CN111678902A - 三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及显微方法 - Google Patents

三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及显微方法 Download PDF

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Abstract

三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及显微方法，包括显微镜主体，照明模块，成像模块，三维纳米级样品锁定模块以及信号连接的控制及显示模块；成像过程中，三通道激光照明光同时照射在样品上，标记样品的三类的荧光染料同时发光闪烁，经过成像模块，分别成像在探测器的不同部分，探测器采集多带有荧光染料“闪烁”信号的原始图像，并传输到控制及显示模块中，控制及显示模块通过高斯拟合，找出每一张原始图像中每一个闪烁点的中心位置，将所有原始图像的闪烁点中心位置叠加在一起，得到三个通道的超高分辨率图像。本系统和方法解决了样品在三维空间中的漂移问题，可以将成像时间缩短两倍，确保实现三通道同时成像。

Description

三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及显微方法
技术领域
本发明涉及生物显微领域，尤其涉及三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及显微方法。
背景技术
自恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)于十八世纪七十年代提出光学成像分辨率极限的理论以来，人们一直在寻找各种各样的方法方式以求突破这一分辨率极限。目前，通过运用现代尖端技术，庄小威，埃里克·贝齐格(Eric Betzig)分别于2006年先后分别提出了随机光学重构显微技术(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM)和荧光定位显微技术(Photoactivation Laser Microscopy，PALM)，均实现了突破光学分辨率极限十倍的超分辨率成像。埃里克·贝齐格更是通过这一技术获得了2014年诺贝尔化学奖。目前荧光定位显微技术已经实现部分商业化，并且开始被用于基础生命科学，尤其是分子生物学以及生物化学的研究当中。通过这一技术，理论上来说研究人员可以以10到20纳米的横向分辨率和50纳米的纵向分辨率研究生物样品的细节结构。
但是使用这个原理应用到实际实验中时就产生了许多问题：
首先，样品漂移是一种普遍存在于超分辨率荧光定位显微镜的问题。这是指由于环境的不稳定，如气流、温度变化、噪音等等，会使样品在拍摄过程中发生几十至几百纳米的位移。尽管这一漂移现象普遍存在于显微系统中，由于一般显微镜的分辨率不足300纳米，且成像所需时间较短，漂移造成的现象并不明显。但是对于分辨率可达十几纳米的超分辨率显微镜而言，漂移会对成像造成严重的干扰。
现有技术解决样品XY漂移的方法为：使用算法矫正漂移，或向样品中加入荧光颗粒，并在成像中记录这些颗粒的位移，随后从所得超分辨率图像中将这一位移减去。使用算法矫正漂移的缺点是对结构不清晰的样品算法无法使用，且只能矫正样品的线性漂移，对非线性漂移无能为力；使用荧光颗粒进行漂移矫正的缺陷是制备麻烦，无法确定荧光颗粒是否已经固定在样品中，另外，由于光漂白，荧光颗粒的荧光会随成像时间衰减，因此漂移的修正精度也会随时间变差。
在纵向Z轴上，目前控制样品漂移的方法是用一束红外或紫外光通过反射干涉的方法求出位移，主动移动物镜补偿样品的位移，这种方法的缺陷是无法对深层细胞进行成像，且若样品辐射出红外或紫外光就会对锁定程序的运行造成影响。
其次，多通道超分辨率荧光显微镜的实现有困难，实现多通道若使用顺序成像的方法，就是多通道按照顺序，用不同波长的激光分别激发荧光染料进行成像，产生的问题是成像时间过长，效率低且样品漂移不好控制；超高成像激光强度强，在对一个通道成像时，对其他通道的错误激发会导致标记样品的荧光染料淬灭，导致标记不足影响成像质量；且不同通道之间会有一定程度的串扰，影响成像准确性。
最后，STORM及PALM成像要求荧光染料分子与成像缓冲液的成分组合进行配合，在较强激光的照射下可产生“闪烁”的效果，高质量的“闪烁”需要荧光分子在亮态的时间很短，但是放射出的光子数多，而不同的荧光染料分子可高质量“闪烁”时对缓冲液的成分要求是不同的，也就是说，越多通道的超分辨率成像，寻找荧光染料分子与成像缓冲液的成分配合就越困难。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及显微方法，以解决现有技术的不足，实现了高质量的三通道荧光定位超分辨率生物显微成像。
本发明是通过以下技术方案实现的：
三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于：
包括显微镜主体，照明模块，成像模块，三维纳米级样品锁定模块以及信号连接的控制及显示模块；
显微镜主体包括顺序布置的物镜，第二多色反射镜，前成像透镜和20:80反射镜；显微镜主体中的样品为采用三种不同激发波长的荧光染料三色标记过的生物样品；
照明模块的照明光路同步产生包含波长为561nm，647nm及750nm三通道激光照明光；三通道激光照明光通过第二多色反射镜反射，经过物镜照射到样品上，激发样品的荧光染料发出三种不同波段的混合荧光；
混合荧光通过第二多色反射镜及前成像透镜后，由20:80反射镜进行分配，其中20％分配到三维纳米级样品锁定模块中，80％分配到成像模块中；
成像模块包括沿成像光路顺序布置的矩形光阑，成像准直透镜，三组并列布置的双色反射镜、滤镜，以及后成像透镜，探测器，矩形光阑对到达成像模块的混合荧光进行成像范围调节，成像准直透镜将调节后混合荧光的转变为平行光，第一双色分光镜，第二双色分光镜及第三双色分光镜分别将混合荧光根据不同波段分配到三个不同的通道中，由每个通道里的滤镜滤除通道激发光后,剩下的单一波段荧光最终通过后成像透镜将三个通道的荧光分别成像在探测器芯片的不同位置上；
三维纳米级样品锁定模块包括明场光源，科勒照明光路，用于装载样品的压电陶瓷平台，锁定成像滤镜和锁定相机，明场光源通过科勒照明光路照射在样品上，通过显微镜主体和锁定成像滤镜后，20％的明场光在锁定相机上成像；
超分辨率成像过程中，561nm通道，647nm通道及750nm三通道激光照明光同时照射在样品上，当照明光强较强时，标记样品的三类的荧光染料同时发光闪烁，经过成像模块，分别成像在探测器的不同部分，探测器采集多带有荧光染料“闪烁”信号的原始图像，并传输到控制及显示模块中，控制及显示模块通过高斯拟合，找出每一张原始图像中每一个闪烁点的中心位置，并将所有原始图像的闪烁点中心位置叠加在一起，得到三个通道的超高分辨率图像。
进一步的，所述荧光染料，第一种为CF568或Cy3B荧光分子染料,第二种为Alexa647或Cy5荧光分子染料，第三种为Alexa750或Cy7荧光分子染料。通过不同波长的激光照射所述生物样品，分别产生与所述Alexa647或Cy5荧光分子染料对应的第一通道闪烁荧光信号，与所述Alexa750或Cy7荧光分子染料对应的第二通道闪烁荧光信号，与所述CF568或Cy3B荧光分子染料对应的第三通道闪烁荧光信号。
进一步的，所述照明模块的照明光路可采用如下的布置结构：包括沿照明光路顺序布置的反射镜，第一多色反射镜，激光混光解析透镜和照明透镜，以及布置在反射镜进光侧的第一激光激发器和第一准直透镜，布置在在第一多色反射镜进光侧的第二激光激发器和第二准直透镜；第二激光激发器激发561nm、647nm波长激光，第一激光激发器激发750波长激光，用于照明方式能够调节的三通道宽场及半全内反射照明、全内反射照明。
再进一步，所述反射镜和第一多色反射镜平行间隔布置，且镜面与激光混光解析透镜的主光轴成45°夹角；照明透镜和激光混光解析透镜的主光轴相互平行或重合；第一准直透镜和第二准直透镜的主光轴相互平行，且垂直于激光混光解析透镜的主光轴。
进一步的，所述照明模块还包括用于调节照明光方向的照明折射反射镜，照明折射反射镜布置在激光混光解析透镜和照明透镜之间，两片照明折射反射镜相对平行布置，且镜面与激光混光解析透镜和照明透镜的主光轴成45°夹角。
进一步的，所述矩形光阑、成像准直透镜、滤镜和后成像透镜的主光轴相互平行或重合，第一双色分光镜，第二双色分光镜及第三双色分光镜平行间隔布置，且镜面与滤镜的主光轴成45°夹角。
进一步的，所述成像模块还包括用于调节单一波段荧光方向的反射镜组，反射镜组布置在滤镜和后成像透镜之间。反射镜组包括成对平行相对布置的三对反射镜，分别对应第一双色分光镜，第二双色分光镜及第三双色分光镜设置，且反射镜组的镜面与双色反射镜的镜面相互平行。
进一步的，所述明场光源为455nm发光二极管。
三维纳米级样品锁定方法，其特征在于：
S1，明场光源产生蓝光，通过科勒照明光路为样品提供明场照明；
S2，物镜从样品处接受的光被20:80反射镜分配，其中20％的光经过前成像透镜成像于锁定相机；
S3，从锁定相机中抓取实时图像；
S4，实时计算出图象局域对比度，选取最优区域，以局域对比度之和最大的区域作为最优区域的位置；
S5，压电平台在纵向上焦面上下进行扫描，例如上下各1微米，在扫描时从锁定相机23中抓取标定图像序列，并记录相应z值；
S6，从标定图像序列最上端或最下端图像以最优区域位置截取固定大小的区域作为参照图像；
S7，对序列的图像与参照图像求空间相关性矩阵，并对相关性矩阵进行高斯拟合；
S8，求出拟合峰值与z值的单调递减对应关系并用多次函数近似拟合；
S9，从锁定相机中实时抓取样品的明场图像；
S10，对实时图像与参照图像求空间相关性矩阵并进行高斯拟合，求出中心位置作为x，y平面上的偏移量，并通过拟合极值求出实时的z值；
S11，驱动压电陶瓷平台补偿偏移；
S12，S5-S11循环至锁定结束。
三通道成像的通道间串扰消除方法，其特征在于：
S1，对每种荧光染料分别测量其在三个通道上的荧光成像，对每一个通道上的亮度取平均，就是该荧光燃料在各通道上的串扰的比例；
S2，由于荧光染料发出的光的量等于各通道接收的光的量的总和，对各通道上的串扰比例进行归一化，即为该荧光染料在各个通道上的分光比例；
S3，将每一单一荧光染料的串扰比例作为一个列向量，合并为一个矩阵，即为此荧光显微镜体系的串扰矩阵；
S4，取该矩阵的逆矩阵，即为去串扰矩阵；
S5，将各通道的图像排成列向量，再将去串扰矩阵作用于该列向量，得到去串扰图像，各通道的顺序应对应串扰矩阵各列的顺序。
本发明的有益效果在于：
1、采用三维纳米级锁定系统和方法，在超高图像拍摄过程中锁定样品位置，解决了样品在三维空间中的漂移问题，可以达到XY方向2nm，Z方向20nm的锁定精度，且锁定过程中可以对细胞深处进行成像。
2、采用三通道同时成像系统，并通过三通道成像的通道间串扰消除方法消除通道间串扰，可以将成像时间缩短两倍，解决了多通道荧光定位超分辨率生物显微成像时间过长，错误激发导致的荧光染料淬灭，并且三个通道之间没有串扰。
3、选择三种合适的荧光染料。本专利技术选择用561nm,657nm和750nm作为三通道的组合，以“具备闪烁性能”和“平衡三种荧光分子的光化学性能”为要求挑选了合适的荧光染料进行组合，使三通道染料都可以有平衡且高质量的“闪烁”性质，确保实现三通道同时成像，并实现三通道xy方向20nm，z方向50nm分辨率。
附图说明
图1为系统布置结构示意图
图2为拟合峰值与z值的单调递减对应关系图
图1中：1为物镜，2为第二多色反射镜，3为前成像透镜，4为20:80反射镜，5为反射镜，6为第一多色反射镜，7为激光混光解析透镜，8为照明折射反射镜，9为照明透镜，10为第一激光激发器，11为第一准直透镜，12为第二激光激发器，13为第二准直透镜，14为矩形光阑，15为成像准直透镜，16为第一双色分光镜，17为滤镜，18为第二双色分光镜及，19为第三双色分光镜，20为反射镜组，21为后成像透镜，22为探测器，23为锁定相机，24为锁定成像滤镜，25为控制及显示模块，26为明场光源，27为科勒照明光路，28为压电陶瓷平台。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明。
如图1所示的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，包括显微镜主体，照明模块，成像模块，三维纳米级样品锁定模块以及信号连接的控制及显示模块25。
显微镜主体包括顺序布置的物镜1，第二多色反射镜2，前成像透镜3和20:80反射镜4；显微镜主体中的样品为采用三种不同激发波长的荧光染料三色标记过的生物样品；三种荧光染料中，第一种为CF568或Cy3B荧光分子染料,第二种为Alexa 647或Cy5荧光分子染料，第三种为Alexa750或Cy7荧光分子染料。
照明模块包括沿照明光路顺序布置的反射镜5，第一多色反射镜6，激光混光解析透镜7，照明折射反射镜8和照明透镜9，以及布置在反射镜5进光侧的第一激光激发器10和第一准直透镜11，布置在在第一多色反射镜6进光侧的第二激光激发器12和第二准直透镜13。
其中，反射镜5、第一多色反射镜6和两片照明折射反射镜8平行间隔布置，且镜面与激光混光解析透镜7的主光轴成45°夹角；照明透镜9和激光混光解析透镜7的主光轴相互平行；第一准直透镜11和第二准直透镜13的主光轴相互平行且垂直于激光混光解析透镜7的主光轴。
第二激光激发器12激发561nm、647nm波长激光，第一激光激发器10激发750波长激光，用于照明方式能够调节的三通道宽场及半全内反射照明、全内反射照明
照明模块的照明光路同步产生包含波长为561nm，647nm及750nm三通道激光照明光；三通道激光照明光通过第二多色反射镜2反射，经过物镜1照射到样品上，激发样品的荧光染料发出三种不同波段的混合荧光。
混合荧光通过第二多色反射镜2及前成像透镜3后，由20:80反射镜4进行分配，其中20％分配到三维纳米级样品锁定模块中，80％分配到成像模块中。
成像模块包括沿成像光路顺序布置的矩形光阑14，成像准直透镜15，三组并列布置的双色反射镜16，18，19、滤镜17和反射镜组20，以及后成像透镜21，探测器22。
其中，矩形光阑14、成像准直透镜15、滤镜17和后成像透镜21的主光轴相互平行或重合，第一双色分光镜16，第二双色分光镜18及第三双色分光镜19平行间隔布置，且镜面与滤镜17的主光轴成45°夹角。反射镜组20包括成对平行相对布置的三对反射镜，分别对应第一双色分光镜16，第二双色分光镜18及第三双色分光镜19设置，且反射镜组20的镜面与双色反射镜16，18，19的镜面相互平行。
矩形光阑14对到达成像模块的混合荧光进行成像范围调节，成像准直透镜15将调节后混合荧光的转变为平行光，第一双色分光镜16，第二双色分光镜18及第三双色分光镜19分别将混合荧光根据不同波段分配到三个不同的通道中，由每个通道里的滤镜17滤除通道激发光后,再由反射镜组20将剩下的单一波段荧光调节方向，最终通过后成像透镜21将三个通道的荧光分别成像在探测器芯片的不同位置上。
三维纳米级样品锁定模块包括明场光源26，科勒照明光路27，用于装载样品的压电陶瓷平台28，锁定成像滤镜24和锁定相机23，明场光源26采用455nm发光二极管，通过科勒照明光路27照射在样品上，通过显微镜主体和锁定成像滤镜24后，20％的明场光在锁定相机23上成像；
超分辨率成像过程中，561nm通道，647nm通道及750nm三通道激光照明光同时照射在样品上，当照明光强较强时，标记样品的三类的荧光染料同时发光闪烁，经过成像模块，分别成像在探测器22的不同部分，探测器22采集几千到几万张带有荧光染料“闪烁”信号的原始图像，并传输到控制及显示模块25中，控制及显示模块25通过高斯拟合，找出每一张原始图像中每一个闪烁点的中心位置，并将所有原始图像的闪烁点中心位置叠加在一起，得到三个通道的超高分辨率图像。
三维纳米级样品锁定方法，按以下步骤进行样品在三维空间的位置锁定：
S1，明场光源26产生蓝光，通过科勒照明光路27为样品提供明场照明；
S2，物镜1从样品处接受的光被20:80反射镜4分配，其中20％的光经过前成像透镜3成像于锁定相机23；
S3，从锁定相机23中抓取实时图像；
S4，实时计算出图象局域对比度，选取最优区域，以局域对比度之和最大的区域作为最优区域的位置；
S5，压电平台在纵向上焦面上下进行扫描，例如上下各1微米，在扫描时从锁定相机23中抓取标定图像序列，并记录相应z值；
S6，从标定图像序列最上端或最下端图像以最优区域位置截取固定大小的区域作为参照图像；
S7，对序列的图像与参照图像求空间相关性矩阵，并对相关性矩阵进行高斯拟合；
S8，求出拟合峰值与z值的单调递减对应关系并用多次函数近似拟合，如图2所示；
S9，从锁定相机23中实时抓取样品的明场图像；
S10，对实时图像与参照图像求空间相关性矩阵并进行高斯拟合，求出中心位置作为x，y平面上的偏移量，并通过拟合极值求出实时的z值；
S11，驱动压电陶瓷平台28补偿偏移；
S12，S5-S11循环至锁定结束。
三通道成像时，通道间串扰消除按以下步骤进行：
S1，对每种荧光染料分别测量其在三个通道上的荧光成像，对每一个通道上的亮度取平均，就是该荧光燃料在各通道上的串扰的比例；
S2，由于荧光染料发出的光的量等于各通道接收的光的量的总和，对各通道上的串扰比例进行归一化，即为该荧光染料在各个通道上的分光比例；
S3，将每一单一荧光染料的串扰比例作为一个列向量，合并为一个矩阵，即为此荧光显微镜体系的串扰矩阵；
S4，取该矩阵的逆矩阵，即为去串扰矩阵；
S5，将各通道的图像排成列向量，再将去串扰矩阵作用于该列向量，得到去串扰图像，各通道的顺序应对应串扰矩阵各列的顺序。

Claims (10)

1.三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于：
包括显微镜主体，照明模块，成像模块，三维纳米级样品锁定模块以及信号连接的控制及显示模块(25)；
显微镜主体包括顺序布置的物镜(1)，第二多色反射镜(2)，前成像透镜(3)和20:80反射镜(4)；显微镜主体中的样品为采用三种不同激发波长的荧光染料三色标记过的生物样品；
照明模块的照明光路同步产生包含波长为561nm，647nm及750nm三通道激光照明光；三通道激光照明光通过第二多色反射镜(2)反射，经过物镜(1)照射到样品上，激发样品的荧光染料发出三种不同波段的混合荧光；
混合荧光通过第二多色反射镜(2)及前成像透镜(3)后，由20:80反射镜(4)进行分配，其中20％分配到三维纳米级样品锁定模块中，80％分配到成像模块中；
成像模块包括沿成像光路顺序布置的矩形光阑(14)，成像准直透镜(15)，三组并列布置的双色反射镜(16，18，19)、滤镜(17)以及后成像透镜(21)，探测器(22)，矩形光阑(14)对到达成像模块的混合荧光进行成像范围调节，成像准直透镜(15)将调节后混合荧光的转变为平行光，第一双色分光镜(16)，第二双色分光镜(18)及第三双色分光镜(19)分别将混合荧光根据不同波段分配到三个不同的通道中，由每个通道里的滤镜(17)滤除通道激发光后,剩下的单一波段荧光最终通过后成像透镜(21)将三个通道的荧光分别成像在探测器芯片的不同位置上；
三维纳米级样品锁定模块包括明场光源(26)，科勒照明光路(27)，用于装载样品的压电陶瓷平台(28)，锁定成像滤镜(24)和锁定相机(23)，明场光源(26)通过科勒照明光路(27)照射在样品上，通过显微镜主体和锁定成像滤镜(24)后，20％的明场光在锁定相机(23)上成像；
超分辨率成像过程中，561nm通道，647nm通道及750nm三通道激光照明光同时照射在样品上，标记样品的三类的荧光染料同时发光闪烁，经过成像模块，分别成像在探测器(22)的不同部分，探测器(22)采集多张带有荧光染料“闪烁”信号的原始图像，并传输到控制及显示模块(25)中，控制及显示模块(25)通过高斯拟合，找出每一张原始图像中每一个闪烁点的中心位置，并将所有原始图像的闪烁点中心位置叠加在一起，得到三个通道的超高分辨率图像。
2.根据权利要求1所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于：所述荧光染料，第一种为CF568或Cy3B荧光分子染料,第二种为Alexa647或Cy5荧光分子染料，第三种为Alexa750或Cy7荧光分子染料。
3.根据权利要求1所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于：所述照明模块包括沿照明光路顺序布置的反射镜(5)，第一多色反射镜(6)，激光混光解析透镜(7)和照明透镜(9)，以及布置在反射镜(5)进光侧的第一激光激发器(10)和第一准直透镜(11)，布置在在第一多色反射镜(6)进光侧的第二激光激发器(12)和第二准直透镜(13)；
第二激光激发器(12)激发561nm、647nm波长激光，第一激光激发器(10)激发750波长激光。
4.根据权利要求3所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于：所述反射镜(5)和第一多色反射镜(6)平行间隔布置，且镜面与激光混光解析透镜(7)的主光轴成45°夹角；照明透镜(9)和激光混光解析透镜(7)的主光轴相互平行或重合；第一准直透镜(11)和第二准直透镜(13)的主光轴相互平行，且垂直于激光混光解析透镜(7)的主光轴。
5.根据权利要求3所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于：所述照明模块还包括用于调节照明光方向的照明折射反射镜(8)，照明折射反射镜(8)布置在激光混光解析透镜(7)和照明透镜(9)之间，两片照明折射反射镜(8)相对平行布置，且镜面与激光混光解析透镜(7)和照明透镜(9)的主光轴成45°夹角。
6.根据权利要求1所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于：所述矩形光阑(14)、成像准直透镜(15)、滤镜(17)和后成像透镜(21)的主光轴相互平行或重合，第一双色分光镜(16)，第二双色分光镜(18)及第三双色分光镜(19)平行间隔布置，且镜面与滤镜(17)的主光轴成45°夹角。
7.根据权利要求1所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于：所述成像模块还包括用于调节单一波段荧光方向的反射镜组(20)，反射镜组(20)布置在滤镜(17)和后成像透镜(21)之间。
8.根据权利要求1所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于：所述明场光源(26)为455nm发光二极管。
9.三维纳米级样品锁定方法，其特征在于：
S1，明场光源(26)产生蓝光，通过科勒照明光路(27)为样品提供明场照明；
S2，物镜(1)从样品处接受的光被20:80反射镜(4)分配，其中20％的光经过前成像透镜(3)成像于锁定相机(23)；
S3，从锁定相机(23)中抓取实时图像；
S4，实时计算出图象局域对比度，选取最优区域，以局域对比度之和最大的区域作为最优区域的位置；
S5，压电平台在纵向上焦面上下进行扫描，在扫描时从锁定相机(23)中抓取标定图像序列，并记录相应z值；
S6，从标定图像序列最上端或最下端图像以最优区域位置截取固定大小的区域作为参照图像；
S7，对序列的图像与参照图像求空间相关性矩阵，并对相关性矩阵进行高斯拟合；
S8，求出拟合峰值与z值的单调递减对应关系并用多次函数近似拟合；
S9，从锁定相机(23)中实时抓取样品的明场图像；
S10，对实时图像与参照图像求空间相关性矩阵并进行高斯拟合，求出中心位置作为x，y平面上的偏移量，并通过拟合极值求出实时的z值；
S11，驱动压电陶瓷平台(28)补偿偏移；
S12，S5-S11循环至锁定结束。
10.三通道成像的通道间串扰消除方法，其特征在于：
S1，对每种荧光染料分别测量其在三个通道上的荧光成像，对每一个通道上的亮度取平均，就是该荧光燃料在各通道上的串扰的比例；
S2，由于荧光染料发出的光的量等于各通道接收的光的量的总和，对各通道上的串扰比例进行归一化，即为该荧光染料在各个通道上的分光比例；
S3，将每一单一荧光染料的串扰比例作为一个列向量，合并为一个矩阵，即为此荧光显微镜体系的串扰矩阵；
S4，取该矩阵的逆矩阵，即为去串扰矩阵；
S5，将各通道的图像排成列向量，再将去串扰矩阵作用于该列向量，得到去串扰图像，各通道的顺序应对应串扰矩阵各列的顺序。
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