CN116067935A - 一种单光束光路的超分辨成像方法与装置 - Google Patents

一种单光束光路的超分辨成像方法与装置 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种单光束光路的超分辨成像方法与装置，所述方法包括：采用合束器将不同光路的激发激光和损耗激光进行合束，得到合束激光；对所述合束激光进行光束准直，得到准直后的合束激光；将所述准直后的合束激光转换为圆偏振激光；采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，得到整形后的激光光束；将所述整形后的激光光束聚焦在样品上得到发出荧光信号的荧光光斑；其中，所述荧光光斑为损耗光斑与激发光斑叠合在样品上产生的光斑；探测所述荧光光斑的荧光信号，并进行成像处理。本申请通过单根光纤传输合束后的激发激光和耗损激光，通过采用多个玻片拼合的分段相位板进行整形，减少了超分辨成像过程中元件的数量，降低了成本，提高了超分辨成像过程的稳定性。

Description

一种单光束光路的超分辨成像方法与装置
技术领域
本申请涉及显微成像技术领域，具体涉及一种单光束光路的超分辨成像方法与装置。
背景技术
激光共聚焦显微镜是高度集成化的光学显微镜，在生物科学的形态学研究中具有极重要的地位。其基本原理是以激光作为光源，采用共轭聚焦技术消除焦点以外杂散光的干扰，极大的提高了分辨率。但受到衍射极限的限制，共聚焦显微镜的分辨率一般难以超越所用波长的一半，为了突破衍射极限的限制，近年来也出现了多种超分辨显微成像技术，受激发射损耗(Stimulated Emission Depletion，STED)超分辨显微成像技术便是其中的典型代表之一。
STED超分辨显微成像技术是能够直接克服光学衍射极限的技术，该方法能够实现几十纳米的分辨率，扫描成像速度和共聚焦显微镜相同。然而，STED显微成像需要激发激光和损耗激光进行精准的合束，两束激光在物镜聚焦后能够在样品上精准的重合，但是由于受到环境震动、温度变化、显微镜元件机械应力等影响，成像使用中会发生激发激光和损耗激光光斑漂移不再重合的情况，使损耗光斑不能完全覆盖激发光斑，不能缩小激发光斑范围，从而不能实现超分辨成像。
发明内容
本申请提供一种单光束光路的超分辨成像方法与装置，以解决现有技术中激发激光光束和损耗激光光束在显微成像系统容易引起光斑漂移的问题，提高STED超分辨显微成像的稳定性。
第一方面，本申请提供一种单光束光路的超分辨成像方法，所述方法包括：
采用合束器将不同光路的激发激光和损耗激光进行合束，得到合束激光；
对所述合束激光进行光束准直，得到准直后的合束激光；
将所述准直后的合束激光转换为圆偏振激光，并经转向单元转向至扫描单元进行二维扫描；
采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，得到整形后的激光光束；其中，所述分段相位板为将多个玻片拼合形成的；
将所述整形后的激光光束聚焦在样品上得到发出荧光信号的荧光光斑；其中，所述荧光光斑为损耗光斑与激发光斑叠合在样品上产生的光斑，且所述荧光光斑的面积小于所述激发光斑；
探测所述荧光光斑的荧光信号，并进行成像处理。
根据本申请提供的一种单光束光路的超分辨成像方法，所述采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，包括：采用两片分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理，具体包括：利用第一分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理，得到损耗激光光束和激发激光光束；其中，所述损耗激光光束为环形光束，所述激发激光光束为高斯光束；利用第二分段相位板的旋转角度调节所述损耗激光光束的空间分布；其中，所述第二分段相位板与所述第一分段相位板相互平行且中心轴线相同。
根据本申请提供的一种单光束光路的超分辨成像方法，所述损耗光斑的形状和面积由所述损耗激光光束的空间分布决定；所述损耗激光光束的空间分布还通过所述分段相位板的参数进行调节，所述分段相位板的参数包括相位差、玻片块数。
根据本申请提供的一种单光束光路的超分辨成像方法，所述采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，还包括：采用第三分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理；其中，所述第三分段相位板通过旋转装置进行更换，所述旋转装置连接有至少一个分段相位板。
根据本申请提供的一种单光束光路的超分辨成像方法，所述对所述合束激光进行光束准直，得到准直后的合束激光，包括：采用单根光纤和准直镜对所述合束激光进行光束准直，得到准直后的合束激光；其中，所述单根光纤为保偏光纤。
根据本申请提供的一种单光束光路的超分辨成像方法，所述将所述准直后的合束激光转换为圆偏振激光，包括：采用四分之一波片将所述准直后的合束激光转换为圆偏振激光。
根据本申请提供的一种单光束光路的超分辨成像方法，在采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理之前，所述方法还包括：在所述分段相位板后方增加二分之一波片；采用所述分段相位板和二分之一波片对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，得到整形后的三维激光光束；将所述整形后的三维激光光束聚焦在样品上得到发出荧光信号的三维荧光光斑，所述三维荧光光斑为三维损耗光斑与三维激发光斑叠合在样品上产生的光斑；探测所述三维荧光光斑的荧光信号，并进行成像处理。
第二方面，本申请还提供一种单光束光路的超分辨成像装置，所述装置包括：
光源单元，用于采用合束器将不同光路的激发激光和损耗激光进行合束，得到合束激光；
传输单元，用于对所述合束激光进行光束准直，得到准直后的合束激光；
偏振单元，用于将所述准直后的合束激光转换为圆偏振激光，并经转向单元转向至扫描单元进行二维扫描；
相位调节单元，用于采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，得到整形后的激光光束；其中，所述分段相位板为将多个玻片拼合形成的；
成像单元，用于将所述整形后的激光光束聚焦在样品上得到发出荧光信号的荧光光斑；其中，所述荧光光斑为损耗光斑与激发光斑叠合在样品上产生的光斑，且所述荧光光斑的面积小于所述激发光斑；
探测器，用于探测所述荧光光斑的荧光信号，并进行成像处理。
根据本申请提供的一种单光束光路的超分辨成像装置，所述相位调节单元包括两片相互平行且中心轴线相同的分段相位板，具体用于采用两片分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理，具体包括：利用第一分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理，得到损耗激光光束和激发激光光束；其中，所述损耗激光光束为环形光束，所述激发激光光束为高斯光束；利用第二分段相位板的旋转角度调节所述损耗激光光束的空间分布；其中，所述第二分段相位板与所述第一分段相位板相互平行且中心轴线相同。
根据本申请提供的一种单光束光路的超分辨成像装置，所述相位调节单元还包括第三分段相位板，具体用于采用第三分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理；其中，所述第三分段相位板通过旋转装置进行更换，所述旋转装置连接有至少一个分段相位板。
综上所述，本申请实施例提供的一种单光束光路的超分辨成像方法与装置，利用单个合束器先将不同光路的激光合束，并采用单根光纤传输合束后的激发激光和耗损激光，再采用多个玻片拼合的分段相位板进行整形处理，使得超分辨成像过程中转向、扫描、整形均是对合束后的处于单光束光路下的一路光束同时进行处理。一方面，减少了超分辨成像过程中元件的数量，降低了成本；另一方面，由于温度变化、机械应力等对一路的激光光束影响是一致的，使得本申请提供的超分辨成像方法与装置不会产生光束的偏移，提高了超分辨成像过程的稳定性。此外，所述分段相位板采用多个玻片拼合的方式，结构简单，易于加工和复制，加工成本低，适合推广应用。通过设置两片旋转角度不同的分段相位板实现对损耗激光光束的空间分布的调节，或者，通过旋转装置转换不同的分段相位板，实现对损耗激光光束的空间分布的调节，进而改变超分辨成像的分辨率。
附图说明
为了更清楚地说明本申请或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请提供的一种单光束光路的超分辨成像方法的流程示意图；
图2a是本申请提供的一种分段相位板的结构示意图；
图2b是本申请提供的一种采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理的方法的结构示意图；
图2c是本申请提供的另一种采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理的方法的结构示意图；
图3是本申请提供的一种损耗光斑、激发光斑和荧光光斑的关系示意图；
图4是本申请提供的一种单光束光路的超分辨成像装置的结构示意图。
图标：210-第一分段相位板；220-第二分段相位板；230-第三分段相位板；240-旋转装置；250-转轴；260-分段相位板的底座；410-光源单元；4101-激发激光器；4102-损耗激光器；4103-合束器；420-传输单元；4201-保偏光纤；4202-准直镜；430-偏振单元；440-转向单元；450-扫描单元；460-相位调节单元；470-成像单元；480-探测器；490-样品。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请中的附图，对本申请中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
图1是本申请提供的一种单光束光路的超分辨成像方法的流程示意图。参照图1，所述方法包括：
S10，采用合束器将不同光路的激发激光和损耗激光进行合束，得到合束激光；
其中，所述激发激光用于激发样品上的荧光染料发出荧光信号，所述损耗激光用于抑制样品上的荧光染料不发出荧光信号；所述合束器用于将所述激发激光和损耗激光进行合束；在一些实施例中，所述合束器可以是二向色镜。
S11，对所述合束激光进行光束准直，得到准直后的合束激光。
具体地，采用单根光纤和准直镜对所述合束激光进行光束准直，得到准直后的合束激光；其中，所述单根光纤为保偏光纤。该方法形成的激发激光和损耗激光具有较好的重合度，而且不容易受到机械应力和温度变化影响而引起光斑漂移情况。
S12，将所述准直后的合束激光转换为圆偏振激光，并经转向单元转向至扫描单元进行二维扫描。
具体地，采用四分之一波片将所述准直后的合束激光转换为圆偏振激光，并经转向单元转向至扫描单元进行二维扫描。
S13，采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，得到整形后的激光光束。
其中，所述分段相位板为将多个玻片拼合形成的，所述整形后的激光光束包括损耗激光光束和激发激光光束。在一些实施例中，所述多个玻片拼合的方式可以采用胶粘的方式，本申请对此不做特殊限定。
图2a是本申请提供的一种分段相位板的结构示意图。参照图2a，所述分段相位板为将四块玻璃片拼合形成的，每一块的快轴为45度。在一些实施例中，所述分段相位板的块数还可以是四块、六块，甚至可以是更多块玻璃片拼合形成的；所述分段相位板的厚度对于所述激发激光为3个波长厚度，对于所述耗损激光为2.5个波长厚度。
采用图2a所示的分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理时，由于对所述激发激光的改变是相同的，并不会改变激发激光光束空间分布的整体形状，故所述激发激光光束仍为高斯光束；由于对所述耗损激光的改变是不同的，具体地，所述耗损激光光束被所述分段相位板分为四部分，相对的两部分光相位相差为180度，两束光在圆心位置相干抵消，形成空心的环形光束。
进一步地，所述采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，包括：采用两片分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理，具体包括：
步骤a1，利用第一分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理，得到损耗激光光束和激发激光光束；其中，所述损耗激光光束为环形光束，所述激发激光光束为高斯光束；
步骤a2，利用第二分段相位板的旋转角度调节所述损耗激光光束的空间分布；其中，所述第二分段相位板与所述第一分段相位板相互平行且中心轴线相同。
进一步地，所述采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，还包括：采用第三分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理；其中，所述第三分段相位板通过旋转装置进行更换，所述旋转装置连接有至少一个分段相位板。
图2b和图2c是本申请提供的采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理的方法的结构示意图。图2b和图2c中的虚线箭头表示单光束光路的传输方向。
参照图2b，采用第一分段相位板210和第二分段相位板220对所述圆偏振激光进行整形处理，所述第一分段相位板210和所述第二分段相位板220相互平行且中心轴线相同，第二分段相位板220相对于第一分段相位板210旋转了45度。其中，所述第一分段相位板210和所述第二分段相位板220可以采用图2a所示的四块玻片拼合形成的分段相位板，也可以采用玻片块数不同的其他分段相位板，在整形处理过程中，通过旋转第二分段相位板220的旋转角度调节所述损耗激光光束的空间分布，以改变样品上的荧光发光区域，从而实现光学分辨率的调节。
参照图2c，采用第三分段相位板230对所述圆偏振激光进行整形处理。其中，所述第三分段相位板230可以采用图2a所示的四块玻片拼合形成的分段相位板，也可以采用玻片块数不同的其他分段相位板。例如，图2c中的所述旋转装置240连接有三个转轴，每个转轴250与分段相位板的底座260相连接，所述分段相位板的底座260用于放置第三分段相位板230。在一些实施例中，所述旋转装置240内设有电机，可通过电机驱动各转轴旋转，以使第三分段相位板230的中心与单光束光路的中心轴线重合；所述分段相位板的底座260可以是固定大小，也可以设置为具有收缩功能的卡座，以便于放置不同尺寸的分段相位板。所述旋转装置240连接的分段相位板可以采用应用较多的几片分段相位板，也可以根据实际工作场景需求更换满足相应需求的分段相位板，利用此方法的旋转装置实现超分辨成像，相对于结构复杂且价格昂贵的空间光调制器，结构简单且易于实现，制作成本也相对较低，相对于采用固定的单片分段相位板，可以选择应用较多的几片分段相位板放置在所述旋转装置，以使得所述超分辨成像方法能够通过旋转装置更换分段相位板去调整成像的光学分辨率，以适用于更多场景的超分辨成像。
S14，将所述整形后的激光光束聚焦在样品上得到发出荧光信号的荧光光斑。
其中，所述荧光光斑为损耗光斑与激发光斑叠合在样品上产生的光斑，且所述荧光光斑的面积小于所述激发光斑。
具体地，可以理解的是，所述损耗光斑为将所述损耗激光光束聚焦在样品上形成的光斑，即抑制样品上的荧光染料不发出荧光信号所形成的光斑；所述激发光斑将所述激发激光光束聚焦在样品上形成的光斑，即激发样品上的荧光染料发出荧光信号所形成的光斑；所述荧光光斑为将所述损耗光斑与激发光斑叠合后，样品的荧光染料最终能发出荧光信号的光斑，且所述荧光光斑的面积小于所述激发光斑。
图3是本申请提供的损耗光斑、激发光斑和荧光光斑的关系示意图。参照图3，为样品在二维平面（XY平面）上的光斑示意图，第一个环形光斑为所述损耗光斑，第二个实心圆形光斑为所述激发光斑，将所述损耗光斑与所述激发光斑叠合在样品上得到第三个实心圆形光斑，即为样品的荧光染料最终能发出荧光信号的光斑——荧光光斑。将损耗激光和激发激光同时聚焦在样品上时，样品发出荧光的区域相对单独采用激发激光激发样品发出荧光的区域更小，进而提高了二维平面的光学分辨率。
具体地，还可以理解的是，所述损耗光斑的形状和面积由所述损耗激光光束的空间分布决定，例如，若所述损耗激光为环形光束，则所述损耗光斑为环形光斑；所述损耗激光光束的空间分布还通过所述分段相位板的参数进行调节，所述分段相位板的参数包括相位差、玻片块数。参照图2b，根据所述第一分段相位板210的参数可初步确定所述损耗激光光束的空间分布，利用第二分段相位板220的旋转角度可以进一步调节所述损耗激光光束的空间分布。
值得注意的是，光束的空间分布包括光束在空间的分布形状、分散角度等；所述分段相位板的参数还包括相位板厚度，不同的相位差、玻片块数和相位板厚度，可以使激光光束在空间中呈现为多种不同空间分布的光束，例如，不同内径尺寸的环形光束、不同半径的圆形光束、不同边长的方形光束等。
S15，探测所述荧光光斑的荧光信号，并进行成像处理。
具体地，对所述荧光光斑的荧光信号进行探测，并按照扫描的轨迹进行成像处理，得到样品的超分辨图像；其中，所述超分辨图像可以是二维的，也可以是三维的。
在一些实施例中，为了获得样品的三维超分辨图像，在上述方法的步骤S14增加二分之一波片进行三维成像，所述单光束光路的超分辨成像方法还包括：
步骤b1，在所述分段相位板后方增加二分之一波片；
步骤b2，采用所述分段相位板和二分之一波片对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，得到整形后的三维激光光束；
步骤b3，将所述整形后的三维激光光束聚焦在样品上，得到发出荧光信号的三维荧光光斑，所述三维荧光光斑为三维损耗光斑与三维激发光斑叠合在样品上产生的光斑；
步骤b4，探测所述三维荧光光斑的荧光信号，并进行成像处理。
本申请实施例提供的一种单光束光路的超分辨成像方法，利用单个合束器先将不同光路的激光合束，再经单根光纤和准直镜传输后形成的激发激光和损耗激光具有较好的重合度，而且不容易受到机械应力和温度变化影像而引起光斑漂移情况。相对于常规的超分辨成像方法，通过先合束再进行整形处理，使得超分辨成像过程中转向、扫描、整形均是对合束后的处于单光束光路下的一路光束同时进行处理。一方面，减少了超分辨成像过程中元件的数量，降低了成本；另一方面，由于温度变化、机械应力等对一路的激光光束影响是一致的，使得本申请提供的超分辨成像方法不会产生光束的偏移，提高了超分辨成像过程的稳定性。此外，所述分段相位板采用多个玻片拼合的方式，结构简单，易于加工和复制，加工成本低，适合推广应用。通过设置两片旋转角度不同的分段相位板实现对损耗激光光束的空间分布的调节，或者，通过旋转装置转换不同的分段相位板，实现对损耗激光光束的空间分布的调节，进而改变超分辨成像的分辨率。
图4是本申请提供的一种单光束光路的超分辨成像装置的结构示意图，参照图4，所述装置包括：
光源单元410，用于采用合束器将不同光路的激发激光和损耗激光进行合束，得到合束激光；所述光源单元410由激发激光器4101、损耗激光器4102、合束器4103组成，所述激发激光器4101用于发射激发激光，所述损耗激光器4102用于发射损耗激光。
传输单元420，用于对所述合束激光进行光束准直，得到准直后的合束激光；所述传输单元420由保偏光纤4201、光纤前端的耦合透镜（图中未示出）、准直镜4202组成，经过此类传输单元传输的激发激光和损耗激光具有较好的重合度，而且不容易受到机械应力和温度变化影响而引起光斑漂移情况。
偏振单元430，用于将所述准直后的合束激光转换为圆偏振激光，并经转向单元440转向至扫描单元450进行二维扫描；
其中，所述偏振单元430为四分之一波片；所述转向单元440为双波段二向色镜，用于将所述偏振单元430的圆偏振光转向到扫描单元440进行二维扫描，还用于将样品490发出的荧光信号透射到探测器480；所述扫描单元450，用于对圆偏振激光进行二维扫描，在一些实施例中，所述扫描单元可以是二维振镜，也可以是微机电系统(Micro-Electro-Mechanical System, MEMS)扫描镜或者其他扫描装置，本申请对此不做特殊限定。
相位调节单元460，用于采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，得到整形后的激光光束。其中，所述分段相位板为将多个玻片拼合形成的。
在一些实施例中，所述相位调节单元包括两片相互平行且中心轴线相同的分段相位板，具体用于采用两片分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理，具体包括：利用第一分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理，得到损耗激光光束和激发激光光束；其中，所述损耗激光光束为环形光束，所述激发激光光束为高斯光束；利用第二分段相位板的旋转角度调节所述损耗激光光束的空间分布。
在另一些实施例中，所述相位调节单元包括第三分段相位板，具体用于采用第三分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理；其中，所述第三分段相位板通过旋转装置进行更换，所述旋转装置连接有至少一个分段相位板。
在上述多个实施例中的超分辨成像装置，至少具有如下优势：由于相位调节单元的分段相位板采用多个玻片拼合的方式，结构简单，易于加工和复制，加工成本低，适合推广应用；通过设置两片旋转角度不同的分段相位板或者通过旋转装置更换不同的分段相位板，实现对损耗激光光束的空间分布的调节，进而改变超分辨成像的分辨率。
成像单元470，用于将所述整形后的激光光束聚焦在样品490上得到发出荧光信号的荧光光斑；其中，所述荧光光斑为损耗光斑与激发光斑叠合在样品上产生的光斑，且所述荧光光斑的面积小于所述激发光斑；所述成像单元由筒镜、扫描镜、物镜组成。
探测器480，用于探测所述荧光光斑的荧光信号，并进行成像处理；所述探测器前端设有滤光片和/或遮光小孔，可以减少超分辨成像时背景光的影响。
具体地，所述探测器480光电倍增管或者雪崩光电二极管，用于探测、接收所述荧光光斑的荧光信号，并将所述荧光光斑的荧光信号转换为电信号，按照扫描的轨迹形成图像。
本申请实施例提供的一种单光束光路的超分辨成像装置，利用合束器得到单光束光路下的合束激光，再经传输单元传输后形成的激发激光和损耗激光具有较好的重合度，而且不容易受到机械应力和温度变化影像而引起光斑漂移情况；在探测器前端设有滤光片和/或遮光小孔，减少超分辨成像时背景光的影响；通过先合束再进行整形处理，使得超分辨成像过程中转向、扫描、整形均是对合束后的处于单光束光路下的一路光束同时进行处理。一方面，减少了超分辨成像装置中元件的数量，降低了成本；另一方面，由于温度变化、机械应力等对一路的激光光束影响是一致的，使得本申请提供的超分辨成像装置不会产生光束的偏移，提高了超分辨成像装置的稳定性。
上述一种单光束光路的超分辨成像装置的详细描述，请参见上述实施例中相关方法步骤的描述，重复之处不再赘述。
以上所描述的超分辨成像装置的实施例仅仅是示意性的，所述超分辨成像装置可以是超分辨成像的显微镜，也可以是其他可实现超分辨的成像设备，其中所使用的作为分离部件说明的“单元”可以是实现预定功能的软件和/或硬件的组合，可以是或者也可以不是物理上分开的。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性的劳动的情况下，即可以理解并实施。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的精神和范围都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种单光束光路的超分辨成像方法，其特征在于，所述方法包括：
采用合束器将不同光路的激发激光和损耗激光进行合束，得到合束激光；
对所述合束激光进行光束准直，得到准直后的合束激光；
将所述准直后的合束激光转换为圆偏振激光，并经转向单元转向至扫描单元进行二维扫描；
采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，得到整形后的激光光束；其中，所述分段相位板为将多个玻片拼合形成的；
将所述整形后的激光光束聚焦在样品上得到发出荧光信号的荧光光斑；其中，所述荧光光斑为损耗光斑与激发光斑叠合在样品上产生的光斑，且所述荧光光斑的面积小于所述激发光斑；
探测所述荧光光斑的荧光信号，并进行成像处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，包括：采用两片分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理，具体包括：
利用第一分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理，得到损耗激光光束和激发激光光束；其中，所述损耗激光光束为环形光束，所述激发激光光束为高斯光束；
利用第二分段相位板的旋转角度调节所述损耗激光光束的空间分布；其中，所述第二分段相位板与所述第一分段相位板相互平行且中心轴线相同。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述损耗光斑的形状和面积由所述损耗激光光束的空间分布决定；所述损耗激光光束的空间分布还通过所述分段相位板的参数进行调节，所述分段相位板的参数包括相位差、玻片块数。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，还包括：采用第三分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理；其中，所述第三分段相位板通过旋转装置进行更换，所述旋转装置连接有至少一个分段相位板。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对所述合束激光进行光束准直，得到准直后的合束激光，包括：采用单根光纤和准直镜对所述合束激光进行光束准直，得到准直后的合束激光；其中，所述单根光纤为保偏光纤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将所述准直后的合束激光转换为圆偏振激光，包括：采用四分之一波片将所述准直后的合束激光转换为圆偏振激光。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理之前，所述方法还包括：
在所述分段相位板后方增加二分之一波片；
采用所述分段相位板和二分之一波片对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，得到整形后的三维激光光束；
将所述整形后的三维激光光束聚焦在样品上得到发出荧光信号的三维荧光光斑，所述三维荧光光斑为三维损耗光斑与三维激发光斑叠合在样品上产生的光斑；
探测所述三维荧光光斑的荧光信号，并进行成像处理。
8.一种单光束光路的超分辨成像装置，其特征在于，所述装置包括：
光源单元，用于采用合束器将不同光路的激发激光和损耗激光进行合束，得到合束激光；
传输单元，用于对所述合束激光进行光束准直，得到准直后的合束激光；
偏振单元，用于将所述准直后的合束激光转换为圆偏振激光，并经转向单元转向至扫描单元进行二维扫描；
相位调节单元，用于采用分段相位板对经扫描的所述圆偏振激光进行整形处理，得到整形后的激光光束；其中，所述分段相位板为将多个玻片拼合形成的；
成像单元，用于将所述整形后的激光光束聚焦在样品上得到发出荧光信号的荧光光斑；其中，所述荧光光斑为损耗光斑与激发光斑叠合在样品上产生的光斑，且所述荧光光斑的面积小于所述激发光斑；
探测器，用于探测所述荧光光斑的荧光信号，并进行成像处理。
9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述相位调节单元包括两片相互平行且中心轴线相同的分段相位板，具体用于采用两片分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理，具体包括：
利用第一分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理，得到损耗激光光束和激发激光光束；其中，所述损耗激光光束为环形光束，所述激发激光光束为高斯光束；
利用第二分段相位板的旋转角度调节所述损耗激光光束的空间分布；其中，所述第二分段相位板与所述第一分段相位板相互平行且中心轴线相同。
10.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述相位调节单元还包括第三分段相位板，具体用于采用第三分段相位板对所述圆偏振激光进行整形处理；其中，所述第三分段相位板通过旋转装置进行更换，所述旋转装置连接有至少一个分段相位板。
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