CN111512207B - 使用荧光显微镜利用受激发射损耗对样本成像的方法 - Google Patents

Abstract

介绍一种使用荧光显微镜(10)利用受激发射损耗对样本(18)进行成像的方法，包括图像产生过程，在该图像产生过程中借助显微镜控制器(42)来控制所述荧光显微镜(10)，从而产生照明焦点，其方式为，给聚焦的激发光分布叠加聚焦的去激发光分布，用于受激发射损耗，由此在用所述照明焦点照明时仅在有效的激发焦点内部对所述样本(18)予以激发，以便发出产生图像的荧光，所述激发焦点的延展范围小于所述激发光分布的延展范围，且在所述样本(18)的目标区域内部连续地借助所述照明焦点以第一位置分辨率对多个样本片段予以扫描，并且成像到相应数量的图像片段中，由这些图像片段产生光栅图像(58)，该第一位置分辨率与有效的激发焦点的减小的延展范围相适配。借助所述显微镜控制器(42)还适当地控制所述荧光显微镜(10)，从而在所述图像产生过程之前以第二位置分辨率产生所述目标区域的概览图像(48)，该第二位置分辨率小于所述第一位置分辨率且高于与所述激发光分布的延展范围相适配的第三位置分辨率，并且分析所述概览图像(48)，以便识别出无相关图像信息的图像区域，且在所述图像产生过程期间在扫描样本片段时至少减小所述去激发光分布的辐射功率，这些样本片段指配于在所述概览图像(48)中识别出来的无相关图像信息的图像区域。

Description

使用荧光显微镜利用受激发射损耗对样本成像的方法

技术领域

本发明涉及一种使用荧光显微镜利用受激发射损耗对样本进行成像的方法，包括图像产生过程，在该图像产生过程中借助显微镜控制器来控制荧光显微镜，从而产生照明焦点，其方式为，给聚焦的激发光分布叠加聚焦的去激发光分布，由此在用照明焦点照明时仅在有效的激发焦点内部对样本予以激发，以便发出产生图像的荧光，所述激发焦点的延展范围小于激发光分布的延展范围，且在样本的目标区域内部连续地借助照明焦点以第一位置分辨率对多个样本片段予以扫描，并且成像到相应数量的图像片段中，由这些图像片段产生光栅图像，该第一位置分辨率与有效的激发焦点的减小的延展范围相适配。本发明还涉及一种以此方式工作的荧光显微镜。

背景技术

近来已开发出荧光显微的方法，其能实现以不受曾经由Ernst Abbe提出的光显微成像分辨率极限限制的位置分辨率对样本结构成像。所谓的受激发射损耗，简写为STED(Stimulated Emission Depletion)，是能实现这种提高的位置分辨率的众多方法之一。

对于STED-显微术，将激光束聚焦到样本中，以便把那里存在的荧光染料激发至发出荧光辐射。如此在样本中产生的激发光分布具有受到光学显微分辨率极限限制的空间延展范围，即不能任意地缩小。但为了能实现提高的位置分辨率，通过射入光给激发光分布叠加聚焦的去激发光分布，所述光通过受激辐射使得激发的荧光染料去激发。下面也称为STED-光的去激发光分布与激发光分布一起形成照明焦点，该去激发光分布通常具有环形的强度分布，其中心为强度尽可能降至零的最小值。

为了提高位置分辨率，使去激发光分布与激发光分布叠加，从而其中央的强度零位恰好位于激发光分布的强度最大值的区域内。在该中央的区域中，因而不会出现通过激发光分布被激发的荧光染料的由受激辐射引起的去激发。换句话说，在中央区域中，自发的荧光辐射不因去激发光分布而受到抑制。

然而，在激发光分布的与前述中央区域邻接的外部区域中，却产生了对自发的荧光辐射的抑制，在这些外部区域中，叠加的去激发光分布的强度从零位起首先急剧地上升。结果，于是由激发光分布与去激发分布的叠加，如下样本区域产生了能提高分辨率的缩小，该样本区域可以通过激发光主要被激发至发出可用于图像产生的荧光。该样本区域的延展范围相比于激发光分布的延展范围明显减小，该样本区域在下面称为有效的激发焦点。

前述情况在图1中示范性地示出。在此，图1示出了在STED-显微术中用于提高位置分辨率(图1中在x-方向上)的通常的光分布的横剖视图。

在图1中，A表示激发光分布，B表示去激发光分布即STED-光。激发光分布A的唯一有激发作用的部分位于两条竖直线V之间的中央区域内部，其中，该部分的根据在中央区域内部的去激发光分布曲线而变化的激发有效性在图1中用曲线C表示。曲线C因而也反映了上述的有效激发焦点。在图1中还标明了饱和强度I_sat。该饱和强度表示需要用来借助STED-光B通过受激辐射使得样本中含有的荧光染料完全去激发的强度。

现在，图1中所示的光分布的问题是，STED-光B在中心必须具有零位，激发光分布在该中心具有其最大的强度，且同时尽量靠近该零位就已经提高至饱和强度I_sat，以便把有效激发焦点限制到尽量小的样本区域。该受限制的样本区域规定了有效的点扩展函数，简写为PSF，进而规定了位置分辨率。STED-光的这种强度分布具有零位，且具有紧邻零位尽量急剧地提高到所需值I_sat的强度，该强度分布目前却只能用比较高的辐射功率来产生，该辐射功率必然导致STED-光B的强度分布随着相距零位的距离增大而首先具有比I_sat高多倍的强度。但是，伴随高的辐射功率必然产生的、对于荧光抑制本身并不需要的光强导致，被施加所述光强的样本区域遭受到特别高的光负荷，这造成荧光染料的严重的光褪色，并且还会在所检查的组织中引起损伤。因此，在通常的STED-图像产生过程期间，以根据图1的整个光分布对全部的待以最高分辨率成像的样本片段予以扫描，亦即尤其也在STED-光B的强度超调远离零位的情况下扫描，其中，光强大于饱和强度I_sat。

在通常的STED-显微方法中出现的光褪色使得往往无法多次对样本成像，比如以便随着时间的推移探测样本中的变化。通常，光褪色甚至如此之严重，乃至就连唯一的光栅图像都无法摄取，或者所摄取的图像含有很少的信号，致使难以分析。这尤其在三维的图像摄取过程中成问题，因为在此每个样本片段都非常频繁地受到光分布，进而特别严重地褪色。

由现有技术已知一些解决方案，其涉及恰恰即使对于STED-应用也减轻光褪色。在这些解决方案之一中提出，在扫描过程期间针对每个像素或样本片段都在短暂的诊断时间内测量荧光信号是否高于预定的极限值。如果情况如此，则由激发光分布和STED-光组成的照明焦点仍保持被接通，并且针对该样本片段存储所检测的荧光信号。相反，如果在诊断时间内检测到的荧光信号低于极限值，则切断照明焦点，因为认为在这种情况下没有荧光染料位于STED-探测区域内。由此，位于STED-探测区域之外的荧光染料保持免受照明焦点的影响。

在

等人的“Strong signal increase in STED fluorescencemicroscopy by imaging regions of subdiffraction extent”(PNAS 2017，第114卷第9号，2125-2130)中，利用照明焦点仅对样本的很小的部分区域予以扫描。这些部分区域很小，致使所感兴趣的区域明显小于共焦的PSF。通过这种方式来确保所感兴趣的样本结构仅在直接邻接零位的区域中与STED-光分布接触，但其外部区域并不如此，STED-光分布在所述外部区域中具有特别高的强度。因而该方法只能用于很小的通常在150nm以下的图像区。另外，为了实施该方法，需要特殊的电光扫描仪，因为常用的机械式扫描仪不适合于这么小的图像区。

在Heine等人的“Adaptive-illumination STED nanoscopy”(PNAS 2017，第114卷第37号，9797-9802)中提出了一种方法，在该方法中同样在STED-图像产生过程期间对来自于每个单独的样本片段的荧光信号予以分析。然而，在此并非在照明焦点的全额强度情况下分析信号。确切地说，照明焦点的辐射功率是逐步提高的。

在这种逐个像素地实施的过程中，为了分析目的而对STED-光强进行的检测已经占用了一定的时间。然后才针对该像素进行真正的又占用时间的数据采集。由此产生了很长的总测量时间。因此，对于每个像素而言，照明焦点的停留时间在目前约为80～100μs。在摄取二维图像时，这导致80～100s的总测量时间，在像素边长为10nm时，二维图像的大小通常为10μm x 10μm。在摄取三维图像时，对于每个单独的图像平面都会出现这种测量时间，这急剧地增加了时间耗费。

这里要注意，在采用常见的机械式扫描仪时，通常无法直截了当地实现从一个未在其中探测到信号的像素快速地跳转到下一个像素，以便把在第一像素上的停留时间至少缩短用来读取图像信号的所需时间。这种跳转因而由于扫描仪的惯性会导致扫描过程中的不均衡性，进而导致图像误差。因此，在现有技术中必须始终都以相同的缓慢速度扫描全部的像素。

发明内容

本发明的目的是，提出一种用来可以使用荧光显微镜利用受激发射损耗快速地且保护样本地对样本成像的方法。此外本发明的目的是，提出一种相应地工作的荧光显微镜。

本发明通过独立权利要求的主题来实现这些目的。有利的改进在从属权利要求中给出。

本发明规定了一种使用荧光显微镜利用受激发射损耗对样本进行成像的方法，其包括图像产生过程，在该图像产生过程中借助显微镜控制器来控制荧光显微镜，从而产生照明焦点，其方式为，给聚焦的激发光分布叠加聚焦的去激发光分布，用于受激发射损耗，由此在用照明焦点照明时仅在有效的激发焦点内部对样本予以激发，以便发出产生图像的荧光，所述激发焦点的延展范围小于激发光分布的延展范围，且在样本的目标区域内部连续地借助照明焦点以第一位置分辨率对多个样本片段予以扫描，并且成像到相应数量的图像片段中，由这些图像片段产生光栅图像，该第一位置分辨率与有效的激发焦点的减小的延展范围相适配。根据本发明，借助显微镜控制器还适当地控制荧光显微镜，从而在图像产生过程之前以第二位置分辨率产生目标区域的概览图像，该第二位置分辨率小于第一位置分辨率且高于与激发光分布的延展范围相适配的第三位置分辨率，并且分析概览图像，以便识别出无相关图像信息的图像区域，且在图像产生过程期间在扫描样本片段时至少减小去激发光分布的辐射功率，这些样本片段指配于在概览图像中识别出来的无相关图像信息的图像区域。

为了保护样本免遭光褪色，本发明规定了一个置于真正的图像产生过程之前的方法步骤，在该方法步骤中摄取目标区域的概览图像，以便识别出其中的无相关图像信息的图像区域。在这种图像区域中不存在感兴趣的必须在随后的STED-图像产生过程中以最高的位置分辨率予以成像的样本结构。因此，对于指配给与图像产生不相关的图像区域的那些样本片段，可以调制照明焦点，从而减小由其引起的对样本的光负荷。根据本发明，这按如下方式进行：至少减小去激发光分布的辐射功率，该辐射功率在通常的STED-图像产生过程中比较高，用于减小有效的激发焦点。为了能够实现分析概览图像，以便识别出无相关图像信息的图像区域，以一方面比采用激发光分布单独可达到的分辨率高的位置分辨率摄取概览图像。另一方面，概览图像的该位置分辨率小于在真正的STED-图像产生中为了产生分辨率最高的光栅图像所采用的位置分辨率。由此可以相比于STED-光栅图像快很多地摄取概览图像。

因而相比于常规的方法，根据本发明的方法提供了显著的速度优势，常规的方法被设计为避免褪色效应，并且在常规的方法中，在扫描过程期间逐个像素地即针对每个要成像的样本片段都要做出是接通还是切断STED-光的判定。通过根据本发明产生并分析概览图像，因而节省了在现有技术中对于逐个像素地执行的分析过程所需要的时间。

本发明通过如下方式允许有效地减轻褪色：基于对概览图像的分析来至少调制STED-光的辐射功率，从而在扫描过程期间给尽量少的样本结构施加以高于饱和强度I_sat的STED-强度。这例如可以按如下方式来进行：只有当待成像的样本结构或其尽量大的部分处在紧密地围绕STED-光的中央零位分布的区域中即参照图1处在位于两条竖直线V之间的区域中时才激活全额的STED-强度。如果待摄取的样本结构处在一区域中，在该区域内STED-强度在全额的STED-辐射功率情况下高于饱和强度，或者在该区域内根本就未出现激发光，则根据本发明的方法可以调节STED-辐射功率，从而给样本结构最多仅施加以饱和强度I_sat。替代地，STED-光也可以完全切断。全额的STED-辐射功率只有当待摄取的样本结构处在紧密地围绕STED-光分布的零位周围的区域内时才予以调节。该区域通常从零位离开延伸至50～100nm。在任何情况下，其延展范围小于激发光分布的延展范围，后者决定了对于STED-图像产生通常使用的共焦显微镜的位置分辨率。

优选地，当扫描指配给在概览图像中被识别出来的无相关图像信息的图像区域的样本片段时，附加地减小激发光分布的辐射功率。这有助于更有效地减轻光褪色。

在一种优选的设计中，将所述辐射功率减小至零。这意味着，在STED-图像产生过程期间，针对没有感兴趣的样本结构的样本片段，将激发光或者将用于受激发射损耗的去激发光切断。

优选地，以第二位置分辨率产生概览图像，其方式为，首先以小于第二位置分辨率的位置分辨率摄取原图像，然后对原图像进行能提高位置分辨率的图像处理。该实施方式规定了用于产生概览图像的两级过程，其中，在基本上基于硬件的第一级中，以分辨率比较低的原图像的形式提供图像数据，然后在基于软件的第二步骤中把图像数据进一步处理成分辨率较高的概览图像。

在一种特别优选的设计中，产生原图像，其方式为，借助激发光分布，以第三位置分辨率扫描目标区域。这具有如下优点：为了产生原图像，基本上可以采用与随后摄取STED-图像相同的图像产生过程，区别是，为了摄取原图像，仅以激发光而不是去激发光来照明样本。

有利地通过如下方式来改进该方法的前述设计：通过共焦的扫描成像来产生原图像。共焦的原图像通常具有250nm范围内的位置分辨率，该原图像形成了随后的图像处理的合适的基础，通过该图像处理将产生分辨率较高的概览图像。

原图像的产生并非必须必然要基于扫描显微的过程。原图像例如也可以采用宽视野照明来产生。

在一种特别优选的实施方式中，用于产生概览图像的图像处理规定了对原图像的反卷积。因而在现有技术中有高效的反卷积算法可用，这些反卷积算法能在智能地利用现代工作站计算机的计算能力来实现很短暂的处于几十毫秒以下的计算时间。由此可以实现的是，在很短的时间内就产生概览图像。此外，特别是当样本被荧光染料染色的密度相当小，也就是说，在真正的图像产生过程中要检查的细微的各样本结构在空间上并排靠置得并不太紧密时，反卷积非常适合于提高图像分辨率。在这种情况下，根据本发明的方法特别好地适合于减轻褪色。

在一种替代的实施方式中，通过以第二位置分辨率对目标区域直接成像来产生概览图像。在这种情况下，无需附加的图像处理。

例如可以采用结构化的照明来产生概览图像。

同样可行的是，通过借助照明焦点对目标区域扫描来产生概览图像，其中，去激发光分布的辐射功率相比于在图像产生过程中采用的辐射功率有所减小。减小的辐射功率一方面很弱，从而它并未或者仅轻微地将样本褪色。另一方面，该辐射功率的强度至少要能实现对于概览图像所希望的位置分辨率。在这种情况下也可行的是，以较弱的、但不同的STED-辐射功率摄取多个概览图像。

但也可采用其它的方法来直接产生概览图像，例如在文献中名为“PixelReassignment”的方法，其例如在C.J.R.Sheppard的“Optik”(1998年)、C.J.R.Sheppard等人的“Optics Letters”(2013年)中有所介绍。

优选地，基于对概览图像的分析来创建并存储辐射功率表格，该辐射功率表格在图像产生过程期间给每个待成像的样本片段都指配了去激发光分布的辐射功率的至少一个值。

在一种特别优选的实施方式中，在概览图像内识别出来的无相关图像信息的图像区域里，确定出剔除区域，且在以第一位置分辨率扫描目标区域时跳过指配给这些剔除区域的样本片段。由此可行的是，在高分辨率的STED-图像产生过程中，跳过较大的样本区域，给这些样本区域例如指配了一行或多行彼此相继的图像片段，由此进一步加速了图像的产生。跳过整行是特别有利的，因为在通常的STED-扫描显微镜中使用的使得照明焦点偏转至下一行的扫描反射镜只是比较缓慢地移动，从而如果在不同的区域中扫描反射镜必须经历不同的距离，则在此无法注意到或者不能明显地注意到图像误差。这比如当扫描反射镜在具有图像信息的行中逐行跳跃，而它在没有图像信息的行中跳过一行或多行时适用。在此可以利用传统的允许扫描较大图像区域的机械式扫描仪来工作。特别地，不指望于只能扫描非常小的图像区域的特殊的电光扫描仪。

优选地，第二位置分辨率相比于第三位置分辨率提高了介于1.5和2之间的倍数。

附图说明

下面参照附图详述本发明。其中：

图1为在STED-显微镜中用于提高位置分辨率的光分布的横剖视图；

图2为根据本发明的STED-显微镜的示意图；

图3为根据本发明产生的原图像的示意图，其中含有可见的样本结构；

图4为根据本发明产生的概览图像的示意图，其中含有可见的样本结构；

图5为示意图，其示出基于概览图像创建的表格的用来控制照明焦点的辐射功率的功能；

图6为示意图，其示出所得到的STED-光栅图像，该图像中含有可见的样本结构。

具体实施方式

图2示出根据本发明的STED-显微镜10，其被设计用于采用受激发射损耗的本已公知的原理，以高的位置分辨率对发荧光的样本结构进行成像。

STED-显微镜10包括分别被设计成激光光源的激发光源12和去激发光源14。激发光源12发射出激发光束16，该激发光束的波长经过选择，从而它把在待成像的样本18中含有的荧光颜料激发至自发地发射出荧光。相比之下，去激发光源14发射出去激发光束20，该去激发光束的波长经过设计，从而在样本18中含有的荧光颜料按照受激发射损耗的原理被去激发。

由激发光源12发出的激发光束16在二色性的第一分光器23处朝向二色性的第二分光器24反射，在该二色性的第二分光器处使得激发光束16与先前穿过调相器22的去激发光束20会聚。为此，第二分光器24经过设计，从而它使得激发光束16穿过，却使得去激发光束22反射。

通过第二分光器24相互叠加的光束16和20继续传播至含有光栅反射镜28的光栅模块26。激发光束16和去激发光束20在光栅反射镜28上反射之后穿过扫描光学器件30以及管式光学器件32，并且随后穿过物镜34聚焦到样本18上。

穿过物镜34聚焦的光束16、20在样本18中叠加成照明焦点，光栅模块26通过光栅反射镜28的翻摆使得该照明焦点沿着样本18进行扫描移动。通过这种方式，在STED-图像产生过程期间利用照明焦点对样本18的目标区域扫描。

调相器22影响由去激发光源14发出的去激发光束20，从而由物镜34在样本18中产生的去激发光分布形成了环形焦点，该环形焦点处于通过物镜34聚焦到样本18中的激发光分布的外围区域上。这导致，利用去激发焦点被照明的样本区域通过受激发射损耗被去激发，并且通过激发光分布无法再被激发至发出能产生图像的荧光。因此，在照明焦点的中央区域中形成了有效的激发焦点，该激发焦点的延展范围小于聚焦到样本14中的激发光分布的延展范围。仅在该有效的激发焦点内部，在样本中含有的荧光颜料才被激发至发出荧光。

在STED-图像产生过程期间利用照明焦点对样本18扫描所采用的位置分辨率与前述的有效激发焦点的延展范围相适配。由于该延展范围通过由受激发射损耗所致的去激发光分布的叠加而相对于射入到样本18中的激发光分布的延展范围明显减小，产生了相应高的位置分辨率，在STED-图像产生过程期间以该位置分辨率产生光栅图像。

由样本18发出的荧光在图2中用36标出，该荧光在经过物镜34、管式光学器件32和扫描光学器件34之后回到光栅反射镜28。在光栅反射镜28上反射之后，荧光36在其被探测器40检测之前依次经过两个二色性的分光器24、23、探测孔眼光圈36和滤光器38。

STED-显微镜10还具有显微镜控制器42，该显微镜控制器控制STED-显微镜10的整体工作。特别地，显微镜控制器42控制用来避免光褪色效应的下述方法。

在图3～6中纯示范性地示出根据本发明的方法可以如何实施。

在第一步骤中，显微镜控制器42控制STED-显微镜10，从而在真正的STED-图像产生过程之前按本已公知的方式在共焦模式下摄取光栅图像，该光栅图像形成根据本发明待进一步处理的共焦-原图像44。为此，样本18仅以激发光束16予以照明，但并不以去激发光束20照明。在这种情况下，激发光束16借助光栅反射镜28沿着样本18进行扫描移动。在该第一步骤中产生共焦-原图像44所采用的位置分辨率与激发光分布的空间延展范围相适配，物镜34使得该激发光分布聚焦到样本18中。由于该延展范围明显大于在STED-图像产生中所用的有效的激发焦点的延展范围，所以该位置分辨率相比于STED-分辨率明显减小。这导致，相比于以后待摄取的STED-图像，共焦-原图像44可以明显更快地且保护样本地产生。如图3中所示，在共焦-原图像44中以比较小的位置分辨率对感兴趣的样本结构46予以成像。

在图4中示出了该方法的第二步骤，其中，为了提高位置分辨率，基于共焦-原图像44，通过图像处理例如通过采用反卷积算法来产生概览图像48。在所示实施例中，概览图像48的位置分辨率相比于共焦-原图像46的位置分辨率提高了大约介于1.5和2之间的倍数。相应地，与在根据图3的共焦-原图像44中相比，在图4中标有50的样本结构更清晰地成像。

图5中示出了该方法的第三步骤，其中首先分析概览图像，以便识别出无相关图像信息的图像区域。然后在该第三步骤中，基于对概览图像48的分析，创建并存储辐射功率表格，该辐射功率表格给每个在下面将要介绍的STED-图像产生过程中以高的位置分辨率有待成像的样本片段都指配了关于照明焦点辐射功率的控制信息，针对该样本片段将要采用该控制信息。在当前实施例中，该控制信息表明：对于刚刚考察的样本片段，照明焦点在其整体上是否应予接通或切断。图5示出一种图谱52，其以辐射功率表格的形式表明了前述控制信息与各个样本片段的指配关系。在此，在图5中把用56标出的区域之外的图像区域指配给如下样本区域：在STED-图像产生过程中针对所述样本区域要将照明焦点切断。相比之下，前述区域56表明了如下样本片段：在STED-图像产生过程中针对所述样本片段要将照明焦点接通。

最后，图6示出该方法的第四步骤，其中考虑到在步骤3中产生的控制信息来实施STED-图像产生过程。在此，图6示出了所产生的STED-光栅图像58，其含有在其中能以高的分辨率看到的样本结构60。

在这里还要指出，图3～6仅仅示出根据本发明的方法的一种特殊的尤其简单地设计的实现方案。因此，在该特殊的实施例中，根据图5的图谱52是在整体上表示出照明焦点，而没有在STED-光与激发光分布之间做出区分。这意味着，在该特殊的例子中，图谱52中含有的控制信息似乎仅由零和一构成，并且，对于那些分别被指配了零的样本片段来说，照明焦点在整体上被切断了，而对于那些被指配了一的样本片段，该照明焦点被接通。但也可以特别是针对STED-光规定更复杂的也覆盖中间值的辐射功率调制。由此得到相应地更复杂的辐射功率图谱，这些辐射功率图谱在概览图像48中含有的图像信息与照明焦点特别是STED-光之间提供了指配关系。

Claims (14)

1.一种使用荧光显微镜(10)利用受激发射损耗对样本(18)进行成像的方法，包括图像产生过程，在该图像产生过程中借助显微镜控制器(42)来控制所述荧光显微镜(10)，

从而产生照明焦点，其方式为，给聚焦的激发光分布叠加聚焦的去激发光分布，用于受激发射损耗，由此在用所述照明焦点照明时仅在有效的激发焦点内部对所述样本(18)予以激发，以便发出产生图像的荧光，所述激发焦点的延展范围与所述激发光分布的延展范围相比减小了，且

在所述样本(18)的目标区域内部连续地借助所述照明焦点以第一位置分辨率对多个样本片段予以扫描，并且成像到相应数量的图像片段中，由这些图像片段产生光栅图像(58)，该第一位置分辨率与有效的激发焦点的减小的延展范围相适配，

其特征在于，借助所述显微镜控制器(42)还适当地控制所述荧光显微镜(10)，

从而在所述图像产生过程之前以第二位置分辨率产生所述目标区域的概览图像(48)，该第二位置分辨率小于所述第一位置分辨率且高于与所述激发光分布的延展范围相适配的第三位置分辨率，并且分析所述概览图像(48)，以便识别出无相关图像信息的图像区域，并且

在所述图像产生过程期间在扫描样本片段时至少减小所述去激发光分布的辐射功率，这些样本片段指配于在所述概览图像(48)中识别出来的无相关图像信息的图像区域，

以所述第二位置分辨率产生所述概览图像(48)，其方式为，首先以小于所述第二位置分辨率的位置分辨率摄取原图像(44)，然后对所述原图像(44)进行能提高位置分辨率的图像处理。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当扫描指配给在所述概览图像(48)中被识别出来的无相关图像信息的图像区域的样本片段时，附加地减小所述激发光分布的辐射功率。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将所述辐射功率减小至零。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，产生所述原图像(44)，其方式为，借助所述激发光分布，以所述第三位置分辨率扫描所述目标区域。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，通过共焦的扫描成像来产生所述原图像(44)。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用宽视野照明来产生所述原图像(44)。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，图像处理规定了对所述原图像(44)的反卷积。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过以所述第二位置分辨率对所述目标区域直接成像来产生概览图像(48)。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，采用结构化的照明来产生所述概览图像(48)。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，通过借助所述照明焦点对所述目标区域扫描来产生所述概览图像(48)，其中，所述去激发光分布的辐射功率相比于在所述图像产生过程中采用的辐射功率有所减小。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，基于对所述概览图像(48)的分析来创建并存储辐射功率表格，该辐射功率表格在所述图像产生过程期间给每个待成像的样本片段都指配了所述去激发光分布的辐射功率的至少一个值。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述概览图像(48)内识别出来的无相关图像信息的图像区域里，确定出剔除区域，且在以所述第一位置分辨率扫描所述目标区域时跳过指配给这些剔除区域的样本片段。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二位置分辨率相比于所述第三位置分辨率提高了介于1.5和2之间的倍数。

14.一种利用受激发射损耗对样本(18)进行成像的荧光显微镜(10)，包括显微镜控制器(42)，该显微镜控制器(42)被设计用来在图像产生过程中控制所述荧光显微镜(10)，

从而产生照明焦点，其方式为，给聚焦的激发光分布叠加聚焦的去激发光分布，用于受激发射损耗，由此在用所述照明焦点照明时仅在有效的激发焦点内部对所述样本(18)予以激发，以便发出产生图像的荧光，所述激发焦点的延展范围相比于所述激发光分布的延展范围减小了，且

在所述样本(18)的目标区域内部连续地借助所述照明焦点以第一位置分辨率对多个样本片段予以扫描，并且成像到相应数量的图像片段中，由这些图像片段产生光栅图像，该第一位置分辨率与有效的激发焦点的减小的延展范围相适配，

其特征在于，借助所述显微镜控制器(42)还适当地控制所述荧光显微镜(10)，

从而在所述图像产生过程之前以第二位置分辨率产生所述目标区域的概览图像(48)，该第二位置分辨率小于所述第一位置分辨率且高于与所述激发光分布的延展范围相适配的第三位置分辨率，并且分析所述概览图像(48)，以便识别出无相关图像信息的图像区域，并且

在所述图像产生过程期间在扫描样本片段时至少减小所述去激发光分布的辐射功率，这些样本片段指配于在所述概览图像(48)中识别出来的无相关图像信息的图像区域，

以所述第二位置分辨率产生所述概览图像(48)，其方式为，首先以小于所述第二位置分辨率的位置分辨率摄取原图像(44)，然后对所述原图像(44)进行能提高位置分辨率的图像处理。

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