ikz}}_S\cos \mathrm{\θ}\right)\left[\begin{array}{c}\cos {\mathrm{\φ}}_0\cos \mathrm{\θ}{J}_1\left({\mathrm{kr}}_s\sin \mathrm{\θ}\right)\\ \sin {\mathrm{\φ}}_0{J}_1\left({\mathrm{kr}}_s\sin \mathrm{\θ}\right)\\ i\cos {\mathrm{\φ}}_0\sin \mathrm{\θ}{J}_0\left({\mathrm{kr}}_s\sin \mathrm{\θ}\right)\end{array}\right]\mathrm{d\θ}---\left(2\right)$

其中，

分别是在柱坐标系中沿径向、切向和轴向的三个正交聚焦场分量；A是一常数分量，表征入射光束的平均振幅；θ是某一聚焦光束的会聚角，即会聚光束波矢与光轴的夹角，其中最大的会聚角α与透镜数值孔径的关系为

其中n为聚焦光束所在空间的媒质折射率；P(θ)为入射光束的光瞳函数，表征入射光束的相对振幅及相位分布；A(θ)透镜切趾函数，与透镜类型有关，例如当透镜满足正弦条件时，A(θ)=cos^1/2θ，当透镜满足赫姆霍斯条件时，A(θ)=cos^-3/2θ；T(θ)为光瞳滤波函数，表征了光瞳滤波器对光束的振幅及相位调制；φ₀为柱矢量光束的初始偏振方位角，很显然，当φ₀=0时公式对应径向偏振光聚焦场的情况，φ₀=π/2对应切向偏振光聚焦场的情况；J₀和J₁分别是级数为0和1的第一类贝塞尔函数。特别说明的是，柱矢量光束聚焦场的强度分布与入射柱矢量光束的光瞳函数、聚焦透镜的切趾函数以及滤波器的滤波函数都有密切关系，不同的聚焦条件对应不同的聚焦场分布，这里不再赘述。

假设激发光束的波长为λ1，经过偏振转换器后得到一种径向偏振光，光束的光瞳函数为贝塞尔-高斯函数，

$P\left(\mathrm{\θ}\right)=\exp [-{\mathrm{\β}}^2{\left(\frac{\sin \mathrm{\θ}}{\sin \mathrm{\α}}\right)}^2]J_1\left(2\mathrm{\β}\frac{\sin \mathrm{\θ}}{\sin \mathrm{\α}}\right)---\left(3\right)$

这里选定β=1.0。

假定光瞳滤波器是一种如图3所示的圆环形结构，其滤波函数为，

其中，a_j和

分别对应第j个环带振幅透过率的振幅及相位值。

这里选用圆环状结构的光瞳滤波器，并且设计成通过该光瞳滤波器，对光束振幅及相位的调制只发生在半径方向，沿着圆周方向不做调制，而且相位只引起0或π的变化，振幅调制因子也只选择0、1或-1的情况，同时确定一个环数，然后进行优化。由于保持了光束的圆对称特性，这种结构在设计上更为简单一些。在此基础上，同时采用全局寻优的方法进行了搜索计算，设计出最优的光瞳滤波器的结构。

例如，选用一种简单的光瞳滤波器，其滤波函数为，

$T\left(\mathrm{\θ}\right)\left\{\begin{array}{cc}0& 0\≤\mathrm{\θ}\≤{\mathrm{\α}}_0\\ 1& {\mathrm{\α}}_0\≤\mathrm{\θ}\≤\mathrm{\α}\end{array}\right.---\left(5\right)$

同时假设选用的聚焦物镜8满足正弦条件，为一种高数值孔径油浸物镜，透镜的数值孔径为1.49，并假定α₀=0.95α。则根据以上条件计算得到的聚焦光斑强度分布如图4(a)和图4(b)所示。在此情况下，聚焦光斑是一实心光斑，光斑半高全宽度为0.46λ1，低于衍射极限。

类似地，STED激光器发出的激光束波长为λ2，经过偏振转换器得到一种切向偏振光，采用与激发光束相同的光瞳函数、滤波函数及聚焦透镜，得到的聚焦光斑强度分布如图4(c)和图4(d)所示。此时，聚焦光斑为一空心光斑，空心光斑的半高全宽度为0.34λ2，低于衍射极限尺寸。

将这两个聚焦光斑中心重叠在一起，通过合理的时序控制，激发的荧光光斑具有超分辨尺寸，利用后续的光电系统探测可获得超分辨的显微图像。

除了以上给出的光瞳滤波器，选用其他光瞳滤波器对生成的径向偏振光束和切向偏振光束的振幅及相位进行调控，可进一步调控聚焦场的强度分布。

假设另一种光瞳滤波器的滤波函数为，

$T\left(\mathrm{\θ}\right)=\left\{\begin{array}{cc}1& \mathrm{\θ}\∈\left[\mathrm{0,0.08}\mathrm{\α}\right]\∪[0.63\mathrm{\α},0.64\mathrm{\α}]\∪[0.83\mathrm{\α},\mathrm{\α}]\\ 0& \mathrm{\θ}\∈[0.08\mathrm{\α},0.63\mathrm{\α}]\∪[0.65\mathrm{\α},0.80\mathrm{\α}]\\ -1& \mathrm{\θ}\∈[0.64\mathrm{\α},0.65\mathrm{\α}]\∪[0.80\mathrm{\α},0.83\mathrm{\α}]\end{array}\right.---\left(6\right)$

该滤波器是一种复数滤波器。利用该滤波器对生成的径向偏振光束（激发光束）和切向偏振光束（STED光束）进行振幅和相位调控，其它条件与图4相同，则得到的聚焦场强度分布如图5(a)-图5(d)所示。对于径向偏振光，其聚焦光斑为一实心光斑，光斑半高全宽度为0.42λ1，突破了衍射极限。而对于切向偏振光，其聚焦光斑为一空心光斑，光斑半高全宽度为0.32λ2。

与图4所示的采用简单振幅型光瞳滤波器的情况相比，采用更复杂的复数滤波器获得了更小的激发光斑和抑制光斑大小，也进一步提高了STED显微成像的分辨率。

通过进一步优化光瞳滤波函数，选择特殊设计的聚焦透镜，例如抛物面透镜或菲涅耳透镜等，可以进一步降低激发光斑和抑制光斑的尺寸，从而进一步提高STED显微成像的分辨率。

另外，将STED显微成像技术和4Pi共焦显微成像技术相结合，建立4Pi-STED显微系统，同时结合柱矢量光束独特的聚焦特性，有望进一步提高STED的成像分辨率。

以上已对本发明实施例进行描述。然而，本领域技术人员将理解，在不背离由权利要求所确定的本发明的真实范围和精神的情况下，可对这些实施例进行更改和变型。

Claims (4)

1.一种基于柱矢量光束的超分辨受激发射损耗显微成像方法，包括如下步骤：

对发出激发光束的第一激光器发出的激光束进行准直，获得第一平行光束；

通过第一偏振转换器将所述第一平行光束转换为径向偏振光；

通过第一光瞳滤波器调制所述径向偏振光，并通过透镜将调制后的第一径向偏振光聚焦在焦平面的样品上，得到聚焦实心光斑；

对发出抑制光束的第二激光器发出的激光束进行准直，获得第二平行光束；

通过第二偏振转换器将所述第二平行光束转换为切向偏振光；

通过第二光瞳滤波器调制所述切向偏振光束，并通过所述透镜将调制后的切向偏振光束聚焦在所述焦平面的样品上，得到聚焦中空光斑，该聚焦中空光斑与上述聚焦实心光斑中心重叠，使得只有中间位置处、尺寸小于衍射极限的中间点发出荧光；

通过探测器探测上述中间点所发出的荧光。

2.如权利要求1所述的超分辨受激发射损耗显微成像方法，其中所述光瞳滤波器是可对入射光束的振幅和相位进行调制的衍射光学元件，采用圆环形结构，其滤波函数为，

其中，a_j和

分别对应第j个环带振幅透过率的振幅及相位值。

3.一种基于径向偏振光束的超分辨受激发射损耗显微成像装置，包括：

对发出激发光束的第一激光器发出的激光束进行准直并获得第一平行光束的第一准直装置；

将所述激发用平行光束转换为激发用径向偏振光的第一偏振转换器；

调制所述激发用径向偏振光的第一光瞳滤波器；

对发出抑制光束的第二激光器发出的激光束进行准直并获得第二平行光束的第二准直装置；

将所述第二平行光束转换为切向偏振光的第二偏振转换器；

调制所述切向偏振光束的第二光瞳滤波器；

透镜，将调制后的径向偏振光聚焦在焦平面的样品上并得到聚焦实心光斑，以及将调制后的切向偏振光束聚焦在焦平面的样品上并得到聚焦中空光斑，该聚焦中空光斑与上述聚焦实心光斑中心重叠，使得只有中间位置处、尺寸小于衍射极限的中间点发出荧光；

探测上述中间点所激发的荧光的探测器。

4.如权利要求3所述的超分辨受激发射损耗显微成像方法，其中所述第一和第二光瞳滤波器是可对入射光束的振幅和相位进行调制的衍射光学元件，采用圆环形结构，其滤波函数为，

其中，a_j和

分别对应第j个环带振幅透过率的振幅及相位值。

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